專利名稱：Hedgehog類多肽對上皮組織的調節(jié)及其相關配制品和用途的制作方法
背景技術：
圖式形成是胚胎細胞用以形成分化組織的有序空間排列的活性。高等生物體的物理復雜性在胚胎發(fā)生期間經(jīng)細胞內在譜系和細胞外在信號的相互作用而產生。誘導性相互作用對于脊椎動物發(fā)育中從身體輪廓的最早建立到胚胎圖式形成、器官系統(tǒng)的圖式形成、組織分化過程中不同細胞類型的產生都是很重要的(Davidson,E.,(1990)發(fā)育108:365-389；Gurdon,J.B.,(1992)細胞68:185-199；Jessell,TM.等(1992)細胞68:257-270)。發(fā)育細胞相互作用的作用是不同的。典型地，通過誘導與應答細胞的未誘導和誘導狀態(tài)均不同的細胞，應答細胞從細胞分化的一個途徑轉向另一個途徑(誘導)。有時細胞誘導其相鄰細胞象其一樣分化(同源誘導)；在另一些情況下，細胞抑制其相鄰細胞象其一樣分化。早期發(fā)育中細胞相互作用可以是相繼進行的，從而兩種細胞類型間的初始誘導導致多樣性的漸進擴增。另外，誘導性相互作用不僅在胚胎中發(fā)生，而且在成熟細胞中也發(fā)生，并且可以發(fā)揮作用建立和保持形態(tài)發(fā)生圖式以及誘導分化(J.G.Gurdon(1992)細胞68:185-199)。
信號分子的Hedgehog家族成員在無脊椎動物和脊椎動物發(fā)育中介導許多重要的短程和長程圖式形成過程。在蒼蠅中，一個單hedgehog基因調節(jié)節(jié)段和器官芽圖式形成。相反，在脊椎動物中，hedgehog基因家族參與左-右不對稱性、CNS中的極性、體節(jié)和肢、器官發(fā)生、軟骨發(fā)生以及精子發(fā)生的調控。
第一個hedgehog基因是通過在黑腹果蠅中的遺傳篩選鑒定的(Nusslein-Volhard,C.和Wieschaus,E.(1980)自然287,795-801)，這一篩選鑒定了若干個影響胚胎和幼蟲發(fā)育的突變。在1992和1993年，報道了果蠅hedgehog(hh)基因的分子學性質(C.F.Lee等(1992)細胞71,33-50)，從那時起，從各種脊椎動物物種中分離了幾個hedgehog同系物。盡管在果蠅和其它無脊椎動物中僅發(fā)現(xiàn)一個hedgehog基因，但是在脊椎動物中存在多個Hedgehog基因。
各種Hedgehog蛋白由信號肽、高保守的N-末端區(qū)和較分化的C-末端結構域組成。除了在分泌途徑的信號序列裂解(Lee,J.J.等人(1992)細胞71:33-50；Tabata,T.等人(1992)基因發(fā)育2635-2645；Chang,D.E.等人(1994)發(fā)育120:3339-3353)之外，Hedgehog前體蛋白發(fā)生內部自我蛋白酶解，這種蛋白酶解取決于C-末端部分的保守序列(Lee等人(1994)科學266:1528-1537；Porter等(1995)自然374:363-366)。這一自我裂解導致產生一19kD N-末端肽和一26-28kD C-末端肽(Lee等人(1992)，文獻同上；Tabata等人(1992)，文獻同上；Chang等人(1994)，文獻同上；Lee等人(1994)，文獻同上；Bumcrot,D.A.等人(1995)分子細胞生物學15:2294-2303；Porter等(1995)，文獻同上；Ekker,S.C.等(1995)當前生物學5:944-955；Lai,C.J.等(1995)發(fā)育121:2349-2360)。N-末端肽與合成其的細胞表面緊密結合，而C-末端肽在體外和體內可自由擴散(Lee等人(1994)，文獻同上；Bumcrot等人(1995)，文獻同上；Mart′,E.等(1995)發(fā)育121:2537-2547；Roelink,H.等(1995)細胞81:445-455)。令人感興趣地，N-末端肽在細胞表面的保留依賴于自我裂解，因為，由在內部裂解的正常位置精確終止的-RNA編碼的HH的一截短形式在體外(Porter等(1995)，文獻同上)和體內(Porter,J.A.等(1996)細胞86,21-34)均是可擴散的。生物化學研究表明HH前體蛋白的自我蛋白酶解經(jīng)一內部硫酯中間體，其隨后在一親核取代中裂解。很可能親核物質是一小親核分子，其與N-肽的C-末端共價結合(Porter等(1996)，文獻同上)，使其粘連在細胞表面上。該生物學暗示是意義深遠的。粘連的結果是在Hedgehog產生細胞的表面產生高局部濃度的N-末端Hedgehog肽。這-N-末端肽對于果蠅和脊椎動物中的短程和長程Hedgehog信號活動是必需的和充分的(Porter等(1995)，文獻同上；Ekker等(1995)，文獻同上；Lai等(1995)，文獻同上；Roelink,H.等(1995)細胞81:445-455；Porter等(1996)，文獻同上；Fietz,M.J.等(1995)當前生物學5:643-651；Fan,C.-M.等(1995)細胞81:457-465；Mart′,E.等(1995)自然375:322-325；Lopez-Martinez等(1995)當前生物學5:791-795；Ekker,S.C.等(1995)發(fā)育121:2337-2347；Forbes,A.J.等(1996)發(fā)育122:1125-1135)。
已暗示HH在果蠅發(fā)育中參與短程和長程圖式形成的各個位點。在早期胚胎的節(jié)段極性的建立中，其具有似乎被直接介導的短程效應，而在器官芽的圖式形成中，其通過誘導二級信號而誘導長程效應。
在脊椎動物中，在過去幾年中已克隆了幾個hedgehog基因(見表1)，在這些基因中，對Shh進行了很多實驗，因為其在不同的組織中心中表達，而這些組織中心是鄰近組織圖式形成的信號來源。最近的證據(jù)表明Shh參與這些相互作用。
hedgehog蛋白與其相關受體之一patched的相互作用引發(fā)一級聯(lián)，參與下游效應器的活化和抑制，在某些情況下，其最終結果是在基因的轉錄和翻譯中發(fā)生可檢測的變化。Hedgehog信號的轉錄靶是patched基因本身(Hidalgo和Ingham,1990發(fā)育110,291-301；Marigo等，1996)，以及果蠅cubitus interruptus(Ci)基因的脊椎動物同系物GLI基因(Hui等(1994)發(fā)育生物學162:402-413)。已顯示patched基因的表達在應答Shh的肢芽和神經(jīng)板細胞中被誘導(Marigo等(1996)發(fā)育122:1225-1233)。GLI基因編碼具有鋅指DNA結合結構域的潛在的轉錄因子(Orenic等(1990)基因和發(fā)育4:1053-1067；Kinzler等(1990)分子細胞生物學10:634-642)。已報道GLI基因的轉錄在肢芽中應答hedgehog呈正調節(jié)，而GLI3基因的轉錄應答hedgehog誘導呈負調節(jié)(Marigo等(1996)發(fā)育122:1225-1233)。另外，已證實Ci的升高水平即使在缺乏hedgehog活性時也足以激活patched(ptc)和其它hedgehog靶基因。
發(fā)明概述本申請的一個方面涉及通過將上皮細胞在體外或體內與hedgehog治療劑或ptc治療劑異位接觸而調節(jié)上皮細胞的生長狀態(tài)的方法，其中所述的hedgehog治療劑或ptc治療劑的用量是例如相對于不給予該hedgehog治療劑或ptc治療劑時足以改變上皮細胞的增殖速率(促進或抑制)的量。本發(fā)明的方法例如可用于調節(jié)上皮組織的生長狀態(tài)，如誘導皮膚或其它皮組織的形成，或誘導毛發(fā)的生長。
當本發(fā)明方法用hedgehog治療劑進行時，該hedgehog治療劑優(yōu)選是一種包括具有至少hedgehog蛋白的生物活性胞外部分的hedgehog部分的多肽，例如，該hedgehog部分包括hedgehog蛋白的N-末端部分的至少50,100或150個(連續(xù))氨基酸殘基。在一優(yōu)選的實施方案中，hedgehog部分包括至少相應于hedgehog蛋白胞外結構域的19kd片段的hedgehog蛋白的一部分。
在某些優(yōu)選的實施方案中，所述的hedgehog部分具有與SEQ IDNO:10-18或20的任一個hedgehog蛋白至少60％、75％、85％或95％相同的氨基酸序列，當然與這些序列相同的序列也適用于本發(fā)明方法。所述的hedgehog部分可由在嚴格條件下與SEQ ID NO:1-9或19的任一個核酸序列雜交的核酸編碼，例如，所述的hedgehog部分可由脊椎動物hedgehog基因、特別是人hedgehog基因編碼。
在某些實施方案中，所述的hedgehog多肽用一或多個固醇部分例如膽固醇或其衍生物修飾。
在某些實施方案中，所述的hedgehog多肽用一或多個脂肪酸部分修飾，例如選自肉豆蔻酰基、棕櫚?；?、硬脂?；突ㄉ南；闹舅岵糠?。
在某些實施方案中，所述的hedgehog多肽用一或多個芳烴修飾，例如苯、北、菲、蒽、萘、芘、屈或并四苯。
在某些實施方案中，所述的hedgehog多肽用C7-C30烷基或環(huán)烷基修飾一或多次。
在其它實施方案中，本發(fā)明方法可以通過給予基因活化構建體而進行，其中所述的基因活化構建體與患者的基因組hedgehog基因組合以提供與所述的hedgehog基因的編碼序列可操縱連接的異源轉錄調控序列。
在其它的一些實施方案中，本發(fā)明方法可通過給予編碼hedgehog多肽的基因治療構建體而實施。例如，所述的基因治療構建體可以提供在選自重組病毒顆粒、脂質體、多聚陽離子核酸結合劑的組合物中。
在其它的實施方案中，本發(fā)明的方法可以用ptc治療劑進行。ptc治療劑的一個例子是與patched蛋白結合并使有絲分裂的pathed介導的抑制脫阻抑的小有機分子，例如與patched結合并模擬hedgehog介導的patched信號轉導的分子，與patcded結合并調節(jié)patched依賴性基因表達的分子。例如，ptc治療劑與patched的結合可導致對patched和/或gli表達的正調節(jié)。
在更通用的意義上，ptc治療劑可以是與上皮細胞相互作用以例如通過改變參與patched信號途徑的胞內蛋白的定位、蛋白-蛋白結合和/或酶活性而誘導hedgehog介導的patched信號轉導的小有機分子。例如，ptc治療劑可以改變hedgehog蛋白、patched蛋白或參與patched胞內信號轉導途徑的蛋白的表達水平。
在某些實施方案中，ptc治療劑是一種反義構建體，其抑制參與patched信號轉導途徑的蛋白的表達，并且其表達拮抗hedgehog介導的信號。該反義構建體優(yōu)選是長度為20-30個核苷酸的寡核苷酸并且GC含量至少為50％。
在其它實施方案中，ptc治療劑是蛋白激酶A(PKA)的抑制劑，如5-異喹啉磺酰胺。PKA抑制劑可以是環(huán)化AMP類似物。PKA抑制劑的例子包括N-[2-((p-溴肉桂基)氨基)乙基]-5-異喹啉磺酰胺，1-(5-異喹啉磺?；?-2-甲基哌嗪，KT5720,8-溴- 其中，R1和R2各自獨立地代表氫，并且若化合價和穩(wěn)定性允許則代表低級烷基，低級鏈烯基，低級炔基，羰基(如羧基、酯、甲酸酯或酮)，硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)，氨基，?；被０被?，氰基，硝基，疊氮基，硫酸酯，磺酸酯，亞磺酰氨基，-(CH2)m-R8,-(CH2)m-OH,-(CH2)m-O-低級烷基，-(CH2)m-O-低級鏈烯基，-(CH2)n-O-(CH2)m-R8,-(CH2)m-SH,-(CH2)m-S-低級烷基，-(CH2)m-S-低級鏈烯基，-(CH2)n-S-(CH2)m-R8，或者R1和R2一起與N形成一雜環(huán)(取代的或未取代的)；R3不存在或代表異喹啉環(huán)的一或多個取代，如低級烷基，低級鏈烯基，低級炔基，羰基(如羧基、酯、甲酸酯或酮)，硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)，氨基，酰基氨基，酰氨基，氰基，硝基，疊氮基，硫酸酯，磺酸酯，亞磺酰氨基，-(CH2)m-R8,-(CH2)m-OH,-(CH2)m-O-低級烷基，-(CH2)m-O-低級鏈烯基，-(CH2)n-O-(CH2)m-R8,-(CH2)m-SH,-(CH2)m-S-低級烷基，-(CH2)m-S-低級鏈烯基，-(CH2)n-S-(CH2)m-R8；R8代表取代的或未取代的芳基，芳烷基，環(huán)烷基，環(huán)烯基或雜環(huán)；以及n和m各自獨立為0或1-6的整數(shù)。
本發(fā)明方法可用于治療例如上皮失調，如控制創(chuàng)傷愈合過程。例如，本發(fā)明方法可作為燒傷治療、皮膚再生、皮膚移植、褥瘡治療、皮膚潰瘍治療、手術后減輕疤痕以及潰瘍性結腸炎治療等治療的一部分。在控制毛發(fā)生長中，本發(fā)明方法可用作禿頭癥治療的一部分。
本發(fā)明的另一方面涉及配制用于上皮組織如皮膚局部應用的hedgehog或ptc治療劑的制備。例如，這種配制品可包括一種多肽，該多肽具有包括hedgehog蛋白的生物活性片段的hedgehog多肽序列，該多肽配制用于上皮組織局部應用。
附圖的簡要描述

圖1A,B和C示出了在用各種hedgehog配制品處理的小鼠上對毛發(fā)生長的誘導。
發(fā)明的詳細描述正常皮膚表皮是一種復雜的上皮組織，其含有處于增殖、分化和脫皮中的角質細胞，并且其分層能使角質細胞中的形態(tài)學和功能變化以有序進程發(fā)生。因為角質細胞的增殖持續(xù)補償從皮膚表面脫落的細胞的損失，所以正常表皮保持一種動態(tài)穩(wěn)態(tài)。在表皮內，增殖發(fā)生在附著于下面的基膜的基底層角質細胞中，并且當細胞遷移通過上基層時，其發(fā)生終末分化，最終作為死的角質鱗從組織表面脫落。通過細胞動力學分析已鑒定了基層角質細胞的三個亞群干細胞、轉運擴增細胞和定型細胞。干細胞在成熟生命過程中保持高自我更新能力，并最終負責表皮的保持和修復。干細胞的子代細胞可以是干細胞本身或是已知為轉運擴增細胞的細胞。轉運擴增細胞分裂次數(shù)較少，但是產生不可逆退出細胞循環(huán)并進行終末分化的子代的可能性卻很高。Ⅰ．總述本申請涉及這樣一種發(fā)現(xiàn)，即hedgehog多肽的制劑可用于控制上皮組織的形成和/或保持。如所附實施例所述，hedgehog蛋白質參與上皮干細胞的增殖并可提供調節(jié)干細胞分化成上皮組織的早期信號。一般地，本發(fā)明方法包括將上皮細胞與一定量的hedgehog治療劑(見下述)接觸，根據(jù)所述hedgehog治療劑是有效的hedgehog興奮劑還是有效的hedgehog拮抗劑，由所述細胞產生(ⅰ)誘導上皮組織形成或(ⅱ)抑制上皮組織形成的非毒性應答。本發(fā)明方法可在分散在培養(yǎng)物中的上皮細胞或是完整組織或器官的一部分的上皮細胞上進行。另外，本發(fā)明方法可在培養(yǎng)物中提供的細胞(體外)或完整動物的細胞(體內)上進行。
在一個方面，本發(fā)明提供了用于控制上皮衍生組織的增殖的藥物制劑和方法，其使用hedgehog多肽或其模擬物作為活性成分。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的藥物制劑控制上皮衍生組織的增殖的方法。
本發(fā)明的hedgehog配制品可用作治療上皮組織疾病的方案的一部分或者手術或美容修復上皮組織的方案的一部分，所述上皮組織例如皮膚和皮膚器官；角膜、晶狀體和其它眼組織；粘膜和牙周上皮。本文公開的方法和組合物提供了治療和預防各種損傷的上皮和粘膜組織的方法。例如，本發(fā)明方法可用于控制創(chuàng)傷愈合進程，例如這在涉及上皮組織的外科手術如皮膚病學或牙周手術中是需要的。用hedgehog療法作為候選治療的外科修復的例子包括嚴重燒傷和皮膚再生，皮膚移植，褥瘡，皮膚潰瘍、皮裂、手術后減輕疤痕以及潰瘍性結腸炎。
在本發(fā)明的另一方面，hedgehog制劑可用于影響毛發(fā)的生長，例如用于治療禿頭癥，其中毛發(fā)的生長被加強，或者例如可用于美容去毛(脫毛)，其中毛發(fā)的生長被抑制。
在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物可用于抑制而不是促進上皮衍生組織的生長。例如，本文所公開的一些組合物可用于治療或防止各種增生或瘤形成癥狀。所述方法可用于治療或預防例如銀屑病、角化癥、痤瘡、粉刺損害、毛囊炎和假毛囊炎、角化棘皮瘤、病、以及斑痕瘤或肥大疤痕。本發(fā)明的一些配制品還可用作自身免疫疾病的治療方案的一部分以影響疾病增殖現(xiàn)象的愈合，例如用作治療口腔潰瘍、天皰瘡如普通天皰瘡、葉狀天皰瘡、增殖性天皰瘡或紅斑狀天皰瘡、表皮松解、狼瘡損害或脫屑損害的一部分。
本發(fā)明的hedgehog治療對患有這些癥狀的人和動物個體均有效。適用于本發(fā)明的動物個體延及家畜，包括寵物或商用家畜，例如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬和山羊。
本發(fā)明的另一方面提供了一種刺激組織培養(yǎng)物中的上皮組織的生長并調節(jié)其分化的方法。
不希望受任何特定理論的限制，hedgehog蛋白對干細胞增殖的誘導至少部分由于這些蛋白質能拮抗(直接或間接)patched介導的基因表達的調節(jié)以及由該蛋白介導的其他生理效應。據(jù)認為patched基因產物-一種細胞表面蛋白-發(fā)信號通過一途徑，導致形態(tài)發(fā)生素的Wnt和Dpp/BMP家族成員的轉錄阻抑，形態(tài)發(fā)生素是賦予位置信息的蛋白質。在脊椎動物的CAN和肢體圖式形成的發(fā)育中，hedgehog的導入消除(脫阻抑)由patched賦予的這種抑制，使得特定基因程序的表達。
最近，已報道人patched基因的突變導致遺傳性皮膚癌并可能導致零星皮膚癌，patched基因是在果蠅發(fā)育途徑中鑒定的第一個基因，例如，參見Hahn等(1996)細胞86:841-851；Johnson等(1996)科學272:1668-1671。痣樣基細胞癌(NBCC)由人patched基因中的突變所致已得到證明，這是patched在胚胎后發(fā)育中起作用的一個例子。這些發(fā)現(xiàn)使得現(xiàn)有技術中了解patched的一個活性是腫瘤抑制基因，其可通過抑制來自hedgehog的增殖信號而起作用。我們下述觀察揭示了hedgehog/patched途徑在保持上皮細胞增殖和分化中的潛在新作用。因此，本發(fā)明涉及能模擬hedgehog蛋白對patched信號傳導的作用的其它制劑的用途，例如，所述其它制劑可從下述藥物篩選分析中鑒別。Ⅱ．定義為方便起見，說明書、實施例和權利要求書中采用的某些術語解釋如下。
術語“hedgehog治療劑”指各種形式的hedgehog多肽以及肽模擬物，其可通過在實施例中清楚示出的模擬或增強(興奮)或抑制(拮抗)天然存在的hedgehog蛋白的作用而調節(jié)上皮細胞的增殖/分化狀態(tài)。模擬或增強野生型hedgehog蛋白的活性的hedgehog治療劑是“hedgehog興奮劑”，相反，抑制野生型hedgehog蛋白的活性的hedgehog治療劑是“hedgehog拮抗劑”。
特別地，術語“hedgehog多肽”包括hedgehog蛋白及其肽片段的制劑，可以是興奮劑和拮抗劑形式，如下所述。
如本文所用術語“hedgehog蛋白的生物活性片段”是指全長hedgehog多肽的一個片段，其中所述片段特異地刺激或拮抗由野生型hedgehog蛋白介導的誘導性事件。hedgehog生物活性片段優(yōu)選地是hedgehog蛋白的可溶性胞外部分，其中可溶性是參照生理學相容溶液而言。舉例性的生物活性片段見PCT出版物WO95/18856和WO96/17924所述。
術語“patched”或“ptc”是指相關跨膜蛋白的一個家族，其已證實參與由細胞與hedgehog蛋白接觸而誘導的信號轉導中。例如，哺乳動物ptc家族包括ptc1和ptc2。除了下述參考文獻外，ptc2的例子還參見Takabatake等(1997)FEBS通信410:485和GenBankAB000847。除非另有說明，應理解針對ptc1(或僅ptc)所述的實施方案也指涉及其它ptc同系物如ptc2的等價實施方案。
術語“ptc治療劑”指這樣的制劑，其(ⅰ)模擬hedgehog蛋白對patched信號轉導的作用，例如，其拮抗patched的細胞周期抑制活性，或者(ⅱ)活化或增強patched信號轉導。在其它實施方案中，ptc治療劑可以是hedgehog拮抗劑。ptc治療劑可以是例如肽、核酸、碳水化合物、小有機分子或天然產物抽提物(或其部分)。
hedgehog或ptc治療劑的“增殖”形式是誘導上皮細胞特別是上皮干細胞的增殖的形式。相反，hedgehog或ptc治療劑的“抗增殖”形式是優(yōu)選地以非毒性方式，例如通過促進或保持分化表型或以其它方式促進沉默而抑制上皮細胞的增殖的形式。
舉例來說，而不希望受特定理論的限制，增殖性hedgehog多肽通常是脫阻抑patched介導的細胞循環(huán)抑制的蛋白形式，例如該多肽模擬天然存在的hedgehog蛋白對上皮細胞的作用。增殖性ptc治療劑包括脫阻抑patched介導的細胞循環(huán)抑制的其它制劑，并可細胞外或細胞內起作用。
舉例性的抗增殖性ptc治療劑可增強patched介導的細胞循環(huán)抑制。這種制劑可以是抑制例如hedgehog與patched結合的小分子，以及刺激和/或增強patched蛋白的信號轉導途徑的制劑。
術語“上皮”指機體內表面和外表面的細胞覆蓋層(皮膚、粘膜和血漿)，包括腺體和其衍生的其它結構，例如角膜、食管、表皮和毛囊上皮細胞。其它舉例性的上皮組織包括嗅覺上皮，其是鼻腔嗅覺區(qū)內層的假分層上皮并含有嗅覺受體；腺上皮，其指由分泌細胞組成的上皮；鱗狀上皮，其指由平板狀細胞組成的上皮。術語上皮還可指過渡上皮，其在經(jīng)歷由于收縮和膨脹所致的巨大機械變化的中空器官中呈特征性分布，例如代表分層的鱗狀上皮和柱形上皮之間的過渡的組織。
術語“上皮化”指由覆蓋裸露表面的上皮組織的生長所致的愈合。
術語“皮膚”指機體的外部保護層，由真皮和表皮組成，并理解為包括汗腺和皮脂腺以及毛囊結構。在本申請中，形容詞“皮膚的”根據(jù)使用時的上下文，可以并且應該理解為通指皮膚的附屬物。
術語“表皮”指皮膚的最外部的非血管層，其衍生自胚胎外胚層，厚度為0.07-1.4mm。在手掌和腳底表面，其從外向內包括5層由垂直排列的柱形細胞組成的基層；由具有短隆起或突起的扁平多面體細胞組成的棘細胞或突起層；由扁平顆粒細胞組成的顆粒層；由幾層清晰透明的細胞組成的透明層，該細胞的細胞核不清楚或無細胞核；由扁平的角化的無核細胞組成的角狀層。在一般的機體表面的表皮中，通常無透明層。
“真皮(conum)”或“真皮(dermis)”指表皮之下的皮膚層，其由致密的血管結締組織層組成，并含有神經(jīng)和感覺的終末器官。毛根和皮脂腺和汗腺是深埋在真皮中的表皮結構。
術語“指甲”指在手指或腳趾遠端的背面上的角狀皮板。
術語“表皮腺體”指與表皮相關的細胞的集合體，其特異分泌或排泄與其通常代謝需要無關的物質。例如“皮脂腺”是分泌油性物質和皮脂的真皮中的全泌腺體。術語“汗腺”指位于真皮或皮下組織中通過一導管在體表開放的分泌汗液的腺體。
術語“毛發(fā)”指線狀結構，特別是由角蛋白組成的從真皮中的乳頭凹陷中發(fā)育的特異表皮結構，其僅由哺乳動物并是該類動物的特征，另外，該術語還指這種毛發(fā)的集合體?！懊摇敝腑h(huán)繞毛發(fā)的表皮的一個個管狀內陷，從中長出毛發(fā)；“毛囊上皮細胞”指環(huán)繞毛囊中的真皮乳頭的上皮細胞，例如干細胞，外根鞘細胞，基質細胞和內根鞘細胞。這種細胞可以是正常的非惡性細胞或轉化/永生細胞。
術語“鼻上皮組織”指鼻和嗅覺上皮。
“切割創(chuàng)傷”包括皮膚上皮層的撕裂傷、擦傷、切口、刺傷或破口并可延伸至真皮層，甚至延伸至皮下脂肪及以下。切割創(chuàng)傷可產生自手術程序或產生自皮膚的偶然刺破。
“燒傷”指由于熱和/或化學試劑導致個體的大面積皮膚移位或喪失的情況。
“真皮潰瘍”指組織的表面喪失導致的皮膚損害，通常伴有炎癥?？梢酝ㄟ^本發(fā)明方法治療的真皮潰瘍包括褥瘡潰瘍、糖尿病潰瘍、靜脈郁滯潰瘍和動脈潰瘍。褥瘡創(chuàng)傷指長期施向皮膚區(qū)域的壓力所致的慢性潰瘍。這種創(chuàng)傷通常稱為褥瘡(bedsore或pressuresore)。靜脈郁滯潰瘍由缺陷靜脈得到血液或其它流體的停滯導致。動脈潰瘍指血液流動差的動脈周圍區(qū)域中的壞死皮膚。
“牙組織”指口腔中的類似上皮組織的組織，例如牙齦組織。本發(fā)明的方法可用于治療牙周病。
“內部上皮組織”指機體內側的組織，其具有與皮膚的表皮層類似的特征。例子包括腸道內層。本發(fā)明方法可用于促進某些內傷如手術創(chuàng)傷的愈合。
“眼組織的創(chuàng)傷”指嚴重的干眼綜合征，角膜潰瘍和擦傷及眼科手術創(chuàng)傷。
在本申請中，術語“增殖性皮膚失調”指以皮組織的不希望或異常增殖為標志的任何皮膚疾病/失調。典型地這些狀態(tài)的特征在于表皮細胞增殖或不完全細胞分化，并包括，例如，X-連鎖魚鱗癬、銀屑病、特應性皮炎、過敏性接觸性皮炎、表皮溶解性角化過度癥和脂溢性皮炎。例如，表皮發(fā)育不良是表皮發(fā)育不全的一種形式。另一個例子是“表皮溶解”，其指表皮的一種松解狀態(tài)，自發(fā)或在外傷部位形成小泡或皺褶。
術語“癌”指由趨于滲透周圍組織并產生轉移的上皮細胞組成的惡性新的生長。癌的例子包括“基細胞癌”，其是一種皮膚的上皮腫瘤，其盡管很少轉移，但是具有局部侵襲和破壞的潛力；“鱗狀細胞癌”，其指從魚鱗狀上皮產生的癌并具有立方形細胞；“癌肉瘤”，其包括由癌性和肉瘤性組織組成的惡性腫瘤；“腺囊性癌”，其是以由小上皮細胞巢或索分離或環(huán)繞的透明或粘質基質柱或條為標志的癌，其在乳腺和唾液腺以及呼吸道的粘液腺中發(fā)生；“表皮樣癌”，其指趨于以與表皮相同方式分化的癌細胞，即它們易于形成棘細胞并發(fā)生角化；“鼻咽癌”，其指在鼻后空間的被覆上皮中產生的惡性腫瘤；“腎細胞癌”，其涉及由各種排列的管狀細胞組成的腎實質的癌癥。另一種癌性上皮生長是“乳頭瘤”，其是從上皮衍生的良性腫瘤，乳頭瘤病毒是其致病因子；以及“表皮樣瘤”，其指在神經(jīng)溝閉合時包含了外胚層元件而形成的腦腫瘤或腦膜腫瘤。
如本文所用，術語“銀屑病”指改變皮膚的調控機制的過度增殖性皮膚失調。特別是，形成的損害涉及表皮增殖的初級和二級改變，皮膚的炎性應答以及調控分子如淋巴因子和炎性因子的表達。銀屑病皮膚的形態(tài)學特征是表皮細胞更新加快、表皮增厚、異常角質化、炎性細胞滲透進真皮層以及多形核白細胞滲透進表皮層導致基細胞循環(huán)增加。另外，存在角化過度細胞和角化不全細胞。
術語“角化病”指以表皮的角質層的增生為特征的增殖性皮膚失調。舉例性的角化病包括濾泡角化病(keratosis follicularis)、手掌腳底角化病、咽角化病、毛發(fā)角化病和光化性角化病。
如本文所用，“增殖”指進行有絲分裂的細胞。
如本文所用，“轉化細胞”指自發(fā)轉變成不受限制地生長狀態(tài)的細胞，即細胞獲得了在培養(yǎng)中無限次分裂而生長的能力。針對其喪失了生長控制，轉化細胞可用如致瘤性、退行性和/或增生性來表征。
如本文所用，“無限增殖化細胞”指經(jīng)化學和/或重組手段改變從而具有在培養(yǎng)中經(jīng)無限次分裂而生長的能力的細胞。
用本發(fā)明方法治療的“患者”或“個體”可以是人或非人動物。
術語“美容制劑”指配制用于局部施用的藥物制劑形式。
針對本發(fā)明治療方法，例如hedgehog治療劑的“有效量”指制劑中例如hedgehog多肽的量，當作為所需的劑量方案的一部分施用時能改變細胞的增殖速率和/或細胞的分化狀態(tài)從而根據(jù)待治療的失調的臨床可接受的標準或美容目的產生一定量的上皮細胞增殖。
細胞的“生長狀態(tài)”指細胞的增殖速率和細胞的分化狀態(tài)。
“同源性”和“相同性”均指兩個多肽序列間的序列相似性，相同性是更嚴格的比較。同源性和相同性可通過比較每個序列中的可用于對比的位置而確定。當比較序列中的位置由相同氨基酸殘基占據(jù)時，則該兩個多肽可以被稱為在該位置相同；當?shù)葍r位點由相同氨基酸(例如，相同)或相似氨基酸(例如，空間和/或電子性質相似)占據(jù)時，則該兩個分子可被稱為在該位置是同源的。序列間的同源性或相同性百分比是序列間共享的匹配或同源位置數(shù)的函數(shù)。“不相關”或“非同源”序列與本發(fā)明的AR序列共享少于40％的相同性，優(yōu)選少于25％相同性。
術語“相應于”，當指特定的多肽或核酸序列時，意味著感興趣的序列與據(jù)稱其與之相應的參照序列相同或同源。
術語“重組蛋白質”、“異源蛋白質”和“外源蛋白質”在說明書中互換使用，指由重組DNA技術產生的多肽，其中通常編碼該多肽的DNA被插入合適的表達構建體中，該表達構建體被用于轉化宿主細胞以產生異源蛋白質。即，多肽是從異源核酸表達的。
“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是編碼hedgehog多肽的第一個氨基酸序列與限定異于hh蛋白的任何結構域或基本上與之不同源的一個結構域的第二個氨基酸序列的融合體。嵌合蛋白可存在一外源結構域，該結構域在也表達第一個蛋白質的生物體中發(fā)現(xiàn)(但在不同的蛋白質中)，或者其可以是由不同種生物體表達的蛋白質結構的“種間”、“基因間”等融合體。通常，融合蛋白可由通式(X)n-(hh)m-(Y)n表示，其中hh代表hedgehog代表的全部或部分，X和Y各自獨立地代表不是天然發(fā)現(xiàn)與hedgehog序列相鄰的多肽鏈的氨基酸序列，m是大于或等于1的整數(shù)，n獨立地代表0或大于或等于1的整數(shù)(n和m優(yōu)選地不大于5或10)。Ⅲ．方法和組合物的舉例應用本發(fā)明方法對于影響上皮組織的失調的治療和預防以及美容應用具有廣泛的實用性。概括地，本發(fā)明方法的特征在于包括給予動物有效改變所處理的上皮組織的增殖狀態(tài)量的ptc或hedgehog治療劑的步驟。給藥方式和劑量方案將根據(jù)待處理的上皮組織而變化。例如，當所處理的組織是表皮組織如真皮或粘膜組織時，優(yōu)選局部配制品。類似地，如下所詳述的，特定ptc或hedgehog治療劑的應用，例如興奮劑或拮抗劑，將取決于所處理的組織的細胞的增殖是所需的還是需防止的。
“促進創(chuàng)傷愈合”的方法由于治療而導致比不治療的類似創(chuàng)傷愈合更快的創(chuàng)傷愈合?！按龠M創(chuàng)傷愈合”也可指該方法導致特別是角質細胞的增殖和生長，或者創(chuàng)傷愈合伴有較小疤痕、較少創(chuàng)傷收縮、較少膠原沉積和較大表面積。在某些情況下，當與本發(fā)明的方法一起應用時，“促進創(chuàng)傷愈合”還可指創(chuàng)傷愈合的某些方法具有改進的成功率(例如，皮膚移植的愈合率)。
并發(fā)癥是未完全愈合并仍開放的創(chuàng)傷的一經(jīng)常的危險。盡管大多數(shù)創(chuàng)傷不經(jīng)治療會很快愈合，但是某些類型的創(chuàng)傷拒絕愈合。覆蓋大面積的創(chuàng)傷也會長時間保持開放。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明方法可用于加速涉及上皮組織的如由于手術、燒傷、炎癥或刺激產生的創(chuàng)傷的愈合。本發(fā)明的某些hedgehog和ptc治療配方(例如，增殖形式)也可預防性施用，如以美容制劑形式施用以促進例如皮膚、毛發(fā)和/或指甲的組織再生過程。
盡管重建手術技術取得了顯著的進展，但是疤痕仍然是愈合皮膚重新獲得正常功能和表觀的重要障礙。當病理性疤痕如手或面部的疤痕疙瘩或肥大疤痕導致功能障礙或生理變形時尤其如此。在最嚴重的情況下，這種疤痕可使人陷入心理憂傷和經(jīng)濟困境。創(chuàng)傷修復包括止血、炎癥、增殖和重建階段，增殖階段涉及成纖維細胞、內皮細胞和上皮細胞的繁殖。通過使用本發(fā)明方法，創(chuàng)傷內和接近創(chuàng)傷的上皮細胞的增殖速率可被控制以加速創(chuàng)傷的閉合和/或使疤痕組織形成最小化。
全部和部分深度燒傷是經(jīng)常覆蓋大面積的創(chuàng)傷類型的例子并因此需要很長時間來愈合。結果是，經(jīng)常發(fā)生危及生命的并發(fā)癥如感染和喪失體液。另外，燒傷愈合通常是無序的，導致疤痕和破相。在某些情況下，由過量膠原沉積所致的創(chuàng)傷收縮導致創(chuàng)傷附近的肌肉活動性降低。本發(fā)明的組合物和方法可被用于加速燒傷愈合速率并促進愈合過程，導致更希望的美容效果并降低創(chuàng)傷收縮，減少疤痕。
大面積嚴重燒傷經(jīng)常通過從患者身體的未損壞部位進行皮膚自體移植而治療。本發(fā)明方法也可以與皮膚移植一起使用以通過加速移植皮膚和接近移植物的患者皮膚的生長而改善移植的“愈合”率。
皮膚潰瘍是適用于經(jīng)本發(fā)明方法例如使?jié)冇虾?或防止?jié)兂蔀槁詣?chuàng)傷而治療的另一個創(chuàng)傷例子。例如，患有糖尿病的個體中7個中有1個會在其肢體發(fā)生皮膚潰瘍，其很易于感染。患有感染性糖尿病性潰瘍的個體經(jīng)常需要住院、護理、昂貴的抗生素，并且在某些情況下需截肢。皮膚潰瘍如由于靜脈疾病(靜脈郁滯性潰瘍)、過度壓迫(褥瘡潰瘍)和動脈潰瘍所致皮膚潰瘍也拒絕愈合?，F(xiàn)有技術的治療通常限制在保護創(chuàng)傷、避免感染以及在某些情況下經(jīng)血管手術重建血流。根據(jù)本發(fā)明方法，皮膚受損區(qū)可通過包括hedgehog或ptc治療劑的療法治療，這種治療劑促進創(chuàng)傷上皮化，例如加速皮膚潰瘍的愈合速率。
本發(fā)明治療法還可以作為治療方案的一部分以有效治療口腔潰瘍和非口腔(paraoral)潰瘍，例如由放療和/或化療導致的潰瘍。這種潰瘍通常在化療或放療后幾天內發(fā)生，并且開始時通常是小的疼痛的無規(guī)則形狀損害，通常被易破的灰白壞死膜覆蓋并并炎性組織環(huán)繞。在許多情況下，缺少治療會導致?lián)p害周圍的組織呈炎性增殖。例如，潰瘍周圍的上皮通常具有增殖活性，導致表面上皮的完整性喪失。這些損害由于其大小和表皮完整性喪失使機體易于受潛在的繼發(fā)感染。食物和水的常規(guī)攝入變成一非常疼痛的過程，并且如果潰瘍增殖至消化道，通常發(fā)生痢疾，并伴有其所有并發(fā)癥。根據(jù)本發(fā)明，包括施用hedgehog治療劑的這種潰瘍的治療法可降低受損上皮的異常增殖和分化，有助于降低后續(xù)炎癥的嚴重性。
在另一個舉例性實施方案中，本發(fā)明方法提供用于治療或防止胃腸道疾病。簡單地說，許多疾病與胃腸道上皮或絨毛的破壞有關，包括化療和放療誘導的腸炎(即腸道毒性)和粘膜炎，消化道潰瘍病，胃腸炎和結腸炎，絨毛萎縮失調等。例如，在骨髓移植和癌癥治療中使用的化療藥劑和放療損害造血組織和小腸中的快速增殖細胞，導致嚴重的和通常為劑量限制性的毒性。小腸粘膜屏障的損害導致嚴重并發(fā)癥即出血和膿毒癥。本發(fā)明方法可用于促進胃腸道上皮的增殖，從而增加放療和化療劑的耐受劑量。胃腸道疾病的有效治療可以通過幾種標準確定，包括腸炎分值，以及現(xiàn)有技術中已知的其它測試法。
本發(fā)明方法和組合物還可用于治療皮膚病產生的創(chuàng)傷，如自身免疫疾病如銀屑病產生的損害。特應性皮炎指與由過敏原如花粉、食物、頭皮屑、昆蟲毒液和植物毒素引起的免疫應答相關的過敏產生的皮膚損傷。
隨著年齡的增長，表皮變薄，皮膚附件萎縮。毛發(fā)稀疏，皮脂分泌降低，結果易于干燥、皸裂和開裂。隨著喪失彈性和膠原纖維，真皮變薄。另外，角質細胞增殖(其是皮膚厚度和皮膚增殖能力的指標)隨年齡增加而降低。據(jù)信角質細胞增殖的增加能抵銷皮膚老化即皺紋、厚度、彈性和修復。根據(jù)本發(fā)明，可治療或美容應用hedgehog或ptc治療劑的增殖形式以至少在一段時間抵銷皮膚的老化。
本發(fā)明方法還可用于治療眼組織創(chuàng)傷。通常，角膜組織的損傷，無論是疾病、手術或受傷，根據(jù)創(chuàng)傷的性質，其可影響上皮和/或內皮細胞。角膜上皮細胞是位于角膜外表面的非角質化上皮細胞并提供抗外界環(huán)境的保護屏障。角膜創(chuàng)傷愈合受到臨床醫(yī)生和研究人員的關注。眼科醫(yī)生經(jīng)常面對角膜營養(yǎng)不良和疑難損傷，其導致持久復發(fā)性上皮糜爛，經(jīng)常導致永久性內皮喪失。在這些情況下可應用本發(fā)明的hedgehog和/或其它ptc治療劑的增殖形式以促進受損角膜組織的上皮化。
為進一步說明，與眼部的上皮細胞損害典型相關并且可用本發(fā)明方法有效治療的具體疾病包括持續(xù)性角膜上皮缺陷，復發(fā)性糜爛，神經(jīng)營養(yǎng)性角膜潰瘍，干燥性角結膜炎，微生物性角膜潰瘍，病毒性角膜潰瘍等。典型地導致對上皮細胞層的損傷的手術程序包括在眼表面進行的激光程序，任何屈光矯正手術程序如放射狀角膜切開術和散光角膜切開術，結膜瓣，結膜移植，表層角膜成形術(epikeratoplasty)和角膜刮除術。另外，淺層創(chuàng)傷如刮傷、表面糜爛、炎癥等可導致上皮細胞的喪失。根據(jù)本發(fā)明，將角膜上皮與有效導致角膜上皮細胞增殖量的ptc或hedgehog治療劑接觸以合適地愈合創(chuàng)傷。
在其它實施方案中，hedgehog或ptc治療劑的抗增殖制劑可用于抑制晶狀體上皮細胞增殖以防止白內障囊外摘除術后并發(fā)癥。白內障是難治的眼疾，目前已進行了治療白內障的各種研究。但是目前對白內障的治療通過外科手術進行。白內障手術已應用了很長時間并且已檢查了各種手術方法。囊外晶狀體摘除術是去除白內障的一種方法。這一技術相對于囊內摘除術的主要醫(yī)學優(yōu)點是無晶狀體性囊樣黃斑水腫和視網(wǎng)膜脫離的發(fā)生率較低。囊外摘除術也是后房型人工晶狀體移植所需的，該后房型人工晶狀體目前被認為是大多數(shù)病例中所需的晶狀體。
但是，白內障囊外摘除術的一個缺點是晶狀體后囊混濁一通常稱為繼發(fā)性白內障－的發(fā)生率高，在手術后3年內發(fā)生率高達50％。繼發(fā)性白內障是由于囊外晶狀體摘除后仍保留的赤道部和前囊晶狀體上皮細胞的增殖所致。這些細胞的增殖導致Sommerling環(huán)，其與也沉積和發(fā)生在后囊上的成纖維細胞一起導致后囊混濁，由此影響視力。防止繼發(fā)性白內障是治療所優(yōu)選的。為防止白內障的二次形成，本發(fā)明方法提供了抑制保留的晶狀體上皮細胞增殖的手段。例如，通過在晶狀體摘除后向眼的前房注入含有抗增殖性hedgehog或ptc治療劑制劑可誘導這些細胞保持靜止。另外，可使該溶液等滲平衡以在注入眼的前房時提供最小的有效劑量，從而以一定的特異性抑制囊下上皮的生長。
本發(fā)明方法還可用于治療以角膜上皮細胞增殖為標志的角膜病，例如治療眼球上皮失調如眼球表面的上皮向下生長或鱗狀細胞癌。
來自體內的組織和器官的保持也是非常希望的。在治療人類疾病中已發(fā)展成熟組織置換療法。例如，在1996年美國進行了超過4萬例角膜移植。人表皮細胞可體外生長并用于植入燒傷部位和慢性皮膚潰瘍和其它皮膚創(chuàng)傷。本發(fā)明方法可用于加速體外上皮組織的生長，以及加速培養(yǎng)的上皮組織向動物宿主的移植。
本發(fā)明方法可用于改善皮膚移植物的“愈合速率”。如果移植物的愈合速率很長，則表皮組織的移植物可起泡和剪切，降低自體移植物“愈合”，即粘附于創(chuàng)傷并形成下面為顆粒組織的基底膜的幾率。通過誘導角質細胞的增殖本發(fā)明方法可增加愈合速率。增加愈合速率的方法包括將皮膚自體移植物與創(chuàng)傷愈合有效量的hedgehog或ptc治療劑組合物接觸，這種組合物如上所述在促進創(chuàng)傷愈合的方法和促進角質細胞的生長和增殖的方法中有描述。
皮膚等同物具有許多用途，不僅可作為人或動物皮膚的置換物用于皮膚移植，也可用作測試皮膚以確定藥物物質和美容品在皮膚上的效果。藥物學、化學和美容測試的一個主要困難是很難確定產品在皮膚上的效果和安全性。本發(fā)明的皮膚等同物的一個優(yōu)點在于它們可作為體外測試這些物質在測試皮膚上產生的效果的指示。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明方法可用作例如裸露區(qū)、肉芽創(chuàng)傷和燒傷的皮膚移植方案的一部分。增殖性hedgehog和/或ptc治療劑的應用可促進移植技術如分裂厚度自體移植和表皮自體移植(培養(yǎng)的同源角質細胞)和表皮同種異體移植(培養(yǎng)的異源角質細胞)。在同種異體移植情況下，應用本發(fā)明方法以促進培養(yǎng)物中形成皮膚等同物有助于提供/保持這種移植物的穩(wěn)定供應(例如，在組織庫中)，從而患者可在一個程序中用能產生永久愈合的材料覆蓋。
為此，本發(fā)明還涉及復合活皮膚等同物，其包括培養(yǎng)的角質細胞的表皮層，該角質細胞已用hedgehog或其它ptc治療劑處理而擴增。本發(fā)明方法可用作制備復合活皮膚等同物的方法的一部分。在一示意性實施方案中，這種方法包括獲得一皮膚樣品，酶處理該皮膚樣品以將表皮與真皮分離，酶處理表皮以釋放角質細胞，在hedgehog或ptc治療劑的存在下培養(yǎng)表皮角質細胞直至鋪滿，同時，或單獨地，酶處理真皮以釋放成纖維細胞，培養(yǎng)該成纖維細胞直至亞鋪滿，用培養(yǎng)的成纖維細胞接種多孔交聯(lián)膠原海綿膜，在其表面培養(yǎng)該接種的膠原海綿以使成纖維細胞生長貫通膠原海綿，然后用培養(yǎng)的角質細胞接種該膠原海綿，進一步在hedgehog或ptc治療劑的存在下培養(yǎng)該復合皮膚等同物復合物以促進細胞的生長。
在其它實施方案中，可在培養(yǎng)物中分離含有上皮和間充質層的皮膚片并用補加增殖形式的hedgehog或ptc治療劑的培養(yǎng)基擴增。
適于細胞培養(yǎng)技術的任何皮膚樣品均可用于本發(fā)明。該皮膚樣品可以是同源或異源的。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明方法可與各種希望控制牙周組織中或牙周組織周圍的上皮細胞增殖的牙周程序結合應用。
在一個實施方案中，增殖形式的hedgehog和ptc治療劑可用于促進天然牙和假牙周圍的再上皮化，例如，促進牙齦組織的形成。
在另一實施方案中，抗增殖性ptc治療劑可用于治療牙周疾病。估計僅在美國就有超過1億2千5百萬成人患有各種形式的牙周疾病。牙周疾病的起因是由于位于牙齦與牙齒附著的區(qū)域中的特殊細菌導致的炎癥損害。通常最先發(fā)生的是下面的結締組織的血管變化，結締組織的炎癥刺激牙溝的上皮層和上皮附件中的下列變化在基底上皮層中的有絲分裂活性增加；增加產生脫落的角蛋白；牙齒表面相鄰的細胞脫落易于加深缺口；牙溝底部的基層的上皮細胞和附件區(qū)的上皮細胞增殖進入結締組織，且牙齦纖維開始發(fā)生斷裂，其中結締組織的溶解導致形成開放的損害。施用hedgehog制劑至牙周可用于一種上皮組織的增殖，因而進一步防止牙周潰壞的發(fā)展。
在另一方面，本發(fā)明方法可用于輔助控制定向組織再生，如當與可生物再吸收的材料一起使用時。例如，通過本方法可促進牙周移植物如假牙的摻入。牙齒的再附著涉及結締組織纖維的形成和牙袋的再上皮化。本發(fā)明治療方法可通過在創(chuàng)傷愈合的早期階段控制基底上皮細胞的有絲分裂功能而用于加速組織再附著。
本發(fā)明的另一方面涉及用hedgehog治療劑制劑控制毛發(fā)生長。毛發(fā)基本上由一種粗糙不溶的蛋白質角蛋白組成；其主要強度取決于其胱氨酸二硫鍵。單根毛發(fā)包括柱狀毛干和毛根，并包含在毛囊中，毛囊是皮膚中的瓶狀凹坑。毛囊底部含有指狀突出物，稱為乳頭，乳頭由長出毛發(fā)的結締組織組成，通過乳頭血管提供營養(yǎng)給細胞。毛干是延伸出皮膚表面的部分，而毛根則被描述為毛發(fā)的埋藏部分。毛根的基部延伸進位于乳頭上的毛球中。產生毛發(fā)的細胞在毛囊的毛球中生長，隨著細胞在毛囊中增殖，它們以纖維形式突出。毛發(fā)“生長”指通過分裂細胞所致的毛發(fā)纖維的形成和伸長。
如本領域所熟知的，通常的毛發(fā)循環(huán)分成3個階段生長期、退化期和末期。在活性期(生長期)，真皮乳頭的表皮干細胞快速分裂，子代細胞向上移動并分化形成毛發(fā)本身的同心層。過渡期即退化期的標志是毛囊中的干細胞停止有絲分裂。靜止期又稱為末期，在此期間毛發(fā)在頭皮上保留幾個星期，隨后在其之下發(fā)育出現(xiàn)的新毛發(fā)將末期毛干從其毛囊中驅除出去。根據(jù)這一模式，很明顯的是分化成毛發(fā)細胞的分裂干細胞群越大，毛發(fā)生長越多。因此，通過分別增強或抑制這些干細胞的增殖可進行增加或降低毛發(fā)生長的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明方法提供了改變毛發(fā)生長周期動力學以誘導毛囊細胞特別是毛囊的干細胞的增殖的手段。本發(fā)明的組合物和方法可用于例如通過促進毛囊干細胞的增殖而在溫血動物如人中增加毛囊大小以及毛發(fā)生長速率。在一個實施方案中，所述方法包括向希望生長毛發(fā)的皮膚區(qū)域施用足以在動物中增加毛囊大小和/或毛發(fā)生長速率的量的hedgehog或ptc治療劑。典型地，組合物以霜劑局部施用，并且每天施用直至觀察到長出毛發(fā)，之后繼續(xù)施用一段時間以足以保持所需量的毛發(fā)生長。這一方法可用于促進新發(fā)生長或刺激毛發(fā)生長的速率，例如在化療后或用于治療各種形式的禿頭癥，例如雄性模式禿頭。例如，患有雄激素性禿頭癥的個體在生長期或退化期發(fā)生的幾種生物化學細胞學和分子學失調中的一種可通過，例如在干細胞起作用或形成中，它們的遷移過程或在毛囊乳頭和基質內產生角蛋白的有絲分裂期過程中，用本發(fā)明方法治療而矯正或改善。
在其它實施方案中，相對于傳統(tǒng)的剪、剃或拔去毛方法，可采用某些hedgehog和ptc治療劑(例如抗增殖形式)作為降低人毛發(fā)生長的方式。例如，本發(fā)明方法可用于治療以異?？焖倩驖饷苊l(fā)生長為特征的毛發(fā)病，例如多毛癥。在一個舉例性實施方案中，hedgehog拮抗劑可用于處理多毛癥，其是以異常多毛為標志的疾病。本發(fā)明方法還可提供延長脫毛時間的方法。
另外，由于hedgehog拮抗劑(或ptc興奮劑)通常對于上皮細胞有細胞抑制性而非細胞毒性，因此這種制劑可用于保護毛囊細胞抗細胞毒性劑。細胞毒性劑需進入細胞周期的S-期才起作用，例如放射誘導的死亡。用本發(fā)明方法治療可通過使毛囊細胞變?yōu)殪o止而提供保護，例如，通過抑制細胞不進入S期，從而防止毛囊細胞進行有絲分裂災變或程序性細胞死亡。例如，進行化療或放療的通常導致脫發(fā)的患者可使用hedgehog拮抗劑。通過在這類療法中抑制細胞周期進程，本發(fā)明治療法可保護毛囊細胞不死亡，否則會由于細胞死亡程序的激活而死亡。化療或放療結束后，可除去hedgehog或ptc療法以解除對毛囊細胞增殖的抑制。
本發(fā)明方法還可用于治療毛囊炎，如脫發(fā)性毛囊炎、網(wǎng)狀萎縮性紅斑性毛囊炎或疤痕疙瘩性毛囊炎。例如，在治療假毛囊炎時可局部施用hedgehog治療劑的一種美容制劑，假毛囊炎是一種通常在頸部的下頜下區(qū)發(fā)生并與剃須有關的慢性病，其特征性損害為紅斑性丘疹和含有埋藏的毛發(fā)的膿皰。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的hedgehog和ptc治療劑的抗增殖形式可用于誘導上皮衍生組織的分化。這種形式的這些分子可提供用于治療涉及上皮組織的增生和/或瘤形成的分化療法的基礎。例如，這種制劑可用于治療皮膚細胞異常增殖或生長的皮膚病。
例如，本發(fā)明的藥物制劑可用于治療增生性表皮癥狀如角化病，以及用于治療瘤形成表皮癥狀，如以高增殖速率為特征的癥狀，如各種皮膚癌，例如基層細胞癌或鱗狀細胞癌。本發(fā)明方法還可用于治療感染皮膚的自身免疫疾病，特別是涉及表皮的病態(tài)增殖和/或角質化的皮膚病，如由銀屑病或特應性皮病引起的皮膚病。
許多常見皮膚病如銀屑病、鱗狀細胞癌、角化棘皮瘤和光化性角化病的特征在于局部異常增殖和生長。例如，在銀屑病中，該病的特征是皮膚上有鱗屑性紅色凸出的斑，已知角質細胞的增殖比正?？煸S多，且分化不完全。
在一個實施方案中，本發(fā)明的制劑適于治療與導致皮膚細胞的異常增殖的角化病連鎖的皮膚病，所述角化病可有炎性組分或非炎性組分。舉例來說，例如促進靜止或分化的ptc興奮劑的治療制劑可用于治療各種形式的銀屑病，包括皮膚、粘膜或是指(趾)甲的銀屑病。如上所述，銀屑病的典型特征在于表皮角質細胞，其隨“再生”途徑顯示顯著的增殖活化和分化。用本發(fā)明的抗增殖性實施方案的治療可用于逆轉病理性表皮活化并可提供持續(xù)減輕該病的基礎。
各種其它角化病損害也是用本發(fā)明抗增殖性制劑治療的候選者。光化性角化病，例如，是在日曬和受輻射的皮膚上產生的淺層炎性惡化前腫瘤，該損害是紅斑狀至棕色，伴有可變的鱗屑。目前的療法包括切除術和冷凍破壞法。但這些治療是疼痛的，且經(jīng)常產生美容上不能接受的疤痕。因此，角化病如光化性角化病的治療可包括優(yōu)選局部應用足以抑制損害的表皮/表皮樣細胞的過度增殖的量的ptc興奮劑組合物。
痤瘡是另一種可用本發(fā)明方法的抗增殖性實施方案治療的皮膚病。例如尋常痤瘡是通常在十幾歲少年和年輕人中發(fā)生的多因子疾病，其特征是在面部和上軀干上的炎性和非炎性損害表觀。導致尋常痤瘡的基本缺陷是活動過強的皮脂腺導管的角化過度，角化過度阻礙了皮膚和毛囊微生物的正常遷移，由此刺激痤瘡丙酸桿菌和表皮葡萄球菌以及卵瓶形酵母釋放脂酶。用hedgehog或ptc治療劑的抗增殖形式特別是局部制劑治療可防止導管的暫時特征，例如導致?lián)p害形成的角化過度。本發(fā)明治療方法還可進一步包括例如抗生素、類維生素A和抗雄激素。
本發(fā)明還提供了治療各種皮炎的方法，皮炎是指不易劃界的損害的一種描述性術語，這種損害是瘙癢的、紅斑狀、起鱗屑的、起皰的、有滲出的、開裂的或結痂的。這些損害的起因各種各樣。最常見的皮炎類型是特應性、接觸性和尿布皮炎。例如，皮脂溢性皮炎是在各種區(qū)域通常是頭皮上的慢性通常瘙癢的皮炎，具有紅斑，干、濕或滑膩的鱗屑以及黃色結痂塊，過量干鱗屑表皮脫落的是停滯性皮炎，其是一種通常為慢性的經(jīng)常是濕疹性皮炎。光化性皮炎是由于暴露于光化性輻射如日光、紫外光或X射線或γ射線導致的皮炎。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的hedgehog或ptc治療劑制劑可用于治療和/或防止由上皮細胞的不希望的增殖導致的皮炎的某些癥狀。各種皮炎的這種療法還可包括局部和系統(tǒng)性應用皮質類固醇、止癢藥和抗生素。
可用本發(fā)明方法治療的疾病還包括非人類特異的疾病如獸疥癬。Ⅳ．舉例性的hedgehog治療劑化合物本發(fā)明方法的hedgehog治療劑組合物可通過各種技術產生，包括天然蛋白質的純化，重組產生的蛋白質和合成化學。hedgehog治療劑的多肽形式優(yōu)選地從脊椎動物hedgehog蛋白衍生，例如具有相應于來自脊椎動物的天然hedgehog蛋白質或其片段的序列。但是，應理解的是hedgehog多肽可相應于在任何后生動物中發(fā)生的hedgehog蛋白(或其片段)。
可衍生本發(fā)明的治療劑的各種天然hedgehog蛋白的特征是一信號肽、一高度保守的N-末端區(qū)以及一較不同的C-末端結構域。除了在分泌途徑信號序列裂解之外(Lee,J.J.等(1992)細胞71:33-50；Tabata,T.等(1992)基因發(fā)育2635-2645；Chang,D.E.等(1994)發(fā)育120:3339-3353),hedgehog前體蛋白天然發(fā)生基于C-末端部分的保守序列的內部自我蛋白酶解(Lee等(1994)科學266:1528-1537；Porter等(1995)自然374:363-366)。這一自我裂解導致產生一19kDN-末端肽和-26-28kD C-末端肽(Lee等(1992)文獻同上；Tabata等(1992)文獻同上；Chang等(1994)文獻同上；Lee等(1994)文獻同上；Bumcrot,D.A.等(1995)分子細胞生物學15:2294-2303；Porter等(1995)文獻同上；Ekker,S.C.等(1995)當前生物學5:944-955；Lai,C.J.等(1995)發(fā)育121:2349-2360)。N-末端肽保持與合成其的細胞表面緊密相連，而C-末端肽可在體外和體內自由擴散(Lee等(1994)文獻同上；Bumcrot,D.A.等(1995)文獻同上；Mart＇,E.等(1995)發(fā)育121:2537-2547；Roelink,H.等(1995)細胞81:445-455)。N-末端肽在細胞表面的停留取決于自我裂解，因為由在內部裂解的正常位置精確終止的RNA編碼的一種截短形式的hedgehog在體外(Porter等(1995)文獻同上)和體內(Porter,J.A.等(1996)細胞86,21-34)是可擴散的。生物化學研究表明hedgehog前體蛋白的自我酶解經(jīng)一內部硫酯中間體進行，該中間體隨后在一親核取代中被裂解。提示親核物質是一小的親脂性分子，更具體地是膽固醇，其與N-肽的C-末端共價結合(Porter等(1996)文獻同上)，使該肽與細胞表面粘連。
hedgehog基因的脊椎動物家族包括至少4個成員，例如單果蠅hedgehog基因(SEQ ID NO:19)的平行進化同源基因。這些成員中的三個，本文稱為Desert hedgehog(Dhh),Sonic hedgehog(Shh)和Indian hedgehog(Ihh)，明顯存在于所有脊椎動物中，包括魚類、鳥類和哺乳類中。第四個成員，本文稱為tiggie-winkle hedgehog(Thh)，看起來是特異于魚類的。根據(jù)所附序列表(也見表1)，雞的Shh多肽由SEQ ID NO:1編碼；小鼠的Dhh多肽由SEQ ID NO:2編碼；小鼠的Ihh多肽由SEQ ID NO:3編碼；小鼠的Shh多肽由SEQ ID NO:4編碼；斑馬魚的Shh多肽由SEQ ID NO:5編碼；人的Shh多肽由SEQ ID NO:6編碼；人的Ihh多肽由SEQ ID NO:7編碼；人的Dhh多肽由SEQ ID NO:8編碼；斑馬魚的Thh多肽由SEQ ID NO:9編碼。
表1序列表中hedgehog序列指南核苷酸氨基酸雞Shh SEQID NO:1 SEQ ID NO:10小鼠Dhh SEQ ID NO:2SEQ ID NO:11小鼠Thh SEQ ID NO:3SEQ ID NO:12小鼠Shh SEQ ID NO:4SEQ ID NO:13斑馬魚Shh SEQ ID NO:5SEQ ID NO:14人Shh SEQ ID NO:6SEQ ID NO:15人Thh SEQ ID NO:7SEQ ID NO:16人Dhh SEQ ID NO:8SEQ ID NO:17斑馬魚Thh SEQ ID NO:9SEQ ID NO:18果蠅HHSEQ ID NO:19 SEQ ID NO:20除了各種hedgehog同系物之間有序列變異外，明顯地hedgehog蛋白也以各種不同形式天然存在，包括蛋白原形式、全長成熟形式和其幾種加工片段。蛋白原形式包括用于胞外結構域的定向分泌的N-末端信號肽，而全長成熟形式缺少這一信號序列。
如上所述，在某些情況下發(fā)生成熟形式的進一步加工以產生該蛋白的生物學活性片段。例如，sonic hedgehog進行進一步蛋白酶解加工產生約19kDa和27kDa的兩個肽，19kDa片段相應于成熟蛋白的蛋白水解的N-末端部分。
除了蛋白水解片段化之外，脊椎動物hedgehog蛋白也可被翻譯后修飾，如經(jīng)糖基化和/或添加親脂性基元，如展伸(stents)、脂肪酸等，但是該蛋白的細菌產生(例如未修飾的)形式也保持某些天然蛋白的生物活性。本發(fā)明的hedgehog多肽的生物活性片段已產生并在例如PCT出版物WO95/18856和WO96/17924中有詳細描述。
用于衍生hedgehog多肽的親脂性基元范圍很廣。與hedgehog多肽相關時術語“親脂性基團”指具有高碳氫含量從而賦予該基團對脂相的高親和性的基團。例如，親脂性基團可以是具有約7-30個碳的相對較長鏈烷基或環(huán)烷基(優(yōu)選正烷基)基團。烷基基團可以以羥基或伯胺“尾”終止。進一步地，親脂性分子包括天然存在的和合成的芳族和非芳族基元，如脂肪酸、甾醇、酯和醇、其它脂類分子、籠形結構如金剛烷和巴基明斯特富勒烯(buckminsterfullerenes)、以及芳烴如苯、苝、菲、蒽、萘、芘、和并四苯在一個實施方案中，hedgehog多肽被一或多個甾醇基元如膽固醇修飾，例如參見PCT出版物WO96/17924。在某些實施方案中，如果hedgehog多肽相應于天然存在的N-末端蛋白水解片段，膽固醇優(yōu)選加到C-末端甘氨酸上。
在另一實施方案中，hedgehog多肽可被脂肪酸基元如肉豆蔻酰、棕櫚酰、硬脂?；蚧ㄉ南；揎?，例如參見Pepinsky等(1998)生物化學雜志273:14037。
除了將膽固醇加到該蛋白胞外片段的C-末端或將脂肪酸加到N-末端觀察的效果之外，經(jīng)用親脂性基元在蛋白的其它位點衍生該蛋白和/或用除膽固醇或脂肪酸之外的基元衍生該蛋白，hedgehog基因產物的至少某些生物學活性令人意想不到地得以增強。本發(fā)明的某些方面涉及在該蛋白的天然加工形式的N-末端或C-末端外的其它位點被修飾，和/或末端殘基被其它親脂性基元、即除了C-末端用甾醇或N-末端用脂肪酸修飾之外修飾的hedgehog多肽制劑的應用。
特別有用的親脂性分子是脂環(huán)烴、飽和和不飽和脂肪酸和其它脂類和磷脂基元、蠟、膽固醇、類異戊二烯、萜和聚脂環(huán)烴，包括金剛烷和buckminsterfullerenes、維生素、聚乙二醇或寡聚乙二醇、(C1-C18)烷基磷酸二酯、-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-烷基，特別是與芘衍生物的共軛物。親脂性基元可以是適用于本發(fā)明的親脂性染料，包括但不限于，二苯基己三烯、尼羅紅、N-苯基-1-萘胺、Prodan、Laurodan、芘、苝、若丹明、若丹明B、四甲基若丹明、得克薩斯紅、硫代若丹明(sulforhodamine)、1,1′-雙十二烷基-3,3,3′,3′-四甲基靛羰花青過氯酸鹽，十八烷基若丹明B和購自分子探針公司的BODIPY染料。
其它親脂性基元的例子包括脂族羰基基團，包括1-或2-金剛烷基乙?；?，3-甲基金剛烷-1-基乙?；?-甲基-3-溴-1-金剛烷基乙?；?，1-萘烷乙?；?，樟腦乙?；?，莰烷乙酰基，降金剛烷基乙?；?，降冰片烷乙?；h(huán)[2.2.2.]-辛-5-烯乙?；?-甲氧基二環(huán)[2.2.2.]-辛-5-烯-2-羰基，順-5-降冰片烯-內-2,3-二羰基，5-降冰片烯-2-基乙?；?，(1R)-(-)myrtentane乙?；?-降冰片烷乙?；?3-氧-三環(huán)[2.2.1.0<2,6>]-庚烷-7-羰基，癸?；；?，十二碳烯?；?，十四碳二烯酰基，癸炔酰基或十二碳炔?；?。
hedgehog多肽可與疏水性基元以各種方式連接，包括化學偶聯(lián)手段或基因工程。
本領域技術人員已知有許多化學交聯(lián)劑，本發(fā)明優(yōu)選的交聯(lián)劑是異雙官能交聯(lián)劑，其可用于以逐步方式連接hedgehog多肽和疏水性基元。異雙官能交聯(lián)劑提供了設計更特異的綴合蛋白質的偶聯(lián)方法的能力，從而降低不希望的副反應如同源蛋白聚合物的發(fā)生。現(xiàn)有技術中已知各種異雙官能交聯(lián)劑，它們包括琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧基酯(SMCC),m-馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)；N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸(SIAB)，琥珀酰亞胺基-4-(p-馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯(SMPB),1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)；4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-a-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT),N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亞胺基-6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯]己酸酯(LC-SPDP)。具有N-羥基琥珀酰亞胺基元的交聯(lián)劑可以N-羥基磺化琥珀酰亞胺類似物形式獲得，其通常具有較高的水溶性。另外，可以合成在連接的鏈內具有二硫鍵的交聯(lián)劑替代烷基衍生物，從而降低體內連接物裂解的量。
除了異雙官能交聯(lián)劑，還存在各種其它交聯(lián)劑，包括同雙官能交聯(lián)劑和光反應性交聯(lián)劑。用于本發(fā)明的有用的同雙官能交聯(lián)劑的例子包括二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(DSS)，雙馬來酰亞胺基己烷(BMH)和二甲基庚二酰亞胺化物·2HCl(DMP)。用于本發(fā)明的有用的光反應性交聯(lián)劑的例子包括雙-[β-(4-疊氮水楊酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)和N-琥珀酰亞胺基-6(4′-疊氮-2′-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)。蛋白質偶聯(lián)技術的最近綜述見Means等(1990)生物綴合物化學法1:2-12，引入本文作參考。
包括上述物質的一類特別有用的異雙官能交聯(lián)劑含有伯胺反應基團，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，或其水溶性類似物N-羥基磺化琥珀酰亞胺(磺化-NHS)。在堿性pH下的伯胺(賴氨酸ε基團)是非質子化的并經(jīng)親核攻擊在NHS或磺化-NHS酯上反應。這一反應導致形成酰胺鍵，并釋放NHS或磺化-NHS作為副產物。
用作異雙官能交聯(lián)劑一部分的另一反應基團是硫羥反應基團，常見的硫羥反應基團包括馬來酰亞胺、鹵素和吡啶二硫化物。在微酸至中性(pH6.5-7.5)條件下，馬來酰亞胺在幾分鐘內特異地與游離巰基(半胱氨酸殘基)反應。鹵素(碘乙?；倌軋F)在生理pH下與-SH基團反應。這些反應基團均形成穩(wěn)定的硫醚鍵。
異雙官能交聯(lián)劑的第三種組分是間隔臂或橋。橋是連接兩個反應末端的結構。橋的最明顯貢獻是其對立體阻礙的作用。在某些情況下，較長的橋可以更容易地跨越連接兩個復雜生物分子所需的距離，例如，SMPB具有14.5埃的跨度。
用異雙官能試劑制備蛋白質-蛋白質綴合物是涉及胺反應和巰基反應的兩步方法。對于第一步胺反應，所選蛋白質應含有伯胺，這可以是賴氨酸ε胺或在大多數(shù)蛋白質N-末端發(fā)現(xiàn)的α伯胺。該蛋白質不應含游離巰基基團。當待綴合的兩個蛋白質含有游離巰基時，可修飾一個蛋白質以用例如N-乙基馬來酰亞胺阻斷全部巰基(見Partis等(1983)蛋白質化學雜志2:263，引入本文作參考)?？捎肊llman′s試劑計算特定蛋白質中的巰基量(例如見Ellman等(1958)，生物化學生物物理檔案74:443和Riddles等(1979)分析生物化學94:75，引入本文作參考)。
反應緩沖液應不含外來胺和巰基，反應緩沖液的pH應為7.0-7.5，這一pH范圍防止了馬來酰亞胺基團與胺反應，保存馬來酰亞胺基團與巰基進行第二步反應。
含有NHS酯的交聯(lián)劑具有有限的水溶性，在將交聯(lián)劑導入反應混合物之前應將其溶解于少量有機溶劑(DMF或DMSO)中。交聯(lián)劑/溶劑形成乳液，使反應發(fā)生。
磺化-NHS酯類似物水溶性較高，可以直接加入反應緩沖液中。應避免高離子強度的緩沖液，因為它們有“鹽析”出磺化-NHS酯的傾向。為避免由于水解所致的反應性的喪失，在溶解蛋白質溶液后立即將交聯(lián)劑加入到反應混合物中。
在濃蛋白質溶液中反應可以更有效。反應混合物的pH越是堿性，反應速率越快。NHS和磺化-NHS酯的水解速率將隨pH增加而提高。較高的溫度將提高水解和?；姆磻俾?。
反應完成后，第一個蛋白質被活化，具有巰基反應基元。經(jīng)簡單的凝膠過濾或透析可從反應混合物中分離活化的蛋白質。為進行第二步交聯(lián)即巰基反應，選擇用于與馬來酰亞胺、活化鹵素或吡啶基二硫化物反應的親脂性基團必需含有游離的巰基?；蛘呖尚揎棽芬蕴砑右粠€基。
在所有情況下，需將緩沖液脫氣以防止巰基基團的氧化?？杉尤隕DTA以螯合緩沖液中可能存在的任何氧化金屬。緩沖液應不含任何含巰基化合物。馬來酰亞胺在稍酸性至中性pH范圍(6.5-7.5)特異與-SH基團反應。中性pH對涉及鹵素和吡啶基二硫化物的反應是足夠的。在這些條件下，馬來酰亞胺通常在幾分鐘內與-SH基團反應，對于鹵素和吡啶基二硫化物，需較長反應時間。
在胺反應步驟制備的第一個巰基反應蛋白質在合適的緩沖液條件下與含巰基的親脂性基團混和。經(jīng)凝膠過濾或透析等方法可從反應混合物中分離綴合物。
用于綴合的活化親脂性基元的例子包括N-(1-芘)馬來酰亞胺；2,5-二甲氧基茋-4＇-馬來酰亞胺，曙紅-5-馬來酰亞胺；熒光素-5-馬來酰亞胺；N-(4-(6-二甲基氨基-2-苯并呋喃基)苯基)馬來酰亞胺；二苯酮-4-馬來酰亞胺；4－二甲基氨基苯基氮雜苯基-4′-馬來酰亞胺(DABMI)，四甲基若丹明-5-馬來酰亞胺，四甲基若丹明-6-馬來酰亞胺，若丹明紅TM C2馬來酰亞胺，N-(5-氨基戊基)馬來酰亞胺，三氟乙酸鹽，N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺，三氟乙酸鹽，Oregon GreenTM488馬來酰亞胺，N-(2-((2-(((4-疊氮-2,3,5,6-四氟)苯甲酰)氨基)乙基)二硫代)乙基)馬來酰亞胺(TFPAM-SS1),2-(1-(3-二甲基氨基丙基)-吲哚-3-基)-3-(吲哚-3-基)馬來酰亞胺(雙吲哚基馬來酰亞胺；GF 109203X),BODIPYFL N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺，N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)馬來酰亞胺(DACM),AlexaTM 488 C5馬來酰亞胺，AlexaTM 594 C5馬來酰亞胺，鈉鹽N-(1-芘)馬來酰亞胺，2,5-二甲氧基茋-4＇-馬來酰亞胺，曙紅-5-馬來酰亞胺，熒光素-5-馬來酰亞胺，N-(4-(6-二甲基氨基-2-苯并呋喃基)苯基)馬來酰亞胺，二苯酮-4-馬來酰亞胺；4-二甲基氨基苯基氮雜苯基-4＇-馬來酰亞胺，1-(2-馬來酰亞胺基乙基)-4-(5-(4-甲氧基苯基)噁唑-2-基)甲磺酸吡啶鎓，四甲基若丹明-5-馬來酰亞胺，四甲基若丹明-6-馬來酰亞胺，若丹明紅TMC2馬來酰亞胺，N-(5-氨基戊基)馬來酰亞胺，N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺，N-(2-((2-(((4-疊氮-2,3,5,6-四氟)苯甲酰)氨基)乙基)二硫代)乙基)馬來酰亞胺，2-(1-(3-二甲基氨基丙基)-吲哚-3-基)-3-(吲哚-3-基)馬來酰亞胺，N-(7-二甲基氨基-4-甲基香豆素-3-基)馬來酰亞胺(DACM),11H-苯并[a]芴，苯并[a]芘。
在一個實施方案中，hedgehog多肽可用可購自分子探針(Eugene,Oreg.)的芘馬來酰亞胺例如N-(1-芘)馬來酰亞胺或1-芘甲基碘乙酸酯(PMIA酯)衍生化。
對于其中疏水性基元是多肽的實施方案，本發(fā)明的修飾的hedgehog多肽可構建成融合蛋白，該融合蛋白含有hedgehog多肽和所述疏水性基元作為一個連續(xù)的多肽鏈。
在某些實施方案中，親脂性基元是兩親性多肽，如爪蟾抗菌肽、殺菌肽、attacin、蜂毒肽、短桿菌肽S、金黃色葡萄球菌的α-毒素、丙甲甘肽或合成的兩親性多肽。來自病毒顆粒的融合包膜蛋白也是用于本發(fā)明的hedgehog蛋白的兩親性序列的方便來源。
另外，例如為了增強治療或預防效果，或穩(wěn)定性(例如來自體內的存放時間或抗體內蛋白降解的抗性)，可使用誘變技術產生修飾的hh多肽。這種修飾的肽可通過例如氨基酸取代、缺失或添加二產生。修飾的hedgehog多肽也可包括相對于天然的hedgehog蛋白質具有改變的翻譯后加工，例如改變的糖基化、膽固醇化、異戊二烯化等，的多肽。
在一個實施方案中，hedgehog治療劑是可被在嚴格條件下與SEQID NO:1-7的一或多個序列所代表的hedgehog編碼序列雜交的核苷酸序列編碼的多肽。促進DNA雜交的合適的嚴格條件，例如6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)在約45℃，之后在50℃于2.0×SSC洗滌，是本領域技術人員公知的或可在分子生物學當前方案，John Wiley& Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。例如，洗滌步驟的鹽濃度可以選自低嚴格性的在50℃于約2.0×SSC中洗滌至高嚴格性的在50℃于約0.2×SSC中洗滌。另外，洗滌步驟的溫度可從低嚴格條件的在室溫即約22℃提高到高嚴格條件的在約65℃洗滌。
如在文獻中所述的，例如來源于其它動物的其它hedgehog蛋白的基因可用本領域公知的技術從mRNA或基因組DNA樣品中獲得。例如，編碼hedgehog蛋白的cDNA可通過從細胞、例如哺乳動物細胞、例如人細胞、包括胚胎細胞分離總mRNA而獲得。隨后可從總mRNA制備雙鏈cDNA，用各種已知技術插入到合適的質?；蚴删w載體中。編碼hedgehog蛋白的基因也可用已知的聚合酶鏈反應技術克隆。
優(yōu)選的核酸編碼的hedgehog多肽包含與選自SEQ ID NO:8-14的氨基酸序列具有至少60％同源性或相同性、更優(yōu)選70％同源性或相同性、最優(yōu)選80％同源性或相同性的氨基酸序列。編碼與SEQ IDNO:8-14之一所代表的氨基酸序列有至少約90％、更優(yōu)選至少約95％、最優(yōu)選至少約98-99％的同源性或相同性的多肽的核酸也屬于本發(fā)明范圍。
除了天然的hedgehog蛋白，本發(fā)明優(yōu)選的hedgehog多肽與SEQID NO:8-14任一所代表的氨基酸序列有至少60％、更優(yōu)選70％、最優(yōu)選80％的同源性或相同性。與選自SEQ ID NO:8-14的序列有至少90％、更優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少約98-99％的同源性或相同性的多肽也屬于本發(fā)明范圍。唯一的前提條件是hedgehog多肽能調節(jié)上皮細胞的生長。
術語“重組蛋白”是指本發(fā)明的多肽由重組DNA技術產生，其中通常編碼hedgehog多肽的DNA插入一合適的表達載體中，該表達載體用于轉化宿主細胞以產生異源蛋白質。另外，短語“衍生自”，當指重組hedgehog基因時，意味著在“重組蛋白”的含義里包括具有天然hedgehog蛋白的氨基酸序列或由該蛋白的天然形式的突變如取代和缺失(包括截短)產生的與其相似的氨基酸序列的蛋白質。
本發(fā)明方法可使用天然hedgehog多肽的變體形式，例如突變的變體進行。
如現(xiàn)有技術已知的，hedgehog多肽可通過標準生物學技術或經(jīng)化學合成產生。例如，用指導編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列表達的核酸載體轉染的宿主細胞可在合適的條件下培養(yǎng)以使肽表達。多肽hedgehog可被分泌或從含有重組hedgehog多肽的細胞和培養(yǎng)基混合物中分離出。或者，可通過從重組hedgehog基因中除去信號肽序列而使該肽保留在細胞質中，收獲細胞，裂解以及分離蛋白質。細胞培養(yǎng)物包括宿主細胞、培養(yǎng)基和其它副產物。用于細胞培養(yǎng)的合適的培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術中已知的。重組hedgehog多肽可用本領域已知的純化蛋白的技術如離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾、電泳和用特異于該肽的抗體的免疫親和純化，從細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基、宿主細胞或兩者中分離出來。在一優(yōu)選的實施方案中，重組hedgehog多肽含有促進純化的結構域的融合蛋白，如hedgehog/GST融合蛋白。宿主細胞可以是原核或真核細胞。
重組hedgehog基因可通過將編碼hedgehog蛋白或其部分的核酸與適于在原核細胞、真核細胞或兩種細胞中表達的載體連接二產生。用于產生重組形式的本發(fā)明hedgehog多肽的表達載體包括質粒和其它載體。例如，用于表達hedgehog多肽的合適的載體包括下列類型的質粒pBR322衍生的質粒、pEMBL衍生的質粒、pEX衍生的質粒、pBTac衍生的質粒和pUC衍生的質粒，用于在原核細胞中表達，如在大腸桿菌中表達。
有各種載體可用于在酵母中表達重組蛋白，例如YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2和YRP17是用于將基因構建體導入啤酒糖酵母的克隆和表達載體(見，例如，Broach等(1983)，《基因表達的實驗操作》，編輯M.Inouye，學術出版社，83頁，引入本文作參考)。這些載體由于存在pBR322 ori而可在大腸桿菌中復制，由于存在酵母2μ質粒的復制因子而可在啤酒糖酵母中復制。另外，可使用藥物抗性標記如氨芐青霉素。在一示意性實施方案中，hedgehog多肽用表達載體重組產生，該表達載體通過亞克隆SEQ ID NO:1-7代表的一個hedgehog基因的編碼序列而產生。
優(yōu)選的哺乳動物表達載體即含有原核序列，以便載體在細菌中繁殖，也含有一或多個在真核細胞中表達的真核轉錄單位。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的載體是適于轉染真核細胞的哺乳動物表達載體的例子。這些載體中的一些可用來自細菌質粒如pBR322的序列修飾以便在真核和原核細胞中復制和藥物抗性篩選?；蛘?，病毒衍生物如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或Epstein-Bart病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205)可用于蛋白質在真核細胞中的瞬時表達。制備質粒和轉化宿主生物體的各種方法是本領域熟知的。對于其它合適的原核和真核細胞表達系統(tǒng)以及通用的重組程序，參見分子克隆實驗手冊，第2版，Sambrook,Fritsch和Maniatis編輯(冷泉港實驗室出版社，1989)，第16和17章。
在某些情況下，希望的是用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達重組hedgehog多肽，這種桿狀病毒表達系統(tǒng)的例子包括pVL衍生的載體(如pVL1392,pVL1393和pVL941),pAcUW衍生的載體(如pAcUW1)和pBlueBac衍生的載體(如含有β-gal的pBlueBacⅢ)。
當希望僅表達hedgehog蛋白的一部分，如缺失N-末端部分的形式即缺少信號肽的截短突變體時，可能需要在含有待表達的所需序列的寡核苷酸片段上加入一起始密碼子(ATG)。本領域公知N-末端位置的甲硫氨酸可用甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)二酶切除去。MAP已從大腸桿菌(Ben-Bassat等(1987)細菌學雜志169:751-757)和鼠傷寒沙門氏菌中克隆，其體外活性已在重組蛋白上證實(Miller等(1987)PNAS 84:2718-2722)。因此，如果需要除去N-末端甲硫氨酸，在體內可通過在產生MAP的宿主(例如大腸桿菌或CM89或啤酒糖酵母)中表達hedgehog衍生的多肽，在體外可用純化的MAP而實現(xiàn)(例如，Miller等的程序，文獻同上)。
或者，多肽的編碼序列可作為包括編碼不同多肽的核苷酸序列的融合基因的一部分而摻入。公認的是融合蛋白也可促進蛋白質的表達，因而可用于表達本發(fā)明的hedgehog多肽。例如，hedgehog多肽可作為谷胱甘肽-S-轉移酶(GST-融合體)蛋白而產生。這種GST-融合蛋白可使得hedgehog多肽易于純化，例如通過使用谷胱甘肽衍生的基質純化(例如，參見《分子生物學當前方案》，Ausubel等編輯(N.Y.:John Wiley&Sons,1991))。在另一個實施方案中，編碼純化前導序列如聚(His)/腸激酶裂解位點序列的融合基因可用于替換hedgehog蛋白N-末端天然存在的信號序列(例如，蛋白原形式的信號序列)，以使得能用Ni2+金屬樹脂經(jīng)親和層析純化聚(His)-hedgehog蛋白。隨后可通過用腸激酶處理除去純化前導序列(例如，參見Hochuli等(1987)層析雜志411:177；Janknecht等，PNAS88:8972)。
制備融合基因的技術是本領域技術人員公知的，簡要地，根據(jù)常規(guī)技術，用鈍端或交錯切口末端進行連接，限制酶消化以提供合適的末端，如果需要補平粘末端，堿性磷酸酶處理以避免不希望的連接，以及酶連接來實現(xiàn)編碼不同多肽序列的各DNA片段的連接。在另一個實施方案中，融合基因可經(jīng)常規(guī)技術如自動化DNA合成儀合成?；蛘?，可用錨定引物進行基因片段的PCR擴增，在兩個連續(xù)基因片段之間產生互補突出端，隨后可退火產生嵌合基因序列(例如，參見《分子生物學當前方案》，Ausubel等編輯，John Wiley & Sons,1992)。
通過與其它化學基元如糖基基團、膽固醇、類異戊二烯、脂類、磷酸根、乙?；刃纬晒矁r或聚集綴合物，可化學修飾hedgehog多肽以產生hedgehog衍生物。Hedgehog蛋白的共價衍生物可通過將化學基元與蛋白的氨基酸側鏈上的官能團連接或將其連接在多肽的N-末端或C-末端而制備。
例如，可產生這樣的hedgehog蛋白，其包括一不是與該蛋白天然相關的序列的基元，該基元結合胞外基質的組分并促進該類似物定位于細胞表面。例如，從纖連蛋白“Ⅲ型重復序列”衍生的序列如四肽序列R-G-D-S(Pierschbacher等(1984)自然309:30-3；Komblihtt等(1985)EMBO 4:1755-9)可加至hedgehog多肽以支持該嵌合分子通過結合ECM組分而附著于細胞(Ruoslahti等(1987)科學238:491-497；Pierschbacher等(1987)生物化學雜志262:17294-8:Hynes(1987)細胞48:549-54；Hynes(1992)細胞69:11-25)。
在一優(yōu)選的實施方案中，hedgehog多肽是分離的形式，或者基本上不含其它細胞蛋白、特別是其它胞外蛋白或與hedgehog多肽天然結合的細胞表面結合蛋白，除非以與hedgehog多肽的融合蛋白形式提供。術語“基本上不含其它細胞或胞外蛋白”(本文也稱為“污染蛋白”)或“基本上純化的制備物”或“純化的制備物”的定義是包括具有少于20％(干重)污染蛋白、優(yōu)選具有少于5％污染蛋白的hedgehog多肽制備物?！凹兓摹笔侵杆阜肿又谢旧喜淮嬖谄渌飳W大分子如其它蛋白。本文所用術語“純化的”優(yōu)選指存在至少80％(干重)、更優(yōu)選95-99％(重量)、最優(yōu)選至少99.8％(重量)的同種類型生物學大分子(但是水、緩沖液、其它小分子特別是分子量小于5000的分子可以存在)。本文所用術語“純的”優(yōu)選具有上述術語“純化的”的相同數(shù)值限制。
如上針對重組多肽所述，分離的hedgehog多肽可包括SEQ IDNO:10-18任一或SEQ ID NO:20所代表的氨基酸序列的全部或一部分，或其同源序列。本發(fā)明的hedgehog蛋白的優(yōu)選的片段相應于成熟蛋白的N-末端和C-末端蛋白水解片段。hedgehog多肽的生物活性片段在PCT出版物WO95/18856和WO96/17924中有詳述。
關于hedgehog多肽的生物活性片段，優(yōu)選的hedgehog治療劑包括hedgehog多肽的至少50個(連續(xù))氨基酸殘基，更優(yōu)選至少100個(連續(xù))氨基酸殘基，更優(yōu)選至少150個(連續(xù))氨基酸殘基。
可包括在hedgehog治療劑中的另一種優(yōu)選的hedgehog多肽是成熟蛋白的N-末端片段，其分子量為約19kDa。
優(yōu)選的人hedgehog蛋白包括約相應于SEQ ID NO:15的24-197位、SEQ ID NO:16的28-202位以及SEQ ID NO:17的23-198位殘基的N-末端片段。“約相應于”是指感興趣的序列與參照序列在長度上至多有20個氨基酸殘基的不同，更優(yōu)選在長度上至多5、10或15個氨基酸不同。
如上針對重組多肽所述，分離的hedgehog多肽可包括SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所代表的氨基酸序列的全部或一部分，或其同源序列。本發(fā)明的hedgehog蛋白的優(yōu)選的片段相應于成熟蛋白的N-末端和C-末端蛋白水解片段。hedgehog多肽的生物活性片段在PCT出版物WO95/18856和WO96/17924中有詳述。
其它優(yōu)選的hedgehog多肽包括由式A-B代表的氨基酸序列，其中(ⅰ)A代表SEQ ID NO:21的殘基1-168指示的氨基酸序列的全部或一部分；B代表SEQ ID NO:21的殘基169-221指示的氨基酸序列的至少一個氨基酸殘基；(ⅱ)A代表SEQ ID NO:15的殘基24-193指示的氨基酸序列的全部或一部分；B代表SEQ ID NO:15的殘基194-250指示的氨基酸序列的至少一個氨基酸殘基；(ⅲ)A代表SEQ ID NO:13的殘基25-193指示的氨基酸序列的全部或一部分；B代表SEQ ID NO:13的殘基194-250指示的氨基酸序列的至少一個氨基酸殘基；(ⅳ)A代表SEQ ID NO:11的殘基23-193指示的氨基酸序列的全部或一部分；B代表SEQ ID NO:11的殘基194-250指示的氨基酸序列的至少一個氨基酸殘基；(ⅴ)A代表SEQID NO:12的殘基28-197指示的氨基酸序列的全部或一部分；B代表SEQ ID NO:12的殘基198-250指示的氨基酸序列的至少一個氨基酸殘基；(ⅵ)A代表SEQ ID NO:16的殘基29-197指示的氨基酸序列的全部或一部分；B代表SEQ ID NO:16的殘基198-250指示的氨基酸序列的至少一個氨基酸殘基；或(ⅶ)A代表SEQ ID NO:17的殘基23-193指示的氨基酸序列的全部或一部分；B代表SEQ IDNO:17的殘基194-250指示的氨基酸序列的至少一個氨基酸殘基。在優(yōu)選的實施方案中，A和B一起代表所指序列的連續(xù)多肽序列，A代表所指序列的至少25、50、75、100或150個(連續(xù))氨基酸，B代表序列表相應登錄號所指氨基酸序列的至少5、10或20個(連續(xù))氨基酸殘基。A和B一起優(yōu)選代表相應于序列表登錄號的連續(xù)序列。來自其它hedgehog的相似片段也包含在內，例如相應于上述數(shù)字表示的序列表登錄號的優(yōu)選片段的片段。在優(yōu)選的實施方案中，hedgehog多肽包括用膽固醇衍生的C-末端甘氨酸(或其它合適的殘基)。
Hedgehog蛋白的分離的肽部分可通過篩選從編碼這種肽的相應核酸片段重組產生的肽而獲得。另外，可用本領域已知的技術如常規(guī)的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學法化學合成片段。例如，本發(fā)明的hedgehog多肽可任意分成所需長度的不重疊的片段，或優(yōu)選地分成所需長度的重疊的片段?？梢?重組或經(jīng)化學合成)產生片段并測試鑒別可作為野生型(例如“真的”)hedgehog蛋白的興奮劑或拮抗劑的肽片段。例如，Roman等(1994)，歐洲生物化學雜志222:65-73描述了用以鑒別結合結構域的應用來自較大蛋白的短的重疊的合成肽的競爭結合分析法。
本發(fā)明的重組hedgehog多肽還包括真的hedgehog蛋白的同系物，如抗蛋白酶解的蛋白質，例如由于改變潛在的裂解序列或使與該蛋白相關的酶活性失活的突變所導致的蛋白質。本發(fā)明的hedgehog同系物也包括被翻譯后修飾成不同于真的蛋白質的蛋白質。Hedgehog蛋白的衍生物的例子包括缺少N-糖基化位點的多肽(例如產生非糖基化蛋白)，缺少膽固醇化位點的多肽，和/或缺少N-末端和/或C-末端序列的多肽。
本發(fā)明的hedgehog多肽結構的修飾的目的也可為了增強治療或預防效果，或穩(wěn)定性(例如來自體內的儲存壽命和體內抗蛋白酶降解的抗性)。這種修飾的肽，當設計應用保持天然蛋白的至少一種活性時，被認為是本文詳述的hedgehog多肽的功能等同物。這種修飾的肽例如可經(jīng)氨基酸取代、缺失或添加而產生。
本領域公知的是，人們有理由預期可進行某些氨基酸的獨立替換，例如用一個相關氨基酸替換另一個氨基酸殘基(即同位和/或等電突變)，而基本上不會影響所得分子的生物學活性。保守替換是發(fā)生在一族氨基酸中與其側鏈有關的替換。遺傳編碼的氨基酸可分成四族(1)酸性氨基酸=天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性氨基酸=賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性氨基酸=丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；(4)非帶電荷極性氨基酸=甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有時聯(lián)合分類成芳香氨基酸。以相似的方式，氨基酸所有組成成分可分組為(1)酸性氨基酸=天冬氨酸，谷氨酸；(2)堿性氨基酸=賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)脂族氨基酸=甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，絲氨酸和蘇氨酸可任選地單獨分為脂族羥基氨基酸組；(4)芳香氨基酸=苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸；(5)酰胺氨基酸=天冬酰胺，谷氨酰胺；(6)含硫氨基酸=半胱氨酸，甲硫氨酸。(參見，例如，《生物化學》，第2版，L.Stryer編輯，WHFreeman and Co.:1981)。氨基酸序列的改變是否會導致有功能的hedgehog同系物(例如，有功能是指其模擬或拮抗野生型)可以通過評價變體肽能否在細胞中以類似于野生型蛋白的方式產生應答或競爭性抑制這種應答而確定。發(fā)生一個以上替換的多肽可以相同方式容易地測定。
應特別指出的是本發(fā)明方法可用天然hedgehog蛋白的同系物進行。在一個實施方案中，本發(fā)明設計使用經(jīng)組合誘變產生的hedgehog多肽。如本領域所知的，這種方法可方便地產生點突變體和截短突變體，并特別適于鑒別能結合hedgehog蛋白受體的潛在的變體序列(例如同系物)。篩選這種組合文庫的目的是產生例如能作為興奮劑或拮抗劑的新的hedgehog同系物。舉例來說，可用本發(fā)明方法對hedgehog同系物工程化，以提供對關聯(lián)受體如patched更有效的結合，并仍保持至少一部分hedgehog相關的活性。因此，可產生與該蛋白的天然形式相比具有增加的效力的組合衍生的同系物。類似地，可用組合途徑產生作為拮抗劑的hedgehog同系物，即它們能夠例如模擬與其它本文基質組分(如受體)的結合，但不誘導任何生物學應答，從而抑制真的hedgehog或hedgehog興奮劑的作用。另外，用本發(fā)明方法對hedgehog某些結構域的操作可提供更適用于融合蛋白中的結構域，如摻入衍生自胞外基質和/或結合胞外基質組分的其它蛋白的一部分的結構域。
為進一步描述組合誘變的現(xiàn)有技術狀態(tài)，應注意Gallop等(1994)，醫(yī)學化學雜志37:1233的綜述文章描述了90年代早期組合文庫的現(xiàn)有技術狀態(tài)。特別是Gallop等在第1239頁指出“篩選類似物文庫有助于確定活性序列的最小大小，以及有助于鑒別對結合和取代的不耐受關鍵的殘基”。另外，Ladner等的PCT出版物WO90/02809,Goeddel等的美國專利5,223,408和Markland等的PCT出版物WO92/15679描述了本領域技術人員可以用于產生hedgehog變體文庫的具體技術，該文庫可被快速篩選以鑒別保持hedgehog多肽的特定活性的變體/片段。這些技術是對現(xiàn)有技術的舉例并證實可產生相關變體/截短體的大文庫并分析其以不需過度實驗而分離特定變體。Gustin等(1993)，病毒學193:653,Bass等(199O)，蛋白質結構、功能和遺傳8:309-314也描述了可用于產生hedgehog多肽的誘變變體的現(xiàn)有技術的舉例性技術。
實際上，從組合誘變現(xiàn)有技術可以明顯看出對hedgehog蛋白的大規(guī)模誘變，而事先不指哪個殘基是生物學功能關鍵殘基，將產生具有相等生物學活性的許多變體。實際上組合技術具有經(jīng)高通量分析篩選數(shù)十億個不同變體的能力，從而不需事先知道關鍵殘基。
舉例而說，優(yōu)選地將一群hedgehog同系物或其它相關蛋白的氨基酸序列進行對比以促使最高同源性成為可能。這種變體群可包括，例如，來自一或多個物種的hedgehog同系物選擇在對比序列的每個位置出現(xiàn)的氨基酸以產生一套簡并的組合序列。在一優(yōu)選的實施方案中，hedgehog變體的多樣化文庫經(jīng)核酸水平的組合誘變產生并由一多樣化基因文庫編碼。例如，合成寡核苷酸的混合物可與基因序列酶連接，以便潛在的hedgehog序列的簡并系列可表達為個體多肽，或者，表達為其中含有該系列hedgehog序列的一套較大的融合蛋白(例如，用于噬菌體展示)。
如PCT出版物WO95/18856所示，為分析變體群的序列，感興趣的氨基酸序列可相對于序列同源性進行序列對比。特定變體的對比序列是否存在氨基酸與參照序列所選共有長度有關，該參照序列可以是真序列或人工序列。
在一舉例性實施方案中，每個Shh克隆的外顯子1、2和一部分外顯子3編碼的序列(例如成熟蛋白的N一末端約221個殘基)的對比產生由下述通式代表的Shh多肽的簡并系列C-G-P-G-R-G-X(1)-G-X(2)-R-R-H-P-K-K-L-T-P-L-A-Y-K-Q-F-I-P-N-V-A-E-K-T-L-G-A-S-G-R-Y-E-G-K-I-X(3)-R-N-S-E-R-F-K-E-L-T-P-N-Y-N-P-D-I-I-F-K-D-E-E-N-T-G-A-D-R-L-M-T-Q-R-C-K-D-K-L-N-X(4)-L-A-I-S-V-M-N-X(5)-W-P-G-V-X(6)-L-R-V-T-E-G-W-D-E-D-G-H-H-X(7)-E-E-S-L-H-Y-E-G-R-A-V-D-I-T-T-S-D-R-D-X(8)-S-K-Y-G-X(9)-L-X(10)-R-L-A-V-E-A-G-F-D-W-V-Y-Y-E-S-K-A-H-I-H-C-S-V-K-A-E-N-S-V-A-A-K-S-G-G-C-F-P-G-S-A-X(11)-V-X(12)-L-X(13)-X(14)-G-G-X(15)-K-X-(16)-V-K-D-L-X(17)-P-G-D-X(18)-V-L-A-A-D-X(19)-X(20)-G-X(21)-L-X(22)-X(23)-S-D-F-X(24)-X(25)-F-X(26)-D-R(SEQ ID NO:21其中每個簡并位置“X”可以是在人、鼠、雞或斑馬魚Shh克隆中該位置發(fā)生的氨基酸，或者，為擴大該文庫，每個X也可選自是每個位置天然出現(xiàn)的氨基酸的保守取代的氨基酸。例如，Xaa(1)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸；Xaa(2)代表精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(3)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(4)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(5)代表賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺；Xaa(6)代表賴氨酸、精氨酸或組氨酸；Xaa(7)代表絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸；Xaa(8)代表賴氨酸、精氨酸或組氨酸；Xaa(9)代表甲硫氨酸、半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(10)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(11)代表亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸或絲氨酸；Xaa(12)代表組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸；Xaa(13)代表谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸；Xaa(14)代表組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸；Xaa(15)代表谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸；Xaa(16)代表丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸；Xaa(17)代表精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸；Xaa(18)代表精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸或異亮氨酸；Xaa(19)代表丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸或甲硫氨酸；Xaa(20)代表丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺；Xaa(21)代表精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺；Xaa(22)代表亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸或異亮氨酸；Xaa(23)代表苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、組氨酸或色氨酸；Xaa(24)代表異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；Xaa(25)代表甲硫氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸或絲氨酸；Xaa(26)代表亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸或絲氨酸。在一個更擴大的文庫，每個X可以選自任何氨基酸。
以類似的方式，每個人、鼠、雞或斑馬魚hedgehog克隆的序列對比可提供由下述通式代表的簡并肽序列C-G-P-G-R-G-X(1)-X(2)-X(3)-R-R-X(4)-X(5)-X(6)-P-K-X(7)-L-X(8)-P-L-X(9)-Y-K-Q-F-X(10)-P-X(11)-X(12)-X(13)-E-X(14)-T-L-G-A-S-G-X(15)-X(16)-E-G-X(17)-X(18)-X(19)-R-X(20)-S-E-R-F-X(21)-X(22)-L-T-P-N-Y-N-P-D-I-I-F-K-D-E-E-N-X(23)-G-A-D-R-L-M-T-X(24)-R-C-K-X(25)-X(26)-X(27)-N-X(28)-L-A-I-S-V-M-N-X(29)-W-P-G-V-X(30)-L-R-V-T-E-G-X(31)-D-E-D-G-H-H-X(32)-X(33)-X(34)-S-L-H-Y-E-G-R-A-X(35)-D-I-T-T-S-D-R-D-X(36)-X(37)-K-Y-G-X(38)-L-X(39)-R-L-A-V-E-A-G-F-D-W-V-Y-Y-E-S-X(40)-X(41)-H-X(42)-H-X(43)-S-V-K-X(44)-X(45) (SEQ ID No:22)其中，如上所述，每個簡并位置“X”可以是在一個野生型克隆中相應位置發(fā)生的氨基酸，或者，可包括是保守取代的氨基酸殘基，或者每個X可以是任何氨基酸殘基。在一個舉例性實施方案中，Xaa(1)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；Xaa(2)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸；Xaa(3)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸或精氨酸；Xaa(4)代表賴氨酸、精氨酸或組氨酸；Xaa(5)代表苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸或氨基酸間隔；Xaa(6)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或氨基酸間隔；Xaa(7)代表天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；Xaa(8)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(9)代表代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(10)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(11)代表絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺；Xaa(12)代表甲硫氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(13)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或脯氨酸；Xaa(14)代表精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(15)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(16)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸；Xaa(17)代表精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(18)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(19)代表蘇氨酸或絲氨酸；Xaa(20)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺；Xaa(21)代表精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(22)代表天冬氨酸或谷氨酸；Xaa(23)代表絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(24)代表谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺；Xaa(25)代表谷氨酸或天冬氨酸；Xaa(26)代表精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(27)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸；Xaa(28)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；Xaa(29)代表甲硫氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、賴氨酸或組氨酸；Xaa(30)代表精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(31)代表色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(32)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸；Xaa(33)代表谷氨酰胺、天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸；Xaa(34)代表天冬氨酸或谷氨酸；Xaa(35)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸；Xaa(36)代表精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(37)代表谷氨酰胺、天冬酰胺、蘇氨酸或絲氨酸；Xaa(38)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸；Xaa(39)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸或絲氨酸；Xaa(40)代表精氨酸、組氨酸或賴氨酸；Xaa(41)代表天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸；Xaa(42)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸；Xaa(43)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸；Xaa(44)代表甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸或絲氨酸；Xaa(45)代表天冬氨酸或谷氨酸。
有許多方式可用以從簡并寡核苷酸序列產生潛在的hedgehog同系物的文庫。簡并基因序列的化學合成可在自動DNA合成儀上進行，然后將合成的基因連接進合適的表達載體中。簡并系列基因的目的是提供在一個混合物中的編碼所需的潛在hedgehog序列的所有序列。簡并寡核苷酸的合成是本領域已知的(例如參見，Narang,SA(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等(1981)重組DNA，第3屆克里夫蘭大分子研討會論文匯編，編輯AG Walton，阿姆斯特丹Elsevier，第273-289頁；Itakura等(1984)生物化學年度綜述53:323；Itakura等(1984)科學198:1056；Ike等(1983)核酸研究11:477)。這種技術已在其它蛋白的定向進化中被采用(例如參見Scott等(1990)科學249:386-390；Roberts等(1992)PNAS 89:2429-2433；Devlin等(1990)科學249:404-406；Cwirla等(1990)PNAS 87:6378-6382；以及美國專利5,223,409,5,198,346和5,096,815)。
本領域已知各種用于篩選由點突變制備的組合文庫的基因產物以及篩選cDNA文庫的具有某種性質的基因產物的技術。這種技術通常適于快速篩選由hedgehog同系物的組合誘變產生的基因文庫。篩選大的基因文庫的最常用技術典型地包括將基因文庫克隆至可復制的表達載體上，用得到的載體文庫轉化合適的細胞，表達組合基因，在所需活性的檢測有利于編碼所檢測產物的基因的載體相對較易分離的條件下進行表達。下述每種舉例性分析均適于高通量分析，這是篩選由組合誘變技術產生的大量簡并hedgehog序列所需的。
在一個實施方案中，組合文庫設計是能分泌的(例如，文庫的多肽均包括信號序列但無跨膜或細胞質結構域)，并用于轉染可與上皮干細胞共培養(yǎng)的真核細胞。由表達組合文庫的細胞分泌的有功能的hedgehog蛋白將擴散進相鄰的上皮細胞并誘導特定的生物學應答如增殖。增殖的檢測模式為梯度函數(shù)，并使得能分離(通常在幾次重復選擇后)產生是上皮細胞的增殖劑的hedgehog同系物的細胞。類似地，hedgehog拮抗劑可通過產生有功能的拮抗劑的細胞保護相鄰細胞(例如抑制增殖)不受加入到培養(yǎng)基中的野生型hedgehog的影響的能力來選擇。
舉例來說，靶上皮細胞在24孔微滴板中培養(yǎng)，用組合hedgehog基因文庫轉染其它真核細胞并在能插入到微滴板孔中的細胞培養(yǎng)插入物(例如，Collaborative Biomedical Products，貨號#40446)中培養(yǎng)。將該細胞培養(yǎng)插入物置于孔中，從而由插入物中的細胞分泌的重組hedgehog同系物可以擴散通過插入物的孔狀底部并接觸微滴板孔中的靶細胞。在足以使有功能形式的hedgehog蛋白在靶細胞中產生可測的應答如增殖的時間后，除去插入物，測定變體hedgehog蛋白對靶細胞的作用。來自相應于活性為陽性的孔的插入物的細胞可以分成幾份并在幾個插入物上再培養(yǎng)，重復這一過程直至活性克隆被鑒別出來。
在另一種篩選分析中，候選的hedgehog基因產物展示在細胞或病毒顆粒表面，并且特定細胞或病毒顆粒經(jīng)這一基因產物與hedgehog結合基元(如patched蛋白或其它hedgehog受體)相結合的能力在一“淘選分析”中被檢測。這種淘選步驟可在從胚胎培養(yǎng)的細胞上進行。例如，基因文庫可被克隆進編碼細菌細胞表面膜蛋白的基因中，經(jīng)淘選檢測得到的融合蛋白(Ladner等，WO88/06630；Fuchs等(1991)生物/技術9:1370-1371；Goward等(1992)TIBS 18:136-140)。以類似的方式，結合hedgehog的熒光標記分子可用于鑒別潛在的有功能的hedgehog同系物。細胞可以在熒光顯微鏡下經(jīng)肉眼檢測并分離，或者，當細胞形態(tài)學允許時，用熒光活化的細胞分選儀分離。
在另一實施方案中，基因文庫在病毒克隆上表達為融合蛋白。例如，在絲狀噬菌體系統(tǒng)中，外來肽序列可在感染性噬菌體的表面上表達，從而賦予兩種顯著的優(yōu)勢。第一，由于這些噬菌體可以非常高的濃度加到親和基質上，所以可一次篩選大量噬菌體。第二，由于每個感染性噬菌體在其表面展示組合基因產物，所以如果從親和基質上回收的特定噬菌體量較低，該噬菌體可經(jīng)另一輪感染二擴增。一組幾乎相同的大腸桿菌絲狀噬菌體M13、fd和f1最常用于噬菌體展示文庫，因為噬菌體gⅢ或gⅧ外殼蛋白可用于產生融合蛋白而不破壞病毒顆粒的最外層包裝(Ladner等，PCT出版物WO90/02909；Garrard等，PCT出版物WO92/09690；Marks等(1992)生物化學雜志267:16007-16010；Griffths等(1993)EMBO J 12:725-734；Clackson等(1991)自然352:624-628；Barbas等(1992)PNAS89:4457-4461)。
在一舉例性實施方案中，可容易地修飾重組噬菌體抗體系統(tǒng)(RPAS,Pharmacia貨號27-9400-01)以用于表達和篩選hedgehog組合文庫。例如，RPAS試劑盒的pCANTAB 5噬菌粒含有編碼噬菌體gⅢ外殼蛋白的基因。Hedgehog組合基因文庫可克隆進噬菌粒中鄰近gⅢ信號序列，從而其表達為gⅢ融合蛋白。連接后，用噬菌粒轉化感受態(tài)大腸桿菌TG1細胞，轉化的細胞隨后用M13KO7輔助噬菌體感染以拯救噬菌粒及其候選的hedgehog基因插入子。得到的重組噬菌體含有編碼特定的候選hedgehog的噬菌粒DNA，并展示一或多個拷貝的相應融合外殼蛋白。經(jīng)淘選法選擇并富集能結合hedgehog受體的噬菌體展示的候選hedgehog蛋白。例如，將噬菌體文庫加到表達patched蛋白的細胞中并洗滌以將未結合的噬菌體從細胞中除去。然后分離結合的噬菌體，并且如果重組噬菌體表達至少一個拷貝的野生型gⅢ外殼蛋白，則它們將保持其感染大腸桿菌的能力。因此，繼續(xù)進行再感染大腸桿菌及淘選將大大富集hedgehog同系物，然后可篩選這些同系物進一步的生物學活性以區(qū)分興奮劑和拮抗劑。
組合誘變具有產生非常大的突變蛋白文庫的潛力，例如1026個分子級別的文庫。這樣大的組合文庫即使用高通量篩選分析如噬菌體展示進行篩選在技術上也是富有挑戰(zhàn)性的。為克服這一問題，最近開發(fā)了一種新技術回歸集團誘變(recursive ensemble mutagenesis,REM)，其使得能在一隨機文庫中避免非常高比例的無功能蛋白質，并增加有功能蛋白質的幾率，由此降低實現(xiàn)序列空間的有用取樣所需的復雜性。REM是一種算法，當采用合適的選擇或篩選方法時，其增加文庫中有功能的突變體的幾率(Arkin和Yourvan,1992,PNASUSA 89:7811-7815；Yourvan等，1992，從自然中解決的平行問題，2,Maenner和Manderick編輯，Elsevir出版公司，阿姆斯特丹，401-410頁；Delgrave等，1993，蛋白質工程6(3):327-331)。
本發(fā)明還提供了降低hedgehog蛋白產生能破壞本發(fā)明的hedgehog多肽與hedgehog受體的結合的模擬物，例如肽或非肽因子的方法。上述這種誘變技術也可用于定位參與蛋白質-蛋白質相互作用的hedgehog蛋白的決定簇，這種相互作用例如參與本發(fā)明的hedgehog多肽與其它胞外基質組分的結合。舉例來說，可確定參與對hedgehog受體如patched的分子識別的本發(fā)明hedgehog多肽的關鍵殘基并用于產生競爭性抑制真hedgehog蛋白與該基元的結合的hedgehog衍生的肽模擬物。通過采用，例如，掃描誘變以定位參與結合其它胞外蛋白的每種本發(fā)明hedgehog蛋白的氨基酸殘基，可產生模擬hedgehog蛋白的那些殘基的肽模擬化合物以促進相互作用。這種模擬物隨后可用于干擾hedgehog蛋白的正常功能。例如，用苯并二氮雜(例如，參見Freidinger等，見《肽化學和生物學》，G.R.Marshall編輯，ESCOM出版社Leiden，荷蘭，1988)、氮雜(例如，參見Huffman等，見《肽化學和生物學》，G.R.Marshall編輯，ESCOM出版社Leiden，荷蘭，1988)、取代的γ-內酰胺環(huán)(Garvey等，見《肽化學和生物學》，G.R.Marshall編輯，ESCOM出版社Leiden，荷蘭，1988)、酮-亞甲基假肽(Ewenson等(1986)醫(yī)學化學雜志29:295；Ewenson等，見《肽結構和功能》(第9屆美國肽研討會論文匯編)，Pierce化學公司，Rockland,L,1985),β轉角二肽核心(Nagai等(1985)四面體通信26:647；Sato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans1:1231)和β-氨基醇(Gordon等(1985)生物化學生物物理研究通訊126:419；Dann等(1986)生物化學生物物理研究通訊134:71)，可以產生這種殘基的不可水解的肽類似物。
重組產生形式的hedgehog蛋白可以用，例如，含有與至少一個轉錄調節(jié)序列可操縱相連的編碼hedgehog多肽的核酸的表達載體來產生?？刹倏v相連是指核苷酸序列以能使該核苷酸序列表達的方式與一調節(jié)序列相連。調節(jié)序列是本領域已知的并選擇用于指導hedgehog多肽的表達。因此，術語轉錄調節(jié)序列包括啟動子、增強子和其它表達控制元件。這種調節(jié)序列在Goeddel；基因表達技術酶學方法185，學術出版社，圣地亞哥，CA(1990)中有描述。例如，任何表達控制序列，當與DNA序列可操縱相連時控制其表達的序列可用于這些載體中以表達編碼hedgehog多肽的DNA序列。這種有用的表達控制序列包括，例如，病毒LTR如Moloney鼠白血病病毒的LTR,SV40的早期和晚期啟動子，腺病毒或巨細胞病毒立即早期啟動子，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，TAC或TRC系統(tǒng)，其表達由T7RNA聚合酶指導的T7啟動子，噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)域，fd外殼蛋白的控制區(qū)，3-磷酸甘油酯激酶或其它糖酵解酶的啟動子，酸性磷酸酶的啟動子，例如Pho5，酵母α-交配因子的啟動子，桿狀病毒系統(tǒng)的多角體啟動子以及已知控制原核細胞或真核細胞及其病毒的基因病毒的序列，及以上的各種組合。應理解的是表達載體的設計應基于這樣的因素，如轉化的宿主細胞的選擇和/或需表達的蛋白質的類型。另外，也應考慮載體的拷貝數(shù)、控制該拷貝數(shù)的能力以及由載體編碼的任何其它蛋白如抗生素標記的表達。
除了提供穩(wěn)定的hedgehog多肽來源用于純化外，本發(fā)明的基因構建體還可用作基因治療方案的一部分以輸送編碼興奮劑或拮抗劑形式的hedgehog多肽的核酸。因此，本發(fā)明的另一方面的特征是用于在特定細胞類型中體內轉染hedgehog多肽的表達載體以導致hedgehog多肽在上皮組織中的異位表達。
這種表達載體的配制品可以任何生物學有效的載體給予，例如能有效將重組基因體內輸送至細胞的任何配制品或組合物。途徑包括將hedgehog編碼序列插入病毒載體如重組逆轉錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和單純皰疹病毒-1，或重組細菌或真核質粒。病毒載體直接轉染細胞；質粒DNA可借助于例如陰離子脂質體(脂轉染)或衍化(例如綴合抗體)，聚賴氨酸綴合物，短桿菌肽S，人工病毒包膜或其它如此的胞內載體而輸送，以及直接注射基因構建體或體內進行CaPO4沉淀。應理解的是由于合適靶細胞的轉導代表了基因治療的關鍵的第一步，因而特定基因輸送系統(tǒng)的選擇依賴于這樣的因素，如潛在的靶的表型和給藥的途徑，例如局部或系統(tǒng)給藥。另外，應認識到提供用于hedgehog表達的體內轉導的特定基因構建體也可用于細胞的體外轉導，如用于下述的來自體內的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。
將核酸體內導入細胞的優(yōu)選的途徑是利用含有編碼所需的特定形式的hedgehog多肽的核酸如cDNA的病毒載體。用病毒載體感染細胞的優(yōu)勢是大部分靶細胞可接受核酸。另外，病毒載體內所編碼的分子，例如由病毒載體內含的cDNA編碼的分子可有效在已吸收病毒載體核酸的細胞中表達。
逆轉錄病毒載體和腺伴隨病毒載體通常被認為是用于體內將外源基因轉移至特別是人中應選擇的重組基因輸送系統(tǒng)。這些載體能有效將基因輸送至細胞中，并且轉移的核酸能穩(wěn)定地整合進宿主的染色體DNA中。應用逆轉錄病毒的一個主要前提條件是保證其應用的安全性，特別是應考慮野生型病毒在細胞群中傳播的可能性。僅產生復制缺陷的逆轉錄病毒的特殊細胞系(稱為“包裝細胞”)的開發(fā)增加了逆轉錄病毒用于基因治療的實用性，已很好地鑒定了能用于基因治療目的的基因轉移中的缺陷的逆轉錄病毒(綜述見Miller,A.D.(1990)血液76:271)。因此，可以構建這樣的重組逆轉錄病毒，其中部分逆轉錄病毒編碼序列(gag,pol,env)已被編碼hedgehog多肽的核酸替換，從而使逆轉錄病毒復制缺陷。然后將復制缺陷的逆轉錄病毒包裝成病毒顆粒，以用于通過標準技術借助輔助病毒感染靶細胞。產生重組逆轉錄病毒以及用這種病毒體外或體內感染細胞的方案可參見《分子生物學當前方案》，Ausubel,F.M.等(編輯)，Greene出版協(xié)會，(1989)，第9.10-9.14部分，及其它標準實驗室手冊。合適的逆轉錄病毒的例子包括本領域公知的pLJ,pZIP,pWE和pEM。用于制備親嗜性和兼嗜性逆轉錄病毒系統(tǒng)的合適的包裝病毒系的例子包括Crip,Cre,2和Am。逆轉錄病毒已用于將各種基因體內和/或體外導入許多不同的細胞類型，包括上皮細胞(例如參見Eglitis等(1985)科學230:1395-1398；Danos和Mulligan(1988)美國科學院院刊85:6460-6464；Wilson等(1988)美國科學院院刊85:3014-3018；Armentano等(1990)美國科學院院刊87:6141-6145；Huber等(1991)美國科學院院刊88:8039-8043；Ferry等(1991)美國科學院院刊88:8377-8381；Chowdhury等(1991)科學254:1802-1805；van Beusechem等(1992)美國科學院院刊89:7640-7644；Kay等(1992)人類基因治療3:641-647；Dai等(1992)美國科學院院刊89:10892-10895；Hwu等(1993)免疫學雜志150:4104-4115；美國專利4,868,116；美國專利4,980,286；PCT申請WO89/07136；PCT申請WO89/02468；PCT申請WO89/05345和PCT申請WO92/07573)。
另外，已表明可通過修飾病毒顆粒表面上的病毒包裝蛋白來限制逆轉錄病毒的感染譜，從而限制基于逆轉錄病毒的載體的感染譜(例如參見PCT出版物WO93/25234和WO94/06920)。例如，修飾逆轉錄病毒載體的感染譜的策略包括將特異于細胞表面抗原的抗體與病毒env蛋白偶聯(lián)(Roux等(1989)PNAS 86:9079-9083；Julan等(1992)普通病毒學雜志73:3251-3255；Goud等(1983)病毒學163:251-254)；或將細胞表面受體配體與病毒env蛋白偶聯(lián)(Neda等(1991)生物化學雜志266:14143-14146)。偶聯(lián)可以是與蛋白質或其它物質(例如乳糖以將env蛋白轉化成脫唾液酸糖蛋白)的化學交聯(lián)形式，以及通過產生融合蛋白而偶聯(lián)(例如單鏈抗體/env融合蛋白)。這一技術盡管用于限制或指導對某些組織類型的感染，但也可用于將親嗜性載體轉變成兼嗜性載體。
另外，逆轉錄病毒基因輸送的應用還可通過用控制逆轉錄病毒載體的hedgehog基因表達的組織特異性或細胞特異性轉錄調控序列來增強。
用于本發(fā)明方法的另一種病毒基因輸送系統(tǒng)利用腺病毒衍生的載體?？刹僮飨俨《镜幕蚪M以使其編碼并表達感興趣的基因產物，但使其在正常裂解性病毒生命周期中的復制能力失活。例如參見Berkner等(1988)生物技術6:616；Rosenfeld等(1991)科學252:431-434；Rosenfeld等(1992)細胞68:143-155。衍生自腺病毒Ad株5型d1324或腺病毒其它株(例如Ad2,Ad3,Ad7等)的合適的腺病毒載體是本領域技術人員公知的。在某些情況下重組腺病毒是有利的，因為它們可用于感染各種細胞類型，包括上皮細胞(Rosenfeld等(1992)，文獻同上)。另外，病毒顆粒相對較穩(wěn)定并易于純化和濃縮，并且如上所述，可被修飾以改變感染譜。另外，導入的腺病毒DNA(和其中所含的外源DNA)不整合進宿主細胞的染色體，而是保持附加體形式，從而避免了導入的DNA整合進宿主基因組的情況(例如逆轉錄病毒DNA)中由于插入誘變而可能發(fā)生的潛在問題。另外，腺病毒基因組攜帶外源DNA的能力相對于其它基因輸送載體也是較大的(高達8kb)(Berkner等，文獻同上；Haj-Ahmand andGraham(1986)病毒學雜志57:267)。目前最常用的因而也是本發(fā)明優(yōu)選的復制缺陷的腺病毒載體缺失了病毒E1和E3基因的全部或部分但仍保持多達80％的腺病毒遺傳物質(例如，參見Jones等(1979)細胞16:683；Berkner等，文獻同上；Graham等，《分子生物學方法》，E.J.Murray編輯(Humana,Clifton,NJ,1991)，第7卷，第109-127頁)。插入的hedgehog基因的表達可在例如E1A啟動子、主要晚期啟動子(MLP)和相關前導序列、E3啟動子或外源添加的啟動子序列的控制下。
除了如上所述的病毒轉移方法，也可采用非病毒方法以使hedgehog多肽在動物組織中表達。大多數(shù)非病毒基因轉移方法依賴于哺乳動物細胞吸收及胞內轉運大分子所用的正常機制。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的非病毒基因輸送系統(tǒng)依賴于胞吞途徑已由靶細胞吸收hedgehog多肽基因。這一類型的基因輸送系統(tǒng)的例子包括脂質體衍生的系統(tǒng)、聚賴氨酸綴合物以及人工病毒包膜。
在臨床設置中，用于治療性hedgehog基因的基因輸送系統(tǒng)可以通過各種方法導入患者，每種方法均是本領域熟知的。例如，基因輸送系統(tǒng)的藥物制劑可經(jīng)例如靜脈注射系統(tǒng)導入，靶細胞中的蛋白質的特異性轉導主要由基因輸送載體提供的轉染的特異性，由于控制受體基因表達的轉錄調節(jié)序列導致的細胞型或組織型表達的特異性，或其組合所產生。在其它實施方案中，重組基因的最初輸送更限制在導入相當局限的動物內。例如，基因輸送載體可經(jīng)導管(見美國專利5,328,470)或立體異構(stereotactic)注射(例如Chen等(1994)PNAS 91:3054-3057)而導入。hedgehog表達構建體可在基因治療構建體中經(jīng)例如電穿孔被輸送至皮膚細胞，電穿孔所用技術例如如Dev等((1994)癌癥治療綜述20:105-115)所述。
基因治療構建體的藥物制劑可基本上由在可接受的稀釋劑中的基因輸送系統(tǒng)組成，或者可包括一種緩釋基質，該基質中包埋基因輸送載體?；蛘?，當可從重組細胞完整產生完整的基因輸送系統(tǒng)，例如逆轉錄病毒載體時，藥物制劑可包括一或多種產生基因輸送系統(tǒng)的細胞。
在另一個實施方案中，hedgehog或ptc治療劑可以是一種“基因活化”構建體，其通過與基因組DNA同源重組而改變內源基因的轉錄調節(jié)序列。例如，基因活化構建體可以將hedgehog基因的內源啟動子用異源啟動子替換，所述異源啟動子例如是在不同于基因的正常表達模式的條件下能導致hedgehog基因的組成型表達或導致該基因的誘導型表達的啟動子。patched信號途徑中的其它基因可以類似地靶擊。已知基因活化構建體的各種不同形式。例如，參見Transkaryotic治療公司的PCT出版物WO93/09222,WO95/31560,WO96/29411,WO95/31560和WO94/12650。
在優(yōu)選的實施方案中，用作基因活化構建體的核苷酸序列可以包括(1)來自內源性hedgehog基因的某些部分(外顯子序列，內含子序列，啟動子序列等)的指導重組的DNA和(2)異源轉錄調控序列，其在基因活化構建體的重組后與基因組hedgehog基因的編碼序列可操縱相連。為用于產生hedgehog生產細胞的培養(yǎng)物，該構建體還可進一步包括報道基因以檢測細胞中剔除構建體的存在。
基因活化構建體插入細胞，并與細胞的基因組DNA在如此的位置整合，以將異源調控序列可操縱地與天然hedgehog基因結合。這種插入經(jīng)同源重組而發(fā)生，即與內源性hedgehog基因序列同源的活化構建體的重組區(qū)與基因組DNA雜交，并與基因組序列重組，從而該構建體摻入基因組DNA的相應位置。
術語“重組區(qū)”或“靶序列”是指基因活化構建體的區(qū)段(即一部分)，其具有與基因組序列基本上相同或基本上互補的序列，例如，包括基因組基因的5’側翼序列，并可促進基因組序列和靶轉基因構建體之間的同源重組。
如本文所用，術語“置換區(qū)”是指活化構建體的一部分，其在重組區(qū)和基因組序列之間的同源重組后整合進內源性染色體位置。
異源調控序列，例如，提供在置換區(qū)的異源調控序列，可包括一或多個不同元件，包括啟動子(如組成型或誘導型啟動子)、增強子、陰性調控元件、基因座控制區(qū)、轉錄因子結合位點或其組合?？捎糜诳刂瓢谢虻捏w內表達的啟動子/增強子包括但不限于巨細胞病毒(CMV)啟動子/增強子(Karasuyama等，1989，實驗醫(yī)學雜志，169:13)，人β-肌動蛋白啟動子(Gunning等(1987)PNAS 84:4831-4835)，存在于小鼠乳腺瘤病毒長末端重復序列(MMTV LTR)中的糖皮質激素誘導型啟動子(Klessig等(1984)分子細胞生物學4:1354-1362),Moloney鼠白血病病毒的長末端重復序列(MuLV LTR)(Weiss等(1985)RNA腫瘤病毒，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)，SV40早期或晚期區(qū)啟動子(Bemoist等(1981)自然290:304-310；Templeton等(1984)分子細胞生物學4:817；Sprague等(1983)病毒學雜志45:773),Rous肉瘤病毒(RSV)的3’長末端重復序列中所含的啟動子(Yamamoto等，1980，細胞22:787-797)，單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶啟動子/增強子(Wagner等(1981)PNAS82:3567-71)，以及單純皰疹病毒LAT啟動子(Wolfe等(1992)自然遺傳學1:379-384)。
在一舉例性實施方案中，部分人Shh基因的5’側翼區(qū)用加入限制性位點的引物擴增，產生下述片段5’-gcgcgcttcgaaGCGAGGCAGCCAGCGAGGGAGAGAGCGAGCGGGCGAGCCGGAGCGAGGAAatcgatgcgcgc(引物1)5’-gcgcgcagatctGGGAAAGCGCAAGAGAGAGCGCACACGCACACACCCGCCGCGCGCACTCGggatccgcgcgc(引物2)如所示出的，引物1包括人Shh基因的5’非編碼區(qū)并且側翼為AsuⅡ和ClaⅠ限制性位點。引物2包括位于引物1中存在的5’非編碼區(qū)序列3’的5’非編碼區(qū)的一部分。hedgehog基因序列的側翼為XhoⅡ和BamHⅠ限制性位點。用每種合適的酶切割純化的擴增物。
載體pCDNA1.1(Invitrogen)包括一CMV啟動子，用在CMV啟動子序列3’裂解的AsuⅡ切割質粒，將引物1的AsuⅡ/ClaⅠ片段與pcDNA載體的AsuⅡ裂解位點連接。ClaⅠ/AsuⅡ連接破壞了在正確插入的引物1的3’末端的AsuⅡ位點。
然后用BamHⅠ切割載體，并將引物2的XhoⅡ/BamHⅠ片段連接到該BamHⅠ連接位點。如上所述，BamHⅠ/XhoⅡ連接破壞了正確插入的引物2的5’末端的BamHⅠ位點。
選擇各個菌落，用AsuⅡ和BamHⅠ切割，并測定AsuⅡ/BamHⅠ片段的大小。其中引物1和引物2序列均正確插入的菌落進一步擴增，并用AsuⅡ和BamHⅠ切割產生如下基因活化構建體cgaagcgaggcagccagcgagggagagagcgagcgggcgagccggagcgaggaaATCGAAGGTTCGAATCCTTCCCCCACCACCATCACTTTCAAAAGTCCGAAAGAATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGTAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCgatctgggaaagcgcaagagagagcgcacacgcacacacccgccgcgcgcactcgg在這一構建體中，側翼的引物1和引物2序列提供了重組區(qū)，其允許CMV啟動子插入人Shh基因的編碼序列之前。其它異源啟動子(或其它轉錄調控序列)可通過類似方法插入基因組hedgehog基因中。
在其它實施方案中，置換區(qū)僅僅缺失了天然基因的陰性轉錄控制元件以例如活化表達或者除去(ablate)陽性控制元件，以例如抑制靶基因的表達。Ⅴ．舉例性的ptc治療化合物在另一實施方案中，本發(fā)明方法用ptc治療組合物進行。這種組合物可以用例如與patched結合并改變其信號轉導活性的化合物、改變參與patched信號途徑的蛋白(例如胞內蛋白)的結合和/或酶學活性的化合物、以及改變hedgehog蛋白、patched蛋白或參與patched的胞內信號轉導途徑的蛋白的表達水平的化合物來產生。
純化的和重組hedgehog多肽的可得性促進了可用于篩選藥物如小有機分子的分析系統(tǒng)的產生，該藥物是hedgehog和/或patched蛋白的正常細胞功能、特別是它們在水平細胞增殖和/或分化的病理中的作用的興奮劑或拮抗劑。在一個實施方案中，所述分析評價化合物調節(jié)hedgehog多肽和hedgehog受體如patched之間結合的能力。在其它實施方案中，所述分析僅僅記錄測試化合物改變patched蛋白的信號轉導活性的能力。以這種方式，可鑒別各種增殖性活性和抗增殖性活性的hedgehog和/或ptc治療劑。有各種分析形式可提供給本領域技術人員，并且根據(jù)本發(fā)明的教導其是可由本領域技術人員理解的。
在測試化合物庫和天然提取物的許多藥物篩選程序中，希望的是高通量分析以便使給定時間內分析的化合物數(shù)達到最大。在無細胞系統(tǒng)中進行的分析，如可用純化的或半純化的蛋白質衍生的分析經(jīng)常是“初級”篩選所優(yōu)選的，因為它們可允許快速開發(fā)及容易檢測由測試化合物介導的分子靶中的改變。另外，測試化合物的細胞毒性和/或生物利用性的效果可通常在體外系統(tǒng)中忽視，分析主要集中于藥物對分子靶的作用效果，其可由與受體蛋白的結合親和性的改變而證實。
因此，在一個舉例性的篩選ptc治療劑的分析中，感興趣的化合物與包括hedgehog受體蛋白(例如表達patched受體的細胞)和hedgehog蛋白的混合物在通常該化合物能結合hedgehog蛋白的條件下接觸，然后向混合物中加入含有測試化合物的組合物。受體/hedgehog復合物的檢測和定量提供了一種確定測試化合物抑制(或增強)受體蛋白和hedgehog多肽之間形成復合物的功效的手段。化合物的功效可通過從用各種濃度測試化合物獲得的數(shù)據(jù)產生劑量應答曲線來評價。另外，還可進行對照分析以提供基線用于比較。在對照分析中，將分離的純化的hedgehog多肽加入到受體蛋白，并在缺少測試化合物的條件下定量受體/hedgehog復合物的形成。
在其它實施方案中，本發(fā)明的ptc治療劑是破壞patched與smoothened的結合的治療劑。
通過隨后用例如培養(yǎng)的上皮細胞進行測試可以區(qū)分上皮細胞生長的興奮劑和拮抗劑并可以評價化合物的功效。
在一舉例性實施方案中，用作hedgehog受體的多肽可從patched蛋白產生。因此，一舉例性的篩選分析包括完整的或合適部分的patched蛋白，其可從例如，人patched基因(GenBank U43148)或其它脊椎動物來源(雞patched基因，GenBank登錄號U40074，小鼠patched基因，U46155)，以及果蠅(GenBank登錄號M28999)或其它無脊椎動物來源獲得。在篩選分析中，patched蛋白可以完整蛋白形式提供(優(yōu)選地在細胞表面表達)，或者作為與hedgehog多肽結合的全長蛋白的片段提供，例如，作為一個或兩個基本上為胞外的結構域提供(例如，相應于人patched蛋白的殘基Asn120-Ser438和/或Arg770-Trp1027，其也是hedgehog依賴性信號轉導的潛在拮抗劑)。例如，patched蛋白可以可溶形式提供，例如作為一個胞外結構域的制備物，或經(jīng)非結構接頭共價連接的兩個胞外結構域的制備物(參見，例如Huston等(1988)PNAS85:4879；美國專利5,091,513)。在其它實施方案中，該蛋白可以脂質體制劑的一部分提供或在細胞表面表達。patched蛋白可衍生自例如在異源細胞中異位表達的重組基因。例如，該蛋白可通過標準重組DNA技術在卵細胞、哺乳動物細胞(例如，COS,CHO,3T3等)或酵母細胞上表達。這些重組細胞可用于受體結合、信號轉導或基因表達分析。Marigo等(1996)發(fā)育122:1225-1233描述了人hedgehog與在Xenopus laevis卵細胞中異位表達的雞patched蛋白的結合分析。Marigo等的分析系統(tǒng)可適于本發(fā)明的藥物篩選分析。如該文獻所述，Shh以一種選擇性、飽和的、劑量依賴性方式與patched蛋白結合，由此證實patched是Shh的受體。
hedgehog多肽和hedgehog受體間的復合物形成可通過各種技術檢測，例如，可用例如可檢測標記的蛋白質如放射標記的、熒光標記的或酶標記的hedgehog多肽經(jīng)免疫分析或經(jīng)色譜檢測而定量對復合物形成的調控。
典型地，對于無細胞分析，希望的是固定化hedgehog受體或hedgehog多肽以利于從非復合形式的一種蛋白中分離受體/hedgehog復合物，以及適應分析的自動化。在一個實施方案中，可提供一融合蛋白，其添加了一能使蛋白與基質結合的結構域。例如，可將谷胱甘肽-S-轉移酶/受體(GST/受體)融合蛋白吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma化學公司，St.Louis,MO)或谷胱甘肽衍生的微滴板上，然后將其與hedgehog多肽，例如35S-標記的hedgehog多肽及測試化合物混和，并在利于復合物形成的條件下保溫，例如在生理條件的鹽和pH下保溫，當然稍嚴格的條件可能是希望的。保溫后，洗滌珠以除去任何未結合的hedgehog多肽，直接測定基質珠結合的放射標記(例如，置于閃爍劑中的珠)，或在受體/hedgehog復合物解離后在上清液中測定。或者，可從珠中解離復合物，經(jīng)SDS-PAGE凝膠分離，用標準電泳技術從凝膠中定量在珠組分中發(fā)現(xiàn)的hedgehog多肽水平。
還有其它的將蛋白質固定在基質上的技術可用于本發(fā)明分析。例如，hedgehog受體蛋白的可溶部分用生物素和鏈親和素的綴合而固定化。例如，用本領域熟知的技術(例如，生物素化試劑盒，Pierce化學公司，Rockford,IL)可從生物素-NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)制備生物素化受體分子，并固定在鏈親和素包被的96孔平板(Pierce化學公司)的孔中。或者，與hedgehog受體反應但不干擾hedgehog結合的抗體可衍生化至平板的孔中，并經(jīng)抗體綴合在孔中捕獲受體。如上所述，在平板的存在受體孔中保溫hedgehog多肽的制備物和測試化合物，并可以定量孔中捕獲的受體/hedgehog復合物的量。檢測這種復合物的方法除了上述檢測GST-固定化復合物的方法外，還包括用與hedgehog多肽反應的抗體，或與受體蛋白反應并競爭結合hedgehog多肽的抗體免疫檢測復合物，以及基于檢測與hedgehog多肽相關的酶活性的酶聯(lián)分析。在后者情況下，酶可以是化學綴合的或以與hedgehog多肽的融合蛋白形式提供。舉例來說，hedgehog多肽可與堿性磷酸酶化學交聯(lián)或遺傳融合，可用該酶的生色底物如對硝基苯磷酸評價復合物中捕獲的hedgehog多肽的量。類似地，可提供包含hedgehog多肽和谷胱甘肽-S-轉移酶的融合蛋白，并用1-氯-2,4-二硝基苯檢測GST活性來定量復合物形成(Habig等(1974)生物化學雜志249:7130)。
對于依賴免疫檢測定量復合物中捕獲的一種蛋白的方法，可使用抗該蛋白的抗體，如本文描述的抗hedgehog抗體?；蛘撸瑥秃衔镏写龣z測的蛋白質可以融合蛋白的形式進行“表位附加”，該融合蛋白除包括hedgehog多肽或hedgehog受體序列外，還包括可容易獲得其抗體的第二種多肽(例如，商購抗體)。例如，用抗GST基元的抗體，上述GST融合蛋白還可用于定量結合。其它有用的附加表位包括myc-表位(例如，參見Ellison等(1991)生物化學雜志266:21150-21157)，其包括來自c-myc的10殘基序列，以及pFLAG系統(tǒng)(International Biotechnologies,Inc.)或pEZZ-蛋白A系統(tǒng)(Pharmacia,NJ)。
當希望的hedgehog受體部分(或其它結合hedgehog的分子)不能以可溶形式提供時，可使用脂質體小泡以提供可操作的和可分離的受體來源。例如，可將真的和重組形式的patched蛋白重組在人工脂質體小泡(例如磷脂酰膽堿脂質體)或細胞膜衍生的小泡中(例如，參見Bear等(1992)細胞68:809-818；Newton等(1983)生物化學22:6110-6117；Reber等(1987)生物化學雜志262:11369-11374)。
除了上述無細胞分析外，現(xiàn)有技術提供的很易得到的hedgehog蛋白的來源也有利于產生基于細胞的分析以鑒別小分子興奮劑/拮抗劑等。與上述篩選組合文庫的基于細胞的分析類似，可將對hedgehog誘導敏感的細胞，例如patched表達細胞或對hedgehog誘導敏感的其它上皮衍生細胞與hedgehog蛋白和感興趣的測試試劑接觸，分析中的評分為在存在和不存在測試試劑時與細胞的簡單結合至靶細胞對hedgehog誘導性應答的調控。與無細胞分析一樣，可鑒別產生hedgehog活性的統(tǒng)計學顯著變化(抑制或增強)的試劑。
在其它實施方案中，基于細胞的分析評價破壞例如細胞表面膜或脂質體制備物中的patched和smoothened蛋白的結合的試劑。
除了鑒別天然表達patched蛋白的細胞外，已遺傳工程化異位表達patched的細胞還可用于藥物篩選分析。例如，表達低水平或不表達patched蛋白的細胞，例如Xenopus laevis卵細胞，COS細胞或酵母細胞可用標準技術遺傳修飾以異位表達patched蛋白(見Marigo等，文獻同上)。
得到的重組細胞，例如表達有功能的patched受體的細胞可用于受體結合分析中以鑒別hedgehog結合的興奮劑或拮抗劑。結合分析可用完整細胞進行。另外，本發(fā)明的重組細胞可以工程化以包括編碼參與hedgehog依賴性信號途徑的蛋白的其它異源基因。例如，sommothened,costal-2和/或fused中的一或多種的基因產物可在反應物細胞中與patched共表達，從而分析對hedgehog信號轉導級聯(lián)的有功能重建敏感。
或者，可應用使用重組的patched蛋白的脂質體制備物。從來自真的和重組來源的去污劑提取物純化的patched蛋白可重組在人工脂質體小泡(例如磷脂酰膽堿脂質體)或細胞膜衍生的小泡中(例如，參見Bear等(1992)細胞68:809-818；Newton等(1983)生物化學22:6110-6117；Reber等(1987)生物化學雜志262:11369-11374)。得到的脂質體的薄層結構和大小可用電子顯微鏡鑒別。重組的膜中的patched蛋白的外部取向可通過例如免疫電子顯微鏡術證實。在候選試劑存在下含有patched的脂質體和沒有該蛋白的脂質體的hedgehog蛋白結合活性可進行比較以鑒別hedgehog-patched相互作用的潛在調控物。
用于這些基于細胞的分析中的hedgehog蛋白可以純化的來源(天然或重組的來源)提供，或以表達該蛋白并與靶細胞共培養(yǎng)的細胞/組織形式提供。如在無細胞分析中一樣，當在分析中記錄到hedgehog活性僅僅是簡單的結合(而非誘導)時，可用任何上述技術標記蛋白，例如熒光標記，酶標記或放射標記，或用免疫分析檢測。
除了結合分析，可使用功能分析鑒別hedgehog或patched活性的調控物，即興奮劑或拮抗劑。通過檢測在與測試試劑接觸的表達patched的細胞胞內信號的變化，如第二信使或基因表達的改變，可以鑒別patched信號的候選興奮劑和拮抗劑。
有許多基因產物參與patched介導的信號轉導，包括patched,轉錄因子cubitus interruptus(ci)，絲氨酸/蘇氨酸激酶fused(fu)以及costal-2,smoothened和fused的抑制基因的基因產物。
Hedgehog蛋白與patched的相互作用激活一級聯(lián)，其參與下游效應器的活化和抑制，在某些情況下，其最終結果是，在基因的轉錄或翻譯中導致一可檢測的變化。Patched信號轉導的潛在轉錄靶是patched基因本身(Hidalgo and Ingham,1990發(fā)育110,291-301；Marigo等，1996)以及果蠅cubitus interruptus基因的脊椎動物同系物GLI基因(Hui等(1994)發(fā)育生物學162:402-413)。patched基因表達已證明在應答Shh的肢芽和神經(jīng)板細胞中被誘導(Marigo等(1996)PNAS，出版中；Marigo等(1996)發(fā)育122:1225-1233)。GLI基因編碼具有鋅指DNA結合結構域的推測的轉錄因子(Orenic等(1990)基因和發(fā)育4:1053-1067；Kinzler等(1990)分子細胞生物學10:634-642)。已報道GLI基因的轉錄在肢芽中應答hedgehog而正調，而GLI3基因的轉錄應答hedgehog誘導而下調(Marigo等(1996)發(fā)育122:1225-1233)。通過從這種靶基因選擇轉錄調控序列，例如從patched或GLI基因選擇轉錄調控序列，這些調控序列負責應答patched信號轉導而正調或下調這些基因，并將這種啟動子與報道基因可操縱相連，則可衍生一基于轉錄的分析，其對特異測試化合物修飾patched信號轉導途徑的能力敏感。因此，報道基因的表達提供了開發(fā)作為分化/靜止的ptc誘導的興奮劑或拮抗劑的化合物的有價值的篩選工具。
本發(fā)明的基于報道基因的分析測量上述級聯(lián)的最末期，例如轉錄調控。因此，在實施該分析的一個實施方案時，報道基因構建體被插入反應細胞(reagent cell)以產生依賴于ptc信號轉導的檢測信號。為鑒別靶基因的轉錄調控序列中存在的潛在的應答ptc信號轉導的調控元件，可用標準技術構建靶基因的基因組克隆的嵌套缺失。例如，參考《分子生物學當前方案》，Ausubel,FM等編輯，Greene出版協(xié)會，(1989)；美國專利5,266,488；Sato等(1995)生物化學雜志270:10314-10322；Kube等(1995)細胞因子7:1-7。來自基因的5′側翼區(qū)的嵌套系列DNA片段被置于報道基因如螢光素酶基因的上游，并分析其在表達patched的細胞中指導報道基因表達的能力。可以記錄在hedgehog存在和不存在下用報道基因構建體瞬時轉染的宿主細胞中報道基因的誘導表達，以確定應答patched依賴性信號轉導的調控系列。
在實施該分析的一個實施方案時，報道基因構建體插入到反應細胞以產生依賴于用hedgehog蛋白誘導產生的第二信使的檢測信號。典型地，報道基因構建體包括與應答hedgehog活性的一或多個轉錄調控元件可操縱相連的報道基因，報道基因的表達水平提供了hedgehog依賴的檢測信號。從報道基因轉錄的量可用任何本領域技術人員已知的合適方法測量。例如，來自報道基因的mRNA的表達可用RNAse保護或基于RNA的PCR檢測，或者報道基因的蛋白產物可用特征性染色或固有活性鑒別。報道基因的表達量然后與在不存在測試化合物(或hedgehog)時相同細胞的表達量比較，或者其可與缺少靶受體蛋白的基本上相同的細胞中的轉錄量比較。轉錄量的任何統(tǒng)計學或其它方式顯著的差異表示測試化合物以某種方式改變patched蛋白的信號轉導，例如測試化合物是潛在的ptc治療劑。
如下所進一步詳述的，在優(yōu)選實施方案中，報道基因的基因產物通過與該產物相關的固有活性檢測。例如，報道基因可編碼一基因產物，該產物通過酶活性給出基于顏色、熒光或發(fā)光的檢測信號。在其它優(yōu)選的實施方案中，報道基因或標記基因提供了選擇性生長的優(yōu)勢，例如，報道基因可增強細胞存活性，降低細胞營養(yǎng)要求，和/或提供對藥物的抗性。
優(yōu)選的報道基因是容易檢測的報道基因。報道基因也可包括在構建體中，以與包括所需的轉錄調控系列或展示其它所需性質的基因形成融合基因的形式存在。報道基因的例子包括但不限于CAT(氯霉素乙酰轉移酶)(Alton and Vapnek(1979)，自然282:864-869)，螢光素酶和其它酶檢測系統(tǒng)，如β-半乳糖苷酶；螢火蟲螢光素酶(deWet等(1987)分子細胞生物學7:725-737)；細菌螢光素酶(Engebrecht and Silverman(1984),PNAS1:4154-4158；Baldwin等(1984)，生物化學23:3663-3667)；堿性磷酸酶(Toh等(1989)歐洲生物化學雜志182:231-238,Hall等(1983)分子應用遺傳學雜志2:101)，人胎盤分泌的堿性磷酸酶(Cullen and Malim(1992)酶學方法216:362-368)。
可包括在報道基因構建體中的轉錄控制元件包括但不限于啟動子，增強子和阻遏蛋白和活化蛋白結合位點。合適的轉錄調控元件可衍生自在調控patched信號轉導途徑后其表達被誘導的基因的轉錄調控區(qū)。衍生轉錄控制元件的優(yōu)選的基因的特征包括但不限于在靜止細胞中表達很低或檢測不到，在胞外模擬幾分鐘內快速誘導轉錄水平，誘導是瞬時的且不依賴于新蛋白質的合成，隨后轉錄的關閉需要新的蛋白質合成，從這些基因轉錄的mRNA具有短的半壽期。不需要所有這些性質均存在。
在其它實施方案中，第二信使的產生可直接在檢測步驟測量，如定量胞內鈣的移動，磷脂代謝或腺苷酸環(huán)化酶活性，例如，可測量磷脂水解的產物IP3,DAG或cAMP。例如，最近的研究表面蛋白激酶A(PKA)是hedgehog/patched信號途徑的一個可能的組分(Hammerschmidt等(1996)基因和發(fā)育10:647)。已表明高PKA活性在這些系統(tǒng)中拮抗hedgehog信號轉導。盡管還不清楚PKA是直接作用于下游還是與hedgehog信號轉導平行作用，但可能的是hedgehog信號轉導通過抑制PKA活性而發(fā)生。因此，檢測PKA活性提供了本分析的潛在的讀出器。
在一個優(yōu)選的實施方案中，ptc治療劑是PKA抑制劑?，F(xiàn)有技術中已知各種PKA抑制劑，包括肽化合物和有機化合物。例如，ptc治療劑可以是5-異喹啉磺酰胺，如由下述通式所代表的 其中，R1和R2各自獨立地代表氫，并且若化合價和穩(wěn)定性允許則代表低級烷基，低級鏈烯基，低級炔基，羰基(如羧基、酯、甲酸酯或酮)，硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)，氨基，?；被?，酰氨基，氰基，硝基，疊氮基，硫酸酯，磺酸酯，亞磺酰氨基，-(CH2)m-R8,-(CH2)m-OH,-(CH2)m-O-低級烷基，-(CH2)m-O-低級鏈烯基，-(CH2)n-O-(CH2)m-R8,-(CH2)m-SH,-(CH2)m-S-低級烷基，-(CH2)m-S-低級鏈烯基，-(CH2)n-S-(CH2)m-R8，或者R1和R2一起與N形成一雜環(huán)(取代的或未取代的)；R3不存在或代表異喹啉環(huán)的一或多個取代，如低級烷基，低級鏈烯基，低級炔基，羰基(如羧基、酯、甲酸酯或酮)，硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)，氨基，?；被?，酰氨基，氰基，硝基，疊氮基，硫酸酯，磺酸酯，亞磺酰氨基，-(CH2)m-R8,-(CH2)m-OH,-(CH2)m-O-低級烷基，-(CH2)m-O-低級鏈烯基，-(CH2)n-O-(CH2)m-R8,-(CH2)m-SH,-(CH2)m-S-低級烷基，-(CH2)m-S-低級鏈烯基，-(CH2)n-S-(CH2)m-R8；R8代表取代的或未取代的芳基，芳烷基，環(huán)烷基，環(huán)烯基或雜環(huán)；以及n和m各自獨立為0或1-6的整數(shù)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，PKA抑制劑是N-[2-((p-溴肉桂基)氨基)乙基]-5-異喹啉磺酰胺(H-89；Calbiochem，貨號371963)，例如，具有下式 在另一個實施方案中，PKA抑制劑是1-(5-異喹啉磺?；?-2-甲基哌嗪(H-7；Calbiochem，貨號371955)，例如，具有下式 在其它實施方案中，PKA抑制劑是KT5720(Calbiochem，貨號420315)，具有下述結構 各種核苷類似物也可用作PKA抑制劑，例如本發(fā)明方法可用抑制PKA激酶活性的環(huán)化AMP類似物進行，例如，8-溴-cAMP或二丁酰-cAMP
PKA活性的肽抑制劑的例子包括PKA熱穩(wěn)定抑制劑(同工型α；例如參見Calbiochem，貨號539488；Wen等(1995)生物化學雜志270:2041)。
某些hedgehog受體可刺激磷脂酶活性。肌醇脂可用標準脂類提取技術提取并分析。所有三種肌醇脂(IP1,IP2,IP3)的可溶性衍生物也可用放射標記技術或HPLC定量。
胞內鈣的移動或來自細胞外的鈣內向通量可以是對hedgehog刺激或缺乏的應答。反應細胞中的鈣內向通量可用標準技術測量。合適的鈣指示劑，熒光，生物發(fā)光，金屬顯色或鈣離子敏感的微電極的選擇取決于細胞類型以及所研究的事件的量級和時間常數(shù)(Borle(1990)環(huán)境健康預測84:45-56)。作為鈣離子檢測的舉例方法，可用標準技術將細胞加載鈣離子敏感的熒光染料fura-2或indo-1，并用熒光劑測量鈣離子的任何變化。
在該分析的某些實施方案中，可能希望的是篩選細胞磷酸化的變化。例如，編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶的果蠅基因fused(fu)已被鑒別為hedgehog信號轉導中潛在的下游靶(Preat等，1990，自然347,87-89；Therond等，1993,Mech.Dev.44,65-80)?；衔镎{控絲氨酸/蘇氨酸激酶活化的能力可用抗磷酸化絲氨酸或蘇氨酸殘基的抗體經(jīng)集落免疫印跡(Lyons and Nelson(1984)美國科學院院刊81:7426-7430)篩選。進行這種分析的試劑是可商購的，例如測量絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化增加的磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸特異性抗體可商購。
在另一個實施方案中，ptc治療劑是一種反義分子，其抑制參與patched介導的信號轉導途徑的蛋白質的表達。舉例來說，通過抑制參與patched信號的蛋白質如fused,costal-2,smoothened和/或Gli基因的表達，patched信號途徑抑制細胞增殖的能力可以被改變，例如增強或阻遏。
如本文所用，“反義”治療是指給予或原位產生在細胞條件下與編碼hedgehog蛋白，patched或參與patched介導的信號轉導的蛋白的細胞mRNA和/或基因組DNA特異地雜交(例如結合)的寡核苷酸探針或其衍生物。雜交應例如通過抑制轉錄和/或翻譯而抑制該蛋白的表達。結合應通過常規(guī)的堿基對互補，或者，例如在與DNA雙螺旋結合的情況下，通過在雙螺旋的大溝中的特異相互作用進行。通常，“反義”治療指現(xiàn)有技術中通常采用的技術范圍，并包括基于與寡核苷酸序列的特異結合的任何療法。
本發(fā)明的反義構建體可以例如作為表達質粒而輸送，其在細胞中轉錄時，產生與靶細胞mRNA的至少一獨特部分互補的RNA?；蛘?，反義構建體是一寡核苷酸探針，其來自體內產生，并且當導入細胞時，通過與靶基因的mRNA和/或基因組序列的雜交導致表達的抑制。這種寡核苷酸探針優(yōu)選地是修飾的寡核苷酸，其對內源性核酸酶例如外切核酸酶和/或內切核酸酶有抗性，并且因此是體內穩(wěn)定的。用作反義寡核苷酸的核酸分子的例子是DNA的磷酰胺、硫代磷酸和甲基膦酸類似物(也參見美國專利5,176,996；5,264,564和5,256,775)。另外，構建用于反義治療的寡聚物的通用方案已由例如Van der Krol等(1988)生物技術6:958-976；Stein等(1988)癌癥研究48:2659-2668綜述。
當構建反義寡核苷酸用于本發(fā)明方法時應考慮(1)寡聚物應具有50％或更高的GC含量；(2)避免具有3個或更多個G的序列段；(3)寡核苷酸應不超過25-26聚體。當測試反義寡核苷酸時，應構建錯配的對照。對照可通過反轉相應的反義寡核苷酸的序列順序而產生以保持相同的堿基比例。
在一舉例性實施方案中，ptc治療劑可以是用于抑制patched表達的反義寡核苷酸，例如以模擬hedgehog對patched的抑制。舉例性的反義構建體包括5′-GTCCTGGCGCCGCCGCCGCCGTCGCC5′-TTCCGATGACCGGCCTTTCGCGGTGA5′-GTGCACGGAAAGGTGCAGGCCACACTⅥ．舉例性的hedgehog和ptc治療劑的藥物制劑待配制的hedgehog和ptc治療劑的來源將取決于試劑的的特定形式。小有機分子和肽片段可以化學合成并以純的形式提供以適合藥用/美容用。天然提取物的產物可根據(jù)現(xiàn)有技術已知的技術提純。例如，Cox等的美國專利5,286,654描述了提純天然形式的分泌蛋白的方法并可用于純化hedgehog多肽。重組來源的hedgehog多肽也是可利用的。例如，從PCT出版物WO95/18856和WO96/17924特別地已知編碼hedgehog多肽的基因。
治療上皮組織的技術人員可以確定配制在藥物或美容制劑中的hedgehog或ptc治療劑的有效量。
用于本發(fā)明方法的hedgehog或ptc治療劑配制品最優(yōu)選地以合適的組合物形式施用。合適的組合物可以提及通常用來系統(tǒng)或局部施用藥物的所有組合物。藥物學可接受的載體應是基本上惰性的，從而不與活性成分作用。合適的惰性載體包括水、醇聚乙二醇、礦物油或石油凝膠，丙二醇等。
為制備本發(fā)明的藥物組合物，將作為活性成分的有效量的特定hedgehog或ptc治療劑與藥物學可接受的載體混和，該載體根據(jù)給藥所需的制劑形式可采用各種形式。希望的是這些藥物組合物呈適合特別是口服、直腸、經(jīng)皮或非腸道注射的給藥方式的單一劑量形式。例如，在制備口服劑型的組合物時，可采用任何常用的藥物介質，如在口服液體制劑如懸液，糖漿，酏劑和溶液情況下為水，乙二醇，油，醇等；在粉劑，丸劑，膠囊劑和片劑情況下為固體載體如淀粉，蔗糖，高嶺土，潤滑劑，粘合劑，崩解劑等。由于其易于給藥，片劑和膠囊劑為最有利的口服劑型，在此情況下顯然采用固體藥物載體。對于非腸道組合物，載體通常包括無菌水，無菌水至少占大部分，當然其它成分，例如有助于溶解性的成分也可包括?？芍苽淇勺⑸淙芤海缙渲械妮d體包括鹽水溶液，葡萄糖溶液或鹽水和葡萄糖溶液的混合物。也可制備可注射懸液，其中可采用合適的液體載體，懸浮劑等。還包括固體形式的制劑，其在即將使用前可被轉變成液體形式的制劑。在適于經(jīng)皮施用的組合物中，載體任選地包括穿透促進劑和/或合適的潤濕劑，其任選地與少量的任意性質的合適添加劑混和，該添加劑不會引起對皮膚的顯著破壞作用。
除了制劑的直接局部施用外，它們可經(jīng)其它方法局部施用，例如，包囊在溫度和/或壓力敏感基質中或包囊在可溶于體液的薄膜或固體載體中等以隨后釋放，優(yōu)選地緩釋活性成分。
用于局部施用的合適的組合物可包括所有通常用于局部施用治療劑的組合物，例如，霜劑，者哩(gellies)，敷料，香波，酊劑，糊劑，軟膏劑，油膏劑，粉劑，液體或半液體配制品等。所述組合物的施用可通過帶有或不帶有推進劑如氮氣，二氧化碳，氟利昂的氣霧劑如泵式噴霧器，滴劑，洗劑，或半固體如增稠的組合物，其可用拭子施用。在特定的組合物中，半固體組合物如油膏劑，霜劑，糊劑，者哩，軟膏劑等可方便地使用。
特別有利的是將本發(fā)明組合物配制成易于給藥并且劑量單一的劑量單位形式。本文說明書和權利要求書中所用的劑量單位形式是指適于作為單元劑量的物理不連續(xù)的單位，每個單位含有經(jīng)計算能產生所需治療效果的預定量的活性成分及所需的藥物載體。這種劑量單位形式的例子是片劑(包括刻痕或包衣片劑)，膠囊劑，丸劑，粉末包，糯米紙囊劑，注射溶液或懸液，一茶匙容量，一大湯匙容量等，及其分離的多份。
如上所述，本發(fā)明的藥物制劑可用于被認為是美容用途的許多應用中。優(yōu)選地低致敏性并pH控制的現(xiàn)有技術中已知的美容組合物是特別優(yōu)選的，包括花露水，潤膚膏，洗劑，乳液或乳狀洗劑。該制劑除了hedgehog或ptc治療劑外還含有這種制劑中通常采用的組分。這種組分的例子為油，脂肪，蠟，表面活性劑，濕潤劑，增稠劑，抗氧化劑，粘度穩(wěn)定劑，螯合劑，緩沖劑，防腐劑，香水，染料，低級烷醇等。如果需要，其它成分也可摻入組合物中，例如抗炎劑，抗細菌劑，抗真菌劑，消毒劑，維生素，遮光劑，抗生素或其它抗痤瘡劑。
油的例子包括脂肪和如橄欖油和氫化油的油類；蠟如蜂蠟和羊毛脂；碳氫化合物如液體石蠟，地蠟，角鯊烷；脂肪酸如硬脂酸和油酸；醇如鯨蠟醇，十八烷醇，羊毛脂醇和十六烷醇；酯如異丙基肉豆蔻酸酯，異丙基棕櫚酸酯和丁基硬脂酸酯。表面活性劑的例子包括陰離子表面活性劑如硬脂酸鈉，十六烷基硫酸酯鈉，聚氧乙烯十二烷基醚磷酸酯，N-?；劝彼徕c；陽離子表面活性劑如硬脂酰二甲基芐基氯化銨和硬脂酰三甲基氯化銨；兩性表面活性劑如烷基氨基乙基甘氨酸鹽酸溶液和卵磷脂；非離子表面活性劑如甘油單硬脂酸酯，山梨聚糖單硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯，丙二醇單硬脂酸酯，聚氧乙烯油基醚，聚乙二醇單硬脂酸酯，聚氧乙烯山梨聚糖單棕櫚酸酯，聚氧乙烯椰子油脂肪酸單乙醇酰胺，聚氧丙二醇(例如，商標為“Pluronic”的物質)，聚氧乙烯海貍香油，聚氧乙烯羊毛脂。濕潤劑的例子包括甘油，1,3-丁二醇和丙二醇；低級醇的例子包括乙醇和異丙醇；增稠劑的例子包括黃原膠，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，聚乙二醇和羧甲基纖維素鈉；抗氧化劑的例子包括丁化羥基甲苯，丁基化羥基苯甲醚，沒食子酸丙酯，檸檬酸和乙氧基喹；螯合劑的例子包括乙二胺四乙酸二鈉和乙羥基二磷酸鹽；緩沖劑的例子包括檸檬酸，檸檬酸鈉，硼酸，硼沙和磷酸氫二鈉；防腐劑的例子包括甲基對羥基苯甲酸酯，乙基對羥基苯甲酸酯，脫氫乙酸，水楊酸和苯甲酸。
為制備軟膏劑，霜劑，花露水，乳液等，典型地將0.01-10％、特別是0.1-5％、更特別是0.2-2.5％活性成分例如hedgehog或ptc治療劑摻入組合物中。在軟膏劑或霜劑中，載體例如由1-20％、特別是5-15％濕潤劑，0.1-10％、特別是0.5-5％增稠劑和水組成；或者所述的載體可由70-99％、特別是20-95％表面活性劑和0-20％、特別是2.5-15％脂肪組織；或者由80-99.9％、特別是90-99％增稠劑組成；或者由5-15％表面活性劑，1-25％潤濕劑，0-80％油，非常少量(＜2％)防腐劑，著色劑和/或香水，和水組成。在花露水中，載體例如由2-10％低級醇，0.1-10％或特別是0.5-1％表面活性劑，1-20％，特別是3-7％潤濕劑，0-5％緩沖劑，水和非常少量(＜2％)防腐劑，染料和/或香水組成。在乳液中，載體典型地由10-50％油，1-10％表面活性劑，50-80％水和0-3％防腐劑和/或香水組成。在上述制劑中，所有百分數(shù)均為重量百分比。
用于本發(fā)明方法中的特別的組合物是其中的hedgehog或ptc治療劑配制在含有脂質體的組合物中的那些組合物。脂質體是由兩親性分子如極性脂形成的人工小泡，所述極性脂例如磷脂酰膽堿，乙醇胺和絲氨酸，鞘磷脂，心磷脂，縮醛磷脂，磷脂酸和腦苷脂。當將合適的兩性性分子在水或水溶液中溶脹以形成通常有由經(jīng)水性物質分開的許多雙層組成的多層結構的液晶(通常成為粗脂質體)時，脂質體會形成。已知由包囊水性物質的單一雙層組成的另一類型的脂質體被稱為單層小泡。如果在脂類的溶脹過程中水溶性物質包括在水相中，則它們被捕獲在脂雙層之間的水層中。
水溶性活性成分如各種鹽形式的hedgehog多肽被包囊在分子層之間的水性空間內。Hedgehog或ptc治療劑的脂溶性活性成分如有機模擬物主要摻入脂質層中，但是極性頭部基團從該層伸出進入水性空間。這些化合物的膠囊化可通過各種方法實現(xiàn)，最常用的方法涉及通過蒸發(fā)有機溶劑將磷脂薄膜鑄型至燒瓶壁上，當將此薄膜在合適的水性介質中分散時，形成多層脂質體。經(jīng)過合適的超聲處理，粗脂質體形成較小的類似閉合的小泡。
水溶性活性成分通常通過用化合物的水溶液分散該鑄型薄膜二摻入。然后經(jīng)離心、層析、透析或其它現(xiàn)有技術已知的合適程序除去未膠囊化的化合物。脂溶性活性成分通常通過在鑄型薄膜之前將其溶解于具有磷脂的有機溶劑中而摻入。如果脂相中的物質的溶解度或存在量沒有超過可與脂類結合的量，上述方法制備的脂質體通常含有結合在脂雙層中的大多數(shù)物質；不需分離脂質體和未膠囊化的物質。
制備脂質體配制形式的hedgehog和ptc治療劑的特別方便的方法是EP-A-253,619中描述的方法，該專利申請引入本文作參考。在該方法中，含有膠囊化的活性成分的單雙層脂質體的制備方法為，將脂類成分溶解在有機介質中，將脂類成分的有機溶液在壓力下注射進水性成分，同時用高速勻漿機或混和設備混和有機和水性成分，由此自發(fā)形成脂質體。
含有膠囊化的hedgehog或ptc治療劑的單雙層脂質體可直接采用，或者其可以與合適的藥物學可接受載體一起用于局部給藥。通過添加一或多種合適的增稠劑如黃原膠，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素及其混合物，可以增加脂質體的粘度。水性成分可僅由水組成，或者其可含有電解質，緩沖系統(tǒng)和其它成分如防腐劑?？刹捎玫暮线m的電解質包括金屬鹽如堿金屬和堿土金屬鹽。優(yōu)選的金屬鹽是氯化鈣，氯化鈉和氯化鉀。電解質的濃度范圍為0-260mM，優(yōu)選5mM-160mM。水性成分置于合適的容器中，該容器可適于經(jīng)在注射有機成分過程中產生大湍流而實現(xiàn)均質化。兩種成分的均質化可在該容器內完成，或者，水性成分和有機成分可分別注射進置于容器外的混和設備中。在后一情況下，在混和設備中形成脂質體，然后被轉移至另一容器中收集。
有機成分由合適的非毒性藥物學可接受的溶劑以及溶于該溶劑中的合適的磷脂組成，所述溶劑例如為乙醇，甘油，丙二醇和聚乙二醇?？刹捎玫暮线m的磷脂例如包括卵磷脂，磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，溶血磷脂酰膽堿和磷脂酰甘油。還可采用其它親脂性添加劑以選擇性修飾脂質體的性質。這種其它添加劑的例子包括硬脂酰胺，磷脂酸，生育酚，膽固醇和羊毛脂提取物。
另外，可防止磷脂氧化的其它成分也可加入到有機成分中，這種其它成分的例子包括生育酚，丁基化羥基苯甲醚，丁化羥基甲苯，棕櫚酸抗壞血酸酯和油酸抗壞血酸酯。也可加入防腐劑如苯甲酸，甲基對羥基苯甲酸酯和丙基對羥基苯甲酸酯。
除了上述組合物外，還可利用含有合適量的hedgehog或ptc治療劑的包裹物，例如膏藥，繃帶，敷料，紗布墊等。在某些情況下可利用已用含有治療劑配制品的局部用配制品浸漬的膏藥，繃帶，敷料，紗布墊等。
舉例本發(fā)明已一般性地描述，通過參照下述實施例其可更容易理解，實施例僅是舉例說明本發(fā)明的某些方面和實施例，而非限制本發(fā)明。Hedgehog蛋白的純化在桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)(Roelink等(1995)細胞81:445-455)中表達人sonic hedgehog蛋白(殘基24-197)。將條件培養(yǎng)基加至用50mM磷酸鉀，0.5mM DTT pH7.0的Fast Flo SP瓊脂糖上。用這一緩沖液洗柱，然后用10M NaCl梯度洗脫。分析組分在間充質干細胞(C3H10T1/2細胞，例如參見Wang等(1993)生長因子9:57-71)上對堿性磷酸酶活性的誘導，然后基于這一活性合并組分并在SDS凝膠上純化。在Amicon超濾裝置(PM10膜)上濃縮合并的物質并對10mM Tris,pH7.4,0.5mM DTT透析。用γ-球蛋白作為標準經(jīng)Bradford方法估計蛋白質的量。膠原海綿的制備用MilliQ水仔細洗滌膠原海綿以除去來自廠商的任何表面活性劑和添加劑。然后用70％乙醇洗海綿，真空干燥。移植物的制備將蛋白質加入到1.0-1.5mm×8-10mm的膠原海綿片(重量1.5-3.0mg)中。在某些情況下在將hedgehog蛋白加入膠原海綿之前加入硫酸鋅至終濃度為0.2mM。然后凍干該重組的海綿。移值將海綿植入Sprague Dawley大鼠(4-8周齡)的胸部皮下或兔(11-14周齡)的股骨肌肉中。飼養(yǎng)動物2-5周，之后取出移植物。然后將移植物在4％福爾馬林或4％低聚甲醛中固定然后包埋在JB-4樹脂中。用甲苯胺藍染色(Wang等(1988)PNAS85:9484-9488)。
新毛囊、皮脂腺和其它皮結構的誘導經(jīng)其明顯的形態(tài)學鑒別。我們將移植物仔細地植入皮下或肌肉內并將這些移植物小心地取出排除了現(xiàn)存皮結構的污染的可能性。另外，在較短(2周)期間在移植物中可見不太成熟的毛囊。
從在3周時從兔肌肉中取出的肌內移植物獲得活檢切片并用蘇木精和曙紅染色。類似檢測了用甲苯胺藍染色的3周兔肌肉肌內移植物的切片。某些樣品的切片揭示了組織形態(tài)學，表明存在在肌內組織形成的毛囊和毛發(fā)類結構。Shh對毛發(fā)的誘導作為上述實驗的繼續(xù)，將載有hedgehog的膠原海綿植入小鼠剃毛的皮下。如圖lA-C所示，hedgehog制劑可在移植物上誘導毛發(fā)生長。另外，具有Von Willebrand因子膠原結合位點的在C末端修飾的Ihh蛋白在毛發(fā)生長中有活性，表明移植的蛋白的局部誘導活性。
所有上述參考文獻和出版物均引入本文作參考。
等價物本領域技術人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動能理解或能確定本文所述的特異多肽、核酸、方法、分析和試劑的各種等價物。這種等價物被認為屬于本發(fā)明范圍。
序列表(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1277堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..1275(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1ATG GTC GAA ATG CTG CTG TTG ACA AGA ATT CTC TTG GTG GGC TTC ATC48Met Val Glu Met Leu Leu Leu Thr Arg Ile Leu Leu Val Gly Phe Ile1 5 10 15TGC GCT CTT TTA GTC TCC TCT GGG CTG ACT TGT GGA CCA GGC AGG GGC96Cys Ala Leu Leu Val Ser Ser Gly Leu Thr Cys Gly Pro Gly Arg Gly20 25 30ATT GGA AAA AGG AGG CAC CCC AAA AAG CTG ACC CCG TTA GCC TAT AAG 144Ile Gly Lys Arg Arg His Pro Lys Lys Leu Thr Pro Leu Ala Tyr Lys35 40 45CAG TTT ATT CCC AAT GTG GCA GAG AAG ACC CTA GGG GCC AGT GGA AGA 192Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr Leu Gly Ala Ser Gly Arg50 55 60TAT GAA GGG AAG ATC ACA AGA AAC TCC GAG AGA TTT AAA GAA CTA ACC 240Tyr Glu Gly Lys Ile Thr Arg Asn Ser Glu Arg Phe Lys Glu Leu Thr65 70 75 80CCA AAT TAC AAC CCT GAC ATT ATT TTT AAG GAT GAA GAG AAC ACG GGA 288Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys Asp Glu Glu Asn Thr Gly85 90 95GCT GAC AGA CTG ATG ACT CAG CGC TGC AAG GAC AAG CTG 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912Ala Leu Phe Ala Ser Arg Val Arg Pro Gly Gln Arg Val Tyr Val Val290 295 300GCT GAA CGC GGC GGG GAC CGC CGG CTG CTG CCC GCC GCG GTG CAC AG C 960Ala Glu Arg Gly Gly Asp Arg Arg Leu Leu Pro Ala Ala Val His Ser305 310 315 320GTG ACG CTG CGA GAG GAG GAG GCG GGC GCG TAC GCG CCG CTC ACG GCG 1008Val Thr Leu Arg Glu Glu Glu Ala Gly Ala Tyr Ala Pro Leu Thr Ala325 330 335CAC GGC ACC ATT CTC ATC AAC CGG GTG CTC GCC TCG TGC TAC GCT GTC 1056His Gly Thr Ile Leu Ile Asn Arg Val Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val340 345 350ATC GAG GAG CAC AGC TGG GCA CAC CGG GCC TTC GCG CCT TTC CGC CTG 1104Ile Glu Glu His Ser Trp Ala His Arg Ala Phe Ala Pro Phe Arg Leu355 360 365GCG CAC GCG CTG CTG GCC GCG CTG GCA CCC GCC CGC ACG GAC GGC GGG 1152Ala His Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ala Pro Ala Arg Thr Asp Gly Gly370 375 380GGC GGG GGC AGC ATC CCT GCA GCG CAA TCT GCA ACG GAA GCG AGG GGC 1200Gly Gly Gly Ser Ile Pro Ala Ala Gln Ser Ala Thr Glu Ala Arg Gly385 390 395 400GCG GAG CCG ACT GCG GGC ATC CAC TGG TAC TCG CAG CTG CTC TAC CAC 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Arg Leu Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val165 170 175Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His Cys Ser Val Lys Ala Glu Asn180 185 190Ser Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe Pro Gly Ser Gly Thr Val195 200 205Thr Leu Gly Asp Gly Thr Arg Lys Pro Ile Lys Asp Leu Lys Val Gly210 215 220Asp Arg Val Leu Ala Ala Asp Glu Lys Gly Asn Val Leu Ile Ser Asp225 230 235 240Phe Ile Met Phe Ile Asp His Asp Pro Thr Thr Arg Arg Gln Phe Ile245 250 255Val Ile Glu Thr Ser Glu Pro Phe Thr Lys Leu Thr Leu Thr Ala Ala260 265 270His Leu Val Phe Val Gly Asn Ser Ser Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala275 280 285Thr Phe Ala Ser Asn Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Leu Val Trp Glu290 295 300Asp Thr Cys Glu Ser Leu Lys Ser Val Thr Val Lys Arg Ile Tyr Thr305 310 315 320Glu Glu His Glu Gly Ser Phe Ala Pro Val Thr Ala His Gly Thr Ile325 330 335Ile Val Asp Gln Val Leu Ala Ser Cys Tyr Ala Val Ile Glu Asn His340 345 350Lys Trp Ala His Trp Ala Phe Ala Pro Val Arg Leu Cys His Lys Leu355 360 365Met Thr Trp Leu Phe Pro Ala Arg Glu Ser Asn Val Asn Phe Gln Glu370 375 380Asp Gly Ile His Trp Tyr Ser Asn Met Leu Phe His Ile Gly Ser Trp385 390 395 400Leu Leu Asp Arg Asp Ser Phe His Pro Leu Gly Ile Leu His Leu Ser405 410 415(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1416堿基對(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈
(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅰx)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..1413(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19ATG GAT AAC CAC AGC TCA GTG CCT TGG GCC AGT GCC GCC AGT GTC ACC 48Met Asp Asn His Ser Ser Val Pro Trp Ala Ser Ala Ala Ser Val Thr1 5 10 15TGT CTC TCC CTG GGA TGC CAA ATG CCA CAG TTC CAG TTC CAG TTC CAG 96Cys Leu Ser Leu Gly Cys Gln Met Pro Gln Phe Gln Phe Gln Phe Gln20 25 30CTC CAA ATC CGC AGC GAG CTC CAT CTC CGC AAG CCC GCA AGA AGA ACG 144Leu Gln Ile Arg Ser Glu Leu His Leu Arg Lys Pro Ala Arg Arg Thr35 40 45CAA ACG ATG CGC CAC ATT GCG CAT ACG CAG CGT TGC CTC AGC AGG CTG 192Gln Thr Met Arg His Ile Ala His Thr Gln Arg Cys Leu Ser Arg Leu50 55 60ACC TCT CTG GTG GCC CTG CTG CTG ATC GTC TTG CCG ATG GTC TTT AGC 240Thr Ser Leu Val Ala Leu Leu Leu Ile Val Leu Pro Met Val Phe Ser65 70 75 80CCG GCT CAC AGC TGC GGT CCT GGC CGA GGA TTG GGT CGT CAT AGG GCG 288Pro Ala His Ser Cys Gly Pro Gly Arg Gly Leu Gly Arg His Arg Ala85 90 95CGC AAC CTG TAT CCG CTG GTC CTC AAG CAG ACA ATT CCC AAT CTA TCC 336Arg Asn Leu Tyr Pro Leu Val Leu Lys Gln Thr Ile Pro Asn Leu Ser100 105 110GAG TAC ACG AAC AGC GCC TCC GGA CCT CTG GAG GGT GTG ATC CGT CGG 384Glu Tyr Thr Asn Ser Ala Ser Gly Pro Leu Glu Gly Val Ile Arg Arg115 120 125GAT TCG CCC AAA TTC AAG GAC CTC GTG CCC AAC TAC AAC AGG GAC ATC 432Asp Ser Pro Lys Phe Lys Asp Leu Val Pro Asn Tyr Asn Arg Asp Ile130 135 140CTT TTC CGT GAC GAG GAA GGC ACC GGA GCG GAT GGC TTG ATG AGC AAG 480Leu Phe Arg Asp Glu Glu Gly Thr Gly Ala Asp Gly Leu Met Ser Lys145 150 155 160CGC TGC AAG GAG AAG CTA AAC GTG CTG GCC TAC TCG GTG ATG AAC GAA 528Arg Cys Lys Glu Lys Leu Asn Val Leu Ala Tyr Ser Val Met Asn Glu165 170 175TGG CCC GGC ATC CGG CTG CTG GTC ACC GAG AGC TGG GAC GAG GAC TAC 576Trp Pro Gly Ile Arg Leu Leu Val Thr Glu Ser Trp Asp Glu Asp Tyr180 185 190CAT CAC GGC CAG GAG TCG CTC CAC TAC GAG GGC CGA GCG GTG ACC ATT 624His His Gly Gln Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Thr Ile195 200 205GCC ACC TCC GAT CGC GAC CAG TCC AAA TAC GGC ATG CTC GCT CGC CTG 672Ala Thr Ser Asp Arg Asp Gln Ser Lys Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu210 215 220GCC GTC GAG GCT GGA TTC GAT TGG GTC TCC TAC GTC AGC AGG CGC CAC 720Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Ser Tyr Val Ser Arg Arg His225 230 235 240ATC TAC TGC TCC GTC AAG TCA GAT TCG TCG ATC AGT TCC CAC GTG CAC 768Ile Tyr Cys Ser Val Lys Ser Asp Ser Ser Ile Ser Ser His Val His245 250 255GGC TGC TTC ACG CCG GAG AGC ACA GCG CTG CTG GAG AGT GGA GTC CGG 816Gly Cys Phe Thr Pro Glu Ser Thr Ala Leu Leu Glu Ser Gly Val Arg260 265 270AAG CCG CTC GGC GAG CTC TCT ATC GGA GAT CGT GTT TTG AGC ATG ACC 864Lys Pro Leu Gly Glu Leu Ser Ile Gly Asp Arg Val Leu Ser Met Thr275 280 285GCC AAC GGA CAG GCC GTC TAC AGC GAA GTG ATC CTC TTC ATG GAC CGC 912Ala Asn Gly Gln Ala Val Tyr Ser Glu Val Ile Leu Phe Met Asp Arg290 295 300AAC CTC GAG CAG ATG CAA AAC TTT GTG CAG CTG CAC ACG GAC GGT GGA 960Asn Leu Glu Gln Met Gln Asn Phe Val Gln Leu His Thr Asp Gly Gly305 310 315 320GCA GTG CTC ACG GTG ACG CCG GCT CAC CTG GTT AGC GTT TGG CAG CCG 1008Ala Val Leu Thr Val Thr Pro Ala His Leu Val Ser Val Trp Gln Pro325 330 335GAG AGC CAG AAG CTC ACG TTT GTG TTT GCG CAT CGC ATC GAG GAG AAG 1056Glu Ser Gln Lys Leu Thr Phe Val Phe Ala His Arg Ile Glu Glu Lys340 345 350AAC CAG GTG CTC GTA CGG GAT GTG GAG ACG GGC GAG CTG AGG CCC CAG 1104Asn Gln Val Leu Val Arg Asp Val Glu Thr Gly Glu Leu Arg Pro Gln355 360 365CGA GTG GTC AAG TTG GGC AGT GTG CGC AGT AAG GGC GTG GTC GCG CCG 1152Arg Val Val Lys Leu Gly Ser Val Arg Ser Lys Gly Val Val Ala Pro370 375 380CTG ACC CGC GAG GGC ACC ATT GTG GTC AAC TCG GTG GCC GCC AGT TGC 1200Leu Thr Arg Glu Gly Thr Ile Val Val Asn Ser Val Ala Ala Ser Cys385 390 395 400TAT GCG GTG ATC AAC AGT CAG TCG CTG GCC CAC TGG GGA CTG GCT CCC 1248Tyr Ala Val Ile Asn Ser Gln Ser Leu Ala His Trp Gly Leu Ala Pro405 410 415ATG CGC CTG CTG TCC ACG CTG GAG GCG TGG CTG CCC GCC AAG GAG CAG 1296Met Arg Leu Leu Ser Thr Leu Glu Ala Trp Leu Pro Ala Lys Glu Gln420 425 430TTG CAC AGT TCG CCG AAG GTG GTG AGC TCG GCG CAG CAG CAG AAT GGC 1344Leu His Ser Ser Pro Lys Val Val Ser Ser Ala Gln Gln Gln Asn Gly435 440 445ATC CAT TGG TAT GCC AAT GCG CTC TAC AAG GTC AAG GAC TAC GTG CTG1392Ile His Trp Tyr Ala Asn Ala Leu Tyr Lys Val Lys Asp Tyr Val Leu450 455 460CCG CAG AGC TGG CGC CAC GAT TGA1416Pro Gln Ser Trp Arg His Asp465 470(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度471氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20Met Asp Asn His Ser Ser Val Pro Trp Ala Ser Ala Ala Ser Val Thr1 5 10 15Cys Leu Ser Leu Gly Cys Gln Met Pro Gln Phe Gln Phe Gln Phe Gln20 25 30Leu Gln Ile Arg Ser Glu Leu His Leu Arg Lys Pro Ala Arg Arg Thr35 40 45Gln Thr Met Arg His Ile Ala His Thr Gln Arg Cys Leu Ser Arg Leu50 55 60Thr Ser Leu Val Ala Leu Leu Leu Ile Val Leu Pro Met Val Phe Ser65 70 75 80Pro Ala His Ser Cys Gly Pro Gly Arg Gly Leu Gly Arg His Arg Ala85 90 95Arg Asn Leu Tyr Pro Leu Val Leu Lys Gln Thr Ile Pro Asn Leu Ser100 105 110Glu Tyr Thr Asn Ser Ala Ser Gly Pro Leu Glu Gly Val Ile Arg Arg115 120 125Asp Ser Pro Lys Phe Lys Asp Leu Val Pro Asn Tyr Asn Arg Asp Ile130 135 140Leu Phe Arg Asp Glu Glu Gly Thr Gly Ala Asp Gly Leu Met Ser Lys145 150 155 160Arg Cys Lys Glu Lys Leu Asn Val Leu Ala Tyr Ser Val Met Asn Glu165 170 175Trp Pro Gly Ile Arg Leu Leu Val Thr Glu Ser Trp Asp Glu Asp Tyr180 185 190His His Gly Gln Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Thr Ile195 200 205Ala Thr Ser Asp Arg Asp Gln Ser Lys Tyr Gly Met Leu Ala Arg Leu210 215 220Ala Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Ser Tyr Val Ser Arg Arg His225 230 235 240Ile Tyr Cys Ser Val Lys Ser Asp Ser Ser Ile Ser Ser His Val His245 250 255Gly Cys Phe Thr Pro Glu Ser Thr Ala Leu Leu Glu Ser Gly Val Arg260 265 270Lys Pro Leu Gly Glu Leu Ser Ile Gly Asp Arg Val Leu Ser Met Thr275 280 285Ala Asn Gly Gln Ala Val Tyr Ser Glu Val Ile Leu Phe Met Asp Arg290 295 300Asn Leu Glu Gln Met Gln Asn Phe Val Gln Leu His Thr Asp Gly Gly305 310 315 320Ala Val Leu Thr Val Thr Pro Ala His Leu Val Ser Val Trp Gln Pro325 330 335Glu Ser Gln Lys Leu Thr Phe Val Phe Ala His Arg Ile Glu Glu Lys340 345 350Asn Gln Val Leu Val Arg Asp Val Glu Thr Gly Glu Leu Arg Pro Gln355 360 365Arg Val Val Lys Leu Gly Ser Val Arg Ser Lys Gly Val Val Ala Pro370 375 380Leu Thr Arg Glu Gly Thr Ile Val Val Asn Ser Val Ala Ala Ser Cys385 390 395 400Tyr Ala Val Ile Asn Ser Gln Ser Leu Ala His Trp Gly Leu Ala Pro405 410 415Met Arg Leu Leu Ser Thr Leu Glu Ala Trp Leu Pro Ala Lys Glu Gln420 425 430Leu His Ser Ser Pro Lys Val Val Ser Ser Ala Gln Gln Gln Asn Gly435 440 445Ile His Trp Tyr Ala Asn Ala Leu Tyr Lys Val Lys Asp Tyr Val Leu450 455 460Pro Gln Ser Trp Arg His Asp465 470(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)長度221氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21Cys Gly Pro Gly Arg Gly Xaa Gly Xaa Arg Arg His Pro Lys Lys Leu1 5 10 15Thr Pro Leu Ala Tyr Lys Gln Phe Ile Pro Asn Val Ala Glu Lys Thr20 25 30Leu Gly Ala Ser Gly Arg Tyr Glu Gly Lys Ile Xaa Arg Asn Ser Glu35 40 45Arg Phe Lys Glu Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile Phe Lys50 55 60Asp Glu Glu Asn Thr Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Gln Arg Cys Lys65 70 75 80Asp Lys Leu Asn Xaa Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Xaa Trp Pro Gly85 90 95Val Xaa Leu Arg Val Thr Glu Gly Trp Asp Glu Asp Gly His His Xaa100 105 110Glu Glu Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Val Asp Ile Thr Thr Ser115 120 125Asp Arg Asp Xaa Ser Lys Tyr Gly Xaa Leu Xaa Arg Leu Ala Val Glu130 135 140Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr Glu Ser Lys Ala His Ile His Cys145 150 155 160Ser Val Lys Ala Glu Asn Ser Val Ala Ala Lys Ser Gly Gly Cys Phe165 170 175Pro Gly Ser Ala Xaa Val Xaa Leu Xaa Xaa Gly Gly Xaa Lys Xaa Val180 185 190Lys Asp Leu Xaa Pro Gly Asp Xaa Val Leu Ala Ala Asp Xaa Xaa Gly195 200 205Xaa Leu Xaa Xaa Ser Asp Phe Xaa Xaa Phe Xaa Asp Arg210 215 220(2)SEQ ID NO22的信息(ⅰ)序列特征(A)長度167氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型肽(ⅴ)片段類型內部(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22Cys Gly Pro Gly Arg Gly Xaa Xaa Xaa Arg Arg Xaa Xaa Xaa Pro Lys1 5 10 15Xaa Leu Xaa Pro Leu Xaa Tyr Lys Gln Phe Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Glu20 25 30Xaa Thr Leu Gly Ala Ser Gly Xaa Xaa Glu Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa35 40 45Ser Glu Arg Phe Xaa Xaa Leu Thr Pro Asn Tyr Asn Pro Asp Ile Ile50 55 60Phe Lys Asp Glu Glu Asn Xaa Gly Ala Asp Arg Leu Met Thr Xaa Arg65 70 75 80Cys Lys Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Leu Ala Ile Ser Val Met Asn Xaa Trp85 90 95Pro Gly Val Xaa Leu Arg Val Thr Glu Gly Xaa Asp Glu Asp Gly His100 105 110His Xaa Xaa Xaa Ser Leu His Tyr Glu Gly Arg Ala Xaa Asp Ile Thr115 120 125Thr Ser Asp Arg Asp Xaa Xaa Lys Tyr Gly Xaa Leu Xaa Arg Leu Ala130 135 140Val Glu Ala Gly Phe Asp Trp Val Tyr Tyr Glu Ser Xaa Xaa His Xaa145 150 155 160His Xaa Ser Val Lys Xaa Xaa16權利要求
1.一種調節(jié)上皮細胞生長狀態(tài)的方法，包括將上皮細胞與有效量的改變上皮細胞增殖速率的制劑異位接觸，其中該制劑選自hedgehog治療劑和ptc治療劑。
2.一種調節(jié)上皮組織生長狀態(tài)的方法，包括將組織與有效量的改變組織中的上皮細胞增殖速率的制劑異位接觸，其中該制劑選自hedgehog治療劑和ptc治療劑。
3.一種誘導皮膚形成的方法，包括用有效量的誘導新皮膚組織形成的制劑處理皮膚，其中該制劑選自hedgehog治療劑和ptc治療劑。
4.一種誘導動物毛發(fā)生長的方法，包括用有效量的誘導毛發(fā)生長的制劑處理動物，其中該制劑選自hedgehog治療劑和ptc治療劑。
5.權利要求1或2的方法，其中該制劑增加上皮細胞的增殖速率。
6.權利要求1或2的方法，其中該制劑降低上皮細胞的增殖速率。
7.權利要求1或2的方法，其中上皮細胞是皮膚上皮細胞。
8.權利要求7的方法，其中上皮細胞是皮膚角質細胞。
9.權利要求7的方法，其中上皮細胞是粘膜上皮細胞。
10.權利要求7的方法，其中上皮細胞是上皮干細胞。
11.權利要求7的方法，其中上皮細胞是毛囊干細胞。
12.權利要求1的方法，其中該細胞處于培養(yǎng)中，該制劑以細胞培養(yǎng)添加劑的形式提供。
13.權利要求1的方法，其中該細胞在動物中被處理，該制劑以治療組合物形式給予動物。
14.權利要求1的方法，其中上皮組織處于組織培養(yǎng)中，該制劑以組織培養(yǎng)添加劑形式提供。
15.權利要求1的方法，其中上皮組織在動物中被處理，該制劑以治療組合物形式給予動物。
16.權利要求3、4、13或15的方法，其中該制劑是局部施用。
17.權利要求1、2、3或4的方法，其中該制劑是hedgehog治療劑。
18.權利要求17的方法，其中hedgehog治療劑是一種多肽，該多肽包括至少hedgehog蛋白的生物活性胞外部分的hedgehog多肽序列。
19.權利要求18的方法，其中該多肽包括至少50個hedgehog蛋白的N-末端部分的氨基酸殘基。
20.權利要求18的方法，其中該多肽包括至少100個hedgehog蛋白的胞外結構域的氨基酸。
21.權利要求18的方法，其中該多肽包括相應于hedgehog蛋白的胞外結構域的19kd片段的至少一部分hedgehog蛋白。
22.權利要求18的方法，其中hedgehog蛋白由脊椎動物的基因編碼。
23.權利要求18的方法，其中該多肽包括SEQ ID NO:21代表的hedgehog多肽序列。
24.權利要求18的方法，其中該多肽包括SEQ ID NO:22代表的hedgehog多肽序列。
25.權利要求18的方法，其中hedgehog蛋白由人hedgehog基因編碼。
26.權利要求18的方法，其中hedgehog多肽序列與選自SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的hedgehog蛋白的氨基酸序列有至少60％相同性。
27.權利要求26的方法，其中hedgehog多肽序列與選自SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的hedgehog蛋白的氨基酸序列有至少75％相同性。
28.權利要求26的方法，其中hedgehog多肽序列與選自SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的hedgehog蛋白的氨基酸序列有至少85％相同性。
29.權利要求26的方法，其中hedgehog多肽序列由在嚴格條件下與選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列雜交的核苷酸序列編碼。
30.權利要求23的方法，其中hedgehog多肽序列是選自SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的hedgehog蛋白的氨基酸序列。
31.權利要求18的方法，其中hedgehog多肽序列是Sonichedgehog蛋白的氨基酸序列。
32.權利要求18的方法，其中hedgehog多肽序列是Indianhedgehog蛋白的氨基酸序列。
33.權利要求18的方法，其中hedgehog多肽序列是Deserthedgehog蛋白的氨基酸序列。
34.權利要求18的方法，其中hedgehog多肽序列包括約相應于SEQ ID NO:15的24-193位殘基的氨基酸序列。
35.權利要求18的方法，其中該多肽純化至至少80％(干重)。
36.權利要求18的方法，其中該多肽是重組產生的多肽。
37.權利要求18的方法，其中該多肽是化學合成的多肽。
38.權利要求17的方法，其中hedgehog治療劑是hedgehog多肽序列的肽模擬物。
39.權利要求1、2、3或4的方法，其中該制劑是ptc治療劑。
40.權利要求39的方法，其中ptc治療劑是與patched蛋白結合并脫阻抑patcded介導的對有絲分裂的抑制的一種小有機分子。
41.權利要求39的方法，其中ptc治療劑與patched結合并模擬hedgehog介導的patched信號轉導。
42.權利要求41的方法，其中ptc治療劑是小有機分子。
43.權利要求41的方法，其中ptc治療劑與patched結合導致patched和/或gli表達的正調節(jié)。
44.權利要求39的方法，其中ptc治療劑是與上皮細胞相互作用以誘導hedgehog介導的patched信號轉導的小有機分子。
45.權利要求44的方法，其中ptc治療劑通過改變參與patched信號途徑的一種胞內蛋白的定位、蛋白質-蛋白質結合和/或酶活性來誘導hedgehog介導的patched信號轉導。
46.權利要求39的方法，其中ptc治療劑改變hedgehog蛋白、patched蛋白或參與patched的胞內信號轉導途徑的蛋白質的表達水平。
47.權利要求46的方法，其中ptc治療劑是抑制一種蛋白質的表達的反義構建體，該蛋白參與patched的胞內信號轉導途徑并且其表達拮抗hedgehog介導的信號。
48.權利要求47的方法，其中該反義構建體是長度約20-30個核苷酸并且GC含量至少為50％的寡核苷酸。
49.權利要求48的方法，其中該反義寡核苷酸選自5′-GTCCTGGCGCCGCCGCCGCCGTCGCC；5′-TTCCGGATGACCGGCCTTTCGCGGTGA；和5′-GTGCACGGAAAGGTGCAGGCCACACT。
50.權利要求44的方法，其中ptc治療劑是與patched結合并調節(jié)patched依賴性基因表達的小有機分子。
51.權利要求44的方法，其中ptc治療劑是蛋白激酶A(PKA)的抑制劑。
52.權利要求51的方法，其中PKA抑制劑是5-異喹啉磺酰胺。
53.權利要求51的方法，其中PKA抑制劑由下述通式代表 其中，R1和R2各自獨立地代表氫，并且若化合價和穩(wěn)定性允許則代表低級烷基，低級鏈烯基，低級炔基，羰基(如羧基、酯、甲酸酯或酮)，硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)，氨基，酰基氨基，酰氨基，氰基，硝基，疊氮基，硫酸酯，磺酸酯，亞磺酰氨基，-(CH2)m-R8,-(CH2)m-OH,-(CH2)m-O-低級烷基，-(CH2)m-O-低級鏈烯基，-(CH2)n-O-(CH2)m-R8,-(CH2)m-SH,-(CH2)m-S-低級烷基，-(CH2)m-S-低級鏈烯基，-(CH2)n-S-(CH2)m-R8，或者R1和R2一起與N形成一雜環(huán)(取代的或未取代的)；R3不存在或代表異喹啉環(huán)的一或多個取代，如低級烷基，低級鏈烯基，低級炔基，羰基(如羧基、酯、甲酸酯或酮)，硫代羰基(如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)，氨基，?；被?，酰氨基，氰基，硝基，疊氮基，硫酸酯，磺酸酯，亞磺酰氨基，-(CH2)m-R8,-(CH2)m-OH,-(CH2)m-O-低級烷基，-(CH2)m-O-低級鏈烯基，-(CH2)n-O-(CH2)m-R8,-(CH2)m-SH,-(CH2)m-S-低級烷基，-(CH2)m-S-低級鏈烯基，-(CH2)n-S-(CH2)m-R8；R8代表取代的或未取代的芳基，芳烷基，環(huán)烷基，環(huán)烯基或雜環(huán)；以及n和m各自獨立為0或1-6的整數(shù)。
54.權利要求51的方法，其中PKA抑制劑是環(huán)化AMP類似物。
55.權利要求51的方法，其中PKA抑制劑選自N-[2-((p-溴肉桂基)氨基)乙基]-5-異喹啉磺酰胺，1-(5-異喹啉磺?；?-2-甲基哌嗪，KT5720,8-溴-cAMP，二丁酰-cAMP和PKA熱穩(wěn)定抑制劑同工型α。
56.一種促進皮膚上皮細胞增殖的方法，包括將細胞與有效量的增加上皮細胞增殖速率的多肽異位接觸，該多肽包括含有至少hedgehog蛋白的N-末端部分的生物活性部分的氨基酸序列。
57.權利要求56的方法，該方法用作控制創(chuàng)傷愈合過程的治療法的一部分。
58.權利要求56的方法，其中該治療法選自燒傷治療、皮膚再生、皮膚移植、褥瘡治療、皮膚潰瘍治療、手術后疤痕減輕和潰瘍性結腸炎治療。
59.權利要求56的方法，其中該方法用作禿頭癥治療法的一部分。
60.一種抑制皮膚上皮細胞增殖的方法，包括將細胞與有效量的降低上皮細胞增殖速率的制劑異位接觸，該制劑抑制hedgehog蛋白與patched結合。
61.權利要求60的方法，其中上皮細胞是毛囊細胞。
62.權利要求61的方法，該方法抑制毛發(fā)生長。
63.一種多肽制劑，該多肽包括含有hedgehog蛋白的生物活性片段的hedgehog多肽序列，該多肽被配制成用于局部施用至上皮組織。
64.權利要求63的制劑，其中該多肽被配制成用于局部施用至皮膚。
65.權利要求63的制劑，其中該多肽包括至少50個hedgehog蛋白N-末端部分的氨基酸殘基。
66.權利要求63的制劑，其中該多肽包括至少100個hedgehog蛋白的胞外結構域的氨基酸。
67.權利要求63的制劑，其中該多肽包括相應于hedgehog蛋白的胞外結構域的19kd片段的至少一部分hedgehog蛋白。
68.權利要求63的制劑，其中hedgehog蛋白由脊椎動物的基因編碼。
全文摘要
本申請涉及通過將上皮細胞在體外或體內與hedgehog治療劑或ptc治療劑異位接觸而調節(jié)上皮細胞的生長狀態(tài)的方法,其中所述的hedgehog治療劑或ptc治療劑的用量是例如相對于不給予該治療劑時足以改變上皮細胞的增殖速率(促進或抑制)的量。本發(fā)明的方法例如可用于調節(jié)上皮組織的生長狀態(tài),如誘導皮膚或其它皮組織的形成,或誘導毛發(fā)的生長。
文檔編號A61K45/00GK1306436SQ98812216
公開日2001年8月1日 申請日期1998年10月20日 優(yōu)先權日1997年10月20日
發(fā)明者伊麗莎白·A·王 申請人:昂托基尼公司