專(zhuān)利名稱(chēng)：載脂蛋白a－i激動(dòng)劑及其在異常脂血相關(guān)病癥的治療中的應(yīng)用的制作方法
1．前言本發(fā)明涉及載脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ)激動(dòng)劑組合物，此類(lèi)組合物可用來(lái)治療異常脂蛋白血癥相關(guān)疾病，其中包括高膽固醇血癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄，和諸如膿毒性休克等其它病癥。
2．發(fā)明背景負(fù)責(zé)循環(huán)膽固醇運(yùn)輸?shù)氖茄獫{脂蛋白--復(fù)合脂和在血液內(nèi)運(yùn)輸脂類(lèi)的蛋白組合物組成的微粒。膽固醇的主要載體為低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。一般認(rèn)為，LDL負(fù)責(zé)在體內(nèi)將膽固醇從肝臟(合成或從食物中攝取膽固醇的場(chǎng)所)運(yùn)輸?shù)礁瓮饨M織?！胺聪蚰懝檀嫁D(zhuǎn)運(yùn)”是指膽固醇從肝外組織向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)，并在肝臟中分解和去除。血漿HDL顆粒則被認(rèn)為在反向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中作為組織膽固醇的清除劑而發(fā)揮重要作用。
很多證據(jù)表明，血清膽固醇的升高與冠心病相關(guān)。例如，動(dòng)脈粥樣硬化是一種進(jìn)行性慢性疾病，其特征為膽固醇在動(dòng)脈管壁內(nèi)的逐漸積累。動(dòng)脈粥樣硬化性疾病中沉積的脂類(lèi)主要來(lái)自于血漿LDL，這一觀點(diǎn)得到眾多證據(jù)的支持；因此，LDLs一般被稱(chēng)為“壞”膽固醇。相比之下，血清中HDL的水平與冠心病呈負(fù)相關(guān)--事實(shí)上，高水平的血清HDL被認(rèn)為是一種負(fù)危險(xiǎn)因子。據(jù)推測(cè)，高水平的血漿HDL不僅能夠預(yù)防冠心病，而且實(shí)際上還能夠誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化性斑塊的減退(例如，見(jiàn)Badimon et al.,1992,Circulation 86(Suppl.Ⅲ):86-94)。因此，HDL一般被稱(chēng)為“好”膽固醇。
2.1．膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)可劃分為兩條途徑外源途徑轉(zhuǎn)運(yùn)由腸道吸收的膽固醇和甘油三酯，內(nèi)源途徑轉(zhuǎn)運(yùn)由肝臟和其他非肝性組織進(jìn)入血液的膽固醇和甘油三酯。
在外源途徑中，攝入的脂肪被包裝成脂蛋白顆粒，稱(chēng)為乳糜微粒，乳糜微粒進(jìn)入血液，并將其中的甘油三酯提供給脂肪組織(用于貯存)和肌肉(用于氧化供能)。包含有膽固醇酯的乳糜微粒殘余物被僅在肝細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的一種特異受體從循環(huán)中清除。此后，該膽固醇還可用于細(xì)胞代謝，或作為血漿脂蛋白再循環(huán)到肝外組織中。
在內(nèi)源途徑中，肝臟將一種體積較大的極低密度脂蛋白顆粒(VLDL)分泌入血液。VLDLs的核心主要含有肝臟合成的甘油三酯，和少量膽固醇酯(在肝臟內(nèi)合成或由乳糜微粒再循環(huán)而來(lái))。載脂蛋白B-100和載脂蛋白E這兩種主要蛋白分布于VLDLs表面。當(dāng)VLDL到達(dá)脂肪組織或肌肉的毛細(xì)血管時(shí)，其中的甘油三酯被吸取，導(dǎo)致形成一種新的顆粒，該顆粒體積減小、膽固醇酯含量更高，但仍保留其兩種載脂蛋白，此類(lèi)顆粒被稱(chēng)為中間密度脂蛋白(IDL)。
在人體內(nèi)約有一半的IDL顆粒被迅速?gòu)难h(huán)中清除(在其形成后2-6小時(shí)內(nèi))，這是由于它們緊緊結(jié)合于能夠吸取其膽固醇以制造新VLDL和膽汁酸的肝細(xì)胞上。沒(méi)有被肝細(xì)胞吸收的IDL顆粒則可在循環(huán)中保留較長(zhǎng)的時(shí)間。此時(shí)，載脂蛋白E從循環(huán)顆粒上解離下來(lái)，使顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)橹缓休d脂蛋白B-100的LDL。
首先，肝臟將大部分膽固醇攝取并降解為膽汁酸，膽汁酸是膽固醇代謝的終產(chǎn)物。肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞上存在高濃度的LDL受體，這些受體可介導(dǎo)含膽固醇顆粒的吸收。LDL受體能夠與載脂蛋白E和載脂蛋白B-100結(jié)合，并負(fù)責(zé)與IDLs和LDLs結(jié)合并將其從循環(huán)中清除。但載脂蛋白E與LDL受體的親和力要比載脂蛋白B-100大得多。因此，LDL顆粒在循環(huán)中的壽命要比IDL顆粒長(zhǎng)得多--在與肝臟或其他組織上的LDL受體結(jié)合之前，LDLs可平均循環(huán)2.5天。血清中較高的LDL(“壞”膽固醇)水平與冠心病呈正相關(guān)。例如在動(dòng)脈粥樣硬化中，來(lái)源于循環(huán)LDLs的膽固醇在動(dòng)脈管壁上聚集而導(dǎo)致大斑塊形成，從而抑制血液流動(dòng)，并最終形成血凝塊而阻塞動(dòng)脈，導(dǎo)致心臟病發(fā)作。
從根本上講，細(xì)胞膽固醇代謝受LDLs釋放的胞內(nèi)膽固醇量的控制。來(lái)源于VLDLs和LDLs的細(xì)胞膽固醇的積累可調(diào)節(jié)三個(gè)過(guò)程首先，通過(guò)關(guān)閉HMGCoA還原酶--膽固醇生物合成途徑中的一種關(guān)鍵酶--的合成來(lái)減少細(xì)胞的膽固醇合成。其次，來(lái)源于LDL的膽固醇的進(jìn)入可通過(guò)激活A(yù)CAT--細(xì)胞中將膽固醇轉(zhuǎn)化為沉積于貯存微滴中的膽固醇酯的酶--來(lái)促進(jìn)膽固醇的儲(chǔ)存。再次，胞內(nèi)膽固醇的積累可驅(qū)動(dòng)一種反饋機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)新LDL受體的合成受到抑制。因此，細(xì)胞可調(diào)節(jié)其LDL受體的補(bǔ)充，以此來(lái)攝入足以滿足其代謝需要但又不會(huì)過(guò)量的膽固醇。(綜述見(jiàn)Brown & Goldstein,In,The量的膽固醇。(綜述見(jiàn)Brown & Goldstein,In,The PharmacologicalBasis of Therapeutics,8th Ed.,Goodman & Gilman,Pergamon Press,NY,1990,Ch.36,pp.874-896)。
2.2．反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)從總體上而言，外周(非肝性)細(xì)胞是通過(guò)就地合成和從VLDLs和LDLs攝取現(xiàn)成固醇相結(jié)合的途徑來(lái)獲得膽固醇。相比之下，外周細(xì)胞的膽固醇則可通過(guò)反向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)途徑返回肝臟，以再循環(huán)至肝外組織，或在膽汁中以膽汁酸修飾形式或氧化形式排泄到腸道內(nèi)。RCT途徑是從大多數(shù)肝外組織中去除膽固醇的唯一方法，它對(duì)體內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能維持至關(guān)重要。
RCT主要包括三個(gè)步驟(a)膽固醇外流，將膽固醇從各種外周細(xì)胞庫(kù)中去除；(b)利用卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(LCAT)的作用將膽固醇酯化，防止流出的膽固醇再次進(jìn)入細(xì)胞；以及(c)將HDL膽固醇酯攝取/轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞。RCT途徑由HDLs介導(dǎo)。HDL是具有高密度特點(diǎn)的脂蛋白顆粒的通稱(chēng)。HDL復(fù)合物的主要脂類(lèi)成分為各種磷脂、膽固醇(酯)和甘油三酯。最主要的載脂蛋白成分為A-Ⅰ和A-Ⅱ，它們決定了HDL的功能特性；此外還觀測(cè)到少量的載脂蛋白C-Ⅰ、C-Ⅱ、C-Ⅲ、D、E、J，等。HDL能夠以很多種不同大小的形式，以及與上述成分的不同混合物的形式存在，這取決于它們?cè)赗CT級(jí)聯(lián)代謝中的重塑情況。
LCAT是參與RCT途徑的關(guān)鍵酶。LCAT主要在肝臟中產(chǎn)生并伴隨HDL級(jí)分在血漿中循環(huán)。LCAT將來(lái)源于細(xì)胞的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，膽固醇酯由HDL捕獲并最終被清除。膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP)和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PLTP)可在循環(huán)HDL群體的進(jìn)一步重塑中發(fā)揮作用。CETP能夠?qū)CAT產(chǎn)生的膽固醇酯轉(zhuǎn)移至諸如VLDL和LDL等其它脂蛋白，尤其是含Apo-B的脂蛋白。PLTP則為HDL提供卵磷脂。HDL中的甘油三酯可被細(xì)胞外的肝甘油三酯酶分解，而脂蛋白膽固醇則通過(guò)某些機(jī)制由肝臟清除。
每個(gè)HDL顆粒中至少包含一分子(通常為2-4分子)的ApoA-Ⅰ。ApoA-Ⅰ在肝臟和小腸中以前載脂蛋白原形式合成，以蛋白原形式分泌，蛋白原則被迅速分解，產(chǎn)生一段含243個(gè)氨基酸殘基的成熟多肽。ApoA-Ⅰ主要包含6-8個(gè)不同的22氨基酸重復(fù)區(qū)，彼此由銜接部分隔開(kāi)，銜接部分通常為脯氨酸，在某些情況下也可由若干殘基組成。ApoA-Ⅰ銜接部分通常為脯氨酸，在某些情況下也可由若干殘基組成。ApoA-Ⅰ可與脂類(lèi)形成三種類(lèi)型的穩(wěn)定復(fù)合物低脂小復(fù)合物，稱(chēng)為前-β-1HDL；含有極性脂類(lèi)(磷脂和膽固醇)的扁平盤(pán)狀顆粒，稱(chēng)為前-β-2HDL；含有極性脂類(lèi)和非極性脂類(lèi)的球狀顆粒，稱(chēng)為球形HDL或成熟HDL(HDL3和HDL2)。循環(huán)HDL群體中大多都既含有ApoA-Ⅰ又含有A-Ⅱ(第二種主要HDL蛋白)，在此稱(chēng)為HDL的AⅠ/AⅡ-HDL成分。但是僅含有ApoA-Ⅰ的HDL成分(在此稱(chēng)為AⅠ-HDL成分)似乎在RCT途徑中更為有效。某些流行病學(xué)方面的研究支持關(guān)于AⅠ-HDL成分是抗動(dòng)脈粥樣硬化藥的學(xué)說(shuō)。(Parra et al.,1992,Arterioscler.Thromb.12:701-707；Decossin et al.,1997,Eur.J.Clin.Invest.27:299-307)。
盡管膽固醇從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移(即膽固醇外流)的機(jī)制尚不清楚，但可認(rèn)為低脂復(fù)合物，前-β-1HDL是RCT中轉(zhuǎn)運(yùn)自外周組織的膽固醇的優(yōu)選受體。(見(jiàn)Davidson et al.,1994,J.Biol.Chem.269:22975-22982；Bielicki et al.,1992,J.Lipid Res.33:1699-1709；Rothblat et al.,1992,J.Lipid Res.33:1091-1097；and Kawano et al.,1993,Biochemistry 32:5025-5028；Kawano et al.,1997,Biochemistry 36:9816-9825)。在從細(xì)胞表面補(bǔ)充膽固醇的這一過(guò)程中，前-β-1HDL迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榍?β-2HDL。PLTP可能會(huì)提高前-β-2盤(pán)狀顆粒形成的速率，但是還沒(méi)有資料能夠表明PLTP在RCT中的作用。LCAT優(yōu)先與盤(pán)狀HDL和球形HDL反應(yīng)，將卵磷脂或其它磷脂的2-?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到膽固醇的自由羥基上以產(chǎn)生膽固醇酯(留在HDL中)和溶血卵磷脂。LCAT反應(yīng)需要ApoA-Ⅰ作為活化劑；即，ApoA-Ⅰ是LCAT的天然輔助因子。將膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)楸Ａ粼贖DL中的膽固醇酯可防止膽固醇重新進(jìn)入細(xì)胞，結(jié)果是膽固醇酯最終將被去除。與來(lái)源于包含ApoA-Ⅰ和ApoA-Ⅱ的HDL(AⅠ/AⅡ-HDL成分)的膽固醇酯相比，AⅠ-HDL成分(即包含ApoA-Ⅰ不含ApoA-Ⅱ)的HDL成熟顆粒中的膽固醇酯能夠更加有效地被肝臟清除并加工為膽汁。這在某種程度上可能是由于AⅠ-HDL能夠與肝細(xì)胞膜更有效地結(jié)合。據(jù)推測(cè)有HDL受體存在，而最近有一種清除劑受體，SR-BI，被確認(rèn)為一種HDL受體(Acton et al.,1996,Science 271:518-520；Xuet al.,1997,Lipid Res.38:1289-1298)。SR-BI在類(lèi)固醇生成組織(如腎上腺)和肝臟中表達(dá)的量最為豐富(Landshulz et al.,1996,J.Clin.Invest.98:984-995；Rigotti et al.,1996,J.Biol.Chem.271:33545-33549)。
CETP似乎在RCT中不發(fā)揮主要作用，而是參與來(lái)源于VLDL和LDL的脂類(lèi)的代謝。但CETP活性或其受體，VLDL和LDL，的改變可對(duì)HDL群體的重塑發(fā)揮一定作用。例如在沒(méi)有CETP的情況下，HDLs就變?yōu)樵龃蟮念w粒而不能被清除。(有關(guān)RCT和HDLs的綜述，見(jiàn)Fielding &Fielding,1995,J.Lipid Res.36:211-228；Barrans et al.,1996,Biochem.Biophys.Acta.1300:73-85；Hirano et al.,1997,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.17(6):1053-1059)。
2.3．目前對(duì)異常脂蛋白血類(lèi)病癥的治療目前有多種療法可用于降低血清中的膽固醇和甘油三酯(例如，見(jiàn)上文Brown & Goldstein)。但是在功效、副作用以及適合的患者群體方面，各療法都有其自身的缺點(diǎn)及局限性。
膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂是一類(lèi)能夠切斷由腸至肝臟的膽汁酸再循環(huán)的藥物；如，消膽胺(Questran Light,Bristol-Myers Squibb)和考來(lái)替泊鹽酸鹽(Colestid,The Upjohn Company)。口服時(shí)，這些帶正電荷的樹(shù)脂可在腸中與帶負(fù)電荷的膽汁酸結(jié)合。由于樹(shù)脂不能由腸吸收，因此它們攜帶著膽汁酸被排出。然而，采用這類(lèi)樹(shù)脂最多也只能使血清中膽固醇的水平降低約20％，同時(shí)還伴有胃腸道副作用，如便秘和某些維生素缺乏癥。此外，由于樹(shù)脂還能夠與其它藥物結(jié)合，所以其它口服藥劑必須在樹(shù)脂攝入前至少1小時(shí)或攝入后4-6小時(shí)后才能服用；因此，會(huì)使心臟病患者的服藥方案變得復(fù)雜。
抑制素是降膽固醇藥，它可通過(guò)抑制HMGCoA還原酶--膽固醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶--來(lái)阻斷膽固醇的合成。抑制素，如洛伐他汀(Mevacor,Merck & Co.,Inc.)和普伐他汀(Pravachol,Bristol-Myers Squibb Co.)有時(shí)可與膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂共同使用。抑制素可顯著降低血清膽固醇和LDL血清的水平，并減緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的繼續(xù)發(fā)展。但血清HDL膽固醇的水平僅有適度增加。LDL降低效應(yīng)的機(jī)制可能既涉及VLDL濃度的降低，也涉及細(xì)胞LDL受體的誘導(dǎo)表達(dá)，從而導(dǎo)致LDLs形成的減少和/或其代謝的增加。使用這些藥物會(huì)伴有肝臟和腎臟功能障礙等副作用(Physicians Desk Reference,Medical Economics Co.,Inc.,Montvale,N.J.,1997)。最近，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)atorvastatin(Pare-Davis開(kāi)發(fā)的一種HMGCoA還原酶抑制劑)(Warner Lambert)上市，以用于雖然罕見(jiàn)但卻緊迫的家族性高膽固醇血癥病例的治療(1995,Scrip 20(19):10)。
吡啶甲酸，或稱(chēng)煙酸，是一種用作飲食添加物和抗高脂血?jiǎng)┑乃苄跃S生素B復(fù)合物。煙酸可減少VLDL的產(chǎn)生并對(duì)降低LDL有效。在某些情況下，它能夠與膽汁酸結(jié)合樹(shù)脂共同使用。當(dāng)使用足夠劑量時(shí)，煙酸可增加HDL水平，但以如此高的劑量使用時(shí)可引起的嚴(yán)重的副作用，從而限制了它的使用。
fibrates是一類(lèi)降脂藥物，用于還可能伴隨高膽固醇血癥產(chǎn)生的各種形式的高脂血癥(即，血清中甘油三酯升高)的治療。fibrates似乎可降低VLDL，并適當(dāng)增加HDL--但這些藥物對(duì)血清膽固醇的效果不穩(wěn)定。美國(guó)已批準(zhǔn)將fibrates作為抗脂血藥物使用，但還未被批準(zhǔn)用作高膽固醇血藥物。例如，安妥明(Atromid-S,Wyeth-AyerstLaboratories)是一種可通過(guò)減少VLDL成分來(lái)降低血清甘油三酯(機(jī)制不清)的抗脂血藥物。盡管在某些病人亞群中的血清膽固醇可能會(huì)降低，但是對(duì)藥物的生化反應(yīng)卻是多種多樣，而且不能始終預(yù)測(cè)哪些病人會(huì)收到良好的療效。Atromid-S在預(yù)防冠心病方面并沒(méi)有顯示出療效。化學(xué)及藥理學(xué)相關(guān)藥物吉非貝齊(Lopid,Parke-Davis)是一種脂類(lèi)調(diào)節(jié)藥物，它可以適度降低血清甘油三酯和VLDL膽固醇，并適度增加HDL膽固醇--HDL2和HDL3亞成分及ApoA-Ⅰ和A-Ⅱ(即，AⅠ/AⅡ-HDL成分)。但脂類(lèi)應(yīng)答卻各不相同，在不同患者群體中更是如此。此外，雖然在40-55歲無(wú)冠心病史或冠心病癥狀的男性患者中觀察到有預(yù)防冠心病的作用，但是還不清楚這些結(jié)果能夠在多大程度上外推到其它患者群體中(例如，女性、年齡更大和年齡更小的男性)。事實(shí)上，在已確診患有冠心病的患者中未觀察到療效。使用fibrates會(huì)伴隨有嚴(yán)重的副作用，其中包括惡性瘤等的毒性(尤其是腸胃癌)、膽囊病以及非冠心病致死發(fā)生率的增加。這些藥物不適用于僅具有高LDL或低HDL的脂質(zhì)異常病人的治療(Physician’s Desk Reference,1997,Medical Economics Co.,Inc.Montvale,N.J.)。
對(duì)絕經(jīng)后婦女的中度高膽固醇血癥可考慮采用口服雌激素替代療法。但HDL的增加可能伴有甘油三酯的升高。當(dāng)然，雌激素治療只能局限于特定的患者群體(絕經(jīng)后婦女)，并且伴有嚴(yán)重的副作用，其中包括惡性腫瘤、膽囊病、血栓栓塞性疾病、肝腺瘤、血壓升高、葡糖不耐性和高鈣血癥。
因此，有必要開(kāi)發(fā)可有效降低血清膽固醇、增加HDL血清水平、預(yù)防冠心病，和/或治療現(xiàn)有疾病，尤其是動(dòng)脈粥樣硬化，的更安全的藥物。
2.4．將ApoA-Ⅰ作為突破口目前所使用的降膽固醇藥物中沒(méi)有一種能夠安全地提高HDL水平并促進(jìn)RCT--大多數(shù)藥物似乎只對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)途徑、飲食攝入調(diào)節(jié)、再循環(huán)、膽固醇合成以及VLDL群體產(chǎn)生影響。
人們希望找到可促進(jìn)膽固醇外流和清除的藥物，但RCT中卻存在著幾個(gè)可能的突破口--例如，LCAT、HDL及其不同成分(ApoA-Ⅰ,ApoA-Ⅱ和磷脂)、PLTP和CETP--并且人們不知道哪個(gè)突破口可更有效地獲得理想的脂蛋白分布和保護(hù)效果。干擾RCT途徑中的任何單一成分都可最終影響循環(huán)脂蛋白群體的組成以及RCT的效率。
以體內(nèi)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的幾方面證據(jù)都暗示，HDL及其主要蛋白組分，ApoA-Ⅰ，參與了動(dòng)脈粥樣硬化病變的預(yù)防、并可能參與粥樣斑塊的減退--從而使其成為具有吸引力的治療性干預(yù)的突破口。首先，血清ApoA-Ⅰ(HDL)濃度與男性動(dòng)脈粥樣化形成之間存在有負(fù)相關(guān)性(Gordon & Rifkind,1989,N.Eng.J.Med.321:1311-1316；Gordon et al.,1989,Circulation 79:8-15)。事實(shí)上，人們已將HDL的特定亞群與人類(lèi)動(dòng)脈粥樣化形成的風(fēng)險(xiǎn)降低聯(lián)系起來(lái)(Miller,1987,Amer.Heart 113:589-597；Cheung et al.,1991,Lipid Res.32:383-394)；Fruchart & Ailhaud,1992,Clin.Chem.38:79)。
其次，一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有利于說(shuō)明ApoA-Ⅰ(HDL)的預(yù)防作用。用ApoA-Ⅰ或HDL處理膽固醇喂養(yǎng)的兔子可以減緩其粥樣斑塊(脂肪紋)的生長(zhǎng)與增加。(Koizumi et al.,1988,J.Lipid Res.29:1405-1415；Badimon et al.,1989,Lab.Invest.60:455-461；Badimonet al.,1990,J.Clin.Invest.85:1234-1241)。但療效隨HDL來(lái)源的不同而不同(Beitz et al.,1992,Prostaglandins,Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47:149-152；Mezdour etal.,1995,Atherosclerosis 113:237-246)。
第三，由涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)獲得了有關(guān)ApoA-Ⅰ作用的直接證據(jù)．將人類(lèi)ApoA-Ⅰ基因轉(zhuǎn)入遺傳上易于由食物誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠體內(nèi)，該基因的表達(dá)可使防止其主動(dòng)脈病變的繼續(xù)發(fā)展(Rubin eta1.,1991,Nature 353:265-267)。ApoA-Ⅰ轉(zhuǎn)基因還在ApoE缺陷小鼠和Apo(a)轉(zhuǎn)基因小鼠中顯示出對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的抑制(Paszty eta1.,1994,J.Clin.Invest.94:899-903:Plump et a1.,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9l:9607-9611:Liu et a1.,1994,J,LipidRes,35:2263-2266)。在表達(dá)人類(lèi)ApoA-Ⅰ的轉(zhuǎn)基因兔上也觀察到了類(lèi)似的結(jié)果(Duverger,1996,Circulation 94:713-717；Duverger eta1.,1996,Arterioscler.Thromb.Vasc.Bi01.16:1424-1429)，而在人類(lèi)ApoA-Ⅰ水平上升的轉(zhuǎn)基因大鼠中可使其免患動(dòng)脈粥樣硬化，并抑制球囊血管成形術(shù)后的再狹窄(Burkey et a1.,1992,Circula-tion,Supplement I,86:I-472,Abstract No.1876；Burkey et a1.,1995,J.Lipid Res.36:1463-1473)。
與AⅠ/AⅡ-HDL相比，AⅠ-HDL似乎在RCT中更為有效。對(duì)人類(lèi)ApoA-Ⅰ轉(zhuǎn)基因小鼠或Apo-Ⅰ和ApoA-Ⅱ(AⅠ/AⅡ)轉(zhuǎn)基因小鼠的研究顯示，HDL的蛋白組成能夠顯著影響其功能--AⅠ-HDL的抗動(dòng)脈粥硬樣能力比AⅠ/AⅡ-HDL更強(qiáng)(Schultz et a1.,1993,Nature 365:762-764)。在表達(dá)人類(lèi)LCAT基因的轉(zhuǎn)基因小鼠上進(jìn)行的平行實(shí)驗(yàn)表明，LCAT活性的適度增加可顯著改變脂蛋白膽固醇的水平，而且LCAT對(duì)包含AnoA-Ⅰ的HDL有顯著的優(yōu)先選擇性(Francone et al.,1995,J.Clinic.Invest.96:1440-1448；Berard et a1.,1997,Nature Medicine3(7):744-749)。盡管這些數(shù)據(jù)有利于說(shuō)明ApoA-Ⅰ在激活LCAT和促進(jìn)RCT中的重要作用，但另外一些實(shí)驗(yàn)卻顯示出更為復(fù)雜的結(jié)果調(diào)節(jié)細(xì)胞膽固醇外流的主要HDL成分是磷脂(Fournier et al.,1996,J.Lipid Res.37:1704-1711)。
考慮到HDL，即ApoA-Ⅰ及其結(jié)合的磷脂，在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化中的潛在作用，UCB Belglum曾利用重組生產(chǎn)的ApoA-Ⅰ開(kāi)始進(jìn)行人類(lèi)臨床實(shí)驗(yàn)，其間曾中斷實(shí)驗(yàn)，但目前顯然又重新開(kāi)始該實(shí)驗(yàn)(Pharmaprojects,Oct.27,1995；IMS R&D Focus,June 30,1997；Drug Status Update, 997, Atherosclerosis 2(6):261-265)；另見(jiàn)M.Eriksson at Congress,“The Roie of HDL in DiseasePrevention,”Nov.7-9,1996,Fort Worth；Lacko & Miller,1997,J.Lip.Res.38:1267-1273；and WO94/13819),Bio-Tech也曾開(kāi)始此類(lèi)實(shí)驗(yàn)，但現(xiàn)已中止(Pharmaprojects,April 7,1989)。人們還對(duì)利用ApoA-Ⅰ治療膿毒性休克的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了嘗試(Opal,“Reconstituted HDL as aTreatment Strategy for Sepsi s,”IBC’s 7th InternationalConference on Sepsis,April 28-30,1997,Washington,D.C.；Gouni et al.,1993,J.Lipid Res.94:139-146；Levine,WO96/04916)。然而，ApoA-Ⅰ的生產(chǎn)和使用伴隨有許多缺陷，使其不足以成為理想的藥物；例如，ApoA-Ⅰ是一種難于生產(chǎn)并且造價(jià)昂貴的大蛋白；就儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性、活性產(chǎn)品的運(yùn)輸及在體內(nèi)的半衰期等問(wèn)題而言，還有許多重要的生產(chǎn)問(wèn)題和重復(fù)性問(wèn)題必須克服。
鑒于這些缺點(diǎn)，人們已經(jīng)試圖制備能夠模擬ApoA-Ⅰ的肽。由于ApoA-Ⅰ的主要活性來(lái)自于蛋白中具有特殊二級(jí)結(jié)構(gòu)部件--A類(lèi)兩親性α-螺旋(Segrest,1974,FEBS lett.38:247-253)--的多個(gè)重復(fù)，因此設(shè)計(jì)能夠模擬ApoA-Ⅰ活性的肽的大多數(shù)努力都集中在可形成A類(lèi)兩親性α-螺旋(class A-rype amphipathicα-helices)的肽的設(shè)計(jì)上。
A類(lèi)兩親性α-螺旋的獨(dú)特性在于，帶正電荷的氨基酸殘基聚集于疏水-親水界面，而帶負(fù)電荷的氨基酸殘基聚集于親水表面的中心。此外，A類(lèi)α-螺旋肽具有的疏水角小于180°(Segrest et al.,1990,PROTEINS:Structure,Function and Genetics 8:103-117)。最初的ApoA-Ⅰ模擬物的重新設(shè)計(jì)策略不是基于天然存在的載脂蛋白的一級(jí)序列，而是將這些獨(dú)特的A類(lèi)螺旋部件與肽類(lèi)似物的序列以及ApoA-Ⅰ結(jié)構(gòu)域的某些屬性結(jié)合起來(lái)(例如，見(jiàn)Dayidson et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13605-13610；Rogers et al.,1997,Biochemistry 36:288-300；Lins et al.,1993,Biochim.Biophys.Acta biomembranes 1151:137-142；Ji and Jonas,1995,J.Biol.Chem.270:11290-11297；Collet et al.,1997,Journal of LipidResearch,38:634-644；Sparrow and Gotto,1980,Ann.N.Y.Acad.Sci.348:187-211；Sparrow and Gotto,1982,CRC Crit.Rev.Biochem.13:87-107；Sorci-Thomas et al.,1993,J.Biol.Chem.268:21403-21409；Wang et al.,1996,Biochim.Biophys.Acta174-184；Minnich et al.,1992,J.Biol.Chem.267:16553-16560；Holvoet et al.,1995,Biochemistry 34:13334-13342；Sorci-Thomas et al,1997,J.Biol.Chem.272(11):7278-7284；以及Frank et al.,1997,Biochemistry 36:1798-1806)。
Fukushima等人在一項(xiàng)研究中合成了一條22聚體肽，該肽完全由周期性排列的Glu、Lys和Leu殘基組成，以形成一個(gè)具有相同親水表面和疏水表面的兩親性α-螺旋(“ELK肽”)(Fukushima et al.,1979,J.Amer.Chem.Soc.101(13):3703-3704；Fukushima et al.,1980,J.Biol.Chem.255:10651-10657)。ELK肽與ApoA-Ⅰ的198-219片段有41％的序列同源性。定量超濾、凝膠滲透層析和圓二色的研究顯示，該ELK肽可與磷脂有效地結(jié)合，并能夠模擬ApoA-Ⅰ的某些物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)(Kaiser et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:1137-1140；Kaiser et al.,1984,Science 223:249-255；Fukushima et al.,1980，見(jiàn)上文；Nakagawa et al.,1985,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092)。Yokoyama等人從這些研究中推斷，LCAT激活活性的關(guān)鍵因素僅在于存在一種足夠大的兩親性結(jié)構(gòu)(Yokoyamaet al.,1980,J.Biol.Chem.255(15):7333-7339)。此后發(fā)現(xiàn)該22-殘基肽的二聚體比單體能夠更精確地模擬ApoA-Ⅰ；人們根據(jù)這些結(jié)果推斷，中間由螺旋阻斷殘基(Gly或Pro)打斷的44-殘基段代表了ApoA-Ⅰ的最小功能結(jié)構(gòu)域(Nakagawa et al.,1985，見(jiàn)上文)。
另一項(xiàng)研究則涉及被稱(chēng)為“LAP肽”的兩親性肽模型(Pownall etal.,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(6):3154-3158；Sparrowet al.,1981,In:Peptides:Synthesis-Structure-Function,Rochand Gross,Eds.,Pierce Chem.Co.,Rockford,IL,253-256)。根據(jù)脂類(lèi)與天然載脂蛋白片段結(jié)合的研究設(shè)計(jì)出了幾種LAP肽，命名為L(zhǎng)AP-16、LAP-20及LAP-24(分別包含16、20及24個(gè)氨基酸殘基)。這些兩親性肽模型與載脂蛋白間無(wú)序列同源性，并且設(shè)計(jì)的親水表面組織方式與結(jié)合于載脂蛋白的A-類(lèi)兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域不同(Segrest etal.,1992,J.Lipid Res.33:141-166)。作者根據(jù)這些研究推斷，要使兩親性肽模型具有與脂類(lèi)結(jié)合的特性，必需的最小長(zhǎng)度為20個(gè)殘基。
在序列的不同位置含有一個(gè)脯氨酸殘基的LAP20突變體的研究表明，脂類(lèi)結(jié)合與LCAT激活之間有直接的關(guān)系，但只具有形成螺旋潛能的肽卻不能導(dǎo)致其具有LCAT激活活性(Ponsin et al.,1986 J.Biol.Chem.261(20):9202-9205)。此外，接近肽的中部存在的該螺旋阻斷殘基(Pro)可降低其對(duì)磷脂表面的親和力以及激活LCAT的能力。盡管有某些LAP肽可顯示出與磷脂結(jié)合(Sparrow et al.,見(jiàn)上文)，但是有關(guān)在脂類(lèi)參與情況下LAP肽的螺旋長(zhǎng)度的爭(zhēng)論依然存在(Buchkoet al.,1996,J.Biol.Chem.271(6):3039-3045；Zhong et al.,1994,Peptide Research 7(2):99-106)。
Segrest等人已合成了與ApoA-Ⅰ的螺旋沒(méi)有序列同源性的含18-24個(gè)氨基酸殘基的肽，(Kannelis et al.,1980,J.Biol.Chem.255(3):11464-11472；Segrest et al.,1983,J.Biol.Chem.258:2290-2295)。根據(jù)疏水力矩(Eisenberg et al.,1982,Nature299:371-374)和電荷分布(Segrest et al.,1990,Proteins8:103-117；U.S.Patent No.4,643,988)將序列特別設(shè)計(jì)成能夠模擬A類(lèi)可轉(zhuǎn)換載脂蛋白的兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域。一種18殘基肽，記為“18A”肽，被設(shè)計(jì)成A類(lèi)α-螺旋模型(Segrest et al.,1990，見(jiàn)上文)。對(duì)這些肽以及其它具有相反電荷分布的肽，如“18R”肽，的研究一致表明，電荷分布對(duì)活性是至關(guān)重要的；與18A A類(lèi)模擬物相比，具有相反電荷分布的肽顯示出對(duì)脂類(lèi)親和力的降低，以及在脂類(lèi)參與情況下較低的螺旋含量(Kanellis et al.,1980,J.Biol.Chem.255:11464-11472；Anantharamaiah et al.,1985,J.Biol.Chem.260:10248-10255；Chung et al.,1985,J.Biol.Chem.260:10256-10262；Epand et al.,1987,J.Biol.Chem.262:9389-9396；Anantharamaiah et al.,1991,Adv.Exp.Med.Biol.285:131-140)。
其它已取得有限進(jìn)展的與載脂蛋白間無(wú)序列同源性的合成肽包括，18A肽的二聚體和三聚體(Anantharamaiah et al.,1986,Proteinsof Biological Fluids 34:63-66),GALA肽和EALA肽(Subbarao etal.,1988,PROTEINS:Structure,Function and Genetics3:187-198)以及ID肽(Labeur et al.,1997,Arteriosclerosis,Thrombosis and Vascular Biology 17:580-588)和18AM4肽(Brasseuret al.,1993,Biochim.Biophys.Acta 1170:1-7)。
另外還設(shè)計(jì)出一種肽，該肽包含有基于人類(lèi)ApoA-Ⅰ的螺旋序列的22個(gè)氨基酸殘基(Anantharamaiah et al.,1990,Arteriosclerosis10(1):95-105；Venkatachalapathi et al.,1991,Mol.Conforma-tion and Biol.Interactions,Indian Acad.Sci.B:585-596)。該序列是通過(guò)確定人類(lèi)ApoA-Ⅰ中假定螺旋的每個(gè)位置上最普遍的殘基而加以構(gòu)建的。與上文所述的肽類(lèi)似，該肽所形成的螺旋的親水-疏水界面處聚集著帶正電荷的氨基酸殘基，在親水表面中心聚集有帶負(fù)電荷的氨基酸殘基，并且疏水角小于180°。盡管這種肽的二聚體在激活LCAT方面具有一些功效，但其單體幾乎不顯示出脂類(lèi)結(jié)合特性(Venkatachalapathi et al.,1991，見(jiàn)上文)。
以上述肽的體外實(shí)驗(yàn)為主要依據(jù)，形成了一套可模擬ApoA-Ⅰ功能的肽的設(shè)計(jì)“標(biāo)準(zhǔn)”。值得注意的是，兩親性α-螺旋在親水-疏水界面處聚集有帶正電荷的殘基以及在親水表面中心聚集有帶負(fù)電荷的殘基被認(rèn)為是脂類(lèi)親和性及LCAT激活所必需的(Venkatachalapathi etal.,1991,見(jiàn)上文)。Anantharamaiah等人還指出，共有22聚體肽的第13位Glu殘基在LCAT激活中具有重要作用，該帶負(fù)電荷的殘基位于α-螺旋疏水表面內(nèi)部(Anantharamaiah et al.,1991，見(jiàn)上文)。此外，Brasseur指出，一個(gè)小于180°的疏水角(pho角)是達(dá)到最佳的脂類(lèi)-載脂蛋白復(fù)合物穩(wěn)定性所必需的，同時(shí)也說(shuō)明了多肽圍繞在脂類(lèi)雙分子層邊緣的盤(pán)狀顆粒的形成原因(Brasseur,1991,J.Biol.Chem.66(24):16120-16127)。Rosseneu等人還強(qiáng)調(diào)，小于180°的疏水角也是LCAT激活所必需的(WO93/25581)。
但是，盡管迄今為止已有這些“標(biāo)準(zhǔn)”，但還沒(méi)有人設(shè)計(jì)或制造出具有與ApoA-Ⅰ同樣活性的肽--利用文中所述的LCAT激活活性測(cè)試法測(cè)定的最佳活性也還低于ApoA-Ⅰ的40％。文獻(xiàn)中所描述的肽“模擬物”中沒(méi)有一個(gè)可證明能夠有效地用作藥物。
鑒于上述原因，因此有必要開(kāi)發(fā)一種可模擬ApoA-Ⅰ活性并且生產(chǎn)相對(duì)簡(jiǎn)單而又節(jié)省成本的穩(wěn)定的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑。但是，人們還未揭示出有效ApoA-Ⅰ模擬物的設(shè)計(jì)“標(biāo)準(zhǔn)”，并且還不了解具有ApoA-Ⅰ功能的有機(jī)分子的設(shè)計(jì)原則。
3．發(fā)明概述本發(fā)明涉及可模擬ApoA-Ⅰ活性形成兩親性α-螺旋，而且其比活，即活性單位(LCAT激活活性)/質(zhì)量單位，接近或超出天然分子比活的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑。詳細(xì)而言，本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為能夠形成兩親性螺旋(在脂類(lèi)參與情況下)、能夠與脂類(lèi)結(jié)合、能夠形成前-β樣或HDL樣復(fù)合物、能夠激活LCAT、能夠提高血清中HDL成分的水平，以及能夠提高膽固醇外流的肽或肽類(lèi)似物。
在某種程度上，本發(fā)明是基于申請(qǐng)人所設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)的能夠模擬ApoA-Ⅰ功能的肽。本發(fā)明所述肽的設(shè)計(jì)依據(jù)是來(lái)源于ApoA-Ⅰ螺旋重復(fù)的22氨基酸共有序列的假定螺旋結(jié)構(gòu)和兩親性性質(zhì)。令人驚奇的是，本發(fā)明所述肽的比活大大高于文獻(xiàn)中所報(bào)道的ApoA-Ⅰ-衍生肽的比活。本發(fā)明中一些實(shí)施方案的活性確實(shí)100％接近于天然ApoA-Ⅰ的活性，而強(qiáng)激動(dòng)劑的比活甚至超出了ApoA-Ⅰ的比活。
本發(fā)明以操作實(shí)例的方法加以闡明，這些操作實(shí)例對(duì)能夠形成螺旋(在脂類(lèi)參與情況下)、能夠與脂類(lèi)結(jié)合、能夠形成復(fù)合物以及能夠提高LCAT活性的特異兩親性肽的結(jié)構(gòu)、制備和使用加以描述。根據(jù)這些典型的實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)和活性，申請(qǐng)人已發(fā)明出一套可用于設(shè)計(jì)亦處于本發(fā)明范圍內(nèi)的變化或變異形式的“標(biāo)準(zhǔn)”。
本發(fā)明還涉及將此類(lèi)ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑(包括肽類(lèi)或肽-脂復(fù)合物類(lèi))作為活性成分而包含在內(nèi)的藥劑，以及此類(lèi)藥劑的制備方法和在異常脂蛋白血相關(guān)疾病(如心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、代謝性綜合癥)、再狹窄，或內(nèi)毒素血癥(如膿毒性休克)的治療中的應(yīng)用。
3.1．縮略語(yǔ)文中遺傳編碼的L-型氨基酸所采用的縮寫(xiě)符合常規(guī)慣例，如下所示
遺傳編碼氨基酸的D-型對(duì)映體采用相同單字母符號(hào)的小寫(xiě)形式。例如，“R”表示L-精氨酸，則“r”表示D-精氨酸。
3.2．定義文中使用的以下術(shù)語(yǔ)所具有的含義如下所述“烷基”指支鏈、直鏈或環(huán)狀的飽和烴基。典型的烷基基團(tuán)包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基等，但并不局限于此。優(yōu)選實(shí)施方案中的烷基基團(tuán)為(C1-C6)烷基。
“烯基”指至少具有一個(gè)碳-碳雙鍵的支鏈、直鏈或環(huán)狀的不飽和烴基。該基團(tuán)的雙鍵可為順式或反式構(gòu)象。典型的烯基基團(tuán)包括乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、異丁烯基、叔丁烯基、戊烯基、己烯基等，但并不局限于此。優(yōu)選實(shí)施方案中的烯基基團(tuán)為(C1-C6)烯基。
“炔基”指至少具有一個(gè)碳-碳三鍵的支鏈、直鏈或環(huán)狀的不飽和烴基。典型的炔基基團(tuán)包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、異丁炔基、戊炔基、己炔基等，但并不局限于此。優(yōu)選實(shí)施方案中的炔基基團(tuán)為(C1-C6)炔基。
“芳基”指具有共軛π電子系統(tǒng)的環(huán)狀不飽和烴基。典型的芳基基團(tuán)包括戊-2,4-二烯、苯基、萘基、蒽基、薁基、基、蔻基、熒蒽基、indacenyl、茚基(idenyl)、卵苯基、苝基、phenalenyl、菲基、苉基、pleiadenyl、芘基、皮蒽基、玉紅省基等，但并不局限于此。優(yōu)選實(shí)施方案中的芳基基團(tuán)為(C5-C20)芳基，特別優(yōu)選的為(C5-C10)芳基。
“烷芳基”指直鏈烷基、烯基或炔基基團(tuán)其中與末端碳原子結(jié)合的一個(gè)氫原子被芳基部分所取代。典型的烷芳基基團(tuán)包括芐基、亞芐基、次芐基、苯并芐基、萘并芐基等，但并不局限于此。優(yōu)選實(shí)施方案中的烷芳基基團(tuán)為(C6-C26)烷芳基，即烷芳基基團(tuán)的烷基、烯基或炔基部分為(C1-C6)，而芳基部分為(C5-C20)。特別優(yōu)選實(shí)施方案中的烷芳基基團(tuán)為(C6-C13)烷芳基，即烷芳基基團(tuán)的烷基、烯基或炔基部分為(C1-C3)，而芳基部分為(C5-C10)。
“雜芳基”指芳基中一個(gè)或多個(gè)碳原子被另一種原子，如N、P、O、S、As、Se、Si、Te等所取代。典型的雜芳基基團(tuán)包括acridarsine、吖啶、arsanthridine、砷雜茚、arsindoline、咔唑、β-咔啉、苯并吡喃、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、中氮茚、異砷雜茚、異砷雜萘、異苯并呋喃、異苯并吡喃、異吲哚、isophosphoindole、isophosphinoline、異喹啉、異噻唑、異噁唑、1,5二氮雜萘、啶、菲啶、菲咯啉、吩嗪、phosphoindole、phosphinoline、酞嗪、蝶啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、噠嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、pyrrolizine、喹唑啉、喹啉、喹嗪、喹喔啉、硒吩、碲吩、噻吩和呫噸(或叫氧雜蒽)，但并不局限于此。優(yōu)選實(shí)施方案中的雜芳基基團(tuán)為5-20元雜芳基，而特別優(yōu)選的為5-10個(gè)主鏈原子。
“烷雜芳基”指直鏈烷基、烯基或炔基基團(tuán)其中與末端碳原子結(jié)合的一個(gè)氫原子被雜芳基部分所取代。優(yōu)選實(shí)施方案中的烷雜芳基基團(tuán)為6-26元烷雜芳基，即烷雜芳基的烷基、烯基或炔基部分為(C1-C6)，雜芳基為5-20元雜芳基。特別優(yōu)選實(shí)施方案中的烷雜芳基基團(tuán)為6-13元烷雜芳基，即烷基、烯基或炔基部分為5-10元雜芳基。
“取代的烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、雜芳基或烷雜芳基”指烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、雜芳基或烷雜芳基基團(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)氫原子被另一種取代基所取代。優(yōu)選的取代基包括-OR、-SR、-NRR、-NO2、-CN、鹵素、-C(O)R、-C(O)OR和-C(O)NR，而每個(gè)R各自獨(dú)立地代表氫、烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、雜芳基或烷雜芳基。
4．附圖簡(jiǎn)述

圖1A為理想化兩親性α-螺旋的Schiffer-Edmundson螺旋輪狀示意圖，其中空心圓圈代表親水性氨基酸殘基，加陰影的圓圈代表疏水性氨基酸殘基。
圖1B為圖1A所示理想化兩親性螺旋的螺旋網(wǎng)狀示意圖。
圖1C為圖1A所示理想化兩親性螺旋的螺旋圓柱狀示意圖。
圖2A為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的Schiffer-Edmundson螺旋輪狀示意圖，說(shuō)明螺旋的兩親性(空心圓圈代表親水性氨基酸殘基，加陰影的圓圈代表疏水性氨基酸殘基，加顆粒狀陰影的圓圈既可代表親水性氨基酸殘基，也可代表疏水性氨基酸殘基)。
圖2B為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的螺旋網(wǎng)狀示意圖，說(shuō)明螺旋的疏水表面。
圖2C為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的螺旋網(wǎng)狀示意圖，說(shuō)明螺旋的親水表面。
圖3A所示螺旋網(wǎng)狀示意圖說(shuō)明Segrest的共有22聚體肽(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)的親水表面。
圖3B所示螺旋網(wǎng)狀示意圖說(shuō)明典型的第146號(hào)核心肽(PVLELFENLLERLLDALQKKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)的親水表面。
圖4A所示螺旋網(wǎng)狀示意圖說(shuō)明Segrest的共有22聚體肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)的疏水表面。
圖4B所示螺旋網(wǎng)狀示意圖說(shuō)明典型的第146號(hào)核心肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)的疏水表面。
圖5A為Segrest的共有22聚體肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)的Schif-fer-Edmundson螺旋輪狀示意圖。
圖5B為典型的第146號(hào)核心肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)的Schif-fer-Edmundson螺旋輪狀示意圖。
圖6顯示兩條第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)以反平行方式排列的計(jì)算機(jī)模型，其中突出顯示Glu-7和Gln-18以說(shuō)明這兩條肽與脂類(lèi)結(jié)合時(shí)能夠形成分子內(nèi)氫鍵。
圖7A顯示本發(fā)明的三級(jí)分支網(wǎng)絡(luò)。
圖7B顯示本發(fā)明的四級(jí)分支網(wǎng)絡(luò)。
圖7C顯示本發(fā)明的混合分支網(wǎng)絡(luò)。
圖7D顯示本發(fā)明的典型“Lys-樹(shù)”分支網(wǎng)絡(luò)。
圖8A所示曲線圖顯示第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)及Segrest的共有22聚體肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)的Hα化學(xué)位移觀測(cè)值與無(wú)規(guī)線圈的Hα化學(xué)位移列表值的差異。
圖8B所示曲線圖顯示第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)及Segrest的共有22聚體肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)的酰胺質(zhì)子化學(xué)位移觀測(cè)值與無(wú)規(guī)線圈的酰胺質(zhì)子化學(xué)位移列表值的差異。
圖8C所示曲線圖顯示由第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)觀測(cè)到的次級(jí)酰胺質(zhì)子化學(xué)位移( )與理想α-螺旋的次級(jí)酰胺質(zhì)子化學(xué)位移( )的對(duì)比(在理想螺旋中，空心圓圈代表親水性殘基，加陰影的圓圈代表疏水性殘基)。
圖9所示曲線圖顯示兔子注射8mg/kg體重的第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)(以肽/DPPC復(fù)合物形式)后的脂蛋白分布。
圖10A顯示可由本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑獲得的各種聚合狀態(tài)和肽-脂復(fù)合物。左圖由若干肽螺旋的相互作用引起的肽多聚體化過(guò)程，該過(guò)程在規(guī)定的肽濃度、pH和離子強(qiáng)度條件下可導(dǎo)致寡聚體的形成。中圖肽與脂類(lèi)小體(如SUVs)的相互作用(在任意的這些聚合狀態(tài)下)可導(dǎo)致脂類(lèi)重組。右圖通過(guò)改變脂∶肽的摩爾比率可獲得不同類(lèi)型的肽-脂復(fù)合物，低脂-肽比率可獲得脂-肽其聚微膠粒，隨著脂∶肽比率的逐漸提高可獲得盤(pán)狀顆粒以及最終的多片層大復(fù)合物。
圖10B顯示在規(guī)定的脂∶肽比率范圍內(nèi)形成的盤(pán)狀肽-脂復(fù)合物的公認(rèn)模型。環(huán)繞圓盤(pán)邊緣的每個(gè)肽都與其最接近的兩個(gè)肽分子緊密接觸。
5．發(fā)明詳述本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可模擬ApoA-Ⅰ的功能和活性。它們能夠形成兩親性螺旋(在脂類(lèi)參與情況下)，能夠與脂類(lèi)結(jié)合，可形成前-β樣或HDL樣復(fù)合物，能夠激活LCAT，能夠提高血清中的HDL濃度，也能夠提高膽固醇外流。這些肽的生物活性與其螺旋結(jié)構(gòu)相關(guān)，或在脂類(lèi)參與情況下與其螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變相關(guān)。
本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑能夠制備成固定容量或固定單位劑量的形式，如凍干制品，可于在體使用前重構(gòu)或重新配制。本發(fā)明包括這些藥劑以及這些制劑在高脂血癥、高膽固醇血癥、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化，和其它如內(nèi)毒素血癥造成的膿毒性休克等病情的治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明以操作實(shí)例的方法加以闡明，這些操作實(shí)例可證明本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑在激活LCAT從而促進(jìn)RCT方面極為有效。在動(dòng)物模型體內(nèi)使用本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可導(dǎo)致血清中HDL濃度的提高。
以下各小節(jié)將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的闡述，其中包括ApoA-Ⅰ肽類(lèi)激動(dòng)劑的組成和結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)特性和功能特性；容量形式及單位劑量形式制劑的制備方法；以及使用方法。
5.1．肽的結(jié)構(gòu)和功能本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑通常為肽或其類(lèi)似物，它們能夠在脂類(lèi)參與情況下形成兩親性α-螺旋，并模擬ApoA-Ⅰ的活性。這些激動(dòng)劑的主要特征是具有一個(gè)包含15-29個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選的為22個(gè)氨基酸殘基，的“核心”肽段，或其類(lèi)似物，其肽段中至少有一個(gè)酰胺鍵被取代酰胺、酰胺等排體或酰胺模擬物所取代。
在某種程度上，本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的基礎(chǔ)是本申請(qǐng)人意外發(fā)現(xiàn)Venkatachalapathi et al.,1991,Mol.Conformation and Biol.Interactions,Indian Acad.Sci.B:585-596中被認(rèn)為對(duì)活性至關(guān)重要的22聚體共有序列的一級(jí)序列(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)75；以下記為“Segrest的共有22聚體”或“共有22聚體”)中特定氨基酸殘基的改變可導(dǎo)致合成肽表現(xiàn)的活性接近，或在某些實(shí)施方案中甚至超出，天然ApoA-Ⅰ的活性。特別是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將Segrest的共有22聚體肽中的三個(gè)荷電氨基酸殘基(Glu-5,Lys-9,Glu-13)替換為疏水性Leu殘基可使肽模擬ApoA-Ⅰ結(jié)構(gòu)和功能特性的程度達(dá)到該領(lǐng)域前所未有的水平。
盡管不希望受到任何特定原理的約束，但與文獻(xiàn)中描述的ApoA-Ⅰ模擬肽所形成的α-螺旋相比，可認(rèn)為由本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑形成的螺旋能夠更精確地模擬天然ApoA-Ⅰ中兩親性螺旋區(qū)域的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能性質(zhì)，這些性質(zhì)對(duì)脂類(lèi)結(jié)合、膽固醇外流和LCAT激活的實(shí)現(xiàn)十分重要。鑒于本發(fā)明中敘述的多種ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的活性確實(shí)接近，在某些實(shí)施方案中甚至超出，ApoA-Ⅰ的活性，而到目前為止，文獻(xiàn)中描述的最有效的ApoA-Ⅰ模擬肽--18AM4(EWLEAFYKKVLEKLKELF；序列標(biāo)識(shí)號(hào)246)(Corinjn et al.,1993,Biochim.Biophys.Acta1170:8-16；Labeur et al.,Oct.1994,Arteriosclerosis:AbstractNos.186 and 187)和N-乙?；?，C-酰胺化18AM4肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)293)(Brasseur,1993,Biochim.Biophys.Acta 1170:1-7)--在本文所述LCAT激活測(cè)試法中顯示出的活性分別低于ApoA-Ⅰ活性的4％和11％。
在本發(fā)明的一項(xiàng)說(shuō)明性實(shí)施方案中，構(gòu)成本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的核心肽(或其類(lèi)似物)具有以下結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22其中X1為Pro(P)、Ala(A)、Gly(G)、Gln(Q)、Asn(N)、Asp(D)或D-Pro(p)；X2為一種脂肪族氨基酸；X3為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X4為Glu(E)；X5為一種脂肪族氨基酸；X6為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X7為Glu(E)或Leu(L)；X8為Asn(N)或Gln(Q)；
X9為L(zhǎng)eu(L)；X10為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)或Gly(G)；X11為一種酸性氨基酸；X12為Arg(R)；X13為L(zhǎng)eu(L)或Gly(G)；X14為L(zhǎng)eu(L)、Phe(F)或Gly(G)；X15為Asp(D)；X16為Ala(A)；X17為L(zhǎng)eu(L)；X18為Asn(N)或Gln(Q)；X19為一種堿性氨基酸；X20為一種堿性氨基酸；X21為L(zhǎng)eu(L)；以及X22為一種堿性氨基酸。
在某種程度上，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心膚是根據(jù)特定種類(lèi)的氨基酸來(lái)定義的。下文將給出各特定種類(lèi)的定義并對(duì)結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的變異或變化的實(shí)施方案加以描述。
在結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽中，氨基酸殘基Xn之間的“-”符號(hào)指一種主鏈結(jié)構(gòu)的連接功能。因而符號(hào)“-”通常表示一種肽鍵或酰胺鍵(-C(O)NH-)。但是應(yīng)該了解，本發(fā)明預(yù)期的肽類(lèi)似物中的一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵可被不同于酰胺鍵的其它鍵，優(yōu)選的為取代酰胺或酰胺等排體，所取代。因此，盡管結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)中的各種Xn殘基一般是按照氨基酸來(lái)加以描述，并且本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是以肽作為實(shí)例而加以說(shuō)明，但具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家都會(huì)認(rèn)可，包含有非酰胺鍵的實(shí)施方案中所使用的“氨基酸”或“殘基”等術(shù)語(yǔ)是指載有結(jié)構(gòu)上與氨基酸側(cè)鏈相似的基團(tuán)的其它雙功能部分。
取代酰胺通常包括公式-C(O)NR-的基團(tuán)，其中R為(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代的(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元雜芳基、5-20元取代雜芳基，或6-26元烷雜芳基和6-26元取代烷雜芳基，但并不局限于此。
酰胺等排體通常包括-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH=CH-(順式和反式)、-C(O)CH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-，但并不局限于此。具有這些非酰胺鍵的化合物以及這些化合物的制備方法已為該領(lǐng)域所熟知(例如，見(jiàn)Spatola,March 1983,Vega Data Vol.l,Issue 3；Spatola,1983,“Peptide Backbone Modifications”In:Chemistryand Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins,Wein-stein,ed.,Marcel Dekker,New York,p.267(general review)；Morley,1980,Trends Pharm.Sci.1:463-468；Hudson et al.,1979,Int.J.Prot.Res.14:177-185(-CH2NH-、-CH2CH2-)；Spatola et al.,1986,Life Sci.38:1243-1249(-CH2-S)；Hann,1982,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I.1:307-314(-CH=CH-，順式和反式)；Almquist etal.,1980,J.Med.Chem.23:1392-1398(-COCH2-)；Jennings-Whiteet al.,Tetrahedron.Lett.23:2533(-COCH2-)；European PatentApplication EP 45665(1982)CA 97:39405(-CH(OH)CH2-)；Holladayet al.,1983,Tetrahedron Lett.24:4401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby,1982,Life Sci.31:189-199(-CH2-S-))。
此外，一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵可被不顯著影響肽結(jié)構(gòu)或活性的擬肽或擬酰胺部分所取代。例如在Olson et al.,1993,J.Med.Chem.36:3039-3049中即對(duì)適當(dāng)?shù)臄M酰胺部分進(jìn)行了描述。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的關(guān)鍵特征是其在脂類(lèi)參與情況下形成兩親性α螺旋的能力。就兩親性而言，其含義是α螺旋沿其長(zhǎng)軸方向具有相對(duì)的親水和疏水表面，也就是說(shuō)，螺旋的一側(cè)表面主要投射親水性側(cè)鏈，而對(duì)側(cè)表面主要投射疏水性側(cè)鏈。圖1A和1B給出的兩個(gè)直觀圖顯示典型的理想化兩親性α-螺旋的相對(duì)的親水和疏水表面。圖1A為Schiffer-Edmundson螺旋輪狀示意圖(Schiffer and Edmundson,1967,Biophys.J.7:121-135)。輪中的螺旋長(zhǎng)軸垂直于頁(yè)面。從N-末端開(kāi)始，連續(xù)的氨基酸殘基(用圓圈表示)以100°的間隔沿圓周呈放射狀分布。因而第n+1個(gè)氨基酸殘基的定位與第n個(gè)殘基呈100°，第n+2個(gè)氨基酸殘基的定位與第n+1個(gè)殘基呈100°，等等。以100°為間隔的布局可解釋為何在理想化α-螺旋中可典型觀測(cè)到每圈含3.6個(gè)氨基酸殘基。由圖1A可明顯看出螺旋相對(duì)的親水和疏水表面；親水性氨基酸以空心圓圈表示，疏水性氨基酸殘基則以加陰影的圓圈表示。
圖1B為圖1A所示理想化兩親性螺旋的螺旋網(wǎng)狀示意圖(Lim,1978,FEBS Lett.89:10-14)。典型的螺旋網(wǎng)狀示意圖顯示的α-螺旋相當(dāng)于沿其親水表面中心將圓柱切開(kāi)并壓平。因此，由螺旋疏水力矩(Eisenbery et al.,1982,Nature 299:371-274)決定的疏水表面中心即位于該圖的中心并且其朝向?yàn)檠仨?yè)平面向外。螺旋狀圓柱被切開(kāi)并壓平之前的圖示顯示于圖1C。沿不同平面切割圓柱可觀測(cè)到同一兩親性螺旋的不同視圖，并可獲得有關(guān)螺旋屬性的不同信息。
圖2說(shuō)明結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽在脂類(lèi)參與情況下形成的α-螺旋的兩親性性質(zhì)。圖2A為Schiffer-Edmundsob螺旋輪狀示意圖，圖2B的螺旋網(wǎng)狀示意圖顯示疏水表面，而圖2C的螺旋網(wǎng)狀示意圖顯示親水表面。在圖2A、2B和2C各圖中，親水性殘基以空心圓圈表示，疏水性殘基以加陰影的圓圈表示，而既可以是親水性也可以是疏水性的殘基以加不完全陰影的圓圈表示。結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的肽的特定氨基酸殘基可被其它氨基酸殘基所替代，從而使該肽形成的螺旋親水表面和疏水表面各自并非完全由親水性氨基酸和疏水性氨基酸構(gòu)成，下文將對(duì)此以及該肽的變化或變異形式加以詳述。因而應(yīng)該了解，當(dāng)涉及由本發(fā)明所述核心肽形成的兩親性α-螺旋時(shí)，短語(yǔ)“親水表面”是指總體凈屬性為親水性的螺旋表面。短語(yǔ)“疏水表面”是指總體凈屬性為疏水性的螺旋表面。
盡管不希望受到任何特定原理的約束，但可認(rèn)為由結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽形成的兩親性螺旋的特定結(jié)構(gòu)性質(zhì)和/或物理性質(zhì)對(duì)活性而言十分重要。這些性質(zhì)包括兩親性度、總疏水性、平均疏水性、疏水角和親水角、疏水力矩、平均疏水力矩，以及α-螺旋的凈電荷。
圖2A的螺旋輪狀示意圖以簡(jiǎn)便方法直觀顯示出結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的兩親性屬性，通過(guò)計(jì)算螺旋的疏水力矩(μH)可方便地確定兩親性度(疏水性的不對(duì)稱(chēng)程度)的大小。計(jì)算特定肽序列的μH的方法已為該領(lǐng)域所熟知，例如在Eisenberg,1984,Ann.Rev.Biochem.53:595-623中即有所描述。特定肽的實(shí)際μH取決于該肽包含的氨基酸總數(shù)。因此，直接比較不同長(zhǎng)度肽的μH通常不會(huì)提供什么信息。
不同長(zhǎng)度的肽的兩親性可用平均疏水力矩(<μH>)進(jìn)行直接比較。將μH除以螺旋中的殘基數(shù)(即，<μH>=μH/N)得平均疏水力矩。利用Eisenberg的標(biāo)準(zhǔn)化公用疏水性標(biāo)準(zhǔn)(Eisenberg,1984,J.Mol.Biol.179:125-142)確定的<μH>的范圍為0.45-0.65的核心肽一般可認(rèn)為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)，優(yōu)選的<μH>范圍則為0.50-0.60。
通過(guò)計(jì)算肽段中各氨基酸殘基的疏水性值的代數(shù)和(即，(H0=Σi=1NHi]]>)，其中N為肽的氨基酸殘基數(shù)，Hi為第ⅰ個(gè)氨基酸殘基的疏水性值)可方便地得出該肽的總疏水性(H0)。將該疏水性值除以氨基酸殘基數(shù)(即，<μ0>=μ0/N)得平均疏水性(<μ0>)。利用Eisenberg的標(biāo)準(zhǔn)化公用疏水性標(biāo)準(zhǔn)(Eisenberg,1984,J.Mol.Biol.179:125-142)確定的平均疏水性的范圍為-0.050--0.070的核心肽一般可認(rèn)為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)，優(yōu)選的平均疏水性范圍則為-0.030--0.055。
通過(guò)計(jì)算處于如下文所定義的疏水角內(nèi)的氨基酸殘基的疏水性總和(即，H0pho=Σi=1NHi]]>，其中Hi的定義與前文相同，NH為疏水表面內(nèi)疏水性氨基酸的總數(shù))可得出兩親性螺旋疏水性表面的總疏水性(H0pho)。疏水表面的平均疏水性(<H0pho>)為H0pho/NH，其中NH的定義與前文相同。利用Eisenberg的公用疏水性標(biāo)準(zhǔn)(Eisenberg,1984，見(jiàn)上文；Eisenberg et al.,1982，見(jiàn)上文)確定的<H0pho>的范圍為0.90-1.2的核心肽一般可認(rèn)為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)，優(yōu)選的<H0pho>范圍則為0.940-1.10。
疏水角(pho角)的常規(guī)定義為，當(dāng)以Schiffer-Edmundson螺旋輪狀表示法顯示肽段時(shí)，最長(zhǎng)的疏水性氨基酸殘基連續(xù)序列(Strech)所覆蓋的角度或弧度(即，輪上的連續(xù)疏水性殘基數(shù)乘以20°)。親水角(phi角)為360°與pho角的差值(即，360°-pho角)。具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家都會(huì)認(rèn)可，pho角和phi角在某種程度上取決于肽的氨基酸殘基數(shù)。例如，參照?qǐng)D5A和5B可看出，只有18個(gè)氨基酸才恰好形成Schiffer-Edmundson螺旋輪的一圈。氨基酸較少會(huì)在輪上留下一個(gè)缺口；氨基酸較多則會(huì)造成輪上的某些位置被一個(gè)以上的氨基酸所占據(jù)。
在肽所包含的氨基酸殘基多于18個(gè)的情況下，例如結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽，一段疏水性氨基酸殘基“連續(xù)”序列意味著，輪上由兩個(gè)或多個(gè)氨基酸占據(jù)的位置上的氨基酸殘基中至少有一個(gè)為疏水性氨基酸。因此，參照?qǐng)D5B，盡管位置20存在一個(gè)親水性氨基酸，但pho角應(yīng)為第5、16、9、2、13、6、17、10、3和14位殘基所覆蓋的弧度，因?yàn)榕c第20位殘基在輪上占據(jù)同一位置的第2位殘基為疏水性氨基酸。具有pho角范圍為160°-220°的核心肽通?？烧J(rèn)為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)，優(yōu)選的pho范圍則為180°-200°。
圖3和圖4顯示結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的某些結(jié)構(gòu)特性和/或物理特性。圖3B給出的本發(fā)明典型核心肽，第146號(hào)肽(PVLELFENLLERLLDALQKKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)，的螺旋網(wǎng)狀示意圖顯示沿螺旋親水表面的電荷分布。在圖3B中，螺旋柱沿疏水表面中心被切開(kāi)并壓平。替代Segrest共有22聚體中親水性殘基的三個(gè)疏水性Leu(L)殘基被加上陰影。由圖3B可以看出，帶正電荷的氨基酸殘基在螺旋的C-末端最后一圈處聚集成簇(C-末端處于頁(yè)面上方)。盡管不希望受到任何特定原理的約束，但可認(rèn)為C-末端的該堿性殘基簇(第19、20和22位殘基)可通過(guò)帶(NH3+)螺旋的偶極子靜電相互作用而穩(wěn)定螺旋。此外，一般認(rèn)為賴(lài)氨酸側(cè)鏈與螺旋核心的疏水性相互作用也可產(chǎn)生穩(wěn)定作用(見(jiàn)，Groebke et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:4025-4029；Esposito et al.,1997,Biopolymers 41:27-35)。
除C-末端帶正電荷的聚集簇之外，負(fù)電荷分布在親水表面的其它部分，且每圈至少有一個(gè)帶負(fù)電的(酸性)氨基酸殘基，這導(dǎo)致沿螺旋親水表面分布著一段連續(xù)的負(fù)電荷。第12位殘基帶有一個(gè)正電荷，它可能與螺旋上一圈之隔的某個(gè)酸性殘基形成鹽鍵，從而有助于螺旋的穩(wěn)定。
圖4B的螺旋網(wǎng)狀示意圖顯示由典型的第146號(hào)核心肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)形成的兩親性螺旋的疏水表面。在圖4B中，螺旋柱沿親水表面中心被切開(kāi)并壓平。除C-末端的最后一圈為堿性氨基酸占優(yōu)勢(shì)外，核心肽的疏水表面每圈都含兩個(gè)疏水性殘基。NMR研究顯示，該核心肽的第3、6、9和10位氨基酸殘基可在螺旋N-末端附近形成一個(gè)疏水性簇。Phe-6位于該簇的中心，并被認(rèn)為在穩(wěn)定疏水性簇中發(fā)揮重要作用。
盡管不希望受到任何特定原理的約束，但可認(rèn)為由第3、6、9和10位殘基形成的疏水性簇在實(shí)現(xiàn)脂類(lèi)結(jié)合和LCAT激活方面具有重要意義。兩親性肽能夠通過(guò)將其疏水表面指向脂類(lèi)部分的烷基側(cè)鏈而與磷脂結(jié)合。因此，可認(rèn)為該強(qiáng)疏水性簇在觀測(cè)到的本發(fā)明所述核心肽與脂類(lèi)的強(qiáng)親和性中發(fā)揮作用。由于與脂類(lèi)結(jié)合是LCAT激活的先決條件，因而可認(rèn)為該疏水性簇對(duì)LCAT激活也是必不可少的。
芳香族殘基通常在肽與脂類(lèi)和蛋白與脂類(lèi)的錨著方面具有重要作用(De Kruijff,1990,Biosci.Rep.10:127-130；O’Neil and DeGrado,1990,Science 250:645-651；Blondelle et al.,1993,Biochim.Biophvs.Acta 1202:331-336)。因此可進(jìn)一步認(rèn)為，位于疏水性簇中心的Phe-6或許同樣在結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽與脂類(lèi)的錨著方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
本發(fā)明所述核心肽與脂類(lèi)的相互作用可導(dǎo)致肽-脂復(fù)合物的形成。如圖10A所示，所得復(fù)合物的類(lèi)型(共聚微膠粒、盤(pán)狀膠粒、泡狀膠粒或多片層膠粒)取決于脂∶肽的摩爾比率，較低的脂∶肽摩爾比通常會(huì)形成共聚微膠粒，隨脂∶肽比率的提高可獲得盤(pán)狀、泡狀或多片層復(fù)合物。有關(guān)兩親性肽的該特性(Epand,The Amphipathic Helix,1993)和ApoA-Ⅰ的該特性(Jones,1992,Structue and Function ofApolipoproteins,Chapter 8,pp.217-250)已有所描述。脂∶肽摩爾比率同時(shí)還可決定復(fù)合物的大小和組成(見(jiàn)，下文，5.3.1節(jié))。
由結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽形成的α-螺旋的長(zhǎng)軸總體上呈彎曲狀。在典型的兩親性螺旋中發(fā)現(xiàn)親水表面和疏水表面的氫鍵長(zhǎng)度各不相同，使得螺旋的疏水側(cè)呈凹形(Barlow and Thornton,1988,J.Mol.Biol.201:601-619；Zhou et al.,1992,J.Am.Chem.Soc.33:11174-11183；Gesell et al.,1997,J.Biomol.NMR 9:127-135)。盡管不希望受到任何特定原理的約束，但可認(rèn)為螺旋疏水表面總體上的彎曲也許對(duì)與盤(pán)狀(discoidal)復(fù)合物的結(jié)合十分重要--曲面螺旋允許肽更適合于環(huán)繞在盤(pán)狀顆粒的邊緣，從而增加肽-盤(pán)狀顆粒復(fù)合物的穩(wěn)定性。
在ApoA-Ⅰ公認(rèn)的結(jié)構(gòu)模型中，兩親性α-螺旋環(huán)繞盤(pán)狀HDL的邊緣進(jìn)行組裝(見(jiàn)，圖10B)。推測(cè)螺旋在該模型中的定位方式為其疏水表面指向脂類(lèi)酰基鏈(Brasseur et al.,1990,Biochim.Biophys.Acta 1043:245-252)。螺旋以反平行反式排列，且螺旋間的協(xié)同效應(yīng)有助于盤(pán)狀HDL復(fù)合物的穩(wěn)定(Brasseur et al.,上文)。有人提議，導(dǎo)致鄰近的反平行螺旋殘基間形成分子間鹽鍵或氫鍵的酸性殘基和堿性殘基間存在的離子相互作用是有助于HDL盤(pán)狀復(fù)合物穩(wěn)定的因素之一。在此模型中，該肽并不被認(rèn)為是一個(gè)單一實(shí)體，而是至少與鄰近的兩個(gè)其它肽分子具有相互作用(圖10B)。
被大家所接受的還有，分別位于螺旋第i和第i+3位的酸性殘基和堿性殘基間形成的分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵可穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)(Marqusee etal.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(24):8898-8902)。
因此，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的其它重要特性有，與另一分子核心肽以反平行方式排列且其疏水表面指向相同方向時(shí)能夠形成分子間氫鍵的能力，與脂類(lèi)結(jié)合時(shí)的情況也是如此(即，第4和7位酸性殘基和第19、20和22位堿性殘基之間)，而且在螺旋N-末端和C-末端附近還可形成分子內(nèi)氫鍵或鹽鍵。
圖6闡明結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽形成分子間氫鍵的能力。在圖6中，典型的第146號(hào)核心肽(序列識(shí)別號(hào)146)的兩個(gè)理想的α-螺旋以反平行方式排列，并且其各自的疏水表面指向相同方向(沿頁(yè)平面向外)。E-7殘基和Q-18殘基間可產(chǎn)生氫鍵相互作用(Huyghues-Despointes et al.,1995,Biochemistry 34(41):13267-13271)。
此外，當(dāng)螺旋以此類(lèi)反平行方式排列時(shí)可緊密組裝；該過(guò)程中不存在妨礙螺旋間緊密接觸的位阻效應(yīng)。核心肽序列若發(fā)生可影響螺旋組裝的改變，則會(huì)對(duì)該核心肽的活性產(chǎn)生負(fù)面影響。
因此，盡管不希望受到任何特定原理的約束，但可認(rèn)為當(dāng)結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽以反平行方式與脂類(lèi)結(jié)合時(shí)能夠緊密組裝并產(chǎn)生離子相互作用以形成分子內(nèi)和/或分子間鹽鍵和/或氫鍵的能力是本發(fā)明所述核心肽的重要特征。
此外，一般認(rèn)為在沒(méi)有脂類(lèi)的情況下，核心肽可產(chǎn)生有利的分子間肽-肽相互作用的能力是恰當(dāng)?shù)?。本發(fā)明所述核心肽能夠自結(jié)合，這在某種程度上是由于其具有較大的<μH>、<H0>和疏水角(見(jiàn)，下文表Ⅰ)。自結(jié)合現(xiàn)象取決于pH、肽濃度和離子強(qiáng)度等條件，并可導(dǎo)致從單體到多體的不同狀態(tài)(圖10A)。肽聚體的疏水核心可促進(jìn)與脂類(lèi)的疏水性相互作用。此類(lèi)肽的甚至在極低濃度下也可聚集的能力或許可促進(jìn)它們與脂類(lèi)的結(jié)合。一般認(rèn)為，肽聚體核心內(nèi)也同樣具有肽-肽相互作用，并且可能與脂-肽相互作用相競(jìng)爭(zhēng)。
除上述性質(zhì)外，還有其它一些參數(shù)亦被認(rèn)為對(duì)活性具有重要作用，其中包括疏水性殘基總數(shù)、荷電殘基總數(shù)，以及肽的凈電荷。
以下表Ⅰ給出結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的優(yōu)選物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的總結(jié)表Ⅰ結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的優(yōu)選ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的物理性質(zhì)性質(zhì) 范圍 優(yōu)選范圍疏水性氨基酸百分?jǐn)?shù) 40-70 50-60<H0>-0.050--0.070 -0.030--0.055<H0Pho>0.90-1.2 0.94-1.1<μH> 0.45-0.65 0.50-0.60pho角 160°-220° 180°-200°帶正電荷的氨基酸數(shù)3-54帶負(fù)電荷的氨基酸數(shù)3-54凈電荷 -1-+1 0疏水性簇第3、6、9、10位為疏水性氨基酸酸性簇 除C-末端的最后5個(gè)氨基酸外每圈至少有一個(gè)酸性氨基酸堿性簇 C-末端的最后5個(gè)氨基酸中至少有三個(gè)堿性氨基酸由本發(fā)明所述核心肽形成的兩親性α-螺旋的性質(zhì)與A類(lèi)兩親性α-螺旋，尤其是Segrest的共有22聚體的A類(lèi)α-螺旋，的性質(zhì)明顯不同。圖3-5利用典型的第146號(hào)核心肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)來(lái)闡明這些差異。
參照?qǐng)D4A和4B可看出，與Segrest的共有22聚體的疏水表面相比，第146號(hào)肽的疏水表面的疏水性要強(qiáng)得多。詳細(xì)而言，第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)中的第5、9和13位殘基(圖4B的陰影區(qū)域)為疏水性Leu(L)殘基，相比之下，在共有22聚體(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)中則為荷電殘基。將Segrest的共有22聚體中這三個(gè)荷電殘基替換為疏水性Leu(L)殘基可導(dǎo)致螺旋的兩親性、疏水性、pho角和其它性質(zhì)的顯著差異。
下表Ⅱ給出第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)與Segrest的共有22聚體(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)的物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)比較表Ⅱ典型第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)與Segrest的共有22聚體(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)的性質(zhì)比較性質(zhì)共有22聚體第146號(hào)肽#氨基酸數(shù) 22 22#親水性氨基酸數(shù)13 10#疏水性氨基酸數(shù) 9 12#疏水性氨基酸百分?jǐn)?shù) 41 55<H0> -0.293 -0.013<H0Pho> 0.9600.990<μH> 0.4250.547pho角 100°200°帶正電荷的氨基酸數(shù) 54帶負(fù)電荷的氨基酸數(shù) 64凈電荷 10最引人注目的是，與Segrest的共有22聚體相比，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽中包含的疏水性殘基的百分率更大，其<H0>和<μH>顯然更大，并且具有兩倍大的pho角(見(jiàn)圖5A和5B)。這些性質(zhì)上的差異可導(dǎo)致活性的顯著差異。與天然ApoA-Ⅰ相比，Segrest的共有22聚體(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)在文中所述測(cè)定中僅顯示出10％的LCAT激活活性，而第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)與天然ApoA-Ⅰ相比在相同測(cè)試中卻顯示出86％的活性。與第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)的差異僅在于X1位是D-Pro(p)的第144號(hào)肽(pVLELFENLLERLLDALQKKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)144)與天然ApoA-Ⅰ相比在相同測(cè)試中則顯示出111％的LCAT激活活性。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽中的某些氨基酸殘基可被其它氨基酸殘基所替代，且不對(duì)肽的活性造成顯著的負(fù)面影響，在很多情況下甚至還會(huì)提高肽的活性。因此，本發(fā)明還考慮了結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的變化或變異形式，其由結(jié)構(gòu)式定義的氨基酸殘基中至少有一個(gè)被另一種氨基酸殘基所替代。由于核心肽在脂類(lèi)參與情況下可形成具有兩親性及其它上述性質(zhì)的α-螺旋的能力被認(rèn)為是能夠影響本發(fā)明所述核心肽的活性的關(guān)鍵特征之一，因此應(yīng)承認(rèn)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的氨基酸替代為保守性的，即替代氨基酸殘基具有與被替代氨基酸殘基相類(lèi)似的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)。
為確定保守的氨基酸替代，可方便地將氨基酸分為兩種主要類(lèi)型--親水性氨基酸和疏水性氨基酸--這主要取決于氨基酸側(cè)鏈的物理-化學(xué)特性。這兩種主要類(lèi)型可被進(jìn)一步劃分為更明確規(guī)定了氨基酸側(cè)鏈特性的亞類(lèi)。例如，親水性氨基酸種類(lèi)可被進(jìn)一步細(xì)分為酸性氨基酸、堿性氨基酸和極性氨基酸。疏水性氨基酸種類(lèi)可被進(jìn)一步細(xì)分為非極性氨基酸和芳香族氨基酸。規(guī)定結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的不同種類(lèi)氨基酸的定義如下“親水性氨基酸”是指根據(jù)Eisenberg et al.,1984,J.Mol.Biol.179:125-142的標(biāo)準(zhǔn)化公用疏水性標(biāo)準(zhǔn)所顯示的疏水性小于零的氨基酸。遺傳編碼的親水性氨基酸包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。
“酸性氨基酸”是指具有的側(cè)鏈pK值小于7的親水性氨基酸。酸性氨基酸在生理pH下由于失去一個(gè)氫離子而通常具有帶負(fù)電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的酸性氨基酸包括Glu(E)和Asp(D)。
“堿性氨基酸”是指具有的側(cè)鏈pK值大于7的親水性氨基酸。堿性氨基酸在生理pH下由于結(jié)合一個(gè)氫離子而通常具有帶正電荷的側(cè)鏈。遺傳編碼的堿性氨基酸包括His(H)、Arg(R)和Lys(K)。
“極性氨基酸”是指具有的側(cè)鏈在生理pH下不帶電荷，但至少有一個(gè)鍵中由兩個(gè)原子共用的電子對(duì)被二者之一更緊密地占有的親水性氨基酸。遺傳編碼的堿性氨基酸包括Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水性氨基酸”是指根據(jù)Eisenberg et al.,1984,J.Mol.Biol.179:125-142的標(biāo)準(zhǔn)化公用疏水性標(biāo)準(zhǔn)所顯示的疏水性大于零的氨基酸。遺傳編碼的親水性氨基酸包括Pro(P)、Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)和Tyr(Y)。
“芳香族氨基酸”是指?jìng)?cè)鏈至少具有一個(gè)芳香環(huán)或雜芳香環(huán)的疏水性氨基酸。芳香環(huán)或雜芳香環(huán)可能包含一個(gè)或多個(gè)取代基，如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中R各自獨(dú)立地代表(C1-C6)烷基、取代的(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、取代的(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、取代的(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元雜芳基、5-20元取代雜芳基、6-26元烷雜芳基或6-26元取代雜芳基。遺傳編碼的芳香族氨基酸包括Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
“非極性氨基酸”是指具有的側(cè)鏈在生理pH下不帶電荷，并且側(cè)鏈的鍵中由兩個(gè)原子共用的電子對(duì)通常被二者同等占有(即，側(cè)鏈不是極性的)的疏水性氨基酸。遺傳編碼的非極性氨基酸包括Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。
“脂肪族氨基酸”是指具有脂肪烴側(cè)鏈的疏水性氨基酸。遺傳編碼的脂肪族氨基酸包括Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。
Cys(C)氨基酸殘基的不尋常之處在于它能夠與其它Cys(C)殘基或其它含sulfanyl的氨基酸形成二硫鍵。Cys(C)殘基(或帶有含-SH側(cè)鏈的其它氨基酸)在肽中能夠以還原型游離-SH形式或氧化型二硫鍵形式存在，這種能力可影響Cys(C)殘基對(duì)肽的凈疏水性作用或凈親水性作用。盡管上文對(duì)一般分類(lèi)進(jìn)行了定義，但是當(dāng)Cys(C)殘基根據(jù)Eisenberg的標(biāo)準(zhǔn)化公用標(biāo)準(zhǔn)(Eigenberg,1984，見(jiàn)上文)顯示出的疏水性為0.29時(shí)，應(yīng)理解就本發(fā)明而言的Cys(C)則被歸類(lèi)為極性親水性氨基酸。
具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家都會(huì)意識(shí)到，上文定義的種類(lèi)并非互不相容。因此，側(cè)鏈顯示出兩種或多種物理-化學(xué)特性的氨基酸可被包括在多個(gè)種類(lèi)之內(nèi)。例如，側(cè)鏈含有芳香族部分，而該部分又被極性取代基進(jìn)一步取代的氨基酸，如Tyr(Y)，也許會(huì)既顯示出芳香族疏水性性質(zhì)，又顯示出極性親水性性質(zhì)。任何氨基酸的適當(dāng)分類(lèi)，尤其是按照此處給出的詳細(xì)公開(kāi)內(nèi)容進(jìn)行的分類(lèi)，對(duì)具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家而言都是顯而易見(jiàn)的。
當(dāng)螺旋的內(nèi)部位置中包含有某些稱(chēng)為“螺旋阻斷”氨基酸的氨基酸殘基時(shí)，這些殘基具有破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)的傾向。目前這些具有螺旋阻斷性質(zhì)的氨基酸殘基已為該領(lǐng)域所熟知(例如，見(jiàn)Chou and Fasman,Ann.Rev.Biochem.47:251-276)，它們包括Pro(P)、Gly(G)以及可能所有的D-氨基酸(當(dāng)被包含在L-肽中時(shí)；同樣的，當(dāng)L-氨基酸被包含在D-肽中時(shí)也可破壞螺旋結(jié)構(gòu))。雖然除Gly(G)之外(下文論述)，這些螺旋阻斷氨基酸殘基均處在上文所定義的種類(lèi)之內(nèi)，但這些殘基不能用來(lái)替代螺旋內(nèi)部位置中的氨基酸殘基--它們只能用來(lái)替代肽的N-末端和/或C-末端的第1-3位氨基酸殘基。
盡管前文定義的種類(lèi)是以遺傳編碼的氨基酸來(lái)舉例說(shuō)明，但氨基酸替代物無(wú)須局限于遺傳編碼的氨基酸，在某些優(yōu)選實(shí)施方案中也確實(shí)沒(méi)有局限于遺傳編碼的氨基酸。事實(shí)上，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的許多優(yōu)選肽中包含有非遺傳編碼的氨基酸。因此，除天然的遺傳編碼氨基酸之外，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽中的氨基酸殘基也能夠被天然的非編碼氨基酸和合成氨基酸所替代。
能夠?yàn)榻Y(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽提供替代物的某些常見(jiàn)氨基酸包括，但并不局限于，β-丙氨酸(β-Ala)和其它諸如3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等ω-氨基酸；α-氨基異丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；N-甲基甘氨酸或肌氨酸(MeGly)；鳥(niǎo)氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔-丁基丙氨酸(t-BuA)；叔-丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基異亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；環(huán)己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle)；萘基丙氨酸(Nal)；4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；蛋氨酸亞砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰賴(lài)氨酸(AcLys)；2,4-二氨基丁酸(Dbu)；2,3-二氨基丁酸(Dba)；對(duì)-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基纈氨酸；高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)和高絲氨酸(hSer)；羥脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、N-甲基化氨基酸和類(lèi)肽(N-取代甘氨酸)。
按照上文的種類(lèi)定義對(duì)遺傳編碼的氨基酸和常見(jiàn)的非編碼氨基酸進(jìn)行的分類(lèi)總結(jié)于下表Ⅲ。應(yīng)了解的是，表Ⅲ的目的僅是為了起說(shuō)明作用，而不是一份用于替代文中所述核心肽的氨基酸殘基的詳盡列表。此處沒(méi)有特別提到的其它氨基酸殘基則可基于其觀測(cè)的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)按文中的定義被輕易地分類(lèi)。
表Ⅲ常見(jiàn)氨基酸的分類(lèi)分類(lèi)遺傳編碼的 非遺傳編碼的疏水性的芳香族 F、Y、W Phg、Nal、Thi、Tic、Phe(4-Cl)、Phe(2-F)、Phe(3-F)、Phe(4-F)、hPhe非極性 L、V、I、M、G、A、 t-BuA、t-BuG、MeIle、Nle、P MeVal、Cha、McGly、Aib脂肪族 A、V、L、I b-Ala、Dpr、Aib、Aha、MeGly、t-BuA、t-BuG、MeIle、Cha、Nle、MeVal親水性的酸性 D、E堿性H、K、RDpr、Orn、hArg、Phe(p-NH2)、Dbu、Dab極性 C、Q、N、S、T Cit、AcLys、MSO、bAla、hSer螺旋阻斷型P、G D-Pro和其它D-氨基酸(在L-肽中)盡管在大多數(shù)實(shí)例中，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽中的氨基酸是被L-型氨基酸所替代，但該替代并不局限于L-型氨基酸。因此，“變異”形式或“變化”形式的定義還包括那些至少有一個(gè)L-氨基酸被相同的D-氨基酸所替代(如，L-Arg→D-Arg)或被相同種類(lèi)或亞類(lèi)的氨基酸所替代(如，L-Arg→D-Lys)的情況以及相反的情況。事實(shí)上，在某些適合于以口服方式向動(dòng)物研究對(duì)象給藥的優(yōu)選實(shí)施方案中的肽可能至少包含有一個(gè)有益的D-型氨基酸。與所含氨基酸全部為L(zhǎng)-氨基酸的肽相比，這些含D-氨基酸的肽在口腔、腸道或血清的降解作用下可更加穩(wěn)定。
如前所述，當(dāng)α-螺旋型L-肽的內(nèi)部位置中包含有D-氨基酸時(shí)，會(huì)傾向于破壞α-螺旋的結(jié)構(gòu)。此外還發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的某些所含完全為D-氨基酸的變異形式在文中所述測(cè)試中顯示的LCAT激活活性與所含完全為L(zhǎng)-氨基酸的相同的膚相比要低得多。因此，內(nèi)部L-氨基酸的替代不應(yīng)采用D-氨基酸；D-氨基酸替代應(yīng)局限于肽N-末端和/或C-末端的1-3位氨基酸殘基。
如前所述，當(dāng)肽內(nèi)部位置中包含氨基酸Gly(G)時(shí)，Gly(G)通常會(huì)成為螺旋阻斷殘基。令人異常驚訝的是，該發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)內(nèi)部氨基酸殘基被Gly(G)替代時(shí)，盡管在沒(méi)有脂類(lèi)的情況下會(huì)破壞本發(fā)明所述核心肽的螺旋結(jié)構(gòu)，但是這類(lèi)包含Gly(G)的肽在有脂類(lèi)參與的情況下仍顯示出有效的螺旋結(jié)構(gòu)和活性。例如，盡管第154號(hào)肽(PVLELFENLLERGLDALQKKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)154)在緩沖液中僅顯示出13％的螺旋結(jié)構(gòu)，但在微膠粒參與情況下卻可觀測(cè)到76％的螺旋結(jié)構(gòu)。值得注意的是，一些包含內(nèi)部Gly(G)殘基的核心肽顯示的LCAT激活活性也≥38％。因此，盡管通常認(rèn)為Gly(G)是一種螺旋阻斷殘基，但Gly(G)可被用來(lái)替代結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽內(nèi)部位置的氨基酸。優(yōu)選而言，則只有位于該肽(尤其是包含的氨基酸數(shù)為偶數(shù)的肽)中心約±1螺旋圈范圍內(nèi)的內(nèi)部殘基可被G1y(G)替代。此外，優(yōu)選方案為肽內(nèi)只有一個(gè)內(nèi)部氨基酸殘基被Gly(G)所替代。本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的包含內(nèi)部甘氨酸的優(yōu)選實(shí)施方案將于下文5.1.2節(jié)加以描述。
利用上文所述的氨基酸殘基分類(lèi)，并結(jié)合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的Schiffer-Edmundson螺旋輪狀和螺旋網(wǎng)狀示意圖以及文中對(duì)預(yù)期性質(zhì)的詳細(xì)描述，能夠很容易地得到可基本保持兩親性和其它螺旋特性的結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的變化或變異形式，因此這些變化或變異形式也被認(rèn)為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的變化或變異形式是按照結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)確定親水性和疏水性殘基，并至少將一個(gè)不確定的殘基用另一種氨基酸替代而獲得，優(yōu)選的為保守替代，即用相同種類(lèi)或亞類(lèi)的另一種氨基酸替代。也可按照結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)確定堿性簇和/或疏水性簇所包含的殘基并至少將一個(gè)不確定的殘基替代，優(yōu)選的為保守替代。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的變化或變異形式是按照結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)確定位于螺旋親水表面范圍內(nèi)的親水性氨基酸殘基，并至少將一個(gè)不確定的氨基酸殘基用另一種氨基酸，優(yōu)選的用相同種類(lèi)或亞類(lèi)的另一種氨基酸殘基，替代而獲得。參照?qǐng)D2A可看到，第1、4、7、8、11、12、15、18、19和22位殘基位于結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽形成的兩親性螺旋的親水表面范圍內(nèi)。在這些殘基中，除第1位殘基可以是親水性殘基或疏水性殘基之外，其余均為親水性殘基。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，按照結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)確定第4、7、8、11、12、15、18、19和22位殘基并至少將第1、2、3、5、6、9、10、13、14、16、17、20和21位殘基之一用相同種類(lèi)的另一種氨基酸替代，優(yōu)選的用相同亞類(lèi)的另一種氨基酸替代。作為選擇，也可按照結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)確定第1位殘基并至少將第2、3、5、6、9、10、13、14、16、17、20和21位殘基之一替代。
在特定優(yōu)選實(shí)施方案中，C-末端的堿性簇(第19、20和22位殘基)也按照結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)被確定，并且只有第2、3、5、6、9、10、13、14、16和/或17位殘基可被替代。
在另一特定優(yōu)選實(shí)施方案中，疏水性簇也被確定，并且只有第2、5、13、14、16、17、20和/或21位殘基可被替代。
在又一特定優(yōu)選實(shí)施方案中，堿性簇和疏水性簇均被確定而只有第2、5、13、14、16和/或17位殘基可被替代。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核心肽的變化或變異形式是通過(guò)確定位于螺旋疏水表面范圍內(nèi)的疏水性氨基酸殘基，并至少將一個(gè)不確定的氨基酸殘基用另一種氨基酸，優(yōu)選的用相同種類(lèi)或亞類(lèi)的另一種氨基酸殘基，替代而獲得。
參照?qǐng)D2A可看到，第2、3、5、6、9、10、13、14、16、17、20和21位殘基位于疏水表面范圍內(nèi)。在這些殘基中，除第20位殘基為親水性殘基之外，其余均為疏水性殘基。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，按照結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)確定第2、3、5、6、9、10、13、14、16、17和21位殘基并至少將第1、4、7、8、11、12、15、18、19、20和22位殘基之一用另一種氨基酸殘基替代，優(yōu)選的用相同種類(lèi)或亞類(lèi)的另一種氨基酸替代。
在特定優(yōu)選實(shí)施方案中，C-末端的堿性簇(第19、20和22位殘基)也被確定，并且只有第1、4、7、8、11、12和/或15位殘基可被替代。
在另一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的肽的變化或變異形式是通過(guò)確定位于螺旋疏水表面或親水表面范圍內(nèi)的所有氨基酸殘基，并至少將一個(gè)位于其它表面的氨基酸殘基用另一種氨基酸，優(yōu)選的用保守的氨基酸殘基，替代而獲得。也可根據(jù)前文所述，按照結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)任意確定疏水性簇中包含的殘基和/或堿性簇中包含的殘基。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的變化或變異形式是通過(guò)至少將一個(gè)氨基酸用一種非保守的氨基酸替代而獲得。具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家都會(huì)承認(rèn)，這種替代基本不會(huì)改變前文所述的螺旋兩親性性質(zhì)和/或結(jié)構(gòu)性質(zhì)。因此，在某些實(shí)例中，將一對(duì)或多對(duì)氨基酸替代以保持螺旋的凈屬性或許是可取的。表Ⅹ所示肽序列可用于選擇適當(dāng)氨基酸替代的進(jìn)一步指導(dǎo)(見(jiàn)，下文8.3節(jié))。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽N-末端和/或C-末端前1-4位氨基酸殘基被一種或多種據(jù)稱(chēng)能夠賦予α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域穩(wěn)定性的氨基酸殘基或肽段(“封端”殘基或“封端”(end-cap)肽段)所替代。目前這類(lèi)“封端”殘基或“封端”肽段已為該領(lǐng)域所熟知(例如，見(jiàn)Richardson and Richardson,1988,Science240:1648-1652；Harper et al.,1993,Biochemistry32(30):7605-7609；Dasgupta and Bell,1993,Int.J.PeptideProtein Res.41:499-511；Seale et al.,1994,Protein Science3:1741-1745；Doig et al.,1994,Biochemistry 33:3396-3403；Zhouet al.,1994,Proteins 18:1-7；Doig and Baldwin,1995,ProteinScience 4:1325-1336；Odaert et al.,1995,Biochemistry34:12820-12829；Petrukhov et al.,1996,Biochemistry35:387-397；Doig et al.,1997,Protein Science 6:147-155)。作為選擇，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的N-末端和/或C-末端前1-4位氨基酸殘基可被能夠模擬封端殘基或封端肽段的結(jié)構(gòu)和/或特性的擬肽部分所替代。目前適當(dāng)?shù)姆舛四M物已為該領(lǐng)域所熟知，例如對(duì)此加以描述的文獻(xiàn)有Richardson and Richardson,1988,Science 240:1648-1652；Harper et al.,1993,Biochemistry 32(30):7605-7609；Dasguptaand Bell,1993,Int.J.Peptide Protein Res.41:499-511；Sealeet al.,1994,Protein Science 3:1741-1745；Doig et al.,1994,Biochemistry 33:3396-3403；Zhou et al.,1994,Proteins 18:1-7；Doig and Baldwin,1995,Protein Science 4:1325-1336；Odaert etal.,1995,Biochemistry 34:12820-12829；Petrukhov et al.,1996,Biochemistry 35:387-397；Doig et al.,1997,Protein Science6:147-155。
盡管結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)包含22個(gè)特定氨基酸位置，但應(yīng)了解的是，本發(fā)明所述核心肽所包含的氨基酸殘基可少于22個(gè)。事實(shí)上，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的截短或內(nèi)部缺失形式包含有18甚至15個(gè)氨基酸殘基，這些氨基酸殘基可基本保持結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)所述核心肽形成的兩親性螺旋的全部特征和性質(zhì)，這些形式也被認(rèn)為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的肽的截短缺失形式是通過(guò)將結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的N-末端和/或C-末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸去除而獲得的。結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的內(nèi)部缺失形式是通過(guò)將結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的肽內(nèi)部位置的-個(gè)或多個(gè)氨基酸去除而獲得的。去除的氨基酸殘基可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的。
具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家都會(huì)承認(rèn)，從結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽中去除內(nèi)部氨基酸殘基將導(dǎo)致靠近缺失部位的螺旋親水-疏水交界面旋轉(zhuǎn)100°。由于這種旋轉(zhuǎn)能夠顯著改變螺旋產(chǎn)物的兩親性性質(zhì)，因此在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)氨基酸殘基的去除要能夠使親水-疏水界面沿整個(gè)螺旋長(zhǎng)軸的定位基本得以保持。
這一點(diǎn)可通過(guò)去除足夠數(shù)量的連續(xù)或不連續(xù)氨基酸殘基以使一整圈螺旋被去除的方法加以方便地實(shí)現(xiàn)。理想的α-螺旋每圈包含3.6個(gè)殘基。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，3-4個(gè)連續(xù)或不連續(xù)氨基酸殘基被成組地去除。是去除3個(gè)還是4個(gè)氨基酸則取決于要去除的第一個(gè)殘基在螺旋中的位置。具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家均能夠很好地確定從兩親性螺旋特定起始位點(diǎn)開(kāi)始構(gòu)成一整圈螺旋的連續(xù)或不連續(xù)氨基酸殘基的適當(dāng)數(shù)量。
據(jù)推測(cè)，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽的C-末端堿性簇在穩(wěn)定螺旋方面具有重要作用，而疏水性簇在實(shí)現(xiàn)脂類(lèi)結(jié)合和LCAT激活方面具有重要作用，所以本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中堿性簇和疏水性簇所包含的殘基不被去除。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，第19、20和22位殘基(堿性簇)以及第3、6、9和10位殘基(疏水性簇)不被去除。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽也可通過(guò)在一端或兩端或內(nèi)部加入基本不妨礙，在某些實(shí)施方案中甚至?xí)鰪?qiáng)，肽的結(jié)構(gòu)和/或功能性質(zhì)的氨基酸殘基而被延長(zhǎng)。事實(shí)上，包含23、25、26、29甚至更多個(gè)氨基酸殘基的延長(zhǎng)的核心肽也被認(rèn)為處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。優(yōu)選而言，這些延長(zhǎng)的肽將基本保持結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的肽的兩親性性質(zhì)和其它性質(zhì)。當(dāng)然，應(yīng)該承認(rèn)在內(nèi)部加入氨基酸會(huì)類(lèi)似于上述的內(nèi)部缺失情況，導(dǎo)致靠近插入部位的螺旋親水-疏水交界面旋轉(zhuǎn)。因此，上文就內(nèi)部缺失所考慮的事項(xiàng)也適用于內(nèi)部增加的情況。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，核心肽在N-末端和/或C-末端至少延伸一個(gè)螺旋圈。優(yōu)選而言，這種延伸在脂類(lèi)參與下可穩(wěn)定螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)，類(lèi)似于前文所述的封端氨基酸和封端肽段。
在特定優(yōu)選實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽在C-末端僅延伸一個(gè)堿性氨基酸殘基，優(yōu)選的為L(zhǎng)ys(K)。
包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)的還有ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的“封閉”形式，即，N-末端和/或C-末端被一種能夠與N-端-NH2或C-端-C(O)OH反應(yīng)的部分所封閉的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑形式。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，將包含18個(gè)或更少氨基酸殘基的本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的N-端和/或C-端電荷去除(通過(guò)合成N-酰化肽/酰胺/酯/酰肼/乙醇及其替代物)可導(dǎo)致激動(dòng)劑的活性接近，在某些實(shí)施方案中甚至超出，未封閉形式激動(dòng)劑的活性。在某些包含22個(gè)或更多氨基酸的實(shí)施方案中，N-端或C-端封閉會(huì)導(dǎo)致ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑顯示出低于未封閉形式的活性。但將包含22個(gè)或更多氨基酸的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的N-端和C-端均封閉或許會(huì)使活性恢復(fù)。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含18個(gè)或更少氨基酸的核心肽的N-端和/或C-端(優(yōu)選的為兩端)被封閉，而包含22個(gè)或更多氨基酸的肽的N-端和C-端則均被封閉或均不封閉。典型的N-端封閉基團(tuán)包括RC(O)-，其中R為-H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、5-20元雜芳基或6-26元烷雜芳基。優(yōu)選的N-端封閉基團(tuán)包括乙?；⒓柞；偷せ酋；?。典型的C-端封閉基團(tuán)包括-C(O)NRR和-C(O)OR，其中每個(gè)R各自獨(dú)立，其定義如上文所述。優(yōu)選的C-端封閉基團(tuán)為每個(gè)R各自獨(dú)立地為甲基的上述基團(tuán)。盡管不希望受到任何特定原理的約束，但可認(rèn)為這些末端封閉基團(tuán)能夠在脂類(lèi)參與情況下穩(wěn)定α-螺旋(例如，見(jiàn)Venkatachelapathi et al.,1993,PROTEINS:Structure,Functionand Genetics 15:349-359)。
ApoA-Ⅰ的天然結(jié)構(gòu)中包含有八個(gè)螺旋單位，一般認(rèn)為這些螺旋單位共同參與同脂類(lèi)的結(jié)合(Nakagawa et al.,1985,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092；Anantharamaiah et al.,1985,J.Biol.Chem.260:10248-10262；Vanloo et al.,1991,J.Lipid Res.32:1253-1264；Mendez et al.,1994,J.Clin.Invest.94:1698-1705；Palgunari et al.,1996,Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16:328-338；Demoor et al.,1996,Eur.J.Biochem.239:74-84)。因此，包含由文中所述核心肽形成的二聚體、三聚體、四聚體以及甚至更高級(jí)聚合物(“多聚物”)的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑亦處于本發(fā)明范圍之內(nèi)。這些多聚物可采取串聯(lián)重復(fù)、分支網(wǎng)絡(luò)或二者相結(jié)合的形式。核心肽之間可直接相連，或是由一種或多種銜接物隔開(kāi)。
構(gòu)成多聚物的核心肽可以是結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的肽、結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的類(lèi)似物、結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的變異形式、結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的截短或內(nèi)部缺失形式、結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的擴(kuò)展形式和/或各種形式相結(jié)合。核心肽的連接方式可以是頭對(duì)尾式(即，N-末端對(duì)C-末端)、頭對(duì)頭式(即，N-末端對(duì)N-末端)、尾對(duì)尾式(即，C-末端對(duì)C-末端)，或各種形式相結(jié)合。
在本發(fā)明的實(shí)施方案中，多聚物為兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)以及多至大約十個(gè)核心肽的串聯(lián)重復(fù)。優(yōu)選而言，則多聚物為2-8個(gè)核心肽的串聯(lián)重復(fù)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑包含具有如下結(jié)構(gòu)式的多聚物 其中每個(gè)m各自獨(dú)立地為0-1的整數(shù)，優(yōu)選為1；n為0-10的整數(shù)，優(yōu)選為0-8；每個(gè)“HH”各自獨(dú)立地代表結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽或肽類(lèi)似物或其文中所述的變異形式、截短缺失形式、內(nèi)部缺失形式或擴(kuò)展形式；每個(gè)“LL”各自獨(dú)立地代表一種銜接物；以及每個(gè)“-”各自獨(dú)立地指一種共價(jià)鍵。
在結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)中，銜接物L(fēng)L可以是任意一種能夠使兩個(gè)肽相互共價(jià)連接的雙功能分子。因此，其中的功能基團(tuán)能夠與肽的N-端和/或C-端相連接的雙功能分子均可作為合適的銜接物。適合與肽的N-端或C-端連接的功能基團(tuán)以及可導(dǎo)致這種共價(jià)鍵形成的適當(dāng)化學(xué)物已為該領(lǐng)域所熟知。
銜接物可以是柔性的、剛性的或半剛性的，這取決于多聚物的預(yù)期性質(zhì)。適當(dāng)?shù)你暯游锇?，例如，Pro或Gly等氨基酸殘基或大約包含2至5、10、15或20或更多氨基酸的肽段，雙功能有機(jī)化合物如H2N(CH2)nCOOH，其中n為1-12的整數(shù)，等等。這類(lèi)銜接物的實(shí)例，以及這類(lèi)銜接物和含有這類(lèi)銜接物的肽的制備方法已為該領(lǐng)域所熟知(例如，見(jiàn)Hünig et al.,1974,Chem.Ber.100:3039-3044；Basaket al.,1994,Bioconjug.Chem.5(4):301-305)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，串聯(lián)重復(fù)從內(nèi)部被單個(gè)的脯氨酸殘基打斷。為此，在那些核心肽N-末端或C-末端終止于脯氨酸的實(shí)例中，例如結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)中的X1為Pro(P)或D-Pro(p)，結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)中優(yōu)選的m為0。在那些核心肽不包含N-末端脯氨酸或C-末端脯氨酸的實(shí)例中，優(yōu)選的LL為Pro(P)或D-Pro(p)，優(yōu)選的m為1。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可考慮采用那些在一定條件下能夠使一個(gè)或多個(gè)螺旋段(HH)釋放的可裂解型銜接物。適當(dāng)?shù)目闪呀庑豌暯游锇?，具有蛋白酶可識(shí)別的氨基酸序列的肽、可被核酸內(nèi)切酶切斷的寡核苷酸以及可通過(guò)化學(xué)方法，如在酸性、堿性或其它條件下，被切斷的有機(jī)化合物。優(yōu)選的裂解條件將是相對(duì)溫和的，以便不會(huì)造成多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑中包含的螺旋段和/或非裂解型銜接物的變性或降解。
可選擇性裂解的肽銜接物和寡核苷酸銜接物以及其裂解方法已為具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家所熟知，或可容易理解，其中包括，例如在WO94/08051中所做的描述，以及本文中引用的參考資料。
優(yōu)選實(shí)施方案中所采用的銜接物是可作為內(nèi)源循環(huán)酶底物的肽，從而允許多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑在體內(nèi)被選擇性裂解。適用于裂解銜接物的內(nèi)源酶包括，例如原載脂蛋白A-Ⅰ原肽酶。適當(dāng)?shù)拿敢约俺洚?dāng)該酶底物的肽段已為該領(lǐng)域所熟知(例如，見(jiàn)Edelstein et al.,1983,J.Biol.Chem.258:11430-11433；Zanis,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2574-2578)。
如上所述，本發(fā)明所述肽的關(guān)鍵特征是，當(dāng)它們以反平行方式排列時(shí)能夠形成分子間氫鍵或鹽鍵。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中采用具有足夠長(zhǎng)度和柔性的銜接物，以允許結(jié)構(gòu)式(Ⅱ)的螺旋段(HH)以反平行方式排列，并在脂類(lèi)參與情況下可形成分子間氫鍵或鹽鍵。
具有足夠長(zhǎng)度和柔性的銜接物包括Pro(P)、Gly(G)、Cys-Cys、H2N-(CH2)n-C(O)OH其中n為1-12，優(yōu)選的為4-6；H2N-芳基-C(O)OH以及碳水化合物，但并不局限于此。
作為選擇，由于天然載脂蛋白的反平行螺旋段之間可協(xié)同結(jié)合，因此，在一級(jí)序列上與連接天然載脂蛋白鄰近螺旋的肽段相符合的肽銜接物可方便地用于核心肽的連接，這些天然載脂蛋白包括，如ApoA-Ⅰ、apoA-Ⅱ、ApoA-Ⅳ、ApoC-Ⅰ、ApoC-Ⅱ、ApoC-Ⅲ、ApoD、ApoE和ApoJ等。這些序列已為該領(lǐng)域所熟知(例如，見(jiàn)Rosseneu et al.,“Analysis of the Primary and of the Secondary Structure of theApolipoproteins,”In:Structure and Function of Lipoproteins,Ch.6,159-183,CRC Press,Inc.,1992)。
允許反平行螺旋段的串聯(lián)重復(fù)之間形成分子間氫鍵或鹽鍵的其它銜接物包括，肽反向轉(zhuǎn)角，如β-轉(zhuǎn)角和γ-轉(zhuǎn)角，以及可模擬肽β-轉(zhuǎn)角和/或γ-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子。反向轉(zhuǎn)角通常是指將多肽鏈方向反轉(zhuǎn)的膚段，它可使單條多肽鏈采用反平行β-折疊或反平行α-螺旋的結(jié)構(gòu)區(qū)域。β-轉(zhuǎn)角通常包含4個(gè)氨基酸殘基，γ-轉(zhuǎn)角則通常包含3個(gè)氨基酸殘基。
目前該領(lǐng)域已對(duì)多種肽β-轉(zhuǎn)角的構(gòu)象和序列進(jìn)行了詳細(xì)描述，利用非限制性舉例方法，則其中包括Ⅰ型、Ⅰ’型、Ⅱ型、Ⅱ’型、Ⅲ型、Ⅲ’型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅴ’型、Ⅵa型、Ⅵb型、Ⅶ型和Ⅷ型(見(jiàn)，Richardson,1981,Adv.Protein Chem.34:167-339；Rose et al.,1985,Adv.Protein Chem.37:1-109；Wilmot et al.,1988,J.Mol.Biol.203:221-232；Sibanda et al.,1989,J.Mol.Biol.206:759-777；Tramontano et al.,1989,Proteins:Struct.Funct.Genet.6:382-394)。
β-轉(zhuǎn)角等短肽轉(zhuǎn)角的特定構(gòu)象主要取決于某些氨基酸殘基(通常為Gly、Asn或Pro)在轉(zhuǎn)角中的位置。除Pro不能出現(xiàn)在第3位以外，Ⅰ型β-轉(zhuǎn)角在轉(zhuǎn)角的1-4位置可采用任意的氨基酸殘基。Ⅰ型和Ⅱ型轉(zhuǎn)角的第4位主要為Gly，第2位主要為Pro.Asp、Asn、Ser和Cys殘基則常出現(xiàn)在第1位，其側(cè)鏈經(jīng)常在此位置與第3位殘基的NH形成氫鍵。
在Ⅱ型轉(zhuǎn)角中，Gly和Asn最常出現(xiàn)在第3位，這是由于它們最容易采取所需的主鏈角度。在理想情況下，Ⅰ’型轉(zhuǎn)角在第2和第3位上為Gly,Ⅱ’型轉(zhuǎn)角則是第2位為Gly。通常大多數(shù)氨基酸殘基都可包含在Ⅲ型轉(zhuǎn)角內(nèi)，但Ⅲ’型轉(zhuǎn)角常需要第2和第3位是Gly。Ⅵa型和Ⅵb型轉(zhuǎn)角經(jīng)常具有一個(gè)順式肽鍵，并且內(nèi)部含有Pro殘基。若讀者需要回顧蛋白和肽中β-轉(zhuǎn)角的不同類(lèi)型和不同序列，可參考Wil-mot et al.,1988,J.Mol.Biol.203:221-232。
目前該領(lǐng)域還對(duì)多種肽γ-轉(zhuǎn)角的構(gòu)象和序列進(jìn)行了詳細(xì)描述(例如，見(jiàn)Rose et al.,1985,Adv.Protein Chem.37:1-109；Wil-mer-White et al.,1987,Trends Biochem.Sci.12:189-192；Wilmotet al.,1988,J.Mol.Biol.203:221-232；Sibanda et al.,1989,J.Mol.Biol.206:759-777；Tramontano et al.,1989,Proteins:Struct.Funct.Genet.6:382-394)。本發(fā)明對(duì)所有這些β-轉(zhuǎn)角和γ-轉(zhuǎn)角，以及后來(lái)發(fā)現(xiàn)的肽β-轉(zhuǎn)角和γ-轉(zhuǎn)角，的結(jié)構(gòu)類(lèi)型和其相應(yīng)序列均加以明確考慮。
作為選擇，銜接物(LL)可能包含有能夠模擬肽β-轉(zhuǎn)角或γ-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子或部分。這種模擬β-轉(zhuǎn)角和/或γ-轉(zhuǎn)角的部分，以及含有該部分的肽的合成方法已為該領(lǐng)域所熟知，其中包括Giannisand Kolter,1993 Angew.Chem.Intl.Ed.Eng.32:1244-1267；Kahnet al.,1988,J.Molecular Recognition 1:75-79；和Kahn et al.,1987,Tetrahedron Lett.28:1623-1626中所做的描述。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，多聚物以分支網(wǎng)絡(luò)形式存在(例如，見(jiàn)圖7)。利用能使兩個(gè)以上的螺旋單位連接到單個(gè)連接部分上的多功能連接部分可方便地獲得這些網(wǎng)絡(luò)。因此，分支網(wǎng)絡(luò)采用的分子可包含三個(gè)、四個(gè)甚至更多可與肽N-端和/或C-端共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)。適當(dāng)?shù)倪B接部分包括，例如，側(cè)鏈中含有羥基、巰基(sulfanyl)、氨基、羧基、酰胺和/或酯功能基團(tuán)的氨基酸殘基，例如Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)、Lys(K)、Arg(R)、Orn、Asp(D)和Glu(E)；或其它包含有這種功能基團(tuán)的有機(jī)分子。
與單個(gè)連接部分相連的螺旋段無(wú)需通過(guò)相同的末端來(lái)連接。事實(shí)上，某些實(shí)施方案中的螺旋段與單個(gè)連接部分相連而使其按反平行方式排列，即一些螺旋通過(guò)其N(xiāo)-末端連接，其它則通過(guò)C-末端連接。
螺旋段可直接與連接部分相連接，或如前所述，由一個(gè)或多個(gè)雙功能銜接物(LL)隔開(kāi)。
參照?qǐng)D7A和7B可看到，分支網(wǎng)絡(luò)可根據(jù)構(gòu)成該網(wǎng)絡(luò)的“結(jié)點(diǎn)”數(shù)目來(lái)加以描述。在圖7A和7B中，螺旋段(即，本發(fā)明所述核心肽)以圓柱體表示，多功能連接部分(或結(jié)點(diǎn))以圓(●)表示，由圓所發(fā)出的線條數(shù)量表明多功能連接部分的“級(jí)”(或功能基團(tuán)的數(shù)量)。
網(wǎng)絡(luò)中結(jié)點(diǎn)的數(shù)量一般取決于螺旋段的預(yù)期總量，典型的約為1-2。當(dāng)然，應(yīng)意識(shí)到對(duì)于特定數(shù)量的預(yù)期螺旋段而言，具有更高級(jí)數(shù)連接部分的網(wǎng)絡(luò)所具有的結(jié)點(diǎn)將更少。例如，參照?qǐng)D7A和7B,7個(gè)螺旋單位的三級(jí)網(wǎng)絡(luò)(即，具有三功能連接部分的網(wǎng)絡(luò))有3個(gè)結(jié)點(diǎn)(圖7A)，而7個(gè)螺旋單位的四級(jí)網(wǎng)絡(luò)(即，具有四功能連接部分的網(wǎng)絡(luò))僅有兩個(gè)結(jié)點(diǎn)(圖7B)。
這些網(wǎng)絡(luò)可以級(jí)數(shù)統(tǒng)一，即其中的所有結(jié)點(diǎn)均為，例如三功能連接部分或四功能連接部分的網(wǎng)絡(luò)，也可以是混合級(jí)數(shù)，即其中的結(jié)點(diǎn)為，例如三功能連接部分和四功能連接部分混合的網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)然，應(yīng)該了解的是，甚至統(tǒng)一級(jí)數(shù)的網(wǎng)絡(luò)中的連接部分也不必完全相同。例如，三級(jí)網(wǎng)絡(luò)可采用兩種、三種、四種甚至多種不同的三功能連接部分。
與線性多聚物相同，分支網(wǎng)絡(luò)所包含的螺旋段可以完全相同，但并非必須如此。
圖7C顯示這種混合分支網(wǎng)絡(luò)的實(shí)例。在圖7C中，螺旋段(即本發(fā)明所述核心肽)以圓柱體表示，多功能連接部分以圓(●)表示，由圓所發(fā)出的線條數(shù)量表明多功能連接部分的“級(jí)”(或功能基團(tuán)數(shù)量)。連接螺旋段的線條代表前文所述的雙功能銜接物L(fēng)L。如前文所述，組成分支網(wǎng)絡(luò)的螺旋段可以是核心肽的串聯(lián)重復(fù)。
在說(shuō)明性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分支網(wǎng)絡(luò)的描述可采用公式 其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為 每個(gè)HH各自獨(dú)立地為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽或類(lèi)似物或其變異形式、截短缺失形式、內(nèi)部缺失形式或擴(kuò)展形式，如文中所述；每個(gè)LL各自獨(dú)立地為一種雙功能銜接物；每個(gè)m各自獨(dú)立地為0-1的整數(shù)；每個(gè)n各自獨(dú)立地為0-8的整數(shù)；Nya和Nyb各自獨(dú)立地為一種多功能連接部分，其中ya和yb分別代表Nya和Nyb上的功能基團(tuán)數(shù)；每個(gè)ya和yb各自獨(dú)立地為3-8的整數(shù)；p為0-7的整數(shù)；以及每個(gè)“-”各自獨(dú)立地指一種共價(jià)鍵。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，分支網(wǎng)絡(luò)包含一種“Lys-樹(shù)”，即其中的多功能連接部分為一個(gè)或多個(gè)Lys(K)殘基的網(wǎng)絡(luò)(例如，見(jiàn)圖7D)。
在說(shuō)明性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的“Lys樹(shù)”分支網(wǎng)絡(luò)的描述可采用公式 其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為 每個(gè)HH各自獨(dú)立地為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽或類(lèi)似物或其變異形式、截短缺失形式、內(nèi)部缺失形式或擴(kuò)展形式，如文中所述；每個(gè)LL各自獨(dú)立地為一種雙功能銜接物；每個(gè)n各自獨(dú)立地為0-8的整數(shù)；每個(gè)m各自獨(dú)立地為0-1的整數(shù)；R1為-OR或-NRR；以及每個(gè)R各自獨(dú)立地為-H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基；(C5-C20)芳基(C6-C26)烷芳基、5-20元雜芳基或6-26元烷雜芳基。
5.1.1．結(jié)構(gòu)與功能分析為選擇具有活性的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑或模擬物，可對(duì)本發(fā)明所述核心肽或肽類(lèi)似物，以及包含這類(lèi)核心肽的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，包括上述的多聚體形式，的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行測(cè)試。例如，可測(cè)定核心肽或肽類(lèi)似物在脂類(lèi)參與情況下形成α-螺旋的能力，與脂類(lèi)結(jié)合的能力，與脂類(lèi)形成復(fù)合物的能力，激活LCAT的能力，提高膽固醇外流的能力，等等。
肽的結(jié)構(gòu)和/或功能的分析方法和測(cè)試方法已為該領(lǐng)域所熟知。下文操作實(shí)例中給出優(yōu)選的方法。例如，下文第7節(jié)所述圓二色(CD)和核磁共振(NMR)測(cè)定法可用于分析肽或肽類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)--尤其是在脂類(lèi)參與情況下的螺旋度。使用下文第7節(jié)所述熒光光譜測(cè)定法可確定與脂類(lèi)結(jié)合的能力。使用下文第8節(jié)所述LCAT激活測(cè)試法可容易地確定肽和/或肽類(lèi)似物激活LCAT的能力。下文第9、10和11節(jié)所述體外和體內(nèi)測(cè)定法可用來(lái)評(píng)價(jià)半壽期、分布、膽固醇外流以及對(duì)RCT的影響。
具有下表Ⅳ所列性質(zhì)的本發(fā)明所述核心肽和/或肽類(lèi)似物通常被認(rèn)為是有活性的。
表Ⅳ活性肽的性質(zhì)
Ri為脂∶肽摩爾比率如下文操作實(shí)例所示，顯示高LCAT激活活性(≥38％)的核心肽在脂類(lèi)單層小泡(SUVs)參與的情況下通常會(huì)具有顯著的α-螺旋結(jié)構(gòu)(在包含22個(gè)或更多氨基酸殘基的未封閉肽情況下以及包含18個(gè)或更少氨基酸殘基的封閉肽情況下的螺旋結(jié)構(gòu)≥60％，在包含18個(gè)或更少氨基酸殘基的未封閉肽情況下的螺旋結(jié)構(gòu)≥40％)，而那些顯示極小或不顯示LCAT激活活性的肽則具有極少的α-螺旋結(jié)構(gòu)。但在某些實(shí)例中，在脂類(lèi)參與情況下具有明顯螺旋結(jié)構(gòu)的肽卻不產(chǎn)生顯著的LCAT激活活性。
與此類(lèi)似，具有顯著LCAT激活活性的肽通常能夠與脂類(lèi)結(jié)合，但在某些實(shí)例中，具有脂類(lèi)結(jié)合能力的肽卻不產(chǎn)生顯著的LCAT激活活性。
因此，具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家都會(huì)承認(rèn)，盡管文中所述核心肽形成α-螺旋(在脂類(lèi)參與情況下)的能力和脂類(lèi)結(jié)合能力對(duì)活性而言至關(guān)重要，但在許多實(shí)例中，這些性質(zhì)或許還不充分。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核心肽須經(jīng)過(guò)一系列篩選，以選出具有顯著藥理學(xué)活性的核心肽。
第一步，利用下文第7節(jié)所述CD測(cè)定法針對(duì)核心肽在脂類(lèi)參與情況下形成α-螺旋的能力對(duì)其進(jìn)行篩選。然后利用下文第7節(jié)所述熒光測(cè)定法對(duì)那些在脂類(lèi)參與情況下至少40％為螺旋(包含18個(gè)或更少氨基酸的未封閉肽)或60％為螺旋(包含18個(gè)或更少氨基酸的封閉肽；包含22個(gè)或更多氨基酸的未封閉肽)的肽(濃度約5μM，脂∶肽的摩爾比約為30)進(jìn)行針對(duì)其與脂類(lèi)結(jié)合能力的篩選。當(dāng)然，只有那些包含發(fā)熒光的Trp(W)或Nal殘基的肽才可針對(duì)其脂類(lèi)結(jié)合能力利用熒光進(jìn)行篩選。但是，對(duì)那些不包含發(fā)熒光殘基的肽而言，如果在脂類(lèi)參與情況下螺旋度增加，則顯然表明其能夠與脂類(lèi)結(jié)合。
然后對(duì)在SUVs參與情況下具有與脂類(lèi)結(jié)合能力的核心肽(0.5-10μM肽；脂∶肽的摩爾比范圍為1-50)進(jìn)行藥理學(xué)活性篩選。當(dāng)然，篩選所針對(duì)的藥理學(xué)活性將取決于ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的預(yù)期用途。在優(yōu)選實(shí)施方案中，針對(duì)核心肽的LCAT激活能力對(duì)其進(jìn)行篩選，這是因?yàn)槲闹兴龇椒▽?duì)可激活LCAT的肽尤其有效。與天然人類(lèi)ApoA-Ⅰ相比，至少顯示出約38％的LCAT激活活性的核心肽(利用下文第8節(jié)所述LCAT激活活性測(cè)試法測(cè)定)為優(yōu)選的核心肽，特別優(yōu)選的核心肽則可顯示50％、60％、70％、80％甚至90％或更高的LCAT激活活性。
5.1.2．優(yōu)選實(shí)施方案利用優(yōu)選實(shí)施方案可對(duì)本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑作進(jìn)一步地定義。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的22氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-端酰化形式和/或C-端酰胺化或酯化形式。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的22氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-端?；问胶?或C-端酰胺化或酯化形式，其中X1為Pro(P)、Gly(G)、Ala(A)、Asn(N)或D-Pro(p)；X2為Ala(A)、Val(V)或Leu(L)；X5為L(zhǎng)eu(L)；X6為Phe(F)；X11為Glu(E)；X19為L(zhǎng)ys(K)；X20為L(zhǎng)ys(K)；且/或X22為L(zhǎng)ys(K)，而X3、X4、X7、X8、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18和X21均與前文定義的結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)相同。
符合本發(fā)明該方面的特別優(yōu)選ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為那些其中的X2為Val(V)且/或X18為Gln(Q)的實(shí)施方案。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的22氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-端?；问胶?或C-端酰胺化或酯化形式，其中X10、X13或X14中的一個(gè)為Gly(G)而另外兩個(gè)為除Gly(G)以外的其它氨基酸。當(dāng)X14為Gly(G)時(shí)，優(yōu)選的X7為Glu(E)。
符合本發(fā)明該方面的特別優(yōu)選ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為選自以下組合的肽第148號(hào)肽PVLELFENLLERLGDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)148)；第151號(hào)肽PVLELFENLGERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)151)；第154號(hào)肽PVLELFENLLERGLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)154)；和其C-端酰胺化或酯化形式和/或N-端?；问?。
利用片段縮合的方法能夠很容易地高產(chǎn)量合成包含內(nèi)部甘氨酸殘基的實(shí)施方案，從而為大規(guī)模生產(chǎn)提供了重要的有利條件。片段縮合，即將小肽鏈組成部分連接起來(lái)形成更長(zhǎng)的肽鏈，已用于多種生物活性肽的制備，其中包括ApoA-Ⅰ的44氨基酸殘基模擬物(例如，見(jiàn)Nakagawaet al.,1985,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7083；Nokihara et al.,1989,Peptides 1988:166-168；Kneib-Cordonnier et al.,1990,Int.J.Pept.Protein Res.35:527-538)，并且被認(rèn)為是用于本發(fā)明所述核心肽的高產(chǎn)批量合成的費(fèi)用最低廉的方法。
通過(guò)片段縮合進(jìn)行合成的優(yōu)點(diǎn)包括，能夠在液相中將預(yù)形成的片段濃縮以及終產(chǎn)物易于純化。該方法的缺點(diǎn)包括，縮合步驟的偶合效率及產(chǎn)量較低以及某些肽序列的溶解度較低。
通過(guò)增加偶合時(shí)間可顯著提高縮合步驟的偶合效率。增加偶合時(shí)間通常會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物的外消旋作用提高(Sieber et al.,1970,Helv.Chim.Acta 53:2135-2150)。但由于甘氨酸缺乏手性中心，從而不會(huì)產(chǎn)生外消旋作用(由于位阻效應(yīng)，脯氨酸殘基在很長(zhǎng)的結(jié)合時(shí)間內(nèi)也不會(huì)或很少產(chǎn)生外消旋作用)。因此，利用甘氨酸不產(chǎn)生外消旋作用的事實(shí)而合成的組成片段可用來(lái)經(jīng)片段縮合以高產(chǎn)率大批量生產(chǎn)包含內(nèi)部甘氨酸殘基的實(shí)施方案。所以說(shuō)，包含內(nèi)部甘氨酸殘基的實(shí)施方案為大規(guī)模批量制備提供了重要的合成優(yōu)勢(shì)。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的22氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-端?；问胶?或C-端酰胺化或酯化形式，其中X10、X13和X14各自均為除Gly(G)以外的殘基。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的肽的變化或變異形式，或其N(xiāo)-端酰化形式和/或C-端酰胺化或酯化形式，其中X4為除Asp(D)以外的殘基；X5為除Phe(F)以外的殘基；X6為除Trp(W)以外的殘基；X7為除Leu(L)或Asp(D)以外的殘基；X9為除Gly(G)或Trp(W)以外的殘基；X12為除Lys(K)以外的殘基；X13為除Trp(W)以外的殘基；X14為除Trp(W)以外的殘基；X15為除Glu(E)以外的殘基；X16為除Trp(W)或Leu(L)以外的殘基；且/或
X17為除Trp(W)以外的殘基。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的22氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-端?；问胶?或C-端酰胺化或酯化形式，其中當(dāng)X7為L(zhǎng)eu(L)時(shí)，X10為T(mén)rp(W),X1為除Gly(G)以外的殘基且/或X14為除Gly(G)以外的殘基。符合本發(fā)明該方面的特別優(yōu)選肽為第155號(hào)肽(PVLELFLNLWERLLDALQKKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)155)。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為22氨基酸殘基肽，或其N(xiāo)-端?；问胶?或C-端酰胺化或酯化形式，其中X19、X20或X22中至少有一個(gè)為除Orn以外的殘基。更優(yōu)選的為X19、X20和X22中至少有兩個(gè)為除Orn以外的殘基。最優(yōu)選的為X19、X20和X22各自均為除Orn以外的殘基。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑選自如下所列肽的組合第144號(hào)肽pVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)144)；第145號(hào)肽GVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)145)；第146號(hào)肽PVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)146)；第147號(hào)肽PVLELFENLLERLFDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)147)；第148號(hào)肽PVLELFENLLERLGDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)148)；第149號(hào)肽PVLELFENLWERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)149)；第150號(hào)肽PLLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)150)；第151號(hào)肽PVLELFENLGERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)151)；第152號(hào)肽PVFELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)152)；第153號(hào)肽AVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)153)；第154號(hào)肽PVLELFENLLERGLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)154)；第155號(hào)肽PVLELFLNLWERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)155)；第186號(hào)肽PVLELFEQLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)186)；第187號(hào)肽PVLELFENLLERLLDALNKKLK(序列識(shí)別號(hào)187)；第188號(hào)肽PVLELFENLLDRLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)188)；第189號(hào)肽DVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)189)；和其N(xiāo)-端?；问胶?或N-端酰胺化或酯化形式。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑選自如下所列肽的組合第144號(hào)肽pVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)144)；第145號(hào)肽GVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)145)；
第146號(hào)肽PVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)146)；第147號(hào)肽PVLELFENLLERLFDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)147)；第148號(hào)肽PVLELFENLLERLGDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)148)；第149號(hào)肽PVLELFENLWERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)149)；第150號(hào)肽PLLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)150)；第151號(hào)肽PVLELFENLGERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)151)；第152號(hào)肽PVFELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)152)；第153號(hào)肽AVLELFENLLERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)153)；第154號(hào)肽PVLELFENLLERGLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)154)；第155號(hào)肽PVLELFLNLWERLLDALQKKLK(序列識(shí)別號(hào)155)；和其N(xiāo)-端酰化形式和/或C-端酰胺化或酯化形式。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為符合結(jié)構(gòu)式Ⅱ、Ⅲ和/或Ⅳ的多聚體形式，其中每個(gè)HH各自獨(dú)立地為符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的肽或其N(xiāo)-端?；问胶?或C-端酰胺化或酯化形式，或任意的文中所述符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的優(yōu)選肽。
在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑所包含的核心肽不是下列肽的任意一種第75號(hào)肽PVLDEFREKLNEELEALKQKLK(序列識(shí)別號(hào)75)；第94號(hào)肽PVLDEFREKLNEALEALKQKLK(序列識(shí)別號(hào)94)；第109號(hào)肽PVLDEFREKLNERLEALKQKLK(序列識(shí)別號(hào)109)；第237號(hào)肽LDDLLQKWAEAFNQLLKK(序列識(shí)別號(hào)237)；第238號(hào)肽EWLKAFYEKVLEKLKELF* (序列識(shí)別號(hào)238)；第241號(hào)肽DWFKAFYDKVFEKFKEFF(序列識(shí)別號(hào)241)；第242號(hào)肽GIKKFLGSIWKFIKAFVG (序列識(shí)別號(hào)242)；第243號(hào)肽DWFKAFYDKVAEKFKEAF(序列識(shí)別號(hào)243)；第244號(hào)肽DWLKAFYDKVAEKLKEAF(序列識(shí)別號(hào)244)；第245號(hào)肽DWLKAFYDKVFEKFKEFF(序列識(shí)別號(hào)245)；第246號(hào)肽EWLEAFYKKVLEKLKELF(序列識(shí)別號(hào)246)；第247號(hào)肽DWFKAFYDKFFEKFKEFF(序列識(shí)別號(hào)247)；第24R號(hào)肽EWLKAFYEKVLEKLKELF(序列識(shí)別號(hào)248)；第249號(hào)肽EWLKAEYEKVEEKLKELF* (序列識(shí)別號(hào)249)；第250號(hào)肽EWLKAEYEKVLEKLKELF* (序列識(shí)別號(hào)250)；以及第251號(hào)肽EWLKAFYKKVLEKLKELF*(序列識(shí)別號(hào)251)。
在最后的優(yōu)選實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑不是表Ⅹ(下文，8.3節(jié))所列肽中顯示的LCAT激活活性與天然人類(lèi)ApoA-Ⅰ相比低于38％的肽的任意一種。
5.2 ApoA-Ⅰ肽類(lèi)激動(dòng)劑的合成與純化本發(fā)明所述核心肽實(shí)際上可采用任何已為該領(lǐng)域所熟知的肽制備技術(shù)加以制備。例如，該肽可采用傳統(tǒng)的溶液或固相分段肽合成法或DNA重組技術(shù)加以制備。
5.2.1化學(xué)合成核心肽的制備可采用傳統(tǒng)的溶液或固相分段合成法(例如，見(jiàn)Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,Williams et al.,Eds.,1997,CRC Press,Boca Raton Florida，以及文中引用的參考文獻(xiàn)；Solid Phase Peptide Synthesis:APractical Approach,Atherton & Sheppard,Eds.,1989,IRL Press,Oxford,England，以及文中引用的參考文獻(xiàn))。
作為選擇，本發(fā)明所述肽可采用片段縮合法加以制備，例如可按Liu et al.,1996,Tetrahedron Lett.37(7):933-936；Baca,et al.,1995,J.Am.Chem.Soc.117:1881-1887；Tam et al.,1995,Int.J.Peptide Protein Res.45:209-216；Schnlzer and Kent,1992,Science 256:221-225；Liu and Tam,1994,J.Am.Chem.Soc.116(10):4149-4153；Liu and Tam,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6584-6588；Yamashiro and Li,1988,Int.J.PeptideProtein Res.31:322-334中的描述進(jìn)行。片段縮合法對(duì)包含內(nèi)部甘氨酸殘基的肽的合成尤其有效。用于合成本發(fā)明所述肽的其它方法則在Nakagawa et al.,1985,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092中有所描述。
包含N-端和/或C-端封閉基團(tuán)的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可采用有機(jī)化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以制備。例如，使一種肽的N-端?；蚴挂环N肽的C-端酰胺化或酯化方法已為該領(lǐng)域所熟知。在N-端和/或C-端施加其它修飾的方法，以及保護(hù)為連接末端封閉基團(tuán)所必需的側(cè)鏈功能團(tuán)的方法對(duì)具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家而言是顯而易見(jiàn)的。
在藥學(xué)上容許的鹽類(lèi)(抗衡離子)能夠方便地通過(guò)離子交換層析或已為該領(lǐng)域所熟知的其它方法加以制備。
本發(fā)明所述以串聯(lián)多聚體形式存在的組合物可方便地通過(guò)在適當(dāng)合成步驟中將銜接物加入肽鏈來(lái)進(jìn)行合成。作為選擇，也可合成螺旋段且每段都與銜接物反應(yīng)。當(dāng)然，合成的具體方法取決于銜接物的組成。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)方案和化學(xué)物已為具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家所熟知，或?qū)λ麄兌允秋@而易見(jiàn)的。
本發(fā)明所述以分支網(wǎng)絡(luò)形式存在的復(fù)合物可利用三聚體樹(shù)脂和四聚體樹(shù)脂以及Tam,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5409-5413和Demoor et al.,1996,Eur.J.Biochem.239:74-84中描述的化學(xué)物加以方便地合成。合成樹(shù)脂的修飾，以及更高級(jí)數(shù)或更低級(jí)數(shù)，或包含不同的核心肽螺旋段組合的分支網(wǎng)絡(luò)的合成策略均完全處于具有肽化學(xué)和/或有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域技能的專(zhuān)家所掌握的能力范圍之內(nèi)。
如果需要，通常可在溫和氧化劑參與情況下形成二硫鍵?？墒褂没瘜W(xué)氧化劑，或簡(jiǎn)單地將復(fù)合物暴露于空氣中的氧來(lái)形成這些鍵。有多種不同的方法為該領(lǐng)域所熟知，其中包括，例如，在Tam et al.,1979,Synthesis 955-957；Stewart et al.,1984,Solid Phase PeptideSynthesis,2d Ed.,Pierce Chemical Company Rockford,IL；Ahmedet al.,1975,J.Biol.Chem.250:8477-8482；以及Pennington etal.,1991 Peptides 1990 164-166,Giralt and Andreu,Eds.,ESCOMLeiden,The Netherlands中所作的描述。其它的選擇還有Kamber etal.,1980,Helv.Chim.Acta 63:899-915中的描述。Albericio,1985,Int.J.Peptide Protein Res.26:92-97對(duì)在固體支持物上的實(shí)現(xiàn)方法進(jìn)行了描述。在本發(fā)明所述肽中形成二硫鍵可采用這些方法中的任意一種。
5.2.2重組合成如果肽所含的氨基酸完全為基因編碼的氨基酸，或其中的一部分完全為基因編碼的氨基酸，則該肽或該相應(yīng)部分也可采用傳統(tǒng)的遺傳工程重組技術(shù)加以合成。
進(jìn)行重組生產(chǎn)需要將一段編碼肽的多核苷酸序列插入適當(dāng)表達(dá)載體，即包含了轉(zhuǎn)錄和翻譯插入編碼序列所必需的組件的載體，或在RNA病毒載體情況下為包含了復(fù)制和翻譯所必需的組件的載體。然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到用于表達(dá)肽的適當(dāng)靶細(xì)胞中。然后按照所使用的表達(dá)載體，利用該領(lǐng)域沿用已久的步驟將表達(dá)的肽分離。重組蛋白和重組肽的生產(chǎn)方法已為該領(lǐng)域所熟知(例如，見(jiàn)Sambrood et al.,1989,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.；以及Ausubel et al.,1989,Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.各自全文引入以作參考)若要提高生產(chǎn)效率，可將多聚核苷酸設(shè)計(jì)成編碼多個(gè)肽單位，其間由酶切位點(diǎn)隔開(kāi)--用這種方法既可設(shè)計(jì)共聚物(重復(fù)肽單位)也可設(shè)計(jì)雜聚物(不同的肽串接在一起)。為回收肽單位，可將合成的多肽切開(kāi)(例如，用適當(dāng)?shù)拿柑幚?。這樣可提高由單個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)的肽的產(chǎn)量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，經(jīng)操作將編碼區(qū)各自與一種非末端依賴(lài)性翻譯調(diào)控序列，如內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，相連可設(shè)計(jì)出多順?lè)醋有远嗑酆塑账幔罐D(zhuǎn)錄出的單條mRNA可編碼多個(gè)肽(即，共聚物或雜聚物)。當(dāng)在適當(dāng)?shù)牟《颈磉_(dá)體系中使用時(shí)，可從轉(zhuǎn)錄子內(nèi)部指導(dǎo)由mRNA編碼的各種肽的翻譯；例如通過(guò)IRES。因此，多順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)可指導(dǎo)單一的多順?lè)醋娱L(zhǎng)mRNA的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而可指導(dǎo)多個(gè)單肽的翻譯。這種方法省去了多肽的生產(chǎn)和酶處理步驟，并且能夠顯著提高由單個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)的肽的產(chǎn)量。
文中所述肽的表達(dá)可采用多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)。其中包括，經(jīng)包含適當(dāng)編碼序列的噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的諸如細(xì)菌等的微生物；經(jīng)包含適當(dāng)編碼序列的酵母或真菌重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母或絲狀真菌；經(jīng)包含適當(dāng)編碼序列的病毒重組表達(dá)載體(如，桿狀病毒)轉(zhuǎn)染的昆蟲(chóng)細(xì)胞體系；經(jīng)包含適當(dāng)編碼序列的病毒重組表達(dá)載體(如，菜花樣花葉病毒或煙草花葉病毒)轉(zhuǎn)染或經(jīng)包含適當(dāng)編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞體系；或動(dòng)物細(xì)胞體系，但并不局限于此。表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)元件在強(qiáng)度與特異性方面各不相同。根據(jù)所采用的宿主/載體系統(tǒng)的不同，可將多種適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄元件和翻譯元件，如組成型和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，任意使用于表達(dá)載體中。例如，當(dāng)在細(xì)菌體系中克隆時(shí)，可使用諸如λ噬菌體的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac雜交啟動(dòng)子)等誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；當(dāng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞體系中克隆時(shí)，可使用多角體桿狀病毒啟動(dòng)子等啟動(dòng)子；當(dāng)在植物細(xì)胞體系中克隆時(shí)，可使用來(lái)源于植物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如，熱休克啟動(dòng)子；用于RUBISCO小亞基的啟動(dòng)子；用于葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子)或來(lái)源于植物病毒的啟動(dòng)子(如，CaMV的35S RNA啟動(dòng)子；TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子)；當(dāng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞體系內(nèi)克隆時(shí)，可使用來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來(lái)源于哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)；當(dāng)產(chǎn)生包含有多拷貝表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞系時(shí)，可使用具有適當(dāng)選擇標(biāo)記的基于SV40、BPV和EBV的載體。
在使用植物表達(dá)載體的情況下，可將多種啟動(dòng)子任意使用于本發(fā)明所述肽編碼序列的表達(dá)。例如，可使用諸如CaMV的35S RNA和19S RNA啟動(dòng)子(Brisson et al.,1984,Nature 310:511-514)、或TMV的外殼蛋白啟動(dòng)子(Takamatsu et al.,1987,EMBO J.6:307-311)等病毒啟動(dòng)子；作為選擇，也可使用諸如RUBISCO小亞基啟動(dòng)子(Coruzzi et al.,1984,EMBO J.3:1671-1680；Broglie et al.,1984,Science 224:838-843)或熱休克啟動(dòng)子，如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley et al.,1986,Mol.Cell.Biol.6:559-565)等植物啟動(dòng)子。這些結(jié)構(gòu)可通過(guò)Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等方法引入植物細(xì)胞。若需要回顧這些技術(shù)，可參考，例如，Weissbach & Weissbach,1988,Methodsfor Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section Ⅷ,pp.421-463；以及Grierson & Corey,1988,Plant Molecular Biology,2d Ed.,Blackie,London,Ch.7-9。
在用于生產(chǎn)本發(fā)明所述肽的一種昆蟲(chóng)表達(dá)體系中，可將核型多角體病毒(AcNPV)Autographa Californica作為載體用于外源基因的表達(dá)。病毒在Spodoptera frugiperda細(xì)胞中增殖。編碼序列可被克隆到病毒的非必需區(qū)域(如多角體基因)內(nèi)并受AcNPV啟動(dòng)子(如，多角體啟動(dòng)子)的控制。編碼序列的成功插入將導(dǎo)致多角體基因的失活并產(chǎn)生非包含型重組病毒(即，缺乏由多角體基因編碼的蛋白質(zhì)外殼的病毒)。然后用這些重組病毒轉(zhuǎn)染Spodoptera frugiperda細(xì)胞，插入基因可在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(例如，見(jiàn)Smith et al.,1983,J.Virol.46:584；Smith,U.S.Patent No.4,215,051)。在Current Protocolsin Molecular Biology,Vol.2,Ausubel et al.,eds.,GreenePublish.Assoc.& Wiley Interscience中可找到更多有關(guān)該表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)，可使用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在以腺病毒作為表達(dá)載體的情況下，可將編碼序列與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控復(fù)合物，如晚期啟動(dòng)子，相連接并將前導(dǎo)序列分為三部分。然后通過(guò)體外重組或體內(nèi)重組將該嵌合基因插入到腺病毒基因組中。病毒基因組非必需區(qū)(如，E1區(qū)或E3區(qū))內(nèi)的插入將使重組病毒能夠在轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞內(nèi)存活并表達(dá)肽。(例如，見(jiàn)Logan & Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:3655-3659)。作為選擇，也可使用痘苗病毒的7.5K啟動(dòng)子，(例如，見(jiàn)Mackett et al.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79:7415-7419；Mackett et al.,1984,J.Virol.49:857-864；Panicali et al.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.79:4927-4931)。
其它用于生產(chǎn)本發(fā)明所述肽的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家而言將是顯而易見(jiàn)的。
5.2.3肽的純化本發(fā)明所述肽可通過(guò)諸如反相層析、高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析等已為該領(lǐng)域所熟知的技術(shù)加以純化。純化特定肽所采用的實(shí)際條件將部分取決于合成策略以及諸如凈電荷、疏水性、親水性等因素，這些條件對(duì)具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家而言將是顯而易見(jiàn)的。分支狀肽多聚物的純化可采用，如離子交換層析或分子篩層析。
就親和層析純化而言，可使用任何能夠與該肽特異結(jié)合的抗體。至于抗體的生成，可利用肽對(duì)多種不同的宿主動(dòng)物，包括但并不局限于家兔、小鼠、大鼠等，進(jìn)行免疫注射。借助側(cè)鏈功能基團(tuán)或與側(cè)鏈功能基團(tuán)相連接的銜接物，可將肽連接到如BSA等適當(dāng)媒介物上。根據(jù)宿主的種類(lèi)，可采用多種不同的佐劑來(lái)提高免疫應(yīng)答，其中包括但并不局限于Freund’s(完全的和不完全的)、氫氧化鋁等礦物質(zhì)凝膠、溶血卵磷脂等表面活性物質(zhì)、復(fù)合多元醇、多聚陰離子、油乳劑、鑰孔血蘭素、二硝基苯酚，以及具有現(xiàn)在用途的人類(lèi)佐劑如BCG(卡介苗)和Corynebacterium parvum。
肽單克隆抗體的制備可采用任何在培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系以用于產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)。其中包括但并不局限于最初由Kohler andMilstein,1975,Nature 256:495-497或在此作為引文被包括在內(nèi)的Kaprowski,U.S.Patent No.4,376,110描述的雜交瘤技術(shù)；人類(lèi)B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor et al.,1983,Immunology Today 4:72；Cote et al.,1983,Proc.Natl.Aead.Sci.U.S.A.80:2026-2030)；以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et la.,1985,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96(1985))。此外，也可采用將具有適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有適當(dāng)生物活性的人類(lèi)抗體分子的基因連接在一起用于“嵌合抗體”生產(chǎn)的技術(shù)(Morrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855；Neuberger et al.,1984,Nature 312:604-608；Takeda et al.,1985,Nature 314:452-454,Boss,U.S.Patent No.4,816,397；Cabilly,U.S.Patent No.4,816,567；均在此作為引文被包括在內(nèi))?；蛘呖梢灾苽洹叭嗽椿笨贵w(例如，見(jiàn)在此作為引文被包括在內(nèi)的Queen,U.S.Patent No.5,585,089)。作為選擇，也可采用單鏈抗體生產(chǎn)技術(shù)(U.S.Patent No.4,946,778)來(lái)生產(chǎn)肽-特異性單鏈抗體。
通過(guò)已知技術(shù)還可產(chǎn)生特異結(jié)合位點(diǎn)缺失的抗體片段。例如，這些片段包括但并不局限于，由胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生的F(ab’)2片段以及由F(ab’)2的二硫鍵還原而產(chǎn)生的Fab片段。作為選擇，也可構(gòu)建Fab表達(dá)庫(kù)(Huse et al.,1989,Science 246:1275-1281),它能夠快速而容易地鑒定出對(duì)特定肽具有預(yù)期特異性的單克隆抗體的Fab片段。
可將預(yù)定肽的特異抗體或抗體片段連接到，如瓊脂糖上，并將該抗體-瓊脂糖復(fù)合物用于免疫層析以純化本發(fā)明所述肽。參見(jiàn)Scopes,1984,Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag New York,Inc.,NY,Livingstone,1974,MethodsIn Enzymology:Immunoaffinity Chromatography of Proteins34:723-731。
5.3藥劑及治療方法本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可用來(lái)治療動(dòng)物，尤其是包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，的任何通過(guò)提高血清中HDL濃度、激活LCAT，以及提高膽固醇外流和RCT可有益于其治療的病癥。這些病癥包括高脂血癥，尤其是高膽固醇血癥，以及心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化(包括動(dòng)脈粥樣硬化的治療和預(yù)防)；再狹窄(例如，由球囊血管形成術(shù)等醫(yī)療操作后產(chǎn)生的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的預(yù)防和治療)；以及可導(dǎo)致膿毒性休克的內(nèi)毒素血癥等其它病癥，但并不局限于此。
ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可單獨(dú)使用或在綜合療法中與其它藥物結(jié)合使用于上述病癥的治療。這些療法包括所涉及藥物的同時(shí)或依次給藥，但并不局限于此。
例如在高膽固醇血癥或動(dòng)脈粥樣硬化的治療中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑制劑可與諸如膽汁酸樹(shù)脂、煙酸和/或抑制素等目前所使用的任何一種或多種旨在降低膽固醇的療法中進(jìn)行給藥。這種聯(lián)合方案可能會(huì)具有非常有益的治療效果，這是由于每種藥物可作用于膽固醇合成和運(yùn)輸?shù)牟煌h(huán)節(jié)；即，膽汁酸樹(shù)脂可影響膽固醇循環(huán)、乳糜微粒和LDL群體；煙酸主要影響VLDL群體和LDL群體；抑制素則抑制膽固醇的合成，降低LDL數(shù)量(并可能增加LDL受體的表達(dá))；而ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可影響RCT、提高HDL、增加LCAT活性并且促進(jìn)膽固醇外流。
在另一實(shí)施方案中，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可與fibrates連同使用于高脂血癥、高膽固醇血癥和/或動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的治療。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可與目前所使用的抗微生物劑和消炎劑共同使用于由內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的膿毒性休克的治療。
本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可按配方制備成肽類(lèi)或肽-脂復(fù)合物類(lèi)制劑，能夠以多種方式向受治療者給藥以把ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑引入循環(huán)。以下對(duì)典型的制劑和治療方案加以描述。
5.3.1作為活性成分的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑與肽/脂復(fù)合物肽類(lèi)ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可利用第5.2節(jié)及其各小節(jié)描述的任何技術(shù)加以合成或制造。將肽凍干可制成保存期較長(zhǎng)的穩(wěn)定制品--可制備成重新配制的散裝形式，也可制備成向受治療者給藥之前用滅菌水或適當(dāng)滅菌緩沖液進(jìn)行再水合重構(gòu)的個(gè)體等分試樣或劑量單位形式。
在某些實(shí)施方案中，肽-脂復(fù)合物為優(yōu)選的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑藥劑和給藥形式。由于復(fù)合物在循環(huán)中具有較長(zhǎng)的半壽期，尤其當(dāng)復(fù)合物與HDL，特別是與前-β-1或前-β-2HDL群體，的大小和密度相似時(shí)更加明顯，因而該方法具有若干優(yōu)點(diǎn)。肽-脂復(fù)合物可通過(guò)下述多種方法中的任意一種加以方便地制備。利用凍干法可制成保存期較長(zhǎng)的穩(wěn)定制品--優(yōu)選方法則為下文所述的聯(lián)合凍干法。凍干的肽-脂復(fù)合物可用來(lái)制備成藥劑重新配制的散裝形式，也可制備成向受治療者給藥之前用滅菌水或適當(dāng)滅菌緩沖液進(jìn)行再水合重構(gòu)的個(gè)體等分試樣或劑量單位形式。
為具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家所熟知的多種方法均可用于肽-脂小泡或復(fù)合物的制備。為此，可使用多種用于脂質(zhì)體或脂蛋白體制備的技術(shù)。例如，可將肽與適當(dāng)?shù)闹餐曁幚?利用水浴超聲儀或探針超聲儀)以形成復(fù)合物。作為選擇，也可將肽與預(yù)制的脂囊泡結(jié)合以自發(fā)形成肽-脂復(fù)合物。也可選擇另一種方法，通過(guò)去污劑透析法形成肽-脂復(fù)合物；比如，將肽、脂類(lèi)和去污劑混合物透析以去除去污劑并重構(gòu)或形成肽-脂復(fù)合物(例如，見(jiàn)Jonas et al.,1986,Methods inEnzymol.128:553-582)。
雖然上述方法確實(shí)可行，但就成本、產(chǎn)量、可重復(fù)性以及安全性而言各方法均具有自身的生產(chǎn)問(wèn)題。該申請(qǐng)人研究出一種用來(lái)制備與HDL性質(zhì)相類(lèi)似的肽-磷脂或蛋白-磷脂復(fù)合物的簡(jiǎn)單方法。該方法可用于ApoA-Ⅰ肽-脂復(fù)合物的制備，并且具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)所包含的組分大多或全部可用于形成指定的復(fù)合物，從而避免了原材料的浪費(fèi)，而這種浪費(fèi)在其它方法中卻很常見(jiàn)。(2)可制成在儲(chǔ)存期間非常穩(wěn)定的凍干復(fù)合物。所得復(fù)合物可在使用前直接重構(gòu)。(3)所得復(fù)合物在制成后和使用前通常無(wú)需進(jìn)一步純化。(4)可避免含有包括膽酸鹽等去污劑在內(nèi)的毒性化合物。此外，該生產(chǎn)方法能夠很容易地按比例擴(kuò)大，并適合于GMP加工(即，在無(wú)內(nèi)毒素的環(huán)境中加工)。
按照優(yōu)選方法，將肽和脂類(lèi)混合加入一種能使各組分共溶，并可通過(guò)凍干法完全去除的溶劑系統(tǒng)中。為此，必須仔細(xì)選擇雙溶劑以確保兩親性肽和脂類(lèi)的共溶。在實(shí)施方案中，可把要結(jié)合到微粒中的蛋白或肽溶解于水性溶劑或有機(jī)溶劑或混合溶劑(溶劑1)。將(磷)脂成分溶解于能夠與溶劑1互溶的水性溶劑或有機(jī)溶劑或混合溶劑(溶劑2)，并將兩種溶液混合。作為選擇，也可將肽和脂混合加入一種共溶劑系統(tǒng)；即可互溶的溶劑的混合物。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，首先確定肽(蛋白)與脂的適當(dāng)比率，以使所得復(fù)合物具有適當(dāng)?shù)奈锢砗突瘜W(xué)特性；即在大小上通常(而非必須)與HDL相似。將所得混合物凍結(jié)并冷凍干燥。有時(shí)必須加入附加溶劑以使混合物易于凍干。該凍干產(chǎn)品可長(zhǎng)期保存并將保持穩(wěn)定。
在下文所述操作實(shí)例中，第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)與磷脂被分別溶解于甲醇并混合，然后在凍干前與二甲苯混合。也可將肽和脂一同加入這兩種溶劑的混合溶劑中。作為選擇，還可將溶解于甲醇的肽溶液與溶解于二甲苯的脂溶液相混合。為避免出現(xiàn)肽的鹽析，應(yīng)注意去除溶劑系統(tǒng)中的鹽類(lèi)。將含有共溶于甲醇/二甲苯的肽和脂的溶液凍干成粉末。
為獲得肽-脂復(fù)合物溶液或懸液，可將凍干產(chǎn)品重構(gòu)。為此，用水溶液將凍干粉末重新水化至適當(dāng)體積(通常為5mgs肽/ml，便于靜脈注射)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用磷酸緩沖鹽溶液或生理鹽水將凍干粉末重新水化。為促進(jìn)水化，可能需要攪拌或搖動(dòng)混合物，多數(shù)情況下應(yīng)該在等于或高于復(fù)合物脂類(lèi)組分相變溫度的溫度下進(jìn)行重構(gòu)步驟。只需幾分鐘即可得到澄清的脂-蛋白復(fù)合物重構(gòu)制劑。
所得重構(gòu)制劑試樣的特征在于可確定制劑中的復(fù)合物具有預(yù)期的粒度分布；如，HDL的粒度分布。為此，可采用凝膠過(guò)濾層析。下文所述操作實(shí)例中采用的是Pharmacia Superose 6 HPLC凝膠過(guò)濾層析系統(tǒng)。所使用的緩沖液為含有150mM NaCl的50mM磷酸緩沖液，pH7.4。標(biāo)準(zhǔn)的樣品體積為20-200微升復(fù)合物，其中含5mgs肽/ml。柱流速為0.5mls/min。一系列已知分子量和Stokes半徑的蛋白以及人類(lèi)HDL作為標(biāo)準(zhǔn)用于柱的校準(zhǔn)。蛋白和脂蛋白通過(guò)254或280nm下的吸光度或光散射加以監(jiān)測(cè)。
本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可與多種脂類(lèi)形成復(fù)合物，其中包括飽和脂類(lèi)、不飽和脂類(lèi)、天然脂類(lèi)和合成脂類(lèi)及/或磷脂。適當(dāng)?shù)闹?lèi)包括短烷基鏈磷脂、卵磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、月桂酰磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、鞘脂類(lèi)、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、腦磷脂酰絲氨酸、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂、磷脂酸、半乳糖腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、腦苷脂類(lèi)、二月桂酰磷脂酰膽堿、(1,3)-D-甘露糖基-(1,3)二甘油酯、氨苯基糖苷、3-膽甾醇基-6’-(硫代糖基)己基醚糖脂類(lèi)、以及膽固醇和其衍生物，但并不局限于此。
該發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑與鞘磷脂復(fù)合時(shí)，前-β-樣微粒中所有的HDL均被去除。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，以ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑和鞘磷脂的復(fù)合物形式給藥。
5.3.2治療方法本發(fā)明所述肽類(lèi)或肽-脂復(fù)合物類(lèi)ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可通過(guò)任何能夠確保在循環(huán)中生物利用度的適當(dāng)途徑加以給藥。其最佳實(shí)現(xiàn)方式是通過(guò)非腸道途徑給藥，其中包括靜脈內(nèi)注射(IV)、肌內(nèi)注射(IM)、皮內(nèi)注射、皮下注射(SC)和腹腔內(nèi)注射(IP)。但也可采用其它途徑給藥。例如，若采用適當(dāng)制劑(如，腸溶衣)以使活性成分，如在口腔粘膜、胃和/或小腸等苛刻環(huán)境下，的降解得以避免或最小化，則通過(guò)口腔途徑給藥(包括但并不局限于口服方式、口腔粘膜方式和舌下方式)也可以實(shí)現(xiàn)胃腸道吸收。作為選擇，也可使用如陰道給藥和直腸給藥等通過(guò)粘膜組織給藥的方式以避免胃腸道降解或使之最小化。作為另一選擇，本發(fā)明所述制劑也可經(jīng)皮(如經(jīng)皮膚)給藥，或通過(guò)吸入給藥。應(yīng)該意識(shí)到優(yōu)選方法可能隨接受者的狀況、年齡和順應(yīng)性的不同而變化。
所用ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑或肽-脂復(fù)合物的實(shí)際劑量將隨給藥方式的不同而不同，并且應(yīng)調(diào)整至在循環(huán)血漿中的濃度為100mg/l-2g/l。由文中所述動(dòng)物模型系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑與HDL組分相聯(lián)系，并且預(yù)計(jì)在人體內(nèi)的半壽期約為5天。因此，實(shí)施方案中ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的給藥可為每周一次，注射劑量0.5mg/kg-100mg/kg。在另一實(shí)施方案中，也可通過(guò)約0.5mg/kg/hr-100mg/kg/hr的連續(xù)輸液或間歇輸液來(lái)維持預(yù)定的血清水平。
不同ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的毒性和療效的確定可利用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)過(guò)程通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物來(lái)確定LD50(半數(shù)致死劑量)和ED50(半數(shù)有效劑量)。毒性與療效的劑量比為治療指數(shù)，可用比率LD50/ED50表示。優(yōu)選的為具有高治療指數(shù)的肽類(lèi)ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑。
5.3.3藥劑本發(fā)明所述藥劑包括作為活性成分包含在適于體內(nèi)給藥及體內(nèi)釋放的藥學(xué)上容許的載體內(nèi)的ApoA-Ⅰ肽激動(dòng)劑或肽-脂復(fù)合物。由于這些肽可能包含酸性和/或堿性的末端和/或側(cè)鏈，因此能夠以游離酸或游離堿形式，或以藥學(xué)上容許的鹽形式包含于制劑中。
注射制劑包括活性成分在水性或油性載體中的無(wú)菌混懸液、溶液或乳劑。其組成可能還包括諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑等配制劑。注射制劑能夠以單位劑量形式提供，如置于安瓿容器或多劑量容器中，并且可能含有添加的防腐劑。
作為選擇，提供的注射制劑也可以是粉末形式，在使用前用適當(dāng)載體，包括但并不局限于無(wú)菌無(wú)熱原的水、緩沖液、葡萄糖溶液等，進(jìn)行重構(gòu)。為此，可將ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑凍干，或利用聯(lián)合凍干法制備肽-脂復(fù)合物。儲(chǔ)存制劑可以單位劑量形式提供并在體內(nèi)使用前重構(gòu)。
就長(zhǎng)期供應(yīng)而言，可將活性成分制成長(zhǎng)效制劑以用于植入給藥；如皮下注射、皮內(nèi)注射或肌內(nèi)注射。因此，例如可采用適當(dāng)?shù)木酆喜牧匣蚴杷牧?如，在容許的油中形成乳劑)或離子交換樹(shù)脂來(lái)配制活性成分，或?qū)⑵渲瞥晌⑷苎苌?；如ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的微溶鹽形式。
作為選擇，也可使用經(jīng)皮釋放系統(tǒng)，該系統(tǒng)可制成緩慢釋放經(jīng)皮吸收活性成分的吸附性盤(pán)片。為此，可使用促滲透劑以促進(jìn)活性成分的經(jīng)皮透入。通過(guò)將本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑或肽-脂復(fù)合物并入硝酸甘油片以用于缺血性心臟病和高膽固醇血癥患者可獲得獨(dú)特的效果。
就口服給藥而言，藥物成分可采用由藥學(xué)上容許的賦形劑經(jīng)常規(guī)方法制備的片劑或膠囊形式，賦形劑包括粘合劑(如，預(yù)凝膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填料(如，乳糖、微晶體纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(如，硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥基乙酸鈉)；或濕潤(rùn)劑(如，月桂硫酸鈉)。通過(guò)該領(lǐng)域熟知的方法可將片劑加上糖衣。用于口服給藥的脂類(lèi)制劑可采用，例如溶液、糖漿或懸浮液的形式，或以干制品方式提供，在使用前用水或其它適當(dāng)載體重構(gòu)。這些脂類(lèi)制劑可由藥學(xué)上容許的添加劑通過(guò)常規(guī)方法加以制備，添加劑包括懸浮劑(如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(如，杏仁油、油性酯、乙醇或分餾的植物油)；以及防腐劑(如，對(duì)甲基羥基苯甲酸鹽或?qū)Ρu基苯甲酸鹽或山梨酸)。制劑中可能還適當(dāng)含有緩沖鹽、調(diào)味劑、著色劑和甜味劑?？诜o藥的制劑可經(jīng)適當(dāng)配制使活性組合物受控釋放。
就口腔粘膜給藥而言，各成分可按傳統(tǒng)配制方式采用片劑或藥糖塊形式。就直腸和陰道途徑給藥而言，活性成分可被制成溶液(用于潴留灌腸)、栓劑或軟膏形式。
就吸入方式給藥而言，利用適當(dāng)?shù)陌l(fā)射劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適當(dāng)氣體，制成由氣壓式包裝或噴霧器噴射的形式可方便地提供活性成分。就氣壓式噴霧劑而言，劑量單位的確定可通過(guò)提供一種能夠計(jì)量噴射量的閥門(mén)加以實(shí)現(xiàn)。配制的用于吸入器或吹藥器的如明膠膠囊和明膠筒中可包含有組合物與諸如乳糖或淀粉等適當(dāng)粉基組成的混合粉末。
如果愿意，也能夠以包含一單位或多單位劑量的包裝或分樣裝置形式提供含活性成分的各組分。該包裝可具有，例如金屬薄片或塑料薄膜，如薄膜包裝即屬于該類(lèi)型。該包裝或分樣裝置可附有給藥說(shuō)明。
5.4其它用途本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可用于，例如出于診斷目的的體外測(cè)量血清HDL的測(cè)試。由于ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑與血清中的HDL相聯(lián)系，因此可將該激動(dòng)劑用作HDL群體的“標(biāo)記物”。此外，也可將該激動(dòng)劑用作在RCT中發(fā)揮效用的HDL亞群體的標(biāo)記物。為此，可將該激動(dòng)劑加入患者的血清樣品或與之混合；經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí)間的保溫，可通過(guò)檢測(cè)加入的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑來(lái)測(cè)試HDL的組成。利用標(biāo)記的激動(dòng)劑(例如，放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、染料等)，或利用該激動(dòng)劑的特異抗體(或抗體片段)經(jīng)免疫測(cè)試可實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
作為選擇，也可將標(biāo)記的激動(dòng)劑用于成像操作(如，CAT掃描、MRI掃描)來(lái)顯現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)，或用于RCT監(jiān)測(cè)，或顯現(xiàn)HDL在脂肪紋、動(dòng)脈粥樣硬化性病變等中的積累(其中HDL在膽固醇外流方面應(yīng)起積極作用)。
6．實(shí)施例ApoA-Ⅰ肽激動(dòng)劑的合成。
以下各小節(jié)將敘述表Ⅹ(下文，第8.3節(jié))所列各種肽的合成與特性，下文第7和第8小節(jié)還將對(duì)這些肽的結(jié)構(gòu)分析與功能分析加以描述。
6.1核心肽的合成肽在固相上的合成是按照Merrifield技術(shù)(Merrifield,1969,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154)使用0.25mmol p-烷氧基芐醇樹(shù)脂(HMP樹(shù)脂)(Wang,1973,J.Am.Chem.Soc.95:1328-1333)和Fmoc化學(xué)物。所有合成過(guò)程的實(shí)現(xiàn)均利用Applied Biosystems ABI的430A型肽自動(dòng)合成儀(Perkin-Elmer,Foster City,CA)。每個(gè)耦合循環(huán)所使用的溶解時(shí)間和活化時(shí)間如下表Ⅴ所示表Ⅴ單次活化劑耦合循環(huán)
在每次耦合步驟之間用NMP清洗樹(shù)脂。單次合成循環(huán)的規(guī)程如下表Ⅵ所示表Ⅵ單次合成循環(huán)的耦合規(guī)程
除Fmoc-β-(1-萘基)丙氨酸之外的所有氨基酸均采用該方法耦合。Fmoc-β-(1-萘基)丙氨酸則為人工耦合。就人工耦合而言，可將1mmol Fmoc-β-(1-萘基)丙氨酸和1mmol 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)溶于5ml NMP，并與肽-樹(shù)脂混合。
然后加入2mmol N-乙基二異丙胺，將混合物搖晃2小時(shí)，用10mlNMP清洗肽-樹(shù)脂共6次。耦合效率的檢驗(yàn)采用Kaiser檢測(cè)法(Kaiser,1970,Anal.Biochem.34:59577)，如果需要還可重復(fù)耦合。在萘基丙氨酸耦合后，其余的合成可如上所述以自動(dòng)方式進(jìn)行。
6.2肽酰胺的合成表Ⅹ(下文，第8.3節(jié))所示肽酰胺的合成采用含有Fmoc-Rink酰胺柄4-(2’,4’-二甲基苯基)-Fmoc-苯氧基甲基的Rink酰胺樹(shù)脂(Rink,1987,Tetrahedron Lett.28:3787-3790)，合成規(guī)程如上文第6.1節(jié)所述。
6.3N-端?；牡暮铣杀恝?下文，第8.3節(jié))所示肽的N-端?；问降闹苽涫前寻吹?.1或6.2節(jié)所述制備的與樹(shù)脂結(jié)合的肽暴露于適當(dāng)?shù)孽；瘎?br> 對(duì)N-端?；亩?，每1g與樹(shù)脂結(jié)合的肽加入15ml乙酸酐溶液(10％v/v溶于NMP)，將混合物搖晃5分鐘，并過(guò)濾回收樹(shù)脂。回收的樹(shù)脂用NMP(15ml)清洗3次，乙醇(15ml)清洗3次。
6.4裂解與脫保護(hù)在合成之后，利用含92.5％三氟乙酸/3.75％苯甲醚/3.75％十二硫醇(v/v/v)的裂解液將上文第6.1、6.2和6.3節(jié)所述的肽從樹(shù)脂上裂解和脫保護(hù)。要實(shí)現(xiàn)裂解，可在0.25mmol肽樹(shù)脂中加入10ml裂解液并在室溫下攪拌1.5小時(shí)。過(guò)濾去除樹(shù)脂并用二乙醚沉淀裂解/脫保護(hù)的肽，乙醚清洗并真空干燥。
含有Trp(W)的肽以及肽酰胺的裂解劑中含86.5％的TFA、4.5％的水、4.5％的1,2-乙二硫醇、4.5％的苯甲醚和3％的苯酚。
6.5純化利用反相HPLC純化第6.4節(jié)中的粗制裂解肽。利用不同的分析技術(shù)(分析HPLC、毛細(xì)管電泳)確定各種肽的純度。毛細(xì)管電泳采用的是長(zhǎng)70cm、內(nèi)徑75μm的熔凝石英毛細(xì)管(熱分割產(chǎn)品)。分離條件為25℃、15kV，運(yùn)行時(shí)間35分鐘，并采用兩種不同的緩沖液系統(tǒng)緩沖液1(20mM Na2B4O7,pH9.2)和緩沖液2(10mM Na2HPO4,pH2.5)。HPLC分離采用的是Nucleosil 7C18柱或Nucleosil 7C4柱(Machereyand Nagel,Germany),250×21mm，流速8ml/min。梯度洗脫采用0.1％TFA水溶液(溶劑A)與0.1％TFA乙腈溶液(溶劑B)的合劑。調(diào)整所用梯度以滿足各種肽的需要。
6.6特性鑒定通過(guò)下文所述的質(zhì)譜分析法和氨基酸分析法分別進(jìn)行第6.5節(jié)所述純化肽的質(zhì)量分析和氨基酸分析。測(cè)序則采用Edman降解法。
6.6.1 LC-MS質(zhì)量的確定是利用作為普通商品銷(xiāo)售的三級(jí)四倍質(zhì)譜儀(TSQ700型；Finnigan MAT,San Jose CA,USA)。通過(guò)氣壓輔助電噴射(ESI)接口將樣品引入質(zhì)譜儀的常壓電離源。接口噴射器在4.5kV正電位下運(yùn)轉(zhuǎn)。鋼制毛細(xì)管溫度保持在200℃，岐管溫度保持在70℃。由該離子蒸發(fā)過(guò)程產(chǎn)生的陽(yáng)離子進(jìn)入質(zhì)譜儀分析器。倍增器電壓調(diào)至1000V。質(zhì)譜儀分析器室處于4E-6。在分辨率＜1u的情況下進(jìn)行所有探測(cè)。
肽的分析是利用具有注射泵(140B型)、紫外檢測(cè)器(785A型)和恒溫器/注射器(112A型)的ABI(Applied Biosystems)微孔系統(tǒng)直接灌注純化肽。溶劑系統(tǒng)包括水(溶劑A)和乙腈(溶劑B)，其中各含有0.1％ TFA。采用梯度條件或無(wú)梯度條件灌注肽，然后將其從Aquapore C18柱上洗脫。流速通常為300μl/min。各肽的濃度約為0.03mg/ml，取20μl進(jìn)行注射(如，30pmol)。
MS全掃描實(shí)驗(yàn)是由m/z500-1500掃描四倍器1，時(shí)間4秒。數(shù)據(jù)采集使用Alpha DEC工作站，并利用Finnigan MAT(BIOWORKS)提供的軟件包進(jìn)行處理。
6.6.2氨基酸分析氨基酸分析采用ABI(Applied Biosystems)420氨基酸分析儀。該系統(tǒng)包括三個(gè)組件水解和衍生化裝置、反相HPLC以及數(shù)據(jù)系統(tǒng)。將肽樣品上樣在多孔載玻片上(分成三份涂三次)，然后在氣相條件下水解(155℃,90分鐘)。去除HCL后，利用PITC(苯異硫氰酸鹽)將所得氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)镻TC-AA(苯氨基硫?；?氨基酸)。轉(zhuǎn)到進(jìn)樣環(huán)管后，在溫控條件下利用梯度方式(溶劑A:50mmol醋酸銨(NH4Ac)水溶液，pH5.4；溶劑B:32mmol醋酸鈉(NaOAc)水性乙腈溶液)將所得混合物在Aquapore C18柱上分離。利用由Applied Biosystems提供的軟件包處理HPLC數(shù)據(jù)。以Applied Biosystems提供的標(biāo)準(zhǔn)肽作為參比進(jìn)行量化。
6.7分支網(wǎng)絡(luò)的合成按照Demoor et al.,1996,Eur.J.Biochem.239:74-84所述方法合成四聚核心肽酰樹(shù)脂和三聚核心肽酰樹(shù)脂。然后如前文所述將仍與4-甲基二苯甲基胺樹(shù)脂相連的四聚和三聚核心基質(zhì)作為最初的肽酰樹(shù)脂用于核心肽的自動(dòng)合成。包含由不同氨基酸組成的螺旋段的分支網(wǎng)絡(luò)可利用該領(lǐng)域熟知的正交合成和保護(hù)策略加以合成。
7．ApoA-Ⅰ肽的結(jié)構(gòu)分析和與脂類(lèi)結(jié)合的分析按上文第6節(jié)所述方法合成的純化肽的結(jié)構(gòu)特性和與脂類(lèi)結(jié)合的特性可利用圓二色(CD)、熒光光譜和核磁共振(NMR)方法加以測(cè)定。
7.1圓二色該實(shí)施例敘述一種用于本發(fā)明所述核心肽在緩沖液中游離狀態(tài)下和在脂類(lèi)參與情況下的螺旋度測(cè)定的優(yōu)選方法。
7.1.1實(shí)驗(yàn)方法利用配備了熱電吸收池架和樣品轉(zhuǎn)換器的AVIV62DS光度計(jì)(AVIVAssociates,Lakewood,NJ,USA)記錄190-260nm(以0.5nm或0.2nm的增量)的遠(yuǎn)紫外圓二色譜。儀器校準(zhǔn)采用(+)-10-樟腦酸。每個(gè)樣品分別利用10cm、5cm、1cm和0.1cm光徑的Suprasil石英杯各掃描1-3次，肽濃度為10-7-10-4M。帶寬固定為1.5nm，每次波長(zhǎng)掃描步驟的掃描速率固定為1秒。所得數(shù)據(jù)至少為2或3次獨(dú)立測(cè)量的平均值。
將減去背景值后的光譜轉(zhuǎn)換為每殘基的克分子橢圓率(θ)，單位是deg·cm-2·dmol-1。利用氨基酸分析法測(cè)定肽的濃度，如果肽包含有發(fā)色團(tuán)(色氨酸、丹磺?；?、萘基丙氨酸)，則還在Perkin ElmerLambda 17紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)上進(jìn)行吸收光譜測(cè)定以確定肽的濃度。
測(cè)定非結(jié)合游離肽(以5μM濃度溶于5mM磷酸緩沖液，pH7.4)；肽-SUV復(fù)合物(EPC∶Chol.比率為20∶1,Ri=30以及Ri=50)；肽-微膠粒復(fù)合物(1-肉豆蔻酰-2-羥基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿，Ri=100)；以及在2,2,2-三氟乙醇(TFE)參與情況下非結(jié)合游離肽(5μM肽，90％體積的TFE)的CD譜。
SUVs是通過(guò)將脂(10mM,EPC∶Chol.比率為20∶1,Avanti PolarLipids,AL)分散于磷酸緩沖液(5mM,pH7.4),N2通氣5分鐘，然后在水浴超聲儀中超聲(1.5小時(shí))而獲得。利用FPLC檢驗(yàn)制備物的均一性。
微膠粒是通過(guò)將脂(6mM的1-肉豆蔻酰-2-羥基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿，Avanti Polar Lipids,AL)分散于磷酸緩沖液(5mM,pH7.4),N2通氣5分鐘，然后旋轉(zhuǎn)混勻而獲得。
將SUVs以30或50的磷脂-肽摩爾比率(Ri)加入肽溶液(以5μM的濃度溶于5mM磷酸緩沖液，pH7.4)獲得肽-SUV復(fù)合物。
將微膠粒以100的Ri加入肽溶液(以μM的濃度溶于5mM磷酸緩沖液，pH7.4)獲得肽-微膠粒復(fù)合物。
所有光譜值均在37℃下記錄。
7.1.2螺旋度測(cè)定肽在不同條件下的螺旋度由222nm下的殘基平均橢圓率確定，或利用CD-1軟件包2DP版(1982年八月)的CONTIN曲線擬合算法系統(tǒng)(Provencher,1982,Comput.Phys.Commun.27:213-227,229-242)將所得CD譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中可獲得的參考譜(16個(gè)螺旋參考譜來(lái)自Provencher & Glockner,1981,Biochemistry 20:33-37；變性蛋白參考譜來(lái)自Venyaminov et al.,1993,Anal.Biochem.214:17-24)相比較而確定。利用由CONTIN算法系統(tǒng)提供的統(tǒng)計(jì)分析方法確定可接受的擬合結(jié)果。所有方法的螺旋度誤差為±5％。
第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)在緩沖液中濃度為5μM時(shí)所包含的α-螺旋含量非常高(86％的螺旋度)。第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)的螺旋度在SUVs(100％的螺旋度)和微膠粒(100％)參與情況下均有所增加，在TFE，一種由于其介電常數(shù)(ε=26.7)顯著低于水(ε=78.4)從而在5-90％(v/v)的濃度范圍內(nèi)可穩(wěn)定α-螺旋及肽內(nèi)氫鍵的溶劑，參與情況下同樣有所增加(95％的螺旋度)。
參照下文第8.3節(jié)表Ⅹ可看出，那些具有高LCAT激活活性(≥38％)的肽在脂類(lèi)參與情況下通常都具有顯著的α-螺旋結(jié)構(gòu)(在包含22個(gè)或更多氨基酸殘基的未封閉肽情況下或包含18個(gè)或更少氨基酸殘基的封閉肽情況下的螺旋結(jié)構(gòu)≥60％，在包含18個(gè)或更少氨基酸殘基的未封閉肽情況下的螺旋結(jié)構(gòu)≥40％)，而具有較低LCAT激活活性或無(wú)此活性的肽則具有極少的α-螺旋結(jié)構(gòu)。但在某些實(shí)例中，在脂類(lèi)參與情況下包含有顯著螺旋結(jié)構(gòu)的肽卻不顯示出明顯的LCAT激活活性。因此，一般認(rèn)為本發(fā)明所述核心肽可在脂類(lèi)參與情況下采取α-螺旋結(jié)構(gòu)的能力是本發(fā)明所述核心肽的關(guān)鍵特征，因?yàn)樵谥?lèi)參與情況下可形成α-螺旋的能力似乎是LCAT激活活性的先決條件。
7.2熒光光譜在肽中含有色氨酸(Trp或W)或萘基丙氨酸(Nal)的情況下，則利用標(biāo)記的肽以熒光測(cè)量法測(cè)定上文第6節(jié)中合成的肽與脂類(lèi)結(jié)合的性質(zhì)。熒光譜的記錄采用Spex(Jobin-Yvon)的Fluoromax熒光儀，該熒光儀配備了150W氙燈、兩個(gè)單色器(激發(fā)和發(fā)射)、一個(gè)直到850nm紅區(qū)都可感光的探測(cè)用R-928光電倍增管以及可磁力攪拌的熱電吸收池架。微摩爾級(jí)濃度的測(cè)量采用Suprasil石英比色杯。利用狹縫調(diào)節(jié)(0.4-5nm)裝置可根據(jù)所測(cè)肽的濃度調(diào)整入射光強(qiáng)度和發(fā)射光強(qiáng)度。所得值一般為2-4次光譜值的平均值。利用Trp吸收譜帶(Tris緩沖液中的ε280nm=5,550M-1cm-1)或Nal吸收譜帶(甲醇中的ε224nm=92,770M-1cm-1)在Philips PU 8800上進(jìn)行吸收光譜測(cè)定以確定肽的濃度。
在有脂類(lèi)參與和無(wú)脂類(lèi)參與情況下記錄肽在Tris-HCl緩沖液(20mM,pH=7.5)中的290-450nm熒光譜。用緩沖液將凍干磷脂再水化并分散，然后在N2氣流下進(jìn)行尖端超聲(tip sonification)處理以形成單層小泡。所用脂類(lèi)為Egg PC/Chol.(20∶1)或POPC/Chol.(20∶1)。在37℃溫度及2μM肽濃度條件下記錄光譜。含有Trp情況下的熒光參比標(biāo)準(zhǔn)為N-乙酰色氨酰胺(NATA)。
通過(guò)將脂類(lèi)載體逐步加入2μM肽溶液來(lái)進(jìn)行脂類(lèi)結(jié)合研究(激發(fā)狹縫5nm，發(fā)射狹縫1.5nm)。確定熒光密度時(shí)考慮到稀釋效應(yīng)。脂的濃度為10-600μM不等，脂肽摩爾比率(Ri)為5-300不等。Trp和Nal的激發(fā)波長(zhǎng)均設(shè)為280nm。
7.2.1熒光光譜分析直接記錄數(shù)據(jù)，并利用來(lái)自Apex的DM3000F軟件通過(guò)與熒光分光儀相連的IBM-PC進(jìn)行處理。減去溶劑所造成的影響以對(duì)光譜加以修正，考慮到光電倍增管相對(duì)于不同波長(zhǎng)的反應(yīng)會(huì)發(fā)生變化，因此還運(yùn)用設(shè)計(jì)者提供的系數(shù)對(duì)光譜加以修正。
肽產(chǎn)生最大發(fā)射熒光時(shí)的波長(zhǎng)以及在色氨酸標(biāo)記肽情況下相對(duì)于NATA的量子產(chǎn)率是其熒光光譜的特征所在。通過(guò)計(jì)算最大熒光發(fā)射時(shí)的波長(zhǎng)(λmax)位移以及相對(duì)發(fā)射熒光強(qiáng)度與脂類(lèi)濃度比的位移進(jìn)行來(lái)分析與脂類(lèi)結(jié)合的過(guò)程。相對(duì)熒光強(qiáng)度的定義為下式比值(I-I0)λmax/I0λmax。I與I0均在(λmax)下測(cè)量，相當(dāng)于肽的最初游離狀態(tài)，即沒(méi)有脂類(lèi)的狀態(tài)。I為規(guī)定脂肽比率下的強(qiáng)度，I0為沒(méi)有脂類(lèi)時(shí)以相同參數(shù)測(cè)量的強(qiáng)度。這些變量不發(fā)生變化則相當(dāng)于肽與脂之間沒(méi)有相互作用。
7.2.2結(jié)果和討論一級(jí)序列除第10位為W(Trp)殘基外其余均與第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)相同的第149號(hào)肽(PVLELFENLWERLLDALQKKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)149)的脂類(lèi)結(jié)合特性顯示于表Ⅶ。
表Ⅶ熒光測(cè)量的第149號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)149)與脂類(lèi)小泡的結(jié)合特性
當(dāng)在緩沖液中濃度為2μM時(shí)，第149號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)149)的色氨酸最大熒光發(fā)射峰位于347nm。這與NATA(λmax=350nm)相似，相當(dāng)于色氨酸相對(duì)暴露于水性環(huán)境。Trp的埋入(Trp最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)從347nm變?yōu)?25nm)以及熒光強(qiáng)度的大幅度提高(見(jiàn)表Ⅶ)均表明第149號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)149)能夠與EPC/Chol(20∶1)單層小泡有效地結(jié)合。脂與肽的摩爾比約為30時(shí)的色氨酸殘基埋入程度達(dá)到最高。
由上文第7.1節(jié)所示圓二色法測(cè)量的其它在脂類(lèi)參與情況下可顯示高螺旋度(包含的氨基酸數(shù)≥22的未封閉肽或包含的氨基酸數(shù)≤18的封閉肽的情況下為≥60％，在包含的氨基酸數(shù)≤18的未封閉肽的情況下為≥40％)的肽同樣能夠顯示出良好的脂類(lèi)結(jié)合能力。當(dāng)然，在利用圓二色法篩選出的所有肽中，只有能夠繼而進(jìn)行熒光檢測(cè)的肽才對(duì)其脂類(lèi)結(jié)合特性加以測(cè)試。
7.3核磁共振(NMR)該實(shí)施例敘述用于本發(fā)明所述核心肽結(jié)構(gòu)分析的NMR方法。
7.3.1 NMR樣品制備樣品的制備是將5mg肽溶解于含有痕量作為化學(xué)位移內(nèi)標(biāo)的2,2-二甲基-2-硅雜-5-戊磺酸鹽(DSS)的90％H2O/10％D2O中。一些樣品中含有三氟乙醇(TFE)(以體積百分?jǐn)?shù)表示)。樣品總體積為500μl，肽濃度約為5mM。
7.3.2 NMR光譜學(xué)1H的NMR譜是利用配備了B-VT2000溫控部件的Bruker DRX500頻譜儀在500MHz頻率下測(cè)得。利用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列對(duì)一維和二維實(shí)驗(yàn)進(jìn)行記錄(Two Dimensional NMR Spectroscopy,Eds.W.R.Croasmunand RMK Carlson,1994,VCH Publishers,New York,USA)。通過(guò)2秒的低功率預(yù)磁飽和實(shí)現(xiàn)水抑制。在相敏方式下利用隨時(shí)間的相增量(TPPI)以及二維譜寬均為6000Hz的條件進(jìn)行二維實(shí)驗(yàn)。通常對(duì)400個(gè)t1增量聯(lián)合進(jìn)行40次掃描，獲得2048個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。利用FELIX95軟件(Molecular Simulations)在INDIGO2工作站(Silicon Graph-ics)上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。將數(shù)據(jù)進(jìn)行零點(diǎn)填充以給出2K×2K的數(shù)據(jù)矩陣，并通過(guò)正弦-錐函數(shù)的平方和45°變換進(jìn)行變跡。
7.3.3 NMR排布按文獻(xiàn)所述(Wüthrich,NMR of Proteins and Nucleic Acids,1986,John Wiley & Sons,New York,USA)利用DQFCOSY譜、TOCSY譜和NOESY譜通過(guò)順序排布技術(shù)獲得完整的質(zhì)子共振排布圖。將相應(yīng)實(shí)驗(yàn)值減去無(wú)規(guī)線圈的化學(xué)位移列表值計(jì)算出HN和Hα質(zhì)子的次級(jí)化學(xué)位移(Wishart and Sykes,1994,Method.Enz.239:363-392)。
7.3.4結(jié)果和討論一般注意事項(xiàng)兩親性螺旋肽水溶液在NMR光譜測(cè)定所需的高濃度下會(huì)傾向于聚集，使得難以獲得高分辨率光譜。例如，典型的第4號(hào)核心肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)4)水溶液的NMR譜即顯示出很寬的譜線。從而不能分辨每個(gè)氨基酸殘基的共振。樣品中加入TFE可提高光譜的分辨率。已知TFE可溶解肽，此外還能夠穩(wěn)定具有形成螺旋傾向的肽的螺旋構(gòu)象。以第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)作為代表性實(shí)例對(duì)NMR光譜測(cè)定結(jié)果進(jìn)行論證。并將Segrest的共有22聚體(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)作為參比加以研究。
次級(jí)化學(xué)位移氨基酸的質(zhì)子化學(xué)位移取決于殘基的類(lèi)型以及肽或蛋白內(nèi)部的局部二級(jí)結(jié)構(gòu)(Szlagyi,1995,Progress in NuclearMagnetic Resonance Spectroscopy 27:325-443)。因此，規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定可通過(guò)將實(shí)驗(yàn)所得位移結(jié)果與無(wú)規(guī)線圈構(gòu)象的列表值加以比較而實(shí)現(xiàn)。
α-螺旋的形成通常會(huì)導(dǎo)致Hα共振向高磁場(chǎng)區(qū)域(負(fù)值)位移。若可觀測(cè)到某些連續(xù)殘基在高磁場(chǎng)區(qū)域的Hα位移，則通?？勺鳛槁菪Y(jié)構(gòu)的證據(jù)。溶于25％TFE的第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)在295K下的Hα次級(jí)位移結(jié)果顯示，第4-19位殘基明顯向負(fù)值轉(zhuǎn)移(圖8A)，說(shuō)明其具有高度螺旋的構(gòu)象。
相對(duì)于無(wú)規(guī)線圈的化學(xué)位移，α-螺旋區(qū)域內(nèi)氨基酸殘基的酰胺氫原子的化學(xué)位移同樣向高磁場(chǎng)區(qū)域轉(zhuǎn)移。此外，還觀測(cè)到HN位移的周期性，這反映了螺旋圈的周期性。位移沿序列的變化幅度與螺旋肽的兩親性度有關(guān)。疏水力矩越大，導(dǎo)致擺動(dòng)越明顯(Zhou et al.,1992,J.Am.Chem.Soc.114:4320-4326)。溶于25％ TFE的第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)在295K下的HN次級(jí)位移顯示出擺動(dòng)狀態(tài)，這與螺旋的兩親性質(zhì)相符合(圖8B)。
這種氨基酸替代可導(dǎo)致沿整個(gè)序列的周期性更加顯著(圖8B)。該模式明顯反映出第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)具有比Segrest的共有22聚體(序列標(biāo)識(shí)號(hào)75)更強(qiáng)的兩親性性質(zhì)。參照?qǐng)D8C，其中的疏水性殘基用加陰影的圓圈表示而親水性殘基用空心圓圈表示，可看出，理想化α-螺旋上的氨基酸分布位置與第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)的酰胺質(zhì)子次級(jí)化學(xué)位移相吻合。為明確表示，可將各實(shí)驗(yàn)值用平滑線連接起來(lái)。從而可論述螺旋結(jié)構(gòu)的NMR位移圖以及5-6個(gè)螺旋圈的存在。
酰胺質(zhì)子一圈螺旋之隔的羰基氧間形成的氫鍵長(zhǎng)度可影響其次級(jí)位移。因此，化學(xué)位移觀測(cè)值的周期性反映了不同的氫鍵長(zhǎng)度。這種差異與螺旋骨架的總體螺旋彎曲形狀有關(guān)，疏水性殘基位于內(nèi)弧側(cè)。第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)的次級(jí)位移預(yù)示著一種彎曲的α-螺旋構(gòu)象。
8．實(shí)施例LCAT激活活性測(cè)試將按照上文第6節(jié)所述合成的肽進(jìn)行其激活LCAT能力的體外分析。在LCAT測(cè)試中，將含有卵磷脂酰膽堿(EPC)或1-棕櫚酰-2-油基-磷脂酰-膽堿(POPC)以及放射性標(biāo)記的膽固醇的基質(zhì)囊(單層小泡或“SUVs”)與相同質(zhì)量的肽或ApoA-Ⅰ(從人類(lèi)血漿中分離)預(yù)保溫。加入LCAT(從人類(lèi)血漿中純化)開(kāi)始反應(yīng)。用作陽(yáng)性對(duì)照的天然ApoA-Ⅰ代表100％的激活活性。肽的“比活”(即，活性單位(LCAT激活活性)/質(zhì)量單位)可由達(dá)到最大LCAT激活活性時(shí)的肽濃度來(lái)加以計(jì)算。例如，可測(cè)試肽的一系列濃度(如，有限稀釋)以確定其“比活”--在測(cè)試中特定時(shí)點(diǎn)(如，1小時(shí))達(dá)到最大LCAT激活活性(即，膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯的百分?jǐn)?shù))時(shí)的濃度。將，例如1小時(shí)后的，膽固醇轉(zhuǎn)化百分?jǐn)?shù)對(duì)所用肽濃度作圖，即可以由所繪制曲線平穩(wěn)段時(shí)的肽濃度來(lái)確定其“比活”。
8.1基質(zhì)囊的制備LCAT測(cè)試所使用的囊為SUVs，其中含有摩爾比為20∶1的卵磷脂酰膽堿(EPC)或1-棕櫚酰-2-油基-磷脂酰膽堿(POPC)和膽固醇。要制備足夠40次測(cè)試使用的載體貯液，可將7.7mg EPC(或7.6mgPOPC；10μmol)、78μg(0.2μmol)4-14C-膽固醇、116μg膽固醇(0.3μmol)溶解于5ml二甲苯并凍干。此后，可利用4ml測(cè)試緩沖液溶解干粉，并于4℃及氮?dú)猸h(huán)境中超聲。超聲條件Branson 250超聲儀，10mm探頭，6×5分鐘；測(cè)試緩沖液10mM Tris,0.14M NaCl,1mM EDTA,pH7.4。將超聲混合物在14,000rpm(16,000×g)下離心6次，每次5分鐘，以去除鈦顆粒。所得澄清溶液即可用于酶的測(cè)試。
8.2 LCAT純化對(duì)LCAT純化而言，可利用葡聚糖硫酸鎂處理人類(lèi)血漿以獲得脂蛋白缺乏血清(LPDS)，然后將其依次在Phenylsepharose、Affigelblue、ConcanavalinA瓊脂糖凝膠以及抗-ApoA-Ⅰ親和層析柱上進(jìn)行層析，代表性純化方法總結(jié)于下表Ⅸ
表ⅣLCAT純化
8.2．1LPDS的制備要制備LPDS，可在500ml血漿中加入50ml葡聚糖硫酸酯(MW=500000)溶液。攪拌20分鐘。在3000rpm(16,000×g)及4℃條件下離心30分鐘。上清液用于進(jìn)一步純化(ca.500ml)。
8.2.2Phenylsepharose層析苯基瓊脂糖凝膠層析使用以下材料和條件。
固相Phenylsepharose fast flow,high subst.級(jí)，Pharmacia柱 XK26/40，膠床高度33cm,V=ca.175ml流速200ml/hr(樣品)清洗200ml/hr(緩沖液)洗脫80ml/hr(蒸餾水)緩沖液10mM Tris,140mM NaCl,1mM EDTA pH7.4,0.01％疊氮化鈉。
柱體用Tris-緩沖液平衡，將29g NaCl加入500ml LPDS中，過(guò)柱。用若干柱體積的Tris緩沖液清洗柱體，直至280nm波長(zhǎng)下的光吸近似達(dá)到基線值，然后開(kāi)始用蒸餾水洗脫。將含有蛋白的組分合并(合并體積180ml)，用于Affigelblue層析。
8.2.3 Affigelblue層析將Phenylsepharose層析后的合并液在4℃條件下對(duì)20mMTris-HCl,pH7.4,0.01％疊氮化鈉透析過(guò)夜。通過(guò)超濾(Amicon YM30)使合并體積減少至50-60ml，并上樣到Affigelblue柱上。
固相Affigelblue,Biorad,153-7301柱，XK26/20，膠床高度ca.13cm；柱體積約70ml。
流速上樣15ml/h清洗50ml/h柱體用Tris-緩沖液平衡，將Phenylsepharose層析后的合并液上柱。同時(shí)收集組分。Tris-緩沖液清洗，合并后的組分(170ml)用于ConA層析。
8.2.4ConA層析通過(guò)Amicon(YM30)使Affigelblue層析后的合并液體積減少至30-40ml，并在4℃條件下對(duì)起始緩沖液(1mM Tris HCl pH7.4；1mMMgCl2,1mM MnCl2,1mM CaCl2,0.01％疊氮化鈉)透析過(guò)夜。
固相ConA sepharose(Pharmacia)柱XK26/20，膠床高度14cm(75ml)流速上樣40ml/h清洗(用起始緩沖液)90ml/h洗脫50ml/h，甲基-α-D-甘露糖苷以0.2M濃度溶于1mM Tris,pH7.4。
收集甘露糖苷洗脫的蛋白組分(110ml)，并通過(guò)超濾(YM30)使體積減少至44ml，將ConA合并液分為2ml的等分試樣，保存于-20℃。
8.2.5抗-ApoA-Ⅰ親和層析利用已共價(jià)連接了抗-ApoA-Ⅰ抗體的Affigel-Hz填料(Biorad)進(jìn)行抗-ApoA-Ⅰ親和層析。
柱XK16/20,V=16ml。利用PBS pH7.4平衡柱，將2ml ConA合并液對(duì)PBS透析2小時(shí)，然后上柱。
流速上樣15ml/hour清洗(PBS)40ml/hour。
合并的蛋白組分(V=14ml)用于LCAT測(cè)試。
柱的再生使用0.1M檸檬酸鹽緩沖液洗脫結(jié)合的A-Ⅰ(200ml)，并在此步驟后立即用PBS再平衡。
8.3結(jié)果下文表Ⅹ給出LCAT激活活性測(cè)試的結(jié)果。
表Ⅹ典型核心肽的LCAT激活活性
1/Segrest′s共有22聚物肽(Anantharamaiah et al.,1990,Arteriosclerosis 10(1):95-105).
2/[A13]-共有22聚物肽(Anantharamaiah et al.,1990,Arteriosclerosis 10(1):95-105).
3/[R13]-共有22聚物肽 (Anantharamaiah et al.,1990,Arteriosclerosis 10(1):95-105).
4/ID-3 肽(Labeur et al.,1997,Arteriosclerosis,Thrombosis and Vascular Biology 17(3):580-588).
5/Ac-18AMOD-C(O)NH2肽(Epand et al.,1987,J.Biol.Chem.262(19):9389-9396).
6/Ac-18AM4-C(O)NH2肽(Brasseur,1993,Biochim.Biophys.Acta 1170:1-7).
7/18L肽(Segrest et al.,1990,Proteins:Structure,Function and Genetics 8:103-117).
8/18A肽(Anantharamaiah et al.,1985,J.Biol.Chem.260(18):10248-10255).
9/18AM4肽(Rosseneu et al.,WO93/25581；Corijn et al.,1993, Biochim.Biophys.Acta 1170:8-16).
10/[Glu3,8；Leu5,11,17]18A肽(Epand et al.,1987,J.Biol.Chem.262(19):9389-9396).
11/Ac-18AM3～C(O)NH2(Rosseneu et al.,WO93/25581).
12/Ac-18AM2-C(O)NH2(Rosseneu et al.,WO93/25581).
13/Ac-18AM1-C(O)NH2(Rosseneu et al.,WO93/25581).
表Ⅹ中的*指明N-端乙?；褻-端酰胺化的肽；？指明N-端丹磺?；碾模籹p指明在實(shí)驗(yàn)條件下溶解困難的肽；X為Aib；Z為Nal；O為Orn；He(％)代表螺旋度百分?jǐn)?shù)；mics代表微膠粒；而-指明缺失的氨基酸。
9．實(shí)施例ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的藥物動(dòng)力學(xué)以下實(shí)驗(yàn)可用來(lái)論證ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑在循環(huán)過(guò)程中呈穩(wěn)定狀態(tài)，并且與血漿中HDL成分相結(jié)合。
9.1．放射性標(biāo)記肽的合成將14C-標(biāo)記的氨基酸作為N-端氨基酸進(jìn)行結(jié)合可合成放射性標(biāo)記肽。合成的實(shí)現(xiàn)可根據(jù)Lapatsanis,Synthesis,1983,671-173。簡(jiǎn)要地說(shuō)，即把250μM未標(biāo)記的N-端氨基酸溶解于225μl的9％Na2CO3溶液中，然后加入到9.25MBq(250μM)14C-標(biāo)記的N-端氨基酸溶液(9％Na2CO3)中。將溶液冷卻至0℃，并與0.75ml含600μM(202mg)9-芴甲基-N-琥珀酰亞氨基碳酸酯(Fmoc-OSu)的DMF混合，室溫?fù)u晃4小時(shí)，然后用二乙醚(2×5ml)和氯仿(1×5ml)抽提混合物，剩余水相用30％HCl酸化，并用氯仿抽提(5×8ml)。有機(jī)相用Na2SO4干燥，過(guò)濾，在氮?dú)鈿饬髦袑Ⅲw積減少至5ml。并利用TLC(CHCl3∶MeOH∶Hac,9∶1∶0.1v/v/v，固定相HPTLC硅膠60,Merck,Germany)判斷純度。
肽的合成可直接采用含有14C-標(biāo)記Fmoc氨基酸的氯仿溶液。按第6節(jié)所述自動(dòng)合成包含第2-22位氨基酸的肽樹(shù)脂。利用Edman降解法測(cè)定肽的序列。耦合過(guò)程則按第6.1節(jié)所述進(jìn)行。
9.2在小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)每次實(shí)驗(yàn)均可將2.5mg/kg的放射性標(biāo)記肽以腹腔內(nèi)注射方式注入用普通鼠食或可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣化的Thomas-Harcroft改進(jìn)型食物(導(dǎo)致VLDL和IDL膽固醇的急劇上升)飼養(yǎng)的小鼠體內(nèi)。以多重時(shí)間間隔采集血樣用于血漿放射性評(píng)定。
9.3．在人類(lèi)血清中的穩(wěn)定性本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑在人類(lèi)血清中的穩(wěn)定性可按下文所述加以證明。
9.3.1實(shí)驗(yàn)方法將100μg的14C-標(biāo)記肽(按上文第9.1節(jié)所述制備)與2ml新鮮人血漿相混合(在37℃下)，并立即脫脂化(對(duì)照樣品)或于37℃保溫8天后脫脂化(測(cè)試樣品)。脫脂化的實(shí)現(xiàn)可通過(guò)加入等體積的2∶1(v/v)氯仿∶甲醇來(lái)抽提脂類(lèi)。
將樣品加載到反相C18 HPLC柱上，并利用線性梯度(25-58％，時(shí)間33分鐘)的乙腈(含0.1％TFA)洗脫。然后測(cè)量吸光度(220nm)和放射性以繪制洗脫曲線。
9.4．前-β樣顆粒的形成本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑形成前-β-樣顆粒的能力可按下文所述加以證明。
9.4.1．實(shí)驗(yàn)方法人類(lèi)HDL的分離可在密度d=1.21g/ml下進(jìn)行KBr密度梯度超速離心，收集頂部組分，并通過(guò)Superose 6的凝膠過(guò)濾層析而將HDL與其它脂蛋白分離開(kāi)來(lái)。根據(jù)由Bradford蛋白測(cè)試法測(cè)定的蛋白含量用生理鹽水將分離的HDL終濃度調(diào)至1.0mg/ml。從分離的HDL制劑中取出300μl試樣，并與100μl的14C-標(biāo)記肽在37℃下保溫2小時(shí)。分析5份獨(dú)立保溫的樣品，其中包括一份含100μl生理鹽水的空白樣品和4份14C-標(biāo)記肽的稀釋樣品(ⅰ)0.20μg/μl的肽∶HDL，比率=1∶15；(ⅱ)0.30μg/μl的肽∶HDL，比率=1∶10；(ⅲ)0.60μg/μl的肽∶HDL，比率=1∶5；以及(ⅳ)1.00μg/μl的肽∶HDL，比率=1∶3。在保溫2小時(shí)后，從樣品(總體積=400μl)中取200μl上樣到Superose 6凝膠過(guò)濾柱上進(jìn)行脂蛋白分離和分析，取100μl用于測(cè)定上樣到柱上的總放射性。
9.5．Apo-A-Ⅰ激動(dòng)劑與人類(lèi)脂蛋白的結(jié)合9.5.1．實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)將14C-標(biāo)記肽與各種類(lèi)型的脂蛋白(HDL、LDL和VLDL)以及不同類(lèi)型脂蛋白的混合物共同保溫的方法可測(cè)定ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑與人類(lèi)脂蛋白組分相結(jié)合的能力。
HDL、LDL和VLDL的分離可在d-1.21g/ml下進(jìn)行KBr密度梯度超速離心，并通過(guò)Superose 6B分子篩柱的FPLC而得以實(shí)現(xiàn)(層析的實(shí)現(xiàn)條件是流速為0.7ml/min，流動(dòng)緩沖液為10mM Tris(pH8)，115mM NaCl,2mM EDTA和0.01％NaN3)。將14C-標(biāo)記肽與HDL、LDL和VLDL以1∶5的肽∶脂比率(質(zhì)量比)于37℃共保溫2小時(shí)。將所需量的脂蛋白(體積取決于要能夠滿足1000μg的所需量)與0.2ml肽貯液(1mg/ml)混合，并用0.9％的NaCl定容至2.2ml。
于37℃保溫2小時(shí)后，取樣(0.1ml)用于液體閃爍計(jì)數(shù)以確定總放射性，用KBr將剩余的保溫混合物的密度調(diào)至1.21g/ml，并利用Beckman桌面超速離心機(jī)及TLA 100.3轉(zhuǎn)頭將樣品于100,000rpm(300,000g)和4℃條件下離心24小時(shí)。從所得各上清液的頂部每次吸取0.3ml試樣，共吸取5份，每份組分取0.05ml用于液體閃爍計(jì)數(shù)。前兩份中包含漂浮的脂蛋白，其余組分(3-5)則相當(dāng)于溶液中的蛋白/肽。
9.6．本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可選擇性結(jié)合在人類(lèi)血漿中的HDL脂類(lèi)9.6.1．實(shí)驗(yàn)方法要證明本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑與人類(lèi)血漿中HDL蛋白的選擇性結(jié)合，可將人類(lèi)血漿(2ml)與20、40、60、80和100μg的14C-標(biāo)記肽在37℃條件下保溫2小時(shí)。將其密度調(diào)整至1.21g/ml，并用TLA100.3轉(zhuǎn)頭在100,000rpm(300,000g)及4℃條件下離心36小時(shí)以分離脂蛋白。從頂部取900μl(每份300μl)用于分析。從300μl的組分中各取50μl進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)，各取200μl進(jìn)行FPLC分析(Superose 6/Superose 12柱聯(lián)合使用)。
10．實(shí)施例ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑可促進(jìn)膽固醇外流要證明本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑對(duì)膽固醇外流的促進(jìn)作用，可將HepG2肝癌細(xì)胞鋪于6孔培養(yǎng)皿上并生長(zhǎng)至相互匯合。通過(guò)膽固醇干燥使3H-膽固醇標(biāo)記細(xì)胞，然后在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中加入1％的牛血清白蛋白(BSA)，將溶液超聲，再將細(xì)胞加入0.2ml的該標(biāo)記液和1.8ml的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，使每孔的放射性達(dá)到2μCi。細(xì)胞在標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。
以1∶2的肽(或蛋白)∶DMPC比率(w∶w)制備肽(或蛋白)∶DMPC復(fù)合物。要制備該復(fù)合物，可將肽或天然人類(lèi)ApoA-Ⅰ蛋白加入溶于PBS的DMPC溶液并在室溫下保溫過(guò)夜，以使溶液澄清。終溶液中的肽或蛋白濃度約為1mg/ml。
從標(biāo)記培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，并用PBS清洗，然后加入復(fù)合物。每孔加1.6ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基，然后加入肽(或蛋白)∶DMPC復(fù)合物，并加入足夠的PBS使每孔的終體積為2ml。肽或ApoA-Ⅰ的終濃度約為1、2.5、5、7.5和25μg/ml培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24小時(shí)，然后去除培養(yǎng)基，并用2ml 1％的BSA/PBS清洗細(xì)胞，再用PBS清洗2次，每次2ml。通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定培養(yǎng)基中的3H-膽固醇外流。
11．實(shí)施例ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑在動(dòng)物模型系統(tǒng)中的使用利用兔子來(lái)論證本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的療效。結(jié)果表明，ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的給藥可提高血清中HDL-樣顆粒的濃度。
11.1．磷脂/肽復(fù)合物的制備包含磷脂(DPPC)和第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)的盤(pán)狀微粒的制備采用膽酸鹽透析法。將磷脂溶于氯仿并在氮?dú)鈿饬飨赂稍?。肽?-2mg/ml的濃度溶于緩沖液(生理鹽水)。將脂膜重溶于含膽酸鹽的緩沖液(43℃)并以3∶1的磷脂/肽比率加入肽溶液?；旌衔镉?3℃保溫過(guò)夜，然后分別在43℃(24小時(shí))、室溫(24小時(shí))和4℃(24小時(shí))下透析，其間改變溫度時(shí)需更換緩沖液，共換三次。將復(fù)合物過(guò)濾消毒(0.22μ)以用于注射或4℃保存。
11.2．肽/磷脂顆粒的分離及特征鑒定利用凝膠過(guò)濾柱(Superose 6HR)分離顆粒。通過(guò)測(cè)量每個(gè)組分中磷脂的濃度來(lái)確定包含該顆粒的峰位。由洗脫體積可確定Stokes半徑。通過(guò)16小時(shí)酸解后測(cè)量苯基丙氨酸含量(利用HPLC)的方法來(lái)確定復(fù)合物中肽的濃度。
11.3．注射兔子用一服磷脂/肽復(fù)合物(8mg/kg體重的第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)或10mg/kg體重的ApoA-Ⅰ，以肽或蛋白的量來(lái)計(jì)算)以靜脈內(nèi)注射方式注射雄性新西蘭大白兔(2.5-3kg)，單次丸劑注射的體積不超過(guò)10-15ml。在操作前對(duì)兔子進(jìn)行輕微的鎮(zhèn)靜處理。在注射前以及注射后5、15、30、60、240和1440分鐘時(shí)采集血樣(采血時(shí)加EDTA)。測(cè)定每份樣品的血細(xì)胞比容。將樣品分裝，分析前保存于-20℃。
11.4．兔血清分析血脂。總血膽固醇、血漿甘油三酯以及血磷脂的測(cè)定是以酶法利用商品化的測(cè)試制劑按廠商提供的規(guī)程加以操作(BoehringerMammheim,Mannheim,Germany and Biomérieux,69280,Marcy-L’étoile,France)。
脂蛋白分布。通過(guò)在蔗糖密度梯度中的離心來(lái)確定血漿按其脂蛋白組分分離后各組分的血漿脂蛋白分布情況。收集各組分并以酶法對(duì)各組分的磷脂和膽固醇含量加以分別測(cè)定。
11.5．結(jié)果注射8mg/kg第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)(以肽/DPPC復(fù)合物形式)的兔子中脂蛋白隨時(shí)間的分布情況顯示于圖9。注射后5分鐘時(shí)可明顯觀測(cè)到HDL膽固醇組分(組分＞1.06mg/ml)中膽固醇的顯著增加，并持續(xù)約24小時(shí)。
經(jīng)密度梯度超速離心獲得的HDL組分合并后的膽固醇水平顯示于下表Ⅺ。HDL膽固醇最大的增加量(90％)出現(xiàn)在給藥后240分鐘。給藥后24小時(shí)時(shí)的增加量仍達(dá)到71.2％。
這些數(shù)據(jù)表明，第146號(hào)肽/DPPC復(fù)合物的給藥(8mg/kg)可快速而有效地引起外周膽固醇的動(dòng)員。
表Ⅺ8mg/kg第146號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)146)或10mg/kg天然ApoA-Ⅰ給藥后兔子中的HDL膽固醇情況
*在處理前動(dòng)物死亡12．實(shí)施例利用聯(lián)合凍干法制備肽-脂復(fù)合物以下規(guī)程用于肽-脂復(fù)合物的制備。
利用帶帽的1ml透明指管(Waters #WAT025054)將1mg第149號(hào)肽(PVLELFENLWERLLDALQKKLK；序列標(biāo)識(shí)號(hào)149)溶于250μl純度為HPLC級(jí)的甲醇(Perkin Elmer)中，室溫下以10分鐘周期不時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩以促進(jìn)肽的溶解。從100mg/ml的二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC；Avanti Polar Lipids,99％純度，產(chǎn)品編號(hào)#850355)貯液中吸取含有3mg DPPC的試樣加入上述混合物中。加入甲醇使混合液體積達(dá)400μl，并進(jìn)一步在室溫下以10分鐘周期不時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩。管中加入200μl二甲苯(Sigma-Aldrich 99％純度，HPLC級(jí))，并每10秒鐘旋轉(zhuǎn)振蕩一次。用規(guī)格為20的注射器針頭在管的頂部穿兩個(gè)小孔，再將其置液氮中冷凍15秒，然后在真空下透析過(guò)夜。向管中加入200ul 0.9％的NaCl溶液。振蕩20秒，此時(shí)管中溶液從外觀上為乳狀，然后將其置41℃水浴中保溫30分，41℃保溫幾分鐘后管中溶液即變?yōu)槌吻?即，從外觀上與水類(lèi)似)。
12.1．利用Superose 6凝膠過(guò)濾層析鑒定復(fù)合物的特性如上所述利用聯(lián)合凍干法制備含有第149號(hào)肽(序列標(biāo)識(shí)號(hào)149)的肽-磷脂復(fù)合物。按重量計(jì)算，該制劑中含有1mg肽和3mgs DPPC。將該復(fù)合物重構(gòu)于200μl 0.9％的NaCl，然后取20μl(含100μg第149號(hào)肽)上樣到Pharmacia Superose 6柱上，流動(dòng)相用0.9％ NaCl，流速0.5mls/minute。利用280nm波長(zhǎng)下的吸光度或光散射監(jiān)控層析過(guò)程。收集1ml組分。利用bioMerieux Phospholipides EnzymatiquePAP 150kit(#61491)并按廠商提供的說(shuō)明測(cè)試含20μl該組分的試樣中的磷脂含量。絕大多數(shù)的磷脂和紫外吸光度都被共同回收在少數(shù)幾份組分中，其峰位約為15.8ml，該洗脫體積相當(dāng)于Stokes半徑為87埃。
作為對(duì)照，利用與第149號(hào)肽復(fù)合物所用的相同的柱在相同條件下對(duì)人類(lèi)HDL2進(jìn)行層析分離。HDL2的制備如下將300ml凍結(jié)的人類(lèi)血漿(Mannheim Blutspendzentrale #1185190)解凍，用固體溴化鉀將其密度調(diào)至1.25，然后用Ti45轉(zhuǎn)頭(Beckman)在40,000RPM和20℃條件下離心45小時(shí)。收集浮層，并對(duì)蒸餾水透析，用固體溴化鉀將其密度調(diào)至1.07，然后在上述條件下再離心70小時(shí)。收集底層(在離心管底部以上1cm)，加入疊氮化鈉至0.01％，在進(jìn)行層析前于4℃保存4天。利用254nm波長(zhǎng)下的吸光度或光散射監(jiān)控柱洗出液。用一系列已知分子量和Stokes半徑的蛋白作為柱的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，以計(jì)算顆粒的Stokes半徑(Pharmacia Gel Filtration Calibration KitInstruction Manual,Pharmacia Laboratory Separation,Piscataway,NJ,Revised April 1985)。洗脫的HDL2的保留體積為14.8ml，相當(dāng)于Stokes半徑為108nm。
13．實(shí)施例抗體的制備要制備本發(fā)明所述ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑的抗體，可將肽與鑰孔血藍(lán)素(KLH；1mg肽用10mg KLH)結(jié)合。將KLH結(jié)合物(LMG)懸浮于Freund’s完全佐劑，并注射兔子，記為時(shí)間0,4周及5周后再兩次進(jìn)行0.25mg的促升注射。利用ELISA測(cè)定免疫前血樣和免疫六周后血樣對(duì)可靠抗原的抗體效價(jià)。
分別收集2只兔子的血液產(chǎn)品。專(zhuān)門(mén)與肽抗原作用的抗體的純化方法如下1．按廠商規(guī)程將游離肽連接到經(jīng)溴化氰活化的Sepharose 4B(Pharmacia)上。
2．利用含有不相關(guān)肽的柱和含有不相關(guān)的人類(lèi)和小鼠血清蛋白的柱預(yù)吸收抗血清。
3．使經(jīng)過(guò)預(yù)吸收的抗血清穿過(guò)含有相關(guān)肽的柱(見(jiàn)第1點(diǎn))。
4．用0.1M硼酸緩沖鹽溶液(pH8.2)清洗柱，結(jié)合抗體的洗脫是利用較小的pH梯度變化從pH4.0到pH3.0再到pH2.0(0.1M甘氨酸緩沖液)，最后用0.1M HCl洗柱。
5．洗脫液用過(guò)量硼酸鹽溶液中和，并超濾濃縮(Amicon,YM30)，然后對(duì)硼酸鹽溶液透析。
6．利用280nm波長(zhǎng)下的吸光度測(cè)量蛋白的濃度。
所得抗體的物種特異性已在ELISA直接結(jié)合測(cè)試中利用純化的人類(lèi)ApoA-Ⅰ或純化的小鼠ApoA-Ⅰ進(jìn)行了檢驗(yàn)。
本發(fā)明并非局限于打算用作本發(fā)明個(gè)別方面的個(gè)別例證的那些特定實(shí)施方案所規(guī)定的范圍之內(nèi)，從功能上等價(jià)的方法和成分亦處在本發(fā)明范圍內(nèi)。除文中已給出及已描述的之外，確實(shí)有許多變型對(duì)具有該領(lǐng)域技能的專(zhuān)家而言顯然源于前文的描述和附圖。這些變型將處于附加權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
從各方面而言，文中引用的所有參考資料都將作為引文被包括在內(nèi)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人Dasseux,Jean-LouisSekul,RenateButtner,KlausCornut,IsabelleMetz,Gunther(ⅱ)發(fā)明名稱(chēng) APOLIPOPROTEIN A-I AGONISTSAND THEIR USE TO TREAT DYSLIPIDEMIC DISORDERS(ⅲ)序列數(shù)254(ⅳ)通訊地址(A)住址Pennie & Edmonds LLP(B)街道1155 Avenue of the Americas(C)城市New York(D)州 NY(E)國(guó)家RY:USA(F)郵編10036-2811(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類(lèi)型盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件FastSEQ Version 2.0(ⅵ)現(xiàn)有申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朠CT/US98/20326(B)提交日28-SEP-1998(C)分類(lèi)(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/940,096(B)提交日29-SEP-1997(ⅷ)律師/代理人資料INFORMATION；(A)姓名Coruzzi,Laura A(B)登記號(hào)30,742(C)參考/案卷號(hào)9196-0005-228(ⅸ)電信資料(A)電話650-493-4935(B)傳真650-493-5556(C)電傳66141 PENNIE(2)SEQ ID NO:1資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置16(D)其他信息Xaa=Naphthylalanine(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:1:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Xaa1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:1資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:2:Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys Lys20(2)SEQ ID NO:3資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:3:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Trp1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:4資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:4:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:5資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置l(D)其他信息Xaa=D-Pro(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:5:Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys Lys20(2)SEQ ID NO:6資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:6:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:7資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:7:Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:8資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:8:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:9資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:9:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20
(2)SEQ ID NO:10資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置17(D)其他信息Xaa=Naphthylalanine(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:10:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Xaa Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:11資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:1l:Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:12資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:12:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Gly Lys Gln Lys Leu Lys20
(2)SEQ ID NO:13資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:13:Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:14資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置18(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa = Orn(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:14:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Xaa Gln Xaa Leu Xaa20(2)SEQ ID NO:15資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:15:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:16資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:16:Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:17資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:17:Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Sln Slu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:18資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:18:Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Lau Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:19資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa=D-Pro(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:19:Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:20資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:20:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:21資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:21:Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:22資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:22:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Gly1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:23資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:23:Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:24資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:24:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:25資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:25:Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:26資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:26:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:27資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa=Naphthylalanine(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:28資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:28:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:29資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:29:Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:30資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息N端丹磺酰肽(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:30:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:31資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:31:Pro Val Leu Asp Leu Phe Leu Glu Leu Leu Asn Glu xaa Leu Glu AlaLeu Lys Gln Lys Leu Lys(2)SEQ ID NO:32資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:32:Xaa Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:33資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:33:Pro Val Leu Asp Leu phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:34資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置5(D)其他信息Xaa=Naphthylalanine(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:34:Pro Val Leu Asp Xaa Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:35資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:35:Pro Val Leu Asp Trp Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:36資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:36:Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:37資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:37:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:38資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:38:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Trp Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:39資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:39:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala1 5 10 15Leu Lys Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:40資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:40:Pro Val Leu Asp Leu Phe Asn Glu Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2) SEQ ID NO:41資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:41:Pro Val Leu Asp Leu Trp Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:42資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:42:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Trp Glu Ala1 5 10 15Leu LVs Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:43資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:43:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lye Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:44資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1……22(D)其他信息所有遺傳編碼氨基酸為D型(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:44:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:45資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:45:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:46資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:46:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Sln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:47資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:47:Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala Leu1 5 10 15Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:48資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa=D-Pro(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置2(D)其他信息Xaa=D-Val(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:48:Xaa Xaa Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20
(2)SEQ ID NO:49資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:49:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Glu Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:50資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:50:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Trp Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lyg20(2)SEQ ID NO:51資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:51:Pro Val Leu Asp Leu Phe Trp Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:52資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:52:Pro Val Trp Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:53資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:53:Val Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:54資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:54:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Trp Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Cln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:55資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:55:Pro Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln1 5 10 15Lys Leu Lys(2)SEQ ID NO:56資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:56:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Lys Lys20(2) SEQ ID NO:57資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:57:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Ala1 5 10 15Leu Glu Gln Lys Leu Lys
20(2)SEQ ID NO:58資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:58:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu20(2)SEQ ID NO:59資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:59:Leu Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:60資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:60:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala15 10 15Leu Lys Gln(2)SEQ ID NO:61資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:61:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Trp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:62資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:62:Pro Val Leu Asp Glu Trp Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:63資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ)序列描述 SEQ ID NO:63:Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 1O 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:64資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:64:Pro Trp Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:65資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:65:Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu1 5 10 15Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:66資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:66:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Asn Leu Leu Glu Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:67資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:67:Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu1 5 10 15Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:68資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:68:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Lys Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:69資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:69:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Lys Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:70資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa = Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:70:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Tyr Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:68資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:71:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Xaa Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:72資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:72:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:73資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib
(ⅹⅰ) 序列描述ESCRIPTION:SEQ ID NO:73:Pro Val Leu Asp Glu Phe Trp Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:74資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:74:Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:75資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:75:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:76資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:76:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Phe Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:77資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:77:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Lys Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:78資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:78:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Asp Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala15 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:79資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:79:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn GluLeu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:80資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:80:Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:81資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:81:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:82資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:82:Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys1 5 10 15Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:83資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:83:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Trp Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:84資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:84:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:85資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:85:Pro Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu1 5 10 15Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:86資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:86:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Asp Glu Leu Leu Asn Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:87資料(ⅰ) 序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息所有氨基酸為D型(ⅹⅰ) 序列描述 SEQ ID NO:87:Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:88資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:88:Pro Val Leu Asp Lys Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:89資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ) 分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ) 特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa = Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:89:Pro Val Lau Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Trp Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys
20(2)SEQ ID NO:90資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置10(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:90:Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala Leu Lys Gln1 5 10 15Lys Leu Lys(2)SEQ ID NO:91資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:91:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:92資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ) 分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ) 特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:92:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Tyr Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:93資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置(D)其他信息Xaa = Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:93:Pro Val Leu ASp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Lys Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:94資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:94:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ala Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lye Leu Lys20(2)SEQ ID NO:95資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:95:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:96資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息所有遺傳編碼的氨基酸均為D型(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:96:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:97資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:97:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO:98資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:98:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:99資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:99:Lys Leu Lys Gln Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg1 5 10 15Phe Leu Asp Leu Val Pro20(2)SEQ ID NO:100資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息所有氨基酸均為D型
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:100:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Lau Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:101資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:101:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Trp Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:102資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:102:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Leu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Glu Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:103資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:103:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:104資料(ⅱ)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:104:Pro Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln Lys Leu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:105資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:105:Pro Ala Ala Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Glu Ala1 5 10 15Ala Lys Gln Lys Ala Lys20(2)SEQ ID NO:106資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:106:Pro Val Leu A6p Leu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Alu1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:107資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息所有氨基酸均為D型(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:107:Lys Leu Lys Gln Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg1 5 10 15Phe Leu Asp Leu Val Pro20(2)SEQ ID NO:108資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:108:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Trp Leu Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:109資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:109:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:110資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:110:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Xaa Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:111資料(ⅰ)序列特征:
(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:111:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Trp Glu Xaa Trp Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:112資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:112:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Ser Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Iys20(2)SEQ ID NO:113資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:113:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Pro Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:114資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ) 分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ) 特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:114:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Met Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:115資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:115:Pro Lys Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:116資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:116:Pro His Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lvs Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:117資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:117:Pro Glu Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:118資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:118:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Xaa Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Glu Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:119資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置13(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:119:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Xaa Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:120資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置16(D)其他信息Xaa=Aib(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:120:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Xaa1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:121資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:121:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Trp Gln Lys Leu Lys
20(2)SEQ ID NO122資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:122:Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Trp1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:123資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:123:Gln Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:124資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置18(D)其他信息Xaa = Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa=Orn
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa=Orn(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:124:Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Xaa Gln Xaa Leu Xaa20(2)SEQ ID NO:125資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:125:Asn Val Lsu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:126資料:
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:126:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Gly Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:127資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:127:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:126資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:128:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Phe1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:129資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:129:Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:130資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:130:Pro Val Leu Glu Leu Phe Asn Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Lau Lys
20(2)SEQ ID NO:131資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:131:Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Arg Gln Lys Leu LYs20(2)SEQ ID NO:132資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:132:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:133資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:133:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Gln Ala1 5 10 15Leu Asn Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:134資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:134:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Leu Lys Ala1 5 10 15Leu Asn Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:135資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:135:Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Alal 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:136資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:136:Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:137資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置17(D)其他信息Xaa=Naphthylalanine(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:137:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Xaa Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:138資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:138:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Trp1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:139資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:139:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:140資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置17(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息 Xaa=Orn(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:140:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Xaa Gln Xaa Leu Xaa20(2)SEQ ID NO:141資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:141:Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:142資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:142:Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:143資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息N-端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:143:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Gly Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Lys Gln Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:144資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Xaa=D-Pro(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:144:Xaa Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:145資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:145:Gly Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:146資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:146:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:147資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:147:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Phe Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:148資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:148:Pro Val Leu Glu Leu Pha Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:149資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:149:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Lau Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:150資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:150:Pro Leu Lau Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:151資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:151:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Gly Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:152資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:152:Pro Val Phe Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:153資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:153:Ala Val Leu Glu Leu Phe Glu Asr Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:154資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:154:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Gly Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:155資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:155:Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Trp Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:156資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:156:Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:157資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:157:Pro Val Leu Glu Phe phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:158資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:158:Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:159資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:159:Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:160資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:160:Pro Val Leu Glu Leu phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Trp1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:161資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:161:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:162資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:162:Pro Val Leu Glu Leu phe Glu Asn Trp Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:163資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:163:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Trp Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:164資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:164:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Trp Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:165資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:165:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Leu1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:166資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:166:Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:167:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Gly Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:168資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:168:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gln Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:169資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:169:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:170資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置12(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置19(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa=Orn(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:170:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Xaa Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Xaa Xaa Leu Xaa20(2)SEQ ID NO:171資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:17l:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Leu1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:172資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:172:Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Gly Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:173資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:173:Pro Val Leu Asp Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Leu1 5 10 15Leu Asn Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:174資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…22(D)其他信息所有氨基酸為D型(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:174:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:175資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:175:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Glu Leu1 5 10 15Leu Asn Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:176資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:176:Pro Val Leu Glu Leu Trp Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:177資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:177:Gly Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:178資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:178:Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Ays Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Arg20(2)SEQ ID NO:179資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:179:Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:180資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:180:Pro Val Leu Glu Leu Phe Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Arg20(2)SEQ ID NO:181資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:181:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Trp Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:182資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:182:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:183資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:183:Pro Leu Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:184資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:184:Pro Val Leu Glu Leu Phe Leu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Trp Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:185資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置19(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置20(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置22(D)其他信息Xaa=Orn(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:185:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Xaa Xaa Leu Xaa20(2)SEQ ID NO:186資料
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:186:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Gln Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:187資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:187:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Asn Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:188資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:188:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Asp Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:189資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:189:Asp Val Leu Glu Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Lys20(2)SEQ ID NO:190資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:190:Pro Val Leu Glu Phe Trp Asp Asn Leu Leu Asp Lys Leu Leu Asp Ala1 5 10 15Leu Gln Lys Lys Leu Arg20(2)SEQ ID NO:191資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:191:Pro Val Leu Asp Leu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:192資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:192:Pro Val Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:193資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:193Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:194資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:194Pro Val Leu Glu Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:195資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:195Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:196資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:196Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Asn Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:197資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:197Pro Leu Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:198資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:198Gly Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:199資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:199:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Trp Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:200資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:200:Asn Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:201資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:201:Pro Leu Leu Asp Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:202資料(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:202:Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gln Lys1 5 10 15Leu Arg(2)SEQ ID NO:203資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:203Ala Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:204資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18
(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:204Pro Val Leu Asp Phe Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:205資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:205:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Trp Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:206資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:206:Pro Leu Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys
(2)SEQ ID NO:207資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:207:Pro Val Leu Glu Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:208資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:208:Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Leu Arg Gln Arg1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:209資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:209:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:210資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:210:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:211資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置16(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置18(D)其他信息Xaa=Orn(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:211:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gln Xaa1 5 10 15Leu Xaa(2)SEQ ID NO:212資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置7(D)其他信息 Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置14(D)其他信息Xaa=Orn(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置16(D)其他信息Xaa=Orn(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:212Pro Val Leu Asp Leu Phe Xaa Glu Leu Leu Glu Glu Leu Xaa Gln Xaa1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:213資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18
(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:213:Pro Ala Leu Glu Leu Phe Lys Asp Leu Leu Glu Glu Phe Arg Gln Arg1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:214資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1(D)其他信息Pro為D型(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:214:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:215資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:215:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Trp Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:216資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:216:Pro Val Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:217資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:217:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Leu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:218資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:218:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:219資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:219:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Trp Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:220資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:220:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Gln Lys Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:221資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:221:Asp Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:222資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:222:Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO:223資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:223:Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Ala Gln Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO:224資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:224:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Trp Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys
(2)SEQ ID NO:225資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:225:Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Ala Glu Ala Leu Ala Gln Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO:226資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:226:Pro Val Leu Asp Ala Phe Arg Glu Leu Gly Glu Ala Leu Leu Gln Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO:227資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:227:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Gly Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys
(2)SEQ ID NO:228資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:228:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Gly Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:229資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:229:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Gly Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:230資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:230:Pro Val Leu Glu Leu Phe Glu Arg Leu Leu Glu Asp Leu Gln Lys Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:231資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:231:Pro Val Lsu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Glu Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:232資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:232:Pro Leu Leu Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15Leu Lys(2)SEQ ID NO:233資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)
(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:233:This sequence has been intentionally skipped(2)SEQ ID NO:234資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:234:This sequence has been intentionally skipped(2)SEQ ID NO:235資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:235:This sequence has been intentionally skipped(2)SEQ ID NO:236資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:236:This sequence has been intentionally skipped(2)SEQ ID NO:237資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:237:Leu Asp Asp Leu Leu Gln Lys Trp Ala Glu Ala Phe Asn Gln Leu Leu1 5 10 15Lys Lys(2)SEQ ID NO:238資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:238:Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO:239資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:239:Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe
(2)SEQ ID NO:240資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:240:Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe(2)SEQ ID NO:241資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:241:Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Phe(2)SEQ ID NO:242資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:242:Gly Ile Lys Lys Phe Leu Gly Ser Ile Trp Lys Phe Ile Lys Ala Phe1 5 10 15Val Gly
(2)SEQ ID NO:243資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:243:Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Ala Phe(2)SEQ ID NO:244資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:244:Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Ala Phe(2)SEQ ID NO:245資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:245:Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Phe Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Phe(2)SEQ ID NO:246資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:246:Glu Trp Leu Glu Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO:247資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:247:Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Phe Phe Glu Lys Phe Lys Glu1 5 10 15Phe Phe(2)SEQ ID NO:248資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:248:Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO:249資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征
(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:249:Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Glu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO:250資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:250:Glu Trp Leu Lys Ala Glu Tyr Glu Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe(2)SEQ ID NO:251資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度18氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…18(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:251:Glu Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Lys Lys Val Leu Glu Lys Leu Lys Glu1 5 10 15Leu Phe
(2)SEQ ID NO:252資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…15(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:252:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Gln Lys Leu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:253資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…16(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:253:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:254資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他
(B)位置1…16(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:254Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Lys Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:255資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…15(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:255:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:256資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…16(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:256:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Glu Ala Leu Lys Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:257資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…16(D)其他信息N端乙酰化且C端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:257Pro Val Leu Asp Leu Phe Glu Asn Leu Leu Glu Arg Leu Lys Gln Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:258資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類(lèi)型無(wú)(ⅸ)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞其他(B)位置1…16(D)其他信息N端乙?；褻端酰胺化(ⅹⅰ) 序列描述SEQ ID NO:258:Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Lys Gln Lys1 5 10 1權(quán)利要求
1．一種ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，包括(ⅰ)一種含15-29個(gè)殘基的肽或肽類(lèi)似物，該肽或肽類(lèi)似物在脂類(lèi)參與情況下可形成兩親性α-螺旋，并且包含結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)Z1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-Z2或其藥學(xué)上容許的鹽，其中X1為Pro(P)、Ala(A)、Gly(G)、Gln(Q)、Asn(N)、Asp(D)或D-Pro(p)；X2為一種脂肪族氨基酸；X3為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X4為Glu(E)；X5為一種脂肪族氨基酸；X6為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X7為Glu(E)或Leu(L)；X8為Asn(N)或Gln(Q)；X9為L(zhǎng)eu(L)；X10為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)或Gly(G)；X11為一種酸性氨基酸；X12為Arg(R)；X13為L(zhǎng)eu(L)或Gly(G)；X14為L(zhǎng)eu(L)、Phe(F)或Gly(G)；X15為Asp(D)；X16為Ala(A)；X17為L(zhǎng)eu(L)；X18為Asn(N)或Gln(Q)；X19為一種堿性氨基酸；X20為一種堿性氨基酸；X21為L(zhǎng)eu(L)；X22為一種堿性氨基酸。X23可不存在或?yàn)橐环N堿性殘基；Z1為H2N-或RC(O)NH-；Z2為-C(O)NRR、-C(O)OR或-C(O)OH或其鹽；每個(gè)R各自獨(dú)立地為-H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基、(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、5-20元雜芳基或6-26元烷雜芳基或一種含1-7個(gè)殘基的肽或肽類(lèi)似物；殘基Xn間的每個(gè)“-”各自獨(dú)立地指一種酰胺鍵、取代的酰胺鍵、酰胺等排體或一種酰胺模擬物；或(ⅱ)結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的缺失形式，其中殘基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X16、X17、X18、X19、X20、X21和X22中至少有一個(gè)并且可多至8個(gè)殘基缺失；或(ⅱ)結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的變化形式，其中殘基X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22或X23中至少有一個(gè)殘基被另一種殘基保守地替代。
2．權(quán)利要求1的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑與人類(lèi)APoA-Ⅰ相比至少可顯示出約38％的LCAT-激活活性。
3．權(quán)利要求1的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的變化形式。
4．權(quán)利要求3的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的疏水性殘基為確定的，并且至少有一個(gè)非確定的殘基被另一種殘基保守地替代。
5．權(quán)利要求4的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中X1為Pro(P)、D-Pro(p)、Gly(G)、Asn(N)或Ala(A)；X2為Ala(A)、Leu(L)或Val(V)；X3為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X5為L(zhǎng)eu(L)；X6為Phe(F)；X9為L(zhǎng)eu(L)；X10為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)或Gly(G)；X12為L(zhǎng)eu(L)或Gly(G)；X14為L(zhǎng)eu(L)、Phe(F)或Gly(G)；X16為Ala(A)；X17為L(zhǎng)eu(L)；X21為L(zhǎng)eu(L)；并且X4、X7、X8、X11、X12、X15、X18、X19、X22和X23中至少有一個(gè)被另一種殘基保守地替代。
6．權(quán)利要求3的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中符合結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的親水性殘基是確定的，并且至少有一個(gè)非確定的殘基被另一種殘基保守地替代。
7．權(quán)利要求6的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中X4為Glu(E)；X7為Glu(E)；X8為Asn(N)或Gln(Q)；X11為Asp(D)或Glu(E)；X12為Arg(R)；X15為Asp(D)；X18為Asn(N)或Gln(Q)；X19為L(zhǎng)ys(K)；X20為L(zhǎng)ys(K)；X22為L(zhǎng)ys(K)；X23可不存在或?yàn)長(zhǎng)ys(K)；并且X1、X2、X3、X5、X6、X9、X10、X13、X14、X16、X17和X21中至少有一個(gè)被另一種殘基保守地替代。
8．權(quán)利要求6的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中X3為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F),X6為Phe(F),X9為L(zhǎng)eu(L),X10為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)或Gly(G)，并且X1、X2、X5、X13、X14、X16、X17和X21中至少有一個(gè)被另一種殘基保守地替代。
9．權(quán)利要求5或權(quán)利要求7的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中替代殘基與被替代殘基屬于同一亞類(lèi)。
10．權(quán)利要求1的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的缺失形式。
11．權(quán)利要求10的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中肽或肽類(lèi)似物的一個(gè)螺旋圈缺失。
12．權(quán)利要求1的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的含22-23個(gè)殘基的肽或肽類(lèi)似物。
13．權(quán)利要求12的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中殘基間的“-”指-C(O)NH-；Z1為H2N-；并且Z2為-C(O)OH或其鹽。
14．權(quán)利要求13的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中X1為Pro(P)、Ala(A)、Gly(G)、Asn(N)、Asp(D)、Gln(Q)或D-Pro(p)；X2為Ala(A)、Val(V)或Leu(L)；X3為L(zhǎng)eu(L)或Phe(F)；X4為Glu(E)；X5為L(zhǎng)eu(L)；X6為Phe(F)；X7為L(zhǎng)eu(L)或Glu(E)；X8為Asn(N)或Gln(Q)；X9為L(zhǎng)eu(L)；X10為L(zhǎng)eu(L)、Trp(W)或Gly(G)；X11為Glu(E)；X12為Arg(R)；X13為L(zhǎng)eu(L)或Gly(G)；X14為L(zhǎng)eu(L)、Phe(F)或Gly(G)；X15為Asp(D)；X16為Ala(A)；X17為L(zhǎng)eu(L)；X18為Asn(N)或Gln(Q)；X19為L(zhǎng)ys(K)；X20為L(zhǎng)ys(K)；X21為L(zhǎng)eu(L)；X22為L(zhǎng)ys(K)；并且X23可不存在或?yàn)長(zhǎng)ys(K)。
15．權(quán)利要求14的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中X23不存在。
16．權(quán)利要求14的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中X10、X13和X14各自為除Gly(G)以外的殘基。
17．權(quán)利要求14的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中X10、X13和X14中的一個(gè)為Gly(G)，其余為除Gly(G)以外的殘基。
18．權(quán)利要求l的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑選自以下組合(序列識(shí)別號(hào)144)pVLELFENLLERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)145)GVLELFENLLERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)146)PVLELFENLLERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)147)PVLELFENLLERLFDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)148)PVLELFENLLERLGDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)149)PVLELFENLWERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)150)PLLELFENLLERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)151)PVLELFENLGERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)152)PVFELFENLLERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)153)AVLELFENLLERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)154)PVLELFENLLERGLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)155)PVLELFLNLWERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)186)PVLELFEQLLERLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)187)PVLELFENLLERLLDALNKKLK；(序列識(shí)別號(hào)188)PVLELFENLLDRLLDALQKKLK；(序列識(shí)別號(hào)189)DVLELFENLLERLLDALQKKLK；和其N(xiāo)-端?；问胶?或C-端酰胺化或酯化形式。
19．一種多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑與人類(lèi)ApoA-Ⅰ相比至少可顯示出約38％的LCAT激活活性，并且具有結(jié)構(gòu)式(Ⅱ) 或其藥學(xué)上容許的鹽，其中每個(gè)m各自獨(dú)立地為0-1的整數(shù)；n為0-10的整數(shù)；每個(gè)“HH”各自獨(dú)立地為權(quán)利要求1的肽或肽類(lèi)似物；每個(gè)“LL”各自獨(dú)立地為一種雙功能銜接物；以及每個(gè)“-”各自獨(dú)立地指一種共價(jià)鍵。
20．一種多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑與人類(lèi)ApoA-Ⅰ相比至少可顯示出約38％的LCAT激活活性，并且具有結(jié)構(gòu)式(Ⅲ) 或其藥學(xué)上容許的鹽，其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為 每個(gè)HH各自獨(dú)立地為結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的核心肽或類(lèi)似物或其如文中所述的變異形式、截短缺失形式、內(nèi)部缺失形式或擴(kuò)展形式；每個(gè)LL各自獨(dú)立地為一種雙功能銜接物；每個(gè)m各自獨(dú)立地為0-1的整數(shù)；每個(gè)n各自獨(dú)立地為0-8的整數(shù)；Nya和Nyb各自獨(dú)立地為一種多功能連接部分，其中ya和yb分別代表Nya和Nyb上的功能基團(tuán)數(shù)；每個(gè)ya或yb各自獨(dú)立地為3-8的整數(shù)；p為0-7的整數(shù)；以及每個(gè)“-”各自獨(dú)立地指一種共價(jià)鍵。
21．一種多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，該激動(dòng)劑與人類(lèi)APoA-Ⅰ相比至少可顯示出約38％的LCAT激活活性，并且具有結(jié)構(gòu)式(Ⅳ)或結(jié)構(gòu)式(Ⅴ) 或其藥學(xué)上容許的鹽，其中每個(gè)X各自獨(dú)立地為 每個(gè)HH各自獨(dú)立地為權(quán)利要求1的肽或肽類(lèi)似物；每個(gè)LL各自獨(dú)立地為一種雙功能銜接物；每個(gè)n各自獨(dú)立地為0-1的整數(shù)；每個(gè)m各自獨(dú)立地為0-8的整數(shù)；R1為-OR或-NRR；以及每個(gè)R各自獨(dú)立地為-H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、(C1-C6)炔基；(C5-C20)芳基(C6-C26)烷芳基、5-20元雜芳基或6-26元烷雜芳基。
22．權(quán)利要求19、20或21的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中的雙功能銜接物為可裂解的。
23．權(quán)利要求19、20或21的ApoA-Ⅰ多聚體激動(dòng)劑，其中的n為0。
24．權(quán)利要求22的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中的m為0。
25．權(quán)利要求19、20或21的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中的每個(gè)HH各自獨(dú)立地為權(quán)利要求13的肽。
26．權(quán)利要求19、20或21的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中的每個(gè)HH各自獨(dú)立地為權(quán)利要求14的肽。
27．權(quán)利要求19、20或21的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，其中的每個(gè)HH各自獨(dú)立地為權(quán)利要求18的肽。
28．一種ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，該復(fù)合物包含一種ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑和一種脂類(lèi)，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求1的肽或肽類(lèi)似物、權(quán)利要求19的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑、權(quán)利要求20的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，或權(quán)利要求21的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑。
29．權(quán)利要求28的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求12的肽。
30．權(quán)利要求28的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求13的肽。
31．權(quán)利要求28的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求14的肽。
32．權(quán)利要求28的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求18的肽。
33．權(quán)利要求28的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，其中的脂類(lèi)為鞘磷脂。
34．權(quán)利要求28的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，該復(fù)合物為凍干粉末形式。
35．權(quán)利要求28的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物，該復(fù)合物為溶液形式。
36．一種藥用組合物，該組合物包含一種ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑和一種藥學(xué)上容許的載體、賦形劑或稀釋劑，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求1的肽或肽類(lèi)似物、權(quán)利要求19的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑、權(quán)利要求20的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑，或權(quán)利要求21的多聚體型ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑。
37．權(quán)利要求36的藥用組合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求12的肽。
38．權(quán)利要求36的藥用組合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求13的肽。
39．權(quán)利要求36的藥用組合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求14的肽。
40．權(quán)利要求36的藥用組合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為權(quán)利要求18的肽。
41．權(quán)利要求36、37、38、39或40的藥用組合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物形式，所述復(fù)合物包含ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑和一種脂類(lèi)。
42．權(quán)利要求41的藥用組合物，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物為凍干粉末形式。
43．一種對(duì)患有異常脂血相關(guān)癥病癥的受治療者進(jìn)行治療的方法，該方法包括將有效劑量的權(quán)利要求1的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑向受治療者給藥的步驟。
44．權(quán)利要求43的方法，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為藥用組合物形式，該組合物包含ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑和一種藥學(xué)上容許的載體、賦形劑或稀釋劑。
45．權(quán)利要求43的方法，其中的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑為ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑-脂類(lèi)復(fù)合物形式，該復(fù)合物包含ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑和一種脂類(lèi)。
46．權(quán)利要求43的方法，其中的異常脂血相關(guān)癥病癥為高膽固醇血癥。
47．權(quán)利要求43的方法，其中的異常脂血相關(guān)癥病癥為心血管疾病。
48．權(quán)利要求43的方法，其中的異常脂血相關(guān)癥病癥為動(dòng)脈粥樣硬化。
49．權(quán)利要求43的方法，其中的異常脂血相關(guān)癥病癥為再狹窄。
50．權(quán)利要求43的方法，其中的異常脂血相關(guān)癥病癥為HDL缺乏或ApoA-Ⅰ缺乏。
51．權(quán)利要求43的方法，其中的異常脂血相關(guān)癥病癥為高甘油三酯血癥。
52．權(quán)利要求43的方法，其中的異常脂血相關(guān)癥病癥為代謝性綜合癥。
53．一種對(duì)患有膿毒性休克的受治療者進(jìn)行治療的方法，該方法包括將有效劑量的權(quán)利要求1的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑向受治療者給藥的步驟。
54．權(quán)利要求43或權(quán)利要求53的方法，其中所述的受治療者為人。
55．權(quán)利要求43或權(quán)利要求53的方法，其中將大約0.5mg/kg至大約100mg/kg的ApoA-Ⅰ激動(dòng)劑向所述受治療者給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供模擬人ApoA－I的結(jié)構(gòu)和藥理特性的肽和肽類(lèi)似物。這樣的肽和肽類(lèi)似物可用于治療多種異常脂血癥相關(guān)性疾病。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1280500SQ9881163
公開(kāi)日2001年1月17日 申請(qǐng)日期1998年9月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月29日
發(fā)明者瓊-路易斯·達(dá)索克斯, 雷納特·塞庫(kù)爾, 克勞斯·巴特納, 伊莎貝爾·康納特, 岡瑟·梅茨 申請(qǐng)人:瓊-路易斯·達(dá)索克斯, 雷納特·塞庫(kù)爾, 克勞斯·巴特納, 伊莎貝爾·康納特, 岡瑟·梅茨