專利名稱：用于基因遞送的生物可降解性混合聚合膠束的制作方法
相關(guān)申請的前后參照本申請要求美國臨時專利申請?zhí)?0/069，551(1997年12月12日提交)的權(quán)益。
早在二十世紀(jì)五十年代中期，人們就開始建立將核酸遞送到組織培養(yǎng)細(xì)胞中的方法，參見H.E.Alexander等，病毒學(xué)(Virology)第5卷，第172-173頁(1958)。其后，在改進(jìn)功能性DNA、RNA和反義寡核苷酸(RNA功能抑制因子)之體內(nèi)和體外的遞送方面取得了穩(wěn)定的進(jìn)展。二十世紀(jì)七十年代后期，由于轉(zhuǎn)染技術(shù)和重組DNA技術(shù)的相互融合，最近二十年來取得了實質(zhì)性的進(jìn)展。這種融合最早見于P.J.Southern等，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志(J.Mol.Appl.Gen.)的第1卷，第327-341頁(1982)，該文獻(xiàn)采用磷酸鈣和二乙基氨基乙基葡聚糖用于在培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)重組質(zhì)粒。目前，核酸的遞送和表達(dá)已成為科學(xué)界持續(xù)關(guān)注的研究課題。
在體外遞送功能性非復(fù)制質(zhì)粒的研究方面，已經(jīng)取得了一些成功。然而，目前，體內(nèi)遞送功能性非復(fù)制質(zhì)粒的方法仍很不完善。轉(zhuǎn)染技術(shù)包括如下方法不溶性無機鹽的方法，參見F.Graham，52病毒學(xué)456-462(1973)；陽離子脂類的方法，參見E.R.Lee等，7人類基因治療(Human Gene Therapy)1701-1717(1996)；陽離子聚合物的方法，參見B.A.Demeneix等，7人類基因治療1947-1954(1996)、A.V.Kabanov等，6生物偶聯(lián)物化學(xué)(Bioconjugate Chem.)7-20(1995)、E.Wagner，88美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)4255-4259(1991)；病毒載體的方法，參見A.H.Jobe，7人類基因治療697-704(1996)、J.Gaulide，6生物工程當(dāng)代觀點(Current Opinonin biotechnology)590-595(1995)；采用細(xì)胞電穿孔技術(shù)的方法，參見美國專利US5，501，662(1996)和美國專利US5，273，525(1993)；以及顯微注射技術(shù)，參見美國專利US5，114，854(1992)。上面列舉的每種方法都有其特定的缺點和限制。研究最廣泛的基因轉(zhuǎn)移載體是病毒載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和皰疹病毒體系。與非病毒載體相比，病毒載體已經(jīng)表現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)染效率。但是，它們在體內(nèi)的應(yīng)用則受到很大限制。它們的缺點包括只導(dǎo)向到分裂細(xì)胞、隨機插入到宿主基因組、發(fā)生復(fù)制的風(fēng)險以及可能的宿主免疫反應(yīng)。參見J.M.Wilson，96臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)2547-2554(1995)。
與病毒載體相比，非病毒載體易于制造，不易發(fā)生免疫反應(yīng)，也不會發(fā)生復(fù)制反應(yīng)。以二甲基氨基乙基葡聚糖、磷酸鈣和聚陽離子為媒介的轉(zhuǎn)染方法已經(jīng)用于實驗室中的組織培養(yǎng)細(xì)胞。在某些條件下，體外細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率已接近100％。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通常非病毒載體在將遺傳材料體內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞方面是無效的，造成基因表達(dá)相對較低。人們已經(jīng)廣泛研究了各種各樣的兩親陽離子，并且已將它們加入到脂質(zhì)體配方中用于基因轉(zhuǎn)染。參見F.D.Ledley，6人類基因治療1129-1144(1995)。目前為止，人們認(rèn)為陽離子脂類體系是最有前途的DNA轉(zhuǎn)染方案，因為它克服了使用病毒載體所引起的問題。然而，與使用病毒載體相比，使用陽離子脂類的轉(zhuǎn)染效率仍然不高，另外，它的細(xì)胞毒性已招致越來越多的抱怨。因此，需要繼續(xù)研究，以尋求一種新型的基因轉(zhuǎn)移方案。
綜上所述，需要開發(fā)一種安全有效的用于體內(nèi)的基因遞送體系，這將是本領(lǐng)域的重大進(jìn)步。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供用于將核酸遞送到細(xì)胞中去的組合物及方法。
本發(fā)明還有一個目的是通過提供微?；蜉d體以提高遞送效率，其中采用多變量(multivariate)方法可以容易地控制微球的體積和電荷密度。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種基因遞送的組合物及方法，其中基因載體是可生物降解的和生物可相容的。
本發(fā)明的這些、以及其它的目的是這樣實現(xiàn)的提供了用于將所選核酸遞送到宿主細(xì)胞中的載體，所述載體包含兩親聚酯-聚陽離子共聚物和兩親聚酯-糖共聚物的混合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，聚酯-聚陽離子共聚物的百分比含量約為載體重量的5～95％，聚酯-糖共聚物百分比含量也優(yōu)選約為載體重量的5～95％。聚酯-聚陽離子共聚物可以是含有通過酰胺鍵連到親水聚陽離子嵌段上的疏水聚酯嵌段的二嵌段共聚物，或者，可以是含有疏水性聚酯部分和親水性陽離子部分的接枝共聚物。優(yōu)選的聚酯選自下列物質(zhì)聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D-，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚丁內(nèi)酯和聚丙醇酸內(nèi)酯。進(jìn)一步優(yōu)選的，聚酯是聚(L-乳酸)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，聚酯的分子量約為500～10，000。優(yōu)選的聚陽離子選自下列物質(zhì)聚(L-絲氨酸酯)、聚(D-絲氨酸酯)、聚(L-賴氨酸)、聚(D-賴氨酸)、聚鳥氨酸和聚精氨酸，更優(yōu)選的是聚(L-絲氨酸酯)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，聚陽離子的分子量約為500～10，000。
聚酯-糖共聚物包含疏水聚酯鏈段和親水糖鏈段。優(yōu)選的聚酯鏈段選自下列物質(zhì)聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D-，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚丁內(nèi)酯和聚丙醇酸內(nèi)酯，進(jìn)一步優(yōu)選的是聚(L-乳酸)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，聚酯鏈段的分子量約為500～10，000。糖鏈段可以包括多糖或糖基化聚合物。優(yōu)選的糖基化聚合物至少包括一種選自下列物質(zhì)的糖部分半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纖維素二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麥芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸，進(jìn)一步優(yōu)選的是乳糖酸。糖基化聚合物的聚合物部分優(yōu)選地選自下列物質(zhì)聚(L-絲氨酸酯)、聚(D-絲氨酸酯)、聚(L-賴氨酸)、聚(D-賴氨酸)、聚鳥氨酸和聚精氨酸，進(jìn)一步優(yōu)選的是聚(L-絲氨酸酯)，更優(yōu)選的是聚(L-賴氨酸)。
載體還可任選地包括含有下列組分的共聚物(a)疏水部分，(b)連到疏水部分上的親水部分，和(c)與親水部分偶聯(lián)的功能部分，其中所述功能部分選自配體、融合劑、溶酶體定位劑(lyosomotrophic agent)、核定位信號以及它們的混合物。優(yōu)選的配體選自運鐵蛋白、表皮生長因子、胰島素、脫唾液酸血清類粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、LewisX、唾液LewisX、N-乙?；樘前贰肴樘?、葡萄糖和凝血調(diào)節(jié)蛋白；優(yōu)選的融合劑選自多粘菌素B和血凝素H2；優(yōu)選的核定位信號是T-抗原。
一種將所選核酸遞送入宿主細(xì)胞的組合物，包括水性介質(zhì)中的混合-聚合-膠束/核酸復(fù)合物，其中的混合-聚合-膠束/核酸復(fù)合物包含(a)兩親聚酯-聚陽離子共聚物和兩親聚酯-糖共聚物的混合物，和(b)有效量的所選核酸。
一種用于將所選核酸遞送入宿主細(xì)胞的方法，包括施用水性介質(zhì)中的有效量的混合聚合膠束/核酸復(fù)合物，其中混合-聚合-膠束/核酸復(fù)合物含有(a)兩親聚酯-聚陽離子共聚物和包括糖部分在內(nèi)的兩親聚酯-糖共聚物的混合物，和(b)有效量的上述所選核酸。通過施用使所述復(fù)合物與宿主細(xì)胞接觸，所述糖部分引發(fā)受體介導(dǎo)的混合-聚合-膠束/核酸復(fù)合物的內(nèi)吞作用，從而將所述核酸遞送入宿主細(xì)胞。
詳細(xì)描述在公開和描述本發(fā)明的用于基因遞送的組合物和方法前，需指出，本發(fā)明不局限于本文所描述的特殊結(jié)構(gòu)、方法步驟和材料，這些結(jié)構(gòu)、方法步驟和材料可以有所改變。還需指出，此處所用的術(shù)語僅用于描述特定的實施方案，而不意在對本發(fā)明范圍加以限制。本發(fā)明以本發(fā)明的權(quán)利要求書及其等價物為準(zhǔn)。
需要指出，除非在上下文中明確指出，本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式的“一”和“這”、“該”均包含復(fù)數(shù)的含義。因此，例如，提及的含有“一種聚酯-陽離子共聚物”包括兩種或兩種以上的上述聚酯-陽離子共聚物的混合物，提及的“一種寡核苷酸”包括一種或一種以上的提及的寡核苷酸，提及的“一種糖部分”包括提及的兩種或兩種以上的上述糖部分。
在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，下列術(shù)語的含義以下面給出的定義為準(zhǔn)。
本文使用的“有效量”是指膠束/核酸復(fù)合物的量無毒性，但是在用于任何醫(yī)學(xué)治療以合理的損/益比將核酸遞送到所選細(xì)胞中去時，足以提供預(yù)期的效果。這里使用的有效量的核酸是指所選擇的量能夠在細(xì)胞內(nèi)提供核酸所希望的效果，例如，表達(dá)mRNA、表達(dá)蛋白質(zhì)、用同mRNA的反義雜交抑制表達(dá)，等等。采用有效量的載體是指當(dāng)與所選核酸通過靜電相互作用形成復(fù)合物時，載體的量足以在水性介質(zhì)中形成膠束。
除非另外特別指明尺寸，本文使用的術(shù)語“多糖”和“寡糖”沒有特意的尺寸限制。
本文使用的“施用”和類似術(shù)語是指將組合物遞送給被處理的個體中，以使組合物可以由循環(huán)系統(tǒng)流通到身體的某些部位，在這些部位，組合物的配體部分或糖部分能夠與它的相關(guān)受體或結(jié)合位點結(jié)合。因此，組合物優(yōu)選以系統(tǒng)施用的方式施用于個體，通常是由皮下的、肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的施用或者是腹膜內(nèi)的施用。上述用途的注射劑可以用常規(guī)形式制備，可以是液體溶液或懸浮液或固體形式，該形式適合在注射前制成溶液或液體中的懸浮液，或者是乳液。合適的賦形劑的例子包括例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等。如果需要的話，可以加入少量的附加物質(zhì)，諸如濕潤劑或乳化劑、緩沖劑等等。
本發(fā)明涉及用于形成自裝配的、混合聚合膠束的組合物，所述混合聚合膠束用于將基因構(gòu)建體運輸進(jìn)特定的真核細(xì)胞。聚合膠束和核酸形成一種靜電復(fù)合物，該復(fù)合物通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。合適的核酸包括DNA、RNA、特定的基因或RNA功能抑制因子，例如反義寡核苷酸?；旌暇酆夏z束包含兩種或兩種以上的組分，所有這些組分都是可生物降解的、兩親的共聚物。第一種組分，聚酯-聚陽離子共聚物，其與聚陰離子核酸之間發(fā)生靜電相互作用。第二種組分，聚酯-糖共聚物，在體內(nèi)將膠束-核酸復(fù)合物特異性地導(dǎo)向所選的細(xì)胞。本發(fā)明任選地還可進(jìn)一步包含一種或多種附加的聚酯-聚陽離子共聚物或聚酯-糖共聚物。兩親共聚物包括在聚合物鏈中既有親水鏈段又有疏水鏈段的嵌段或接枝共聚物。在聚酯-聚陽離子共聚物中，親水鏈段包含可生物降解的陽離子聚合物，例如，聚(絲氨酸酯)。在聚酯-糖共聚物中，親水鏈段包含多糖或者連有單糖或寡糖的聚合物。在這兩種組分中，用生物降解性聚酯(如聚(乳酸))作為疏水鏈段。
在水中，當(dāng)兩種或更多種組分的濃度足夠高時，這些組分就自發(fā)聚集成熱力學(xué)上穩(wěn)定的聚合膠束，膠束微粒呈橢圓形，并且實質(zhì)上是雙層結(jié)構(gòu)。核心“層”是由于疏水聚酯之間的疏水相互作用形成的。類似地，表面“層”是依靠親水聚陽離子和糖與水之間的相應(yīng)的親水相互作用形成的。膠束表面周圍將存在凈正電荷，因為第一種組分的親水鏈段是聚陽離子。正電荷使得可以和核酸(即聚陰離子)之間發(fā)生靜電相互作用，這種作用對于壓緊并保護(hù)核酸是非常重要的。表面的糖基團可以包括體內(nèi)將膠束-核酸復(fù)合物導(dǎo)向特定器官細(xì)胞或組織細(xì)胞的配體。糖基團還可以引發(fā)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，造成基因的內(nèi)在化和表達(dá)。
顆粒大小對于基因遞送系統(tǒng)的優(yōu)化是非常關(guān)鍵的，因為顆粒大小經(jīng)常控制體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性和組織定向。參見F.C.Szoka4生物偶聯(lián)物化學(xué)372-379頁(1993)。通常，基因遞送顆粒的建議尺寸不應(yīng)超過病毒的大小，從而使得基因遞送顆粒能夠有效地滲透到組織中。本發(fā)明中，通過使用共聚物的不同組合可以容易地改變顆粒大小。單個共聚物的尺寸和結(jié)構(gòu)決定聚集數(shù)-即聚集形成膠束的單個共聚物的數(shù)目。因此，尺寸和結(jié)構(gòu)部分控制聚合膠束的顆粒大小。而顆粒大小又可以進(jìn)一步由制備顆粒的條件和方法控制。通過改變聚陽離子共聚物的化學(xué)組成、聚陽離子鏈段的分子量和電荷密度、以及聚陽離子共聚物對含糖共聚物的摩爾比，也可以容易地控制電荷密度。此外，可以摻入附加的離子和/或非離子組分來控制開始的和殘留的電荷密度。
導(dǎo)向特定細(xì)胞并能摻入膠束的配體包括除了其它之外，運鐵蛋白、表皮生長因子(EGF)、胰島素、脫唾液酸血清類粘蛋白、甘露糖-6-磷酸(定向單核細(xì)胞)、甘露糖(定向巨噬細(xì)胞和某些B-細(xì)胞)、LewisX、唾液LewisX(定向內(nèi)皮細(xì)胞)、N-乙?；樘前?定向T-細(xì)胞)、半乳糖(定向黑素瘤細(xì)胞)、葡萄糖(定向結(jié)腸癌細(xì)胞)和凝血調(diào)節(jié)蛋白(定向小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞)。其它的可以加入膠束的化合物包括除了其它之外，融合劑，例如多粘菌素B和血凝素HA2；溶酶體定位劑和核定位信號，如T-抗原。功能性化合物使得外源核酸的遞送和表達(dá)更為有效，因此，功能性化合物對于成功地遞送和表達(dá)基因十分重要。可以用膠束通過如下方式容易地導(dǎo)入功能性化合物(1)制出第三種共聚物組分，它在官能團上帶有化合物，和(2)將共聚物偶聯(lián)到預(yù)裝配的聚合膠束表面。或者，含有功能性化合物的第三種組分可以在膠束剛開始形成時同第一種和第二種組分一起引入膠束。如果那樣的話，就可以優(yōu)選使用官能團留在親水鏈段中的共聚物，以便其暴露在膠束表面層。這樣，糖、配體和其它功能性化合物的各種組合可以留在第二種組分及其后的組分中，以使膠束-核酸復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最大。本發(fā)明的一個優(yōu)點是官能團的種類和含量可不受限制地方便地改變。
根據(jù)本發(fā)明得到的膠束含有可生物降解的生物相容性共聚物，因而是無免疫原性和無毒的。本文公開的優(yōu)選共聚物降解成為可由腎排泄的無毒小分子，該共聚物在所要求的基因表達(dá)期間是惰性的。通過簡單的水解和/或酶促反應(yīng)進(jìn)行降解。當(dāng)共聚物主鏈包含酯鍵時，以簡單水解進(jìn)行的降解作用可能占主導(dǎo)地位的。當(dāng)存在某些細(xì)胞器(如溶酶體之類)時，酶促降解將變得主要起來。通過使用不同種類和分子量的聚合物，可以改變降解期的長短，從幾天到幾個月不等。因此，可以看出是如何用生物降解性聚合物進(jìn)行基因遞送，以解決與聚陽離子基因載體相關(guān)的毒性問題的。眾所周知，大多數(shù)聚陽離子基因載體具有嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，如果在體內(nèi)長期存在會引起嚴(yán)重后果。因此，優(yōu)選的基因載體應(yīng)在完成作用之后能夠降解成為無毒產(chǎn)物。本發(fā)明使用可生物降解的聚酯或多肽，所述聚酯或多肽具有安全的、可生物相容的降解途徑。此外，本發(fā)明的高度支鏈化的膠束結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步降低細(xì)胞毒性，因為諸如樹枝狀的聚酰胺型胺類的分支聚陽離子的細(xì)胞毒性比線性聚陽離子的細(xì)胞毒性低。參見F.C.Szoka，4生物偶聯(lián)物化學(xué)372-379(1993)。因而，由于降低了細(xì)胞毒性，本發(fā)明聚合膠束的有利組分和結(jié)構(gòu)將是人們所期待的。
如

圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的混合聚合膠束10包含兩種或兩種以上的生物降解性兩親共聚物。第一種共聚物12是含有親水聚陽離子鏈段14和疏水聚酯鏈段16的聚酯-聚陽離子嵌段或接枝共聚物。親水聚陽離子鏈段14應(yīng)當(dāng)足夠大以使共聚物具有水溶性。第一種共聚物可以制成二元、三元或多元嵌段或接枝共聚物，但是優(yōu)選二嵌段或接枝共聚物。聚酯鏈段16優(yōu)選自下列物質(zhì)聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚丁內(nèi)酯和聚丙醇酸內(nèi)酯，但是更優(yōu)選聚(L-乳酸)。所述聚陽離子鏈段14優(yōu)選為單體單元通過酯鍵或酰胺鍵相連的聚陽離子，例如聚(L-絲氨酸酯)、聚(D-絲氨酸酯)、聚(L-賴氨酸)、聚(D-賴氨酸)、聚鳥氨酸或聚精氨酸，由于生物降解性較好更優(yōu)選聚(L-絲氨酸酯)。
第二種共聚物18是聚酯-糖嵌段或接枝共聚物，其中，糖鏈段20足夠大以使共聚物能夠溶于水中。聚酯鏈段22可以與第一種共聚物12中的相同，也可以不同，優(yōu)選自上面所指出的第一種共聚物12中聚酯鏈段16的這些物質(zhì)。糖鏈段20優(yōu)選多糖或糖基化聚合物，但是更優(yōu)選糖基化聚合物。如圖1所示，糖基化聚合物是通過將一個或多個單糖或寡糖或其衍生物24偶聯(lián)到含有一個或多個側(cè)基官能團(如羥基、羧基或氨基)的聚合物26上制備的。單糖或寡糖或其衍生物優(yōu)選半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纖維素二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麥芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、葡糖酸或乳糖酸。最優(yōu)選將糖以酸的形式結(jié)合到聚陽離子聚合物上。因此，本發(fā)明最優(yōu)選的方案為將乳糖酸(4-O-β-D-吡喃半乳糖-D-葡糖酸)偶聯(lián)到聚(L-絲氨酸酯)或聚(L-賴氨酸)上。由于細(xì)胞上半乳糖受體的高度親和力，乳糖的半乳糖基單元可以方便地定向于肝細(xì)胞。
由圖1還可看出，將混合的聚合膠束10與所選核酸28相混合，會使核酸上的負(fù)電荷與膠束上的正電荷之間產(chǎn)生靜電結(jié)合，從而形成膠束-核酸復(fù)合物30。
將兩種或兩種以上的共聚物以合適的設(shè)定重量比相混合，就可形成混合聚合膠束。換句話說，顆粒大小應(yīng)約為10-100nm，這取決于聚合物的組成和兩種或兩種以上共聚物的混合比。本發(fā)明的一個最優(yōu)選實施方案為通過以細(xì)胞表面上的半乳糖基受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，將所選核酸有效地遞送入肝細(xì)胞。通過將帶有所選受體的細(xì)胞和所選糖匹配，能夠?qū)⒑怂徂D(zhuǎn)移到其它細(xì)胞中。例如，混合膠束可由下列物質(zhì)制備用于轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞的帶甘露糖側(cè)鏈的共聚物、用于轉(zhuǎn)染T-細(xì)胞的N-乙?；樘前泛陀糜谵D(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞的葡萄糖。
因此，本發(fā)明特別提供了通常用于將所選核酸遞送到肝細(xì)胞(通常也可以是其它細(xì)胞)中的可生物降解的、無毒的非病毒性載體。另外，本發(fā)明提供了一種簡單有效的方法，以構(gòu)建各種各樣的、可精確設(shè)計的膠束結(jié)構(gòu)，也可以用各種各樣的糖配體和融合劑例如內(nèi)體破壞性肽(EDP)，使表面功能化。
聚(N-芐氧羰基-L-絲氨酸酯)二嵌段共聚物。首先，按照大分子(Macromolecules)，1990年23期第65-70頁(此處引入本文供參考)描述的步驟，將等摩爾量的4-(二甲氨基)吡啶和對甲苯磺酸在無水苯中反應(yīng)，制得4-(二甲氨基)吡啶鎓4-甲基苯磺酸鹽。將2.392克N-芐氧羰基(N-CBZ)絲氨酸放入一裝有攪拌棒、氮氣管線和橡膠隔片的雙口圓底燒瓶中，在氮氣保護(hù)下，用注射器加入30毫升四氫呋喃，將其溶解。用注射器連續(xù)加入2.94克4-(二甲氨基)吡啶鎓4-甲苯磺酸鹽和二異丙基碳二亞胺的二氯甲烷溶液80毫升，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1～5天。反應(yīng)一完成，將反應(yīng)混合物過濾，除去二異丙基脲，然后用旋轉(zhuǎn)式汽化器充分干燥。用甲醇重結(jié)晶，得到反應(yīng)產(chǎn)物。以聚苯乙烯作基準(zhǔn)，用凝膠滲透色譜(GPC)對產(chǎn)物進(jìn)行表征。
聚(L-乳酸)。將3克L-乳酸放入一帶有攪拌棒并連有減壓蒸餾設(shè)備的單口圓底燒瓶中。用氮氣徹底沖洗反應(yīng)瓶，然后將混合物在5毫米汞柱的真空度下加熱至160℃。為了得到不同分子量的聚(L-乳酸)，反應(yīng)時間從1～10小時不等。在產(chǎn)物的氯仿溶液中用大大過量的甲醇使其沉淀，即得產(chǎn)品。以聚苯乙烯作基準(zhǔn)，用凝膠滲透色譜(GPC)對產(chǎn)物進(jìn)行表征。
聚(L-乳酸)-聚(L-絲氨酸酯)二嵌段共聚物。將1克聚(L-乳酸)(分子量為1200)用THF溶解，在二環(huán)己基碳二亞胺的存在下，加入兩倍摩爾量的二氨基乙烷，反應(yīng)生成胺終止的聚(L-乳酸)。在室溫下攪拌2小時，然后用甲醇沉淀得到反應(yīng)產(chǎn)物。在室溫下，用二環(huán)己基碳二亞胺使胺終止的聚(L-乳酸)與等摩爾量的聚(N-芐氧羰基L-絲氨酸酯)(分子量為2900)在二甲基甲酰胺中反應(yīng)，然后通過催化加氫除去芐氧羰基基團。參見第23卷大分子，第3399-3406頁，1990。
聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-絲氨酸酯)二嵌段共聚物。將1.33克乳糖酸溶于50毫升無水THF中，用等摩爾量的三乙胺500毫升中和該溶液，然后在室溫下加入500毫升氯代碳酸異丁基酯。攪拌10分鐘以后，將反應(yīng)混合物加到0.67克聚(L-乳酸)-聚(L-絲氨酸酯)的50毫升二甲亞砜溶液中，在室溫下攪拌20分鐘。過濾，并用乙醚沉淀，得到反應(yīng)產(chǎn)物。用SPECTRAPOR膜管(分子量截止1000)，通過滲析法提純反應(yīng)產(chǎn)物。
混合聚合膠束。在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖劑中，制得聚(L-乳酸)-聚(L-絲氨酸酯)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-絲氨酸酯)的混合物，然后用于利用β-半乳糖苷酶基因和HepG2細(xì)胞的實施例4中的轉(zhuǎn)染程序中。
步驟同實施例1，區(qū)別在于，胺終止的聚(L-乳酸)由N-三苯甲游基乙醇胺引發(fā)的L-交酯的開環(huán)聚合來制備。在室溫下，將3克三苯甲游基氯在20ml乙醇胺中攪拌，制得N-三苯甲游基乙醇胺。過濾，析出產(chǎn)物，將產(chǎn)物在甲醇-水(9∶1)中重結(jié)晶進(jìn)行提純。在催化量的辛酸亞錫存在條件下，用N-三苯甲游基乙醇胺在回流甲苯中引發(fā)L-交酯的聚合反應(yīng)。用大大過量的乙醚使聚(L-乳酸)沉淀析出。在二噁烷中，用0.1M的三氟乙酸除去三苯甲游基基團。
由聚(L-乳酸)-聚(L-賴氨酸)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-賴氨酸)共聚物制備混合聚合膠束。聚(L-賴氨酸)(分子量為2700)是從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)得到的，聚(L-乳酸)(分子量為1200)是按照實施例1的步驟進(jìn)行縮聚反應(yīng)制備的。用等摩爾量的氯甲酸異丁酯活化聚(L-乳酸)的羧基末端，然后與等摩爾量的聚(L-賴氨酸)反應(yīng)，生成聚(L-乳酸)-聚(L-賴氨酸)共聚物。將乳糖酸和聚(L-乳酸)-聚(L-賴氨酸)按實施例1的步驟進(jìn)行反應(yīng)，制備聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-賴氨酸)。在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中制得聚(L-乳酸)-聚(L-賴氨酸)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-賴氨酸)的多種組合，然后用于利用半乳糖編苷酶編碼基因的實施例4的人肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序中。
用人肝癌細(xì)胞(HepG2)測試了混合聚合膠束的體外轉(zhuǎn)染效率，該細(xì)胞是在含10％的胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。收獲細(xì)胞，用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)，以2×105細(xì)胞/ml的密度置于96孔平板上。一天以后，在轉(zhuǎn)染前30分鐘，新配制含有聚(L-乳酸)-聚(L-賴氨酸)和/或聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-賴氨酸)共聚物的膠束-基因復(fù)合物和pSV-β-gal質(zhì)粒DNA(Promega Corp.，Madison，Wisconsin；EMBL保藏號為X65335)的各種制劑。用無血清的新鮮生長培養(yǎng)基取代96孔平板上每個孔內(nèi)的生長培養(yǎng)基，加入膠束-基因復(fù)合物，至最終體積為10μl。經(jīng)過4小時培育以后，用含血清的培養(yǎng)基取代原來的生長培養(yǎng)基，在37℃下、5％的CO2的培養(yǎng)箱中將細(xì)胞再進(jìn)一步培育44小時。然后用0.25％的胰蛋白酶-EDTA處理，收獲細(xì)胞。向每個孔中加入100μl的1x裂解緩沖劑(Promega，Madison，WI)，得到細(xì)胞裂解物。
質(zhì)粒pSV-β-gal是監(jiān)控哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的陽性控制病毒。pSV-β-gal含有SV40早期啟動子和增強子序列，轉(zhuǎn)錄起始點，編碼β-半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ編碼區(qū)和SV40小T抗原聚腺苷酸化信號。SV40早期啟動子和增強子驅(qū)動lacZ基因的轉(zhuǎn)錄。
轉(zhuǎn)染效率是通過測定細(xì)胞裂解物中β-半乳糖苷酶的活性來測量的。用2x檢測緩沖液將細(xì)胞裂解物和鄰硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG，1.33mg/ml)的等量混合物在37℃培養(yǎng)4小時。向每個孔中加入150μl的1M碳酸鈉溶液來終止反應(yīng)，用分光光度計讀取420nm處的吸光度數(shù)值以測定β-半乳糖苷酶的活性。用LIPOFECTIN試劑(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)作為比較轉(zhuǎn)染效率的對照。LIPOFECTIN試劑為膜過濾水中的脂質(zhì)體制劑，其中陽離子脂類N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-氯化三甲基銨(DOTMA)和二油?；字Ｒ掖及?DOPE)的重量之比為1∶1。
用T.Mosmann的“細(xì)胞生長及存活的快速比色檢測增殖和細(xì)胞毒性檢測的應(yīng)用”，65免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)55-63(1983)中描述的MTT比色法測定混合聚合膠束對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。簡要地說，從呈指數(shù)性生長的培養(yǎng)物中得到細(xì)胞，將細(xì)胞以2×105細(xì)胞/毫升的密度置于96-孔板上。經(jīng)過24小時的培育后，用各種量的、不含血清的聚(L-乳酸)-聚(L-賴氨酸)和/或聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-賴氨酸)共聚物溶液處理細(xì)胞。經(jīng)4小時培養(yǎng)后，用含血清的生長培養(yǎng)基替代原生長培養(yǎng)基，使細(xì)胞在37℃下、5％的CO2培養(yǎng)箱中再額外培養(yǎng)44小時。然后，向每個孔中加入25微升的3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)隨后，在37℃下培養(yǎng)4小時。小心除去生長培養(yǎng)基，加入150微升DMSO以溶解所形成的甲結(jié)晶。在570nm下，采用Bio-TekEL-3311微板讀數(shù)器(Bio-TekInstrument；Winooski，VT)測定光密度(OD)。根據(jù)下面的方程式計算細(xì)胞的存活力(％)存活力(％)=[OD570(樣本)/OD570(對照)]×100其中，OD570(對照)代表從僅用PBS緩沖液處理的孔得到的測定數(shù)據(jù)，OD570(樣本)代表從用不同量聚合物處理的孔得到的測定數(shù)據(jù)。
如表1所示，當(dāng)無血清存在時，體外在HepG2細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明的混合-聚-膠束的轉(zhuǎn)染效率同LIPOFECTIN試劑一樣高。如表2所示，混合聚合膠束對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性要比LIPOFECTIN試劑小得多或稍小，這提示除肝細(xì)胞外，聚合膠束可廣泛應(yīng)用于其它組織或器官。
表1.相比于LIPOFECTIN試劑用HepG2細(xì)胞測得的由聚(L-乳酸)-聚(L-賴氨酸)(PLL)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-賴氨酸)(PLGL)組成的混合聚合膠束的相對轉(zhuǎn)染效率
表2．相比于LIPOFECTIN試劑，用HepG2細(xì)胞測得的由聚(L-乳酸)-聚(L-賴氨酸)(PLL)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-賴氨酸)(PLGL)組成的混合聚合膠束的細(xì)胞毒性(以細(xì)胞全部成活為100％計)
權(quán)利要求
1．一種將藥物送入宿主細(xì)胞的載體，該載體包含兩親聚酯-聚陽離子共聚物和兩親聚酯-糖共聚物的混合物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其中所述聚酯-聚陽離子共聚物是包含通過酰胺鍵連到親水聚陽離子嵌段上的疏水聚酯嵌段的二嵌段共聚物。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的載體，其中所述聚酯嵌段選自下列物質(zhì)聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚丁內(nèi)酯和聚丙醇酸內(nèi)酯。
4．根據(jù)權(quán)利要求3的載體，其中所述聚酯嵌段是聚(L-乳酸)。
5．根據(jù)權(quán)利要求3的載體，其中所述聚酯嵌段的分子量約為500～10，000。
6．根據(jù)權(quán)利要求2的載體，其中所述聚陽離子嵌段選自下列物質(zhì)聚(L-絲氨酸酯)、聚(D-絲氨酸酯)、聚(L-賴氨酸)、聚(D-賴氨酸)、聚鳥氨酸和聚精氨酸。
7．根據(jù)權(quán)利要求6的載體，其中所述聚陽離子嵌段是聚(L-絲氨酸酯)。
8．根據(jù)權(quán)利要求6的載體，其中所述聚陽離子嵌段的分子量約為500～10，000。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其中所述聚酯-糖共聚物包含疏水聚酯鏈段和親水糖鏈段。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中所述聚酯鏈段選自下列物質(zhì)的一種聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚(乙醇酸)、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚丁內(nèi)酯和聚丙醇酸內(nèi)酯。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的載體，其中所述聚酯鏈段是聚(L-乳酸)。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的載體，其中所述聚酯鏈段的分子量約為500～10，000。
13．根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中所述糖鏈段包括多糖。
14．根據(jù)權(quán)利要求9的載體，其中所述糖鏈段包括糖基化聚合物。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的載體，其中所述糖基化聚合物至少包括一種選自下列物質(zhì)的糖部分半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纖維素二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麥芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的載體，其中所述糖鏈段是乳糖酸。
17．根據(jù)權(quán)利要求14的載體，其中所述糖基化聚合物包含選自下列物質(zhì)的聚合物部分聚(L-絲氨酸酯)、聚(D-絲氨酸酯)、聚(L-賴氨酸)、聚(D-賴氨酸)、聚鳥氨酸和聚精氨酸。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的載體，其中所述聚合物部分是聚(L-絲氨酸酯)。
19．根據(jù)權(quán)利要求17的載體，其中所述聚合物部分是聚(L-賴氨酸)。
20．根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其含有重量百分比約5％～95％的所述聚酯-聚陽離子共聚物。
21．根據(jù)權(quán)利要求1的載體，該載體還包括含有下列組分的共聚物(a)疏水部分，(b)鍵合到疏水部分上的親水部分，和(c)與親水部分偶聯(lián)的功能部分，其中所述功能部分選自下列物質(zhì)配體、融合劑、溶酶體定位劑、核定位信號，以及它們的混合物。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的載體，其中所述配體選自運鐵蛋白、表皮生長因子、胰島素、脫唾液酸血清類粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、LewisX、唾液LewisX、N-乙?；樘前?、半乳糖、葡萄糖和凝血調(diào)節(jié)蛋白；所述融合劑選自多粘菌素B和血凝素H2；所述核定位信號是T-抗原。
23．根據(jù)權(quán)利要求1的載體，其中所述藥物是核酸。
24．一種將所選核酸遞送入宿主細(xì)胞的組合物，該組合物包括水性介質(zhì)中的混合聚合膠束/核酸復(fù)合物，其中的混合聚合膠束/核酸復(fù)合物包含(a)兩親聚酯-聚陽離子共聚物和兩親聚酯-糖共聚物的混合物，和(b)有效量的上述所選核酸。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其中所述聚酯-聚陽離子共聚物是包含通過酰胺鍵連到親水聚陽離子嵌段上的疏水聚酯嵌段的二嵌段共聚物。
26．根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其中所述聚酯嵌段選自下列物質(zhì)聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚丁內(nèi)酯和聚丙醇酸內(nèi)酯。
27．根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述聚酯嵌段是聚(L-乳酸)。
28．根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中所述聚酯嵌段的分子量約為500～10，000。
29．根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其中所述聚陽離子嵌段選自聚(L-絲氨酸酯)、聚(D-絲氨酸酯)、聚(L-賴氨酸)、聚(D-賴氨酸)、聚鳥氨酸和聚精氨酸。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的組合物，其中所述聚陽離子嵌段是聚(L-絲氨酸酯)。
31．根據(jù)權(quán)利要求29的組合物，其中所述聚陽離子嵌段的分子量約為500～10，000。
32．根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其中所述聚酯-糖共聚物包含疏水聚酯鏈段和親水糖鏈段。
33．根據(jù)權(quán)利要求32的組合物，其中所述聚酯鏈段選自下列物質(zhì)聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己內(nèi)酯)、聚丁內(nèi)酯和聚丙醇酸內(nèi)酯。
34．根據(jù)權(quán)利要求33的組合物，其中所述聚酯鏈段是聚(L-乳酸)。
35．根據(jù)權(quán)利要求33的組合物，其中所述聚酯鏈段的分子量約為500～10，000。
36．根據(jù)權(quán)利要求32的組合物，其中所述糖鏈段包含多糖。
37．根據(jù)權(quán)利要求32的組合物，其中所述糖鏈段包含糖基化聚合物。
38．根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述糖基化聚合物至少包括一種選自下列物質(zhì)的糖部分半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纖維素二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麥芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸。
39．根據(jù)權(quán)利要求38的組合物，其中所述糖部分是乳糖酸。
40．根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中所述糖基化聚合物包含選自下列物質(zhì)的聚合物部分聚(L-絲氨酸酯)、聚(D-絲氨酸酯)、聚(L-賴氨酸)、聚(D-賴氨酸)、聚鳥氨酸和聚精氨酸。
41．根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中所述聚合物部分是聚(L-絲氨酸酯)。
42．根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中所述聚合物部分是聚(L-賴氨酸)。
43．根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，該組合物含有重量百分比約5％～95％的所述聚酯-聚陽離子共聚物。
44．根據(jù)權(quán)利要求24的組合物，其中所述混合物還包括含有下列組分的共聚物(a)疏水部分，(b)鍵合到疏水部分上的親水部分，和(c)與親水部分偶聯(lián)的功能部分，其中所述功能部分選自下列物質(zhì)配體、融合劑、溶酶體定位劑、核定位信號，以及它們的混合物。
45．根據(jù)權(quán)利要求44的組合物，其中所述配體選自運鐵蛋白、表皮生長因子、胰島素、脫唾液酸血清類粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、LewisX、唾液LewisX、N-乙?；樘前?、半乳糖、葡萄糖和凝血調(diào)節(jié)蛋白；所述融合劑選自多粘菌素B和血凝素H2；所述核定位信號是T-抗原。
46．一種用于將所選核酸遞送入宿主細(xì)胞的方法，該方法包括施用水性介質(zhì)中的有效量的混合聚合膠束/核酸復(fù)合物，其中混合聚合膠束/核酸復(fù)合物含有(a)兩親聚酯-聚陽離子共聚物和包含糖部分的兩親聚酯-糖共聚物的混合物，和(b)有效量的上述所選核酸，以使所述混合聚合膠束/核酸復(fù)合物與宿主細(xì)胞接觸，所述糖部分引發(fā)受體介導(dǎo)的混合聚合膠束/核酸復(fù)合物的內(nèi)吞作用，從而將所述核酸遞送入宿主細(xì)胞。
47．根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述糖部分是半乳糖，所述宿主細(xì)胞是肝細(xì)胞。
48．根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述糖部分是甘露糖，所述宿主細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。
49．根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述糖部分是N-乙?；樘前?，所述宿主細(xì)胞是T細(xì)胞。
50．根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述糖部分是葡萄糖，所述宿主細(xì)胞是結(jié)腸癌細(xì)胞。
51．根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述糖部分是半乳糖，所述宿主細(xì)胞是黑素瘤細(xì)胞。
全文摘要
用于將所選核酸遞送到靶定宿主細(xì)胞中的生物降解性混合聚合膠束,所述混合聚合膠束含有兩親聚酯－聚陽離子共聚物(12)和兩親聚酯－糖共聚物(18)。聚酯－聚陽離子共聚物(12)與聚陰離子核酸之間發(fā)生靜電相互作用,聚酯－糖共聚物(18)體內(nèi)將膠束－核酸復(fù)合物導(dǎo)入細(xì)胞。也可以包括具有類似性質(zhì)的其它共聚物。本發(fā)明組合物通過提供顆粒基因載體提高了遞送效率,該載體易于用多變量方法控制顆粒大小和電荷密度。使用該組合物還可以引入多種配體和其它功能性化合物。在用所選核酸轉(zhuǎn)化靶定宿主細(xì)胞的方法中,可以使用本發(fā)明組合物。
文檔編號A61K9/107GK1281355SQ98812132
公開日2001年1月24日 申請日期1998年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月12日
發(fā)明者Y·K·喬伊, J·S·基姆 申請人:三陽株式會社