專利名稱：局部應(yīng)用基因載體的疫苗接種的制作方法
本申請(qǐng)要求1997年8月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/055,520號(hào)和1998年2月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/075,113號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及免疫學(xué)和疫苗技術(shù)學(xué)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及皮膚定向的非侵襲性基因傳遞以引發(fā)免疫應(yīng)答的技術(shù)及其用途。
相關(guān)領(lǐng)域的描述脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的激活是保護(hù)動(dòng)物抗病原體和惡性腫瘤的重要機(jī)理。免疫系統(tǒng)由包括體液和細(xì)胞分枝的許多互作組分組成。體液免疫涉及直接結(jié)合抗原的抗體。B淋巴細(xì)胞分泌作為體液免疫效應(yīng)物的抗體分子。細(xì)胞免疫涉及識(shí)別并殺傷產(chǎn)生非自身抗原的其它細(xì)胞的特化的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)。CTL對(duì)降解的肽片段產(chǎn)生應(yīng)答，所述肽片斷出現(xiàn)于結(jié)合MHC(主要組織相容性復(fù)合體)I類分子的靶細(xì)胞表面。當(dāng)然，在所述細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白作為細(xì)胞代謝的組成部分不斷降解成為肽。這些片段結(jié)合到所述MHC分子并轉(zhuǎn)運(yùn)到所述細(xì)胞表面。因此，細(xì)胞免疫系統(tǒng)恒定地監(jiān)測(cè)在機(jī)體細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白譜，并準(zhǔn)備著消除任何產(chǎn)生非自身抗原的細(xì)胞。
疫苗接種是引發(fā)動(dòng)物對(duì)抗原產(chǎn)生應(yīng)答的方法。給予的抗原可以是蛋白質(zhì)(經(jīng)典型)或隨后表達(dá)所述抗原的基因(基因免疫)。所述方法涉及T和B淋巴細(xì)胞、其它類型的淋巴樣細(xì)胞以及特異性抗原提呈細(xì)胞(APC)，所述抗原提呈細(xì)胞可以加工所述抗原并以可激活免疫系統(tǒng)的形式提呈該抗原。給予基因疫苗的現(xiàn)有方式集中于侵襲性方法，所述侵襲性方法包括針注射、劃痕和基因槍介導(dǎo)的穿透。以侵襲性方式接種疫苗需要設(shè)備和經(jīng)特殊醫(yī)療訓(xùn)練的人員，并且常常伴隨不舒適和潛在危害(出血、感染)。目前有證據(jù)顯示，以侵襲性方式接種疫苗可能是非必要的(Tang等，1997；Glenn等，1998)。因?yàn)樗銎つw直接與外界環(huán)境接觸并不斷與潛在病菌原體接觸，所以，免疫系統(tǒng)必須恒定地沿所述皮膚邊緣保持一個(gè)流動(dòng)生物部隊(duì)以防止?jié)撛诟腥?。因此，所述皮膚外表層本質(zhì)上是免疫活性組織。存在于皮膚以引發(fā)體液和細(xì)胞毒性細(xì)胞免疫應(yīng)答的免疫組分，包括表皮朗格漢斯細(xì)胞(它是MHC II類陽(yáng)性的抗原提呈細(xì)胞)、角質(zhì)細(xì)胞以及CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞。這些組分使得所述皮膚成為給予疫苗的理想部位。皮膚的大量可用面積和其持久性是將疫苗應(yīng)用于該組織的其它優(yōu)勢(shì)。在皮膚外表層表達(dá)小量抗原而不需要物理穿刺由此使所述免疫監(jiān)視機(jī)制警戒，從而引發(fā)有效的免疫應(yīng)答。
用隨后對(duì)腫瘤或病原體攻擊的保護(hù)程度測(cè)定疫苗的效力。有效疫苗是在最小量接種后可誘導(dǎo)高滴度和持久免疫的免疫原，以用于定向干預(yù)疾病。例如，基因免疫是通過(guò)在動(dòng)物自身細(xì)胞中表達(dá)編碼所述蛋白的基因從而引發(fā)針對(duì)特定蛋白的免疫應(yīng)答的方法。大量抗原的擴(kuò)增和體內(nèi)持續(xù)抗原提呈產(chǎn)生的免疫刺激可以誘導(dǎo)抗所述抗原的穩(wěn)固免疫。基因免疫使針對(duì)特定蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答的接種方案簡(jiǎn)化，因?yàn)樗コ艘呙缪兄凭Ｒ?guī)需要而通常麻煩的蛋白純化和與佐劑結(jié)合的步驟。因?yàn)榛蛎庖卟恍枰蛛x蛋白質(zhì)，所以它對(duì)生化純化時(shí)可能喪失構(gòu)象表位的蛋白質(zhì)特別重要?；蛞呙缫部梢越M合給予而不產(chǎn)生干擾或影響效力(Tang等，1992；Barry等，1995)，它可以使針對(duì)多種抗原的接種方案簡(jiǎn)化。如本申請(qǐng)所介紹的一樣，已經(jīng)證實(shí)，基因疫苗可以以皮膚定向非侵襲性疫苗的新方式接種?；蛞呙缗c非侵襲性傳送方式結(jié)合，可以產(chǎn)生新類型的不需要特殊使用技能和裝置給予的“平民”疫苗。
盡管已經(jīng)研究了局部應(yīng)用基于蛋白的疫苗，但是其用途可能是有限的。雖然可以以已經(jīng)說(shuō)明(Tang等，1997)的皮膚定向非侵襲性基因疫苗相同的非侵襲方式(Glenn等，1998)，局部應(yīng)用基于蛋白的疫苗和霍亂毒素也可以免疫動(dòng)物，但是，這兩種類型的疫苗通過(guò)不同的機(jī)制激活免疫系統(tǒng)。此外，由于類似于自然感染的從新合成抗原，使得基因疫苗的效力一般高于蛋白疫苗(McDonnell和Askari，1996)。盡管美國(guó)專利第3,837,340號(hào)描述了用干燥的病毒接觸皮膚接種動(dòng)物的方法，但是他們所用的病毒不是能夠表達(dá)轉(zhuǎn)基因的基因載體。另外，所述免疫原可能是病毒外殼蛋白，而不是由在動(dòng)物自身細(xì)胞中表達(dá)病毒基因產(chǎn)生的蛋白。
現(xiàn)有的接種技術(shù)通常需要設(shè)備(例如注射針或基因槍)和給予疫苗的特殊技能。該領(lǐng)域極其需要和希望通過(guò)非醫(yī)療訓(xùn)練人員且不需要裝置從而接種疫苗。因?yàn)樗龇椒ㄊ呛?jiǎn)單、有效、經(jīng)濟(jì)、無(wú)痛和潛在安全的，所以，通過(guò)非侵襲性接種到所述皮膚(NIVS)的發(fā)展可潛在地針對(duì)許多疾病進(jìn)行免疫。因此，NIVS可以在醫(yī)療資源短缺的發(fā)展中國(guó)家以及由于病人舒適性從而在發(fā)達(dá)國(guó)家增加疫苗覆蓋范圍?？梢杂貌恍枰厥獾难b置和醫(yī)療人員的皮膚定向非侵襲性疫苗，預(yù)防或治療所有由病毒(包括AIDS和流感)、細(xì)菌(包括破傷風(fēng)和TB)、寄生蟲(包括瘧疾)引起的傳染病和惡性腫瘤(包括各種癌癥類型)。本發(fā)明滿足所述領(lǐng)域中長(zhǎng)期存在的需要和希望。
發(fā)明概述因?yàn)槠つw是免疫活性組織并且該非侵襲性方法不需要特殊訓(xùn)練的人員，所以非侵襲性接種到所述皮膚(NIVS)可以改善接種方法。皮膚定向非侵襲性基因傳遞可以達(dá)到在所述皮膚中定位的轉(zhuǎn)基因表達(dá)并引發(fā)免疫應(yīng)答(Tang等，1997)。這些結(jié)果表明，NIVS是一種傳送疫苗的新的有效方法。本發(fā)明簡(jiǎn)單、有效、經(jīng)濟(jì)和無(wú)痛的免疫方案應(yīng)該使得接種較少依賴醫(yī)療資源，并由此增加接種的年使用率。
本發(fā)明提供免疫動(dòng)物的方法，包括以下步驟皮膚定向非侵襲性傳遞包含基因載體的制劑，因此所述載體被表皮細(xì)胞攝取，并對(duì)脊椎動(dòng)物具有免疫效應(yīng)。也提供通過(guò)傳遞裝置免疫動(dòng)物的方法，包括以下步驟將基因載體配置在所述傳遞裝置中，并用限定在所述裝置中的均勻劑量的遺傳物質(zhì)接觸脊椎動(dòng)物的裸露皮膚，由此所述載體被表皮細(xì)胞攝取用于在所述免疫活性皮膚組織中表達(dá)特定抗原。所述基因載體可以是腺病毒重組體、DNA/腺病毒復(fù)合體、DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體或能夠在脊椎動(dòng)物皮膚中表達(dá)抗原的任何其它基因載體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例方案中，提供了誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟通過(guò)局給予所述皮膚免疫有效濃度的編碼目的基因的基因載體，從而接觸需要這種治療的個(gè)體或動(dòng)物的皮膚。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在需要這種治療的個(gè)體或動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟通過(guò)局部給予所述皮膚免疫有效濃度的編碼基因的基因載體，從而接觸所述動(dòng)物的皮膚，所述基因編碼在給予后在所述個(gè)體或動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫效應(yīng)的抗原。
在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)用DNA/腺病毒復(fù)合體接觸裸露皮膚從而在同一細(xì)胞中共表達(dá)轉(zhuǎn)基因的方法。該方案使得可以通過(guò)在相同細(xì)胞環(huán)境中與抗原一起共同產(chǎn)生細(xì)胞因子、共同刺激分子或其它免疫調(diào)節(jié)劑，從而操縱免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明還包括傳遞皮膚定向非侵襲性疫苗的傳遞裝置(繃帶、粘性敷料等)的應(yīng)用。
本發(fā)明包括在本文所述方法中設(shè)想的所有用途的所有基因載體。從以說(shuō)明為目的本發(fā)明現(xiàn)有優(yōu)選實(shí)施方案的以下描述，可明顯看出本發(fā)明的其它以及另外的方面、特征和優(yōu)勢(shì)。
附圖簡(jiǎn)述為了實(shí)現(xiàn)并詳細(xì)了解本發(fā)明上述特征、優(yōu)勢(shì)和目的以及清楚明顯的其它方面，參照在附圖中說(shuō)明的某些實(shí)施方案，可以更具體描述以上簡(jiǎn)要概述的本發(fā)明。這些附圖組成本說(shuō)明書的一部分。然而，值得注意的是，所述


本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不應(yīng)認(rèn)為是限制其范圍。
圖1顯示在局部應(yīng)用所述載體的皮膚中腺病毒重組體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)；圖2a和2b顯示由局部應(yīng)用的腺病毒重組體轉(zhuǎn)導(dǎo)的潛在靶細(xì)胞的特征鑒定；圖3a和3b顯示在腺病毒介導(dǎo)的NIVS免疫小鼠血清中的特異性抗體的檢測(cè)；圖4顯示用致死劑量的腫瘤細(xì)胞攻擊的對(duì)照小鼠與免疫小鼠的百分存活率；圖5顯示腫瘤浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞的特征鑒定；圖6顯示腫瘤浸潤(rùn)的CTL的特征鑒定；圖7顯示抗體與用疫苗繃帶局部應(yīng)用免疫小鼠中的人CEA蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析；圖8a顯示DNA/腺病毒介導(dǎo)的NIVS免疫小鼠血清中的特異性抗體的檢測(cè)；圖8b顯示DNA/脂質(zhì)體介導(dǎo)的NIVS免疫小鼠血清中的特異性抗體的檢測(cè)；圖9顯示DNA編碼的轉(zhuǎn)基因和腺病毒編碼的轉(zhuǎn)基因在靶細(xì)胞中的共表達(dá)；圖10顯示局部應(yīng)用的腺病毒重組體、DNA/腺病毒復(fù)合體和DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體的相對(duì)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)；圖11顯示給予皮膚定向非侵襲性疫苗的裝置。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟用免疫有效濃度的包含目的基因的基因載體與需要這種治療的個(gè)體或動(dòng)物皮膚外表層發(fā)生非物理侵襲的接觸，所述接觸時(shí)間適合對(duì)其引發(fā)免疫應(yīng)答。采用本發(fā)明方法，可以用來(lái)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原的典型實(shí)例包括人癌胚抗原、HIVgp120、破傷風(fēng)毒素C片段和流感HA和NP等。最優(yōu)選的是，所述免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗腫瘤或感染性病原體的保護(hù)效應(yīng)。
實(shí)施本發(fā)明需要用非侵襲性方法將操作性編碼多肽的基因載體傳遞到脊椎動(dòng)物皮膚外表層，以用于免疫所述動(dòng)物。這些基因載體可以通過(guò)直接將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到所述皮膚而不用任何裝置，或者采用繃帶或繃帶樣裝置接觸裸露的皮膚，從而給予所述脊椎動(dòng)物。在優(yōu)選應(yīng)用中，所述基因載體為水溶液。由凍干粉重新配制的載體也是可接受的。所述載體可以編碼表達(dá)所必需的轉(zhuǎn)錄/翻譯信號(hào)一起、與免疫調(diào)節(jié)序列(諸如遍在蛋白或富含CpG的合成DNA)融合的完整基因、基因片段或者幾種基因、幾種基因片段。
在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所述載體還包含選自共同刺激基因和細(xì)胞因子基因的基因。在該方法中，所述基因選自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和干擾素基因。
在需要使用腺病毒重組體的本發(fā)明實(shí)施方案中，它可包括E1-缺陷型、E3-缺陷型和/或E4-缺陷型腺病毒載體，或其中所有病毒基因缺失的“無(wú)內(nèi)容的”腺病毒載體。因?yàn)镋1缺陷型腺病毒突變體不能在非容許細(xì)胞中復(fù)制，所以E1突變提高了所述載體的安全范圍。所述E3突變通過(guò)破壞腺病毒向下調(diào)節(jié)MHC I類分子的機(jī)制而提高所述抗原的免疫原性。所述E4突變通過(guò)抑制所述晚期基因表達(dá)從而降低所述腺病毒載體的免疫原性，由此使得可以用同一載體重復(fù)再接種。所述“無(wú)內(nèi)容的”腺病毒載體是腺病毒載體家族中的最新模式。其復(fù)制需要輔助病毒和表達(dá)Ela和Cre兩者的特殊人293細(xì)胞系、天然環(huán)境中不存在的條件；所述載體失去了所有病毒基因，因此所述載體作為疫苗載體是無(wú)免疫原性并可以接種以用于多次再接種。所述“無(wú)內(nèi)容的”腺病毒載體還含有36kb的空間用于容納轉(zhuǎn)基因，由此使得可以將大量抗原基因共同傳遞入細(xì)胞?？梢詫⒅T如RGD基元的特殊序列基元插入腺病毒載體的H-I環(huán)，以增強(qiáng)其感染性。將特定轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因片段克隆入任何諸如上述的腺病毒載體中從而構(gòu)建腺病毒重組體。所述腺病毒重組體用來(lái)以非侵襲方式轉(zhuǎn)導(dǎo)脊椎動(dòng)物的表皮細(xì)胞，以用作免疫劑。
在需要使用DNA/腺病毒復(fù)合體的本發(fā)明實(shí)施方案中，它需要利用或者PEI(聚乙烯亞胺)或聚賴氨酸與腺病毒載體復(fù)合的質(zhì)粒DNA。在所述復(fù)合體中的腺病毒載體可以是“活的”或用UV輻射“殺死的”。作為受體結(jié)合配體和用于促進(jìn)DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染的內(nèi)滲劑(Cotton等，1992)的UV失活的腺病毒載體，可以提高所述疫苗載體的安全范圍。所述DNA/腺病毒復(fù)合體用來(lái)以非侵襲方式轉(zhuǎn)染脊椎動(dòng)物的表皮細(xì)胞，以用作免疫劑。
在需要使用DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體的本發(fā)明實(shí)施方案中，它需要形成脂質(zhì)體的材料，并由需要這些材料制備DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體。所述DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體用來(lái)以非侵襲方式轉(zhuǎn)染脊椎動(dòng)物的表皮細(xì)胞，以用作免疫劑。
本發(fā)明提供的基因載體也可以編碼免疫調(diào)節(jié)分子，所述分子可以用作佐劑以誘發(fā)體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。這類分子包括細(xì)胞因子、共同刺激分子或可以改變免疫應(yīng)答過(guò)程的任何分子。人們可以設(shè)想其中該技術(shù)可以修改以進(jìn)一步增強(qiáng)抗原的免疫性的途徑。
用于NIVS的基因載體可以采取任何數(shù)目的形式，而本發(fā)明不限于任何編碼任何特定多肽的特定基因材料。包括病毒載體、細(xì)菌載體、原生動(dòng)物載體和DNA載體的所有形式的基因載體，當(dāng)這些基因載體用作皮膚定向非侵襲性疫苗的載體時(shí)，均在本發(fā)明設(shè)想的方法以內(nèi)。
所述基因可以用各種方法傳遞，所述方法包括不用裝置的局部應(yīng)用或用諸如墊片或繃帶(例如粘性繃帶)的裝置將所述基因涂抹在所述皮膚表面。參照?qǐng)D11，顯示用于非侵襲性接種的裝置。該疫苗傳遞裝置包括其中配置小泡的非過(guò)敏性皮膚粘性貼劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述貼劑還包含約1cm直徑的塑料。所述疫苗配置在所述泡中。在另一實(shí)施方案中，所述泡含有約1mL的疫苗(為液體、帶有重新配制的凍干粉、和其變異體)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，與所述皮膚接觸的泡表面強(qiáng)度有意地較其相對(duì)面弱，使得當(dāng)施加壓力到所述相對(duì)面時(shí)，強(qiáng)度較弱的一面破裂并釋放出所述泡內(nèi)的疫苗內(nèi)容物到所述皮膚。所述塑料貼劑將所述疫苗貼于皮膚表面。
局部給予本發(fā)明基因載體和目的基因的劑型包括液體、軟膏劑、粉劑和噴霧劑。所述活性組分可以在無(wú)菌條件下與生理可接受載體和任何防腐劑、緩沖劑、噴射劑或可能需要的吸收增強(qiáng)劑混合。
按照本文所用的術(shù)語(yǔ)學(xué)，免疫有效量為編碼所述目的基因的基因載體當(dāng)給予動(dòng)物時(shí)、對(duì)所述目的基因產(chǎn)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的量或濃度。
各種抗原可以以不同濃度局部給予。一般而言，腺病毒載體的用量至少約100pfu，而質(zhì)粒DNA至少約1ngDNA。
本發(fā)明方法可適當(dāng)?shù)赜糜陬A(yù)防接種以預(yù)防疾病或用于治療接種以治療疾病。
本發(fā)明的疫苗可以單獨(dú)或者作為免疫組合物的一部分給予動(dòng)物。
除了上述人用疫苗外，本發(fā)明方法可用來(lái)免疫動(dòng)物牲畜。術(shù)語(yǔ)動(dòng)物是指包括人類的所有動(dòng)物。動(dòng)物實(shí)例包括人類、乳牛、狗、貓、山羊、綿羊和豬等。因?yàn)樗屑棺祫?dòng)物的免疫系統(tǒng)運(yùn)行相似，所以所述應(yīng)用可以在所有脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中實(shí)施。
給出以下實(shí)例為的是說(shuō)明本發(fā)明各種實(shí)施方案，而不是以任何方式限制本發(fā)明。方法小鼠和細(xì)胞培養(yǎng)物近交小鼠保持在Birmingham的Alabama大學(xué)。細(xì)胞培養(yǎng)在含2％胎牛血清和6％小牛血清的RPMI 1640或DMEM培養(yǎng)基中?；蜉d體的局部應(yīng)用麻醉小鼠，并用脫毛劑(例如NAIR)去除腹部或頸部有限范圍皮膚上覆蓋的毛和角質(zhì)化上皮。將基因載體吸取到預(yù)先剃刮并用NAIR處理的皮膚上，使其與裸露皮膚接觸不同時(shí)間(例如1-8小時(shí))。載體可以直接吸取到裸露皮膚上或吸入粘附到所述皮膚上的圓筒中。腺病毒載體的制備從特定腺病毒重組體感染的人293細(xì)胞制備高滴度的腺病毒母液。裂解液通過(guò)氯化銫梯度進(jìn)行超速離心。取出病毒帶并對(duì)10mMTris(pH7.5)/135mM NaCl/5mM KCl/1mM MgCl2進(jìn)行透析。純化的病毒與加至10％的甘油一起過(guò)濾除菌，并等份貯藏于-80℃。用噬菌斑測(cè)定檢測(cè)腺病毒母液的滴度。熒光素酶測(cè)定如前所述(Tang，1994)測(cè)定所述皮膚中的熒光素酶的量。簡(jiǎn)而言之，用Kontes玻璃組織研磨器在裂解緩沖液中勻漿切取的皮膚片。在離心去除組織碎片后，在存在過(guò)量ATP和熒光素的情況下用發(fā)光計(jì)通過(guò)測(cè)量總光發(fā)射，檢測(cè)所述皮膚提取物中的熒光素酶活性。β-半乳糖苷酶測(cè)定將切取的皮膚片快速冷凍于液氮中的Tissue-Tek O.C.T.化合物(Miles Laboratories Inc.)中并貯存于-80℃待用。所述冷凍組織以4μm橫切切片，固定于4％低聚甲醛中，如前所述(Tang，1994)通過(guò)在X-gal染色液中溫育染色以檢測(cè)β半乳糖苷酶活性。切片用蘇木精和伊紅復(fù)染。DNA/腺病毒復(fù)合體的制備在存在凝聚劑聚賴氨酸的情況下混合100μg質(zhì)粒DNA和1×1011腺病毒顆粒，制備DNA/腺病毒復(fù)合體用于各種用途。用吸光度檢測(cè)定腺病毒的滴度。DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物的制備通過(guò)混合100μg質(zhì)粒DNA和100μg DOTAP/DOPE(1∶1；Avanti)，從而制備DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體以用于各種用途。用QiagenPlasmid Maxi試劑盒制備質(zhì)粒。蛋白質(zhì)印跡分析將鼠尾血的血清1∶250至1∶500稀釋，與已經(jīng)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離的純化蛋白反應(yīng)，并轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜(Millipore)。用ECL試劑盒(Amersham)進(jìn)行顯色反應(yīng)。
實(shí)施例1本發(fā)明證實(shí)，不用復(fù)雜的設(shè)備，通過(guò)皮膚定向非侵襲性傳遞基因載體，可以使抗原基因以簡(jiǎn)化的形式傳遞到小鼠皮膚中。圖1表明，傳遞有限量的AdCMV-luc(編碼熒火蟲熒光素酶的腺病毒載體)(Tang等，1994)到所述皮膚后產(chǎn)生大量熒光素酶。Ad，腺病毒；pfu，蝕斑形成單位；LU，光單位。結(jié)果為平均值log[LU/cm2皮膚]±SE(n標(biāo)示于每個(gè)柱頂端)。用不編碼熒光素酶的腺病毒載體模擬使用或涂抹的小鼠，在所述皮膚中不產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光素酶活性。腺病毒載體在所述皮膚中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平看來(lái)與所述病毒滴度無(wú)關(guān)。有可能的是，僅皮膚有限亞群中的少量細(xì)胞被所述病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，而108蝕斑形成單位(pfu)的腺病毒重組體可能已經(jīng)飽和了所述靶細(xì)胞。該變異性也可能部分是由各個(gè)小鼠的變異引起的。另外，某些變異性可能是由仍未標(biāo)準(zhǔn)化的去除角質(zhì)上皮的方法(Johnston和Tang，1994)引起的。通過(guò)將更多的載體接種到更大面積皮膚，可以潛在增加所產(chǎn)生的抗原量。
實(shí)施例2正如皮膚定向非侵襲性傳遞編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(AdCMV-βgal)的腺病毒載體(Tang等，1994)后，用X-gal底物染色的冷凍切片所示，看來(lái)非侵襲性接種到所述皮膚的主要靶細(xì)胞是毛囊中的毛母質(zhì)細(xì)胞(圖2a)和表皮最外層的角質(zhì)細(xì)胞(圖2b)。在經(jīng)受所述處理的皮膚組織中未發(fā)現(xiàn)物理性擦傷，并沒(méi)有誘發(fā)的炎癥。吸取108pfu AdCMV-βgal到所述皮膚后1天，從動(dòng)物切取經(jīng)受非侵襲性基因傳遞的皮膚組織，橫向切片，固定，并如所述用X-gal底物染色(Tang等，1994)。圖2a顯示毛囊中的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的毛母質(zhì)細(xì)胞(×150)。圖2b顯示表皮最外層中腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞(×150)。在用AdCMV-luc或者模擬使用或者涂抹的對(duì)照動(dòng)物中未發(fā)現(xiàn)藍(lán)色細(xì)胞。
實(shí)施例3腺病毒介導(dǎo)的NIVS誘發(fā)體液免疫應(yīng)答NIVS是一種接種動(dòng)物的新方法。為了證實(shí)所述方法可以對(duì)所述載體編碼的抗原誘發(fā)特異性免疫應(yīng)答，將AdCMV-hcea[編碼人癌胚抗原(CEA)的腺病毒載體]吸取到C57BL/6株小鼠的皮膚上。將皮膚定向非侵襲性傳遞108pfu AdCMV-hcea后1個(gè)月的接種小鼠的血清1∶500稀釋，與已經(jīng)在5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離的純化人CEA蛋白(T.Strong提供)和腺病毒蛋白反應(yīng)，并轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜(Millipore)上。參照?qǐng)D3a，泳道1，0.5μg人CEA；泳道2，0.5μg BSA；泳道3，107pfu腺病毒。圖3a顯示，接種動(dòng)物的測(cè)試血清在蛋白質(zhì)印跡分析中與純化人CEA蛋白反應(yīng)，但是不與牛血清白蛋白(BSA)反應(yīng)，它支持這樣的結(jié)論由于皮膚定向非侵襲性基因傳遞的結(jié)果，已經(jīng)產(chǎn)生抗腺病毒載體編碼的外源蛋白的特異性抗體。
為了測(cè)試該技術(shù)是否可以普遍應(yīng)用，把AdCMV-hgmcsf[編碼人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)的腺病毒載體]接種到所述皮膚。為了檢測(cè)抗人GM-CSF蛋白的抗體，皮膚定向非侵襲性傳遞108pfu AdCMV-hgmcsf從而接種所述動(dòng)物。將在15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠中分離的純化人GM-CSF蛋白(CalBiochem)轉(zhuǎn)移到膜，并讓其與稀釋的血清反應(yīng)。如圖3a中所述進(jìn)行其它處理。參照?qǐng)D3b，泳道1，0.25μg人GM-CSF；泳道2，0.25μg BSA；泳道3，107pfu腺病毒。在人293細(xì)胞中產(chǎn)生復(fù)制缺陷型人腺病毒血清型5衍生的AdCMV-hcea和AdCMV-hgmcsf。插入含有人CEA基因或人GM-CSF基因、由所述巨細(xì)胞病毒(CMV)早期增強(qiáng)子-啟動(dòng)子元件驅(qū)動(dòng)的盒以替代所述Ela缺失。因?yàn)樗鯡la區(qū)中的序列缺失，所以這些病毒在非容許細(xì)胞中的自主復(fù)制能力受損。
結(jié)果(Tang等，1997)表明，96％(23/24)的C57BL/6株小鼠在皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-hcea后一個(gè)月產(chǎn)生抗人CEA蛋白的抗體，43％(6/14)的相同株小鼠在皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-hgmcsf后產(chǎn)生抗人GM-CSF蛋白的抗體。在NIVS前收集的免疫前血清和首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物的血清均不能與人CEA和GM-CSF蛋白反應(yīng)。消除了通過(guò)喂食(grooming)經(jīng)攝食載體的口服接種的可能性，因?yàn)?1)在動(dòng)物從麻醉狀態(tài)蘇醒前從所述皮膚上沖洗掉載體，(2)將吸取載體到未剃刮皮膚上，和(3)混合同一個(gè)籠中的首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物和接種動(dòng)物。在首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠和接種小鼠之間未觀察到交叉接種，推測(cè)由于沿剃刮路徑機(jī)械性去除了角質(zhì)化上皮，因此看來(lái)剃刮是NIVS的基本組成部分。因此，腺病毒介導(dǎo)的NIVS能夠引發(fā)抗所述載體編碼的抗原的體液免疫應(yīng)答。
實(shí)施例4為了證實(shí)本發(fā)明技術(shù)可以引發(fā)保護(hù)性抗腫瘤免疫應(yīng)答，把表達(dá)人癌胚抗原(CEA)基因(MC38-CEA-2)(Conry等，1995)的同源腫瘤細(xì)胞接種到首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6株小鼠和已經(jīng)局部應(yīng)用編碼人CEA基因(AdCMV-hcea)的腺病毒載體的相同株的小鼠。觀察經(jīng)受腫瘤攻擊的動(dòng)物存活率(圖4)。在對(duì)照組中，90％(9/10)動(dòng)物產(chǎn)生可觸知的腫瘤小結(jié)并在腫瘤細(xì)胞移植后30天內(nèi)死亡。在接種組中，僅10％(1/10)的所述動(dòng)物死亡，其中70％(7/10)保持完全無(wú)腫瘤。當(dāng)所述腫瘤直徑超過(guò)1cm時(shí)無(wú)痛處死小鼠。注射腫瘤細(xì)胞與無(wú)痛處死之間的時(shí)間用作所述個(gè)體的存活時(shí)間。參照?qǐng)D4，對(duì)照小鼠(未給予疫苗)和NIVS免疫動(dòng)物(一個(gè)月前局部應(yīng)用107pfu AdCMV-hcea)經(jīng)受腫瘤攻擊。括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示每個(gè)處理組的動(dòng)物數(shù)。結(jié)果表明，非侵襲性傳遞基因疫苗到所述皮膚能夠引發(fā)抗表達(dá)特定抗原的腫瘤細(xì)胞的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
實(shí)施例5編碼細(xì)胞因子基因和共同刺激基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建構(gòu)建用于共同傳遞這些免疫調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)基因和抗原基因到皮膚細(xì)胞的編碼共同刺激基因和細(xì)胞因子基因的腺病毒載體，以試圖在接種動(dòng)物中控制所述免疫分布型。按照產(chǎn)生新腺病毒載體的標(biāo)準(zhǔn)方法(Gomez-Foix等，1992)，通過(guò)在人293細(xì)胞的兩種轉(zhuǎn)染質(zhì)粒之間的同源重組，構(gòu)建編碼鼠B7-1基因的腺病毒載體AdCMV-mB7.1和構(gòu)建編碼鼠GM-CSF基因的腺病毒載體AdCMV-mgmcsf。在這些載體中的所有轉(zhuǎn)基因均由CMV早期增強(qiáng)子-啟動(dòng)子元件驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。通過(guò)用抗CD80抗體(PharMingen)染色轉(zhuǎn)導(dǎo)的人肺癌SCC-5細(xì)胞，然后進(jìn)行流式細(xì)胞分析，從而特征鑒定AdCMV-mB7.1。通過(guò)用ELISA試劑盒(Amersham)檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的SCC-5細(xì)胞分泌的鼠GM-CSF，從而特征鑒定AdCMV-mgmcsf。
實(shí)施例6用體內(nèi)細(xì)胞毒性分析檢測(cè)抗腫瘤免疫開發(fā)了體內(nèi)細(xì)胞毒性分析，其中靶細(xì)胞以單層植入到小鼠的肌肉組織上(Tang等，1996)。靶細(xì)胞以單層植入使得可以有效重新取出靶細(xì)胞，用于評(píng)估體內(nèi)生長(zhǎng)數(shù)天后的結(jié)果。該分析法特別用于檢測(cè)不足以有效消除靶細(xì)胞的弱免疫應(yīng)答。所述植入床的組織學(xué)分析可以特征鑒定免疫應(yīng)答。如果無(wú)免疫應(yīng)答，靶細(xì)胞就會(huì)生長(zhǎng)。如果是強(qiáng)力免疫應(yīng)答，在所述植入床存在大量免疫效應(yīng)細(xì)胞的情況下，應(yīng)該可以消除靶細(xì)胞，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可能是遷移到植入床部位和在生長(zhǎng)的靶細(xì)胞周圍原位致敏而產(chǎn)生。如果是弱免疫應(yīng)答，生長(zhǎng)的靶細(xì)胞將與所述植入床中的浸潤(rùn)的免疫效應(yīng)細(xì)胞摻雜。以單層植入5×105RM1-luc細(xì)胞[表達(dá)所述熒光素酶基因的RM1前列腺腫瘤細(xì)胞]到首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠，使得因體內(nèi)RM1-luc細(xì)胞增殖產(chǎn)生腫瘤層，而無(wú)免疫干預(yù)的證據(jù)。與對(duì)照動(dòng)物相反，在通過(guò)皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-luc接種的動(dòng)物中，RM1-luc細(xì)胞與所述植入床中的大量免疫效應(yīng)細(xì)胞摻雜。
實(shí)施例7腫瘤細(xì)胞募集的免疫效應(yīng)細(xì)胞的特征鑒定所述體內(nèi)細(xì)胞毒性分析通過(guò)以單層植入少量靶細(xì)胞到肌肉中，能夠在所述植入床部位集中大量免疫效應(yīng)細(xì)胞。在所述植入床的特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞的特征鑒定，可以提供是否已經(jīng)引發(fā)殺傷靶細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的證據(jù)。為了特征鑒定在皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-luc接種的動(dòng)物中由熒光素酶表達(dá)腫瘤細(xì)胞募集的T細(xì)胞，用抗CD3單克隆抗體(mAb)染色所述植入床的組織切片。通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染pHBA-luc DNA入RM1前列腺腫瘤細(xì)胞(由Baylor College ofMedicine的T.Thompson提供)，然后在含G418的培養(yǎng)液中選擇，從而產(chǎn)生RM1-luc細(xì)胞。用熒光素酶分析特征鑒定表達(dá)熒光素酶的克隆。以單層植入5×105RM1-luc細(xì)胞到小鼠，所述小鼠已經(jīng)通過(guò)皮膚定向非侵襲性傳遞108pfu AdCMV-luc接種。植入后5天，在O.C.T.中冷凍所述植入床，并以4μm切片，在100％丙酮中干燥，通過(guò)用二氨基聯(lián)苯胺作色原的ABC免疫過(guò)氧化物方法，用抗CD3 mAb(克隆F500A2，由UAB的P.Bucy提供)染色。
如圖5所示，在RM1-luc細(xì)胞在皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-luc(x150)接種的小鼠中體內(nèi)生長(zhǎng)5天后，大量T細(xì)胞浸潤(rùn)入所述植入床，而在首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物僅發(fā)現(xiàn)少量T細(xì)胞?？磥?lái)相同數(shù)目的RM1-luc靶細(xì)胞在接種動(dòng)物中較在首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中可以募集更多的T淋巴細(xì)胞到所述植入床。
為了特征鑒定由靶細(xì)胞募集的CTL，用反義粒酶A RNA分子作探針使所述植入床的冰凍切片經(jīng)受原位雜交。以單層植入5×105RM1-luc細(xì)胞到或者首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6小鼠或者已經(jīng)通過(guò)皮膚定向非侵襲性傳遞108pfu AdCMV-luc接種的小鼠。植入后5天，將所述植入床在O.C.T.中冷凍，并以4μm切片。冷凍切片在3％低聚甲醛中固定，在0.2M HCl中溫育以抑制內(nèi)源性堿性磷酸酶活性，并與熱變性的反義粒酶A RNA探針雜交。原位雜交的探針是從含噬菌體啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈RNA分子。在轉(zhuǎn)錄期間，洋地黃毒苷-UTP直接摻入所述序列。有義序列探針用作陰性對(duì)照。與探針雜交后，洗滌切片并與堿性磷酶綴合的抗洋地黃毒苷抗體溫育，然后在NBT/BCIP酶底物溶液中溫育。
表達(dá)粒酶A的CTL是活化的CTL并已經(jīng)用作移植期間的組織排斥的預(yù)測(cè)標(biāo)記。僅在已經(jīng)通過(guò)皮膚定向非侵襲性傳遞AdCMV-luc接種的動(dòng)物中的RM1-luc植入床中發(fā)現(xiàn)粒酶陽(yáng)性的CTL(圖6)。它們?cè)谒踩胧龃驳拇嬖谔崾?，已?jīng)由NIVS誘導(dǎo)了抗表達(dá)特定抗原的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
實(shí)施例8用粘性繃帶局部應(yīng)用基因疫苗首次證實(shí)，繃帶可以用于給予疫苗。該研制使得未經(jīng)醫(yī)療訓(xùn)練的人可以傳遞均一劑量的非侵襲性疫苗到所述皮膚。為了由繃帶轉(zhuǎn)導(dǎo)皮膚，吸取50μl的實(shí)施例7中所述AdCMV-luc載體到粘性繃帶的墊片(Johnson & Johnson)。隨后將含載體的繃帶粘著到預(yù)先剃刮的小鼠皮膚。所述載體與裸露皮膚接觸18小時(shí)。為檢測(cè)繃帶傳遞的基因載體的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，檢測(cè)所述皮膚的熒光素酶(表1)。盡管所述結(jié)果顯示相當(dāng)大的變異，但是用粘性繃帶可以達(dá)到在所述皮膚中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。
為了證實(shí)可以用非侵襲性粘性繃帶接種動(dòng)物，將含AdCMV-hcea的繃帶粘到所述小鼠皮膚后2個(gè)月，檢測(cè)尾血血清的抗CEA抗體。如圖7所示，在100％通過(guò)粘性繃帶接受非侵襲疫苗的小鼠中檢測(cè)到抗CEA抗體。
實(shí)施例9DNA/腺病毒介導(dǎo)的NIVS通過(guò)將質(zhì)粒DNA結(jié)合到腺病毒的外部，可以制備更多用途的基于腺病毒的載體。所產(chǎn)生的載體系統(tǒng)介導(dǎo)更高效地將基因傳遞到各種靶細(xì)胞。該方法使得在外源基因的大小和設(shè)計(jì)方面的適應(yīng)性大大增加。因此DNA/腺病毒復(fù)合體能夠通過(guò)具有更高適應(yīng)性的相同腺病毒受體介導(dǎo)的胞吞途徑將抗原基因傳遞到所述皮膚。
為了證實(shí)DNA/腺病毒介導(dǎo)的NIVS的可行性，將編碼人生長(zhǎng)激素(pCMV-GH)(Tang等，1992)的質(zhì)粒DNA與E4缺陷型腺病毒復(fù)合。通過(guò)使DNA/腺病毒復(fù)合體與裸露的皮膚接觸1天從而接種小鼠(C57BL/6株)。隨后通過(guò)分析尾血血清，監(jiān)測(cè)免疫動(dòng)物的抗人生長(zhǎng)激素蛋白(hGH)的抗體的產(chǎn)生。如圖8a所示，泳道1，hGH(0.5μg)；泳道2，BSA(0.5μg)，在蛋白質(zhì)印跡分析中所述測(cè)試血清與純化的hGH反應(yīng)，但是不與無(wú)關(guān)蛋白反應(yīng)。在接種DNA/腺病毒復(fù)合體的10只小鼠中，8只(80％)在3個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生抗hGH抗體，表明能夠產(chǎn)生抗質(zhì)粒DNA編碼的外源蛋白的特異性抗體，所述質(zhì)粒DNA與腺病毒復(fù)合并以非侵襲性方式給予。處理前收集的免疫前血清、未處理動(dòng)物血清和用無(wú)關(guān)載體接種的動(dòng)物血清均不能與hGH反應(yīng)。因此，DNA/腺病毒復(fù)合體象腺病毒重組體一樣，是用于NIVS的合理載體系統(tǒng)。實(shí)施例10DNA/脂質(zhì)體介導(dǎo)的NIVS除了研制包含作為非侵襲性疫苗載體的腺病毒的基因載體外，也已經(jīng)證實(shí)局部應(yīng)用無(wú)病毒元件的DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體可以接種小鼠。顯而易見(jiàn)的是，許多不同的載體可以以創(chuàng)造性方式用于給予皮膚定向非侵襲性疫苗。如圖8b所示，泳道1，hGH(0.5μg)；泳道2，BSA(0.5μg)，局部應(yīng)用編碼hGH的DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體免疫的小鼠的測(cè)試血清與hGH反應(yīng)，但是不與BSA反應(yīng)。在接種DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體的10只小鼠中，在5個(gè)月內(nèi)其中9只(90％)處理動(dòng)物的試驗(yàn)血清與純化的hGH反應(yīng)。因此，所述DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體象所述腺病毒和DNA/腺病毒復(fù)合體一樣，是用于NIVS的另一個(gè)合理的載體系統(tǒng)。
實(shí)施例11DNA編碼的轉(zhuǎn)基因和腺病毒編碼的轉(zhuǎn)基因的共表達(dá)增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答的策略可能潛在地改善疫苗的臨床結(jié)果。局部產(chǎn)生涉及淋巴細(xì)胞群的活化和擴(kuò)增的免疫調(diào)節(jié)分子，可以顯著改善所述接種的效果。已經(jīng)制備了編碼鼠B7-1和GM-CSF基因的腺病毒載體。因此，局部應(yīng)用DNA/腺病毒復(fù)合體可以在各個(gè)皮膚細(xì)胞中共表達(dá)DNA編碼的抗原或免疫調(diào)節(jié)分子和腺病毒編碼的抗原或免疫調(diào)節(jié)分子，以增強(qiáng)抗所述抗原的免疫應(yīng)答。
圖9表明，在靶細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)取決于腺病毒的存在，因此使得質(zhì)粒編碼的轉(zhuǎn)基因和腺病毒編碼的轉(zhuǎn)基因可以在相同細(xì)胞中共表達(dá)。如所述圖中所示，以特定比率混合pVR-1216質(zhì)粒DNA(Vical提供)、AdCMV-βgal顆粒和聚賴氨酸。所述復(fù)合體施加于孔中的2×105SCC-5細(xì)胞并溫育2小時(shí)。然后去除所述復(fù)合體，第二天收集細(xì)胞用于熒光素酶和β-半乳糖苷酶分析?？招闹鶡晒馑孛富钚?；實(shí)心柱β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明，DNA編碼的轉(zhuǎn)基因在缺乏腺病毒的情況下不能在靶細(xì)胞中表達(dá)，而腺病毒編碼的轉(zhuǎn)基因可以在DNA存在的情況下表達(dá)。也可能的是，DNA可以凝聚在其它病毒表面以用于靶向不同細(xì)胞類型。因此，該方法提供簡(jiǎn)單但是通用的基因傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)使得可以同時(shí)表達(dá)來(lái)自病毒重組體和外部結(jié)合的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因。
實(shí)施例12局部應(yīng)用的不同基因載體在所述皮膚中的相對(duì)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)已經(jīng)表明，腺病毒重組體、DNA/腺病毒復(fù)合體、DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體和許多其它可能的基因載體均可用作非侵襲性疫苗的載體?？梢韵胂蟮氖?，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效率越高，所述載體的效能越大。為了確定所用載體的相對(duì)效率，使腺病毒重組體、DNA/腺病毒復(fù)合體或DNA/脂質(zhì)復(fù)合體通過(guò)局部應(yīng)用與小鼠皮膚接觸18小時(shí)。隨后從所述動(dòng)物取出所述處理的皮膚，通過(guò)用Promega熒光素酶分析系統(tǒng)檢測(cè)2分鐘總的光發(fā)射，用發(fā)光計(jì)測(cè)定熒光素酶活性，并從所述讀數(shù)減去本底。如圖10所示，發(fā)現(xiàn)腺病毒重組體是用于皮膚定向非侵襲性基因傳遞的最高效載體系統(tǒng)。模擬處理小鼠在所述皮膚中未產(chǎn)生可檢測(cè)的熒光素酶活性。LU，光單位；Ad，AdCMV-luc；DNA/Ad，與Ad d11014復(fù)合的pVR-1216 DNA；DNA/脂質(zhì)體，與DOTAP/DOPE復(fù)合的pVR-1216 DNA。結(jié)果為平均log[LU/cm2皮膚]±SE(n標(biāo)示于每個(gè)柱的頂部)。盡管DNA/腺病毒復(fù)合體的效率低于腺病毒重組體，但是它顯著高于DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物。此外，在與DNA復(fù)合之前可用UV輻射使腺病毒失活，以防止活的病毒顆粒傳播。因此，當(dāng)在配制新一代疫苗中把效力和安全因素均考慮在其中時(shí)，DNA/腺病毒復(fù)合體可能是最有希望用于傳遞非侵襲性疫苗的載體系統(tǒng)。
在本說(shuō)明書中提及的任何專利或出版物是說(shuō)明本發(fā)明涉及領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。這些專利和出版物通過(guò)引用結(jié)合到本文中，其引用程度與每個(gè)出版物具體、單獨(dú)表明的引用結(jié)合程度相同。
所述領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該容易認(rèn)識(shí)到，可以很好修改本發(fā)明以實(shí)施所述目標(biāo)，并實(shí)現(xiàn)所述的以及其固有目的和優(yōu)勢(shì)。所述實(shí)施例與本文所述方法、步驟、處理、分子和特定化合物是當(dāng)前典型的優(yōu)選實(shí)施方案，是典型的實(shí)施方案，其目的不是限制本發(fā)明范圍。按所述權(quán)利要求書的范圍限定，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)其進(jìn)行的修改和其它應(yīng)用均包括在本發(fā)明的精神范圍內(nèi)。
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表權(quán)利要求
1.一種非侵襲性誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟通過(guò)將免疫有效量的編碼目的轉(zhuǎn)基因的基因載體局部應(yīng)用到所述皮膚，從而使其接觸需要這種治療的動(dòng)物的皮膚。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基因載體包括能夠表達(dá)轉(zhuǎn)基因的基因載體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述基因載體選自病毒載體和質(zhì)粒DNA。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述基因載體是腺病毒。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼抗原或其片段。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗原或其片段可用來(lái)產(chǎn)生抗病原體或腫瘤的免疫應(yīng)答。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述抗原基本上選自人癌胚抗原、HIV gp120抗原、破傷風(fēng)毒素C片段和流感NP抗原和HA抗原。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述基因載體的免疫有效量對(duì)于腺病毒載體至少約100個(gè)蝕斑形成單位(pfu)，而對(duì)于質(zhì)粒至少為1ngDNA。
9.權(quán)利要求2的方法，其中所述載體編碼免疫調(diào)節(jié)基因。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述載體還編碼共同刺激基因和細(xì)胞因子基因。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)基因選自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和干擾素基因。
12.權(quán)利要求4的方法，其中所述腺病毒載體是其E1區(qū)缺陷型。
13.權(quán)利要求4的方法，其中所述腺病毒載體是其E4區(qū)缺陷型。
14.權(quán)利要求4的方法，其中所述腺病毒載體是其E3區(qū)缺陷型。
15.權(quán)利要求4的方法，其中所述載體缺失所有病毒基因。
16.權(quán)利要求3的方法，其中所述載體包括DNA/病毒復(fù)合體。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述DNA是質(zhì)粒形式的DNA。
18.權(quán)利要求3的方法，其中所述載體包括DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體。
19.權(quán)利要求3的方法，其中所述載體包括編碼抗原或其片段的重組腺病毒。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗感染性病原體或腫瘤的保護(hù)性效應(yīng)。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述接觸步驟還包括在傳遞裝置中配置含有目的基因的基因載體，并將其中具有含所述目的基因的基因載體的裝置用于所述動(dòng)物皮膚。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述裝置包括墊片。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述裝置包括粘性繃帶樣裝置。
24.在需要這種治療的動(dòng)物中非侵襲性誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的方法，包括以下步驟通過(guò)局部應(yīng)用免疫有效濃度的含轉(zhuǎn)基因的載體到所述皮膚，從而使其接觸所述動(dòng)物的皮膚，所述轉(zhuǎn)基因編碼抗原或其片段，所述抗原或其片段給予后在所述動(dòng)物中誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述基因載體包括能夠表達(dá)轉(zhuǎn)基因的基因載體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述基因載體選自病毒載體和質(zhì)粒DNA。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述基因載體是腺病毒。
28.權(quán)利要求24的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼抗原或其片段。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述抗原或其片段可以用來(lái)產(chǎn)生抗腫瘤的免疫應(yīng)答。
30.權(quán)利要求28的方法，其中編碼所述抗原的轉(zhuǎn)基因包括癌基因、腫瘤抑制基因和腫瘤相關(guān)基因。
31.權(quán)利要求24的方法，其中所述基因載體的免疫有效量對(duì)于腺病毒載體來(lái)說(shuō)，至少約100個(gè)蝕斑形成單位(pfu)，而對(duì)于質(zhì)粒至少為1ng DNA。
32.權(quán)利要求25的方法，其中所述載體編碼免疫調(diào)節(jié)基因。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述載體還編碼共同刺激基因和細(xì)胞因子基因。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)基因選自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和干擾素基因。
35.權(quán)利要求27的方法，其中所述腺病毒載體是其E1區(qū)缺陷型。
36.權(quán)利要求27的方法，其中所述腺病毒載體是其E4區(qū)缺陷型。
37.權(quán)利要求27的方法，其中所述腺病毒載體是其E3區(qū)缺陷型。
38.權(quán)利要求27的方法，其中所述載體缺失所有病毒基因。
39.權(quán)利要求26的方法，其中所述載體包括DNA/病毒復(fù)合體。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述DNA是質(zhì)粒形式的DNA。
41.權(quán)利要求26的方法，其中所述載體包括DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體。
42.權(quán)利要求27的方法，其中所述載體包括編碼抗原或其片段的重組腺病毒。
43.權(quán)利要求24的方法，其中所述免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。
44.權(quán)利要求24的方法，其中所述接觸步驟還包括在傳遞裝置中配置含有目的基因的基因載體，并將其中具有含所述目的基因的基因載體的裝置用于所述動(dòng)物皮膚。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述裝置包括墊片。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述裝置包括粘性繃帶樣裝置。
47.形成DNA/病毒復(fù)合體的方法，所述方法包括以下步驟提供合適的病毒載體；提供待與所述病毒載體復(fù)合的DNA樣品；和在存在聚賴氨酸的情況下一起混合所述病毒載體和DNA樣品。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述病毒載體是腺病毒。
49.權(quán)利要求47的方法，其中所述DNA樣品包括目的基因。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述基因編碼抗原或其片段。
51.權(quán)利要求47的方法，其中所述聚-L-賴氨酸(PLL)與DNA樣品的比率范圍為約0.9μgPLL1.0μg DNA至9.0μg PLL1ug DNA
52.權(quán)利要求47的方法，其中所述聚-L-賴氨酸(PLL)與腺病毒載體的比率范圍為約6.0μg PLL108pfu腺病毒至6.0μg PLL1010pfu腺病毒。
53.傳遞基因載體到動(dòng)物皮膚表面的裝置，所述裝置包括皮膚接觸裝置包括具有第一面和第二面的第一片材料，將所述第一面用于接觸所述動(dòng)物皮膚表面；和第一面置于所述第一片材料的所述第一面對(duì)面的第二片材料；所述第一片材料和所述第二片材料在其外緣部分周圍結(jié)合在一起，以其間限定一個(gè)密封的中央空間，用于在其中裝置基因載體；和構(gòu)成所述第一片的材料在結(jié)構(gòu)上弱于構(gòu)成所述第二片的材料，由此當(dāng)所述基因載體放置于所述空間中，并施加外力于所述第二片的第一面時(shí)，所述第一片在所述第二片之前破裂，使得所述基因載體接觸所述動(dòng)物的皮膚。
54.按照權(quán)利要求53的裝置，其中所述第一片材料的所述第一面包括沿其外周配置的膠粘劑，以將所述裝置固定于所述動(dòng)物皮膚的表面，其中疊于所述空間的所述第一片材料的部分基本上無(wú)膠粘劑。
55.按照權(quán)利要求53的裝置，其中所述材料片由不滲透載體的材料構(gòu)成。
56.按照權(quán)利要求53的裝置，其中所述材料片由高分子材料構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明提供以非侵襲方式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法,包括以下步驟:通過(guò)給所述皮膚局部應(yīng)用免疫有效濃度的基因載體,從而使其接觸需要這種治療的個(gè)體的皮膚,其中所述基因載體編碼目的基因。也提供在需要這種治療的動(dòng)物中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的方法,包括以下步驟:通過(guò)給所述皮膚局部應(yīng)用免疫有效濃度的編碼基因的載體,從而使其接觸所述動(dòng)物的皮膚,其中所述基因編碼抗原,所述抗原給予后在所述動(dòng)物中誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)。所述基因載體可包括腺病毒重組體,DNA/腺病毒復(fù)合體,DNA/脂質(zhì)體復(fù)合體或能夠表達(dá)轉(zhuǎn)基因的任何其它載體?；蜉d體的局部應(yīng)用優(yōu)選包括本文設(shè)計(jì)的裝置。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1274290SQ98809932
公開日2000年11月22日 申請(qǐng)日期1998年8月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月13日
發(fā)明者D·C·C·湯, D·H·馬克斯, D·T·庫(kù)里爾, Z·史 申請(qǐng)人:Uab研究基金會(huì)