專(zhuān)利名稱(chēng)：含異黃酮的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含異黃酮的組合物，具體地說(shuō)涉及這樣一種新組合物，它包括含黃豆苷原的物質(zhì)和能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株，或者包括由所述微生物菌株作用于所述含黃豆苷原的物質(zhì)而產(chǎn)生的雌馬酚，所述組合物用于預(yù)防并減緩不明臨床綜合癥以及與中老年婦女絕經(jīng)期有關(guān)的癥狀。
背景技術(shù)：
由日本國(guó)家癌癥中心和Helsinki大學(xué)(芬蘭)進(jìn)行的有備案的合作研究致力于研究日本性別特異性腫瘤疾病，例如男性前列腺癌和女性乳腺或卵巢癌，比歐洲和美洲人群發(fā)生率低的原因在于，日本人大量攝取含各種異黃酮的豆類(lèi)食品，以至很好地調(diào)整了激素平衡(H.Adlercreutz，等，(1992)柳葉刀(Lancet)，339，1233；H.Adlercreutz，等，(1992)柳葉刀，342，1209-1210)。
最近，對(duì)于異黃酮具有類(lèi)雌激素(女性荷爾蒙)活性的事實(shí)已受到越來(lái)越多的關(guān)注(A.Molteni等，(1995)營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志，125，751S-756S)，曾報(bào)道這些化合物對(duì)絕經(jīng)期雌激素分泌衰退或停止后造成的骨質(zhì)疏松(D.Agnusdei等，(1995)骨和礦物質(zhì)，19(增刊)，S43-S48)以及絕經(jīng)期綜合癥有效(D.D.Baird，等，(1995)臨床內(nèi)分泌代謝雜志，80，1685-1690；A.L.Murkies，等，(1995)Maturitas.，21，195-198)。
Margaret Lock(M.Lock，等，(1988)Maturitas.，10，317-332)進(jìn)行的調(diào)查結(jié)果顯示，日本婦女絕經(jīng)期綜合癥發(fā)生率比加拿大婦女的發(fā)生率低很多?；谠搱?bào)道，H.Adlercreutz及其同事推測(cè)日本婦女大量攝取加工后的豆制品例如豆腐、味噌、醬油等，因此這些食物中含有的植物雌激素(類(lèi)異黃酮)導(dǎo)致絕經(jīng)期綜合癥的發(fā)生率降低。該作者在進(jìn)行了公知的反映實(shí)際攝取類(lèi)異黃酮吸收量的尿液排泄物(24小時(shí)的尿液)比較試驗(yàn)后進(jìn)一步報(bào)道，日本婦女類(lèi)異黃酮的尿分泌比西方婦女高十倍(C.Herman，等，(1995)，營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志，125，757S-770S)。
因此，認(rèn)為黃豆苷原、染料木苷原、黃豆苷、染料木苷等類(lèi)異黃酮的攝取對(duì)于減緩和防止絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松和絕經(jīng)期綜合癥有效。特別是據(jù)報(bào)道，由于近年來(lái)的長(zhǎng)壽傾向，絕經(jīng)期后婦女的平均壽命增長(zhǎng)到30多歲，減緩和預(yù)防絕經(jīng)期后可能形成的各種疾病和綜合癥已經(jīng)具有越來(lái)越重要的意義，因?yàn)檫@將改善生活質(zhì)量(QOL)。
然而，上述報(bào)道，即關(guān)于日本中老年婦女?dāng)z取類(lèi)異黃酮量和尿排泄類(lèi)異黃酮量的調(diào)查報(bào)告僅反應(yīng)了部分鄉(xiāng)村地區(qū)的結(jié)果，而且沒(méi)有提供實(shí)質(zhì)信息。另外，絕經(jīng)期綜合癥的幾率和類(lèi)異黃酮攝取量之間的相關(guān)性還未曾徹底地分析和顯示。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種新的組合物，它對(duì)于防止和減緩中老年婦女所謂不明臨床綜合癥，包括絕經(jīng)期綜合癥有效，對(duì)于這類(lèi)疾病還沒(méi)有有效的防止或減緩方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人首先在包括城市在內(nèi)的廣闊地理區(qū)域內(nèi)進(jìn)行了飲食調(diào)查，測(cè)定尿的類(lèi)異黃酮排泄，并且問(wèn)卷調(diào)查了絕經(jīng)期前后婦女的絕經(jīng)期綜合癥(不明臨床綜合癥)。
根據(jù)上面的描述，對(duì)福岡飲食學(xué)家協(xié)會(huì)的116名年齡在40到60歲之間的婦女進(jìn)行的調(diào)查結(jié)果顯示，攝取類(lèi)異黃酮的平均量為黃豆苷原9毫克(mg)/天，染料木苷原13mg/天。類(lèi)異黃酮的平均尿排泄量為黃豆苷原19.6微摩爾(μmol)/天，染料木苷原10.0μmol/天，黃豆苷原的代謝物雌馬酚的平均排泄量為11.9μmol/天(檢測(cè)受試者的平均值)。偶然發(fā)現(xiàn)，雖然所有受試者都檢測(cè)到黃豆苷原和染料木苷原，但是95位受試者中僅有46位(51.6％)檢測(cè)到雌馬酚。
另外，集中了月經(jīng)障礙婦女和處于絕經(jīng)期前后5年內(nèi)的婦女作為絕經(jīng)期受試者，問(wèn)卷調(diào)查包括17項(xiàng)，它們用于常規(guī)診斷絕經(jīng)期綜合癥[作為Kupperman絕經(jīng)期指數(shù)(Kupperman H.S.，等，(1953)，臨床內(nèi)分泌代謝雜志，13，688-703)的17項(xiàng)修正，即1.熱潮，2.排汗，3.傷風(fēng)的局部知覺(jué)，4.呼吸短缺狀況，5.肢體麻木狀況，6.感覺(jué)遲鈍，7.睡眠困難，8.睡眠不寧，9.易怒，10.神經(jīng)過(guò)敏，11.憂(yōu)郁，12.眩暈，惡心，13.虛弱(疲勞)，14.肩膀僵硬，關(guān)節(jié)疼痛，肌肉疼痛，15.頭痛，16.心悸，17.麻刺感]，和計(jì)算簡(jiǎn)化絕經(jīng)期指數(shù)(SMI)。SMI值不低于20的受試者作為高絕經(jīng)期綜合癥組，SMI值不高于19的受試者作為低絕經(jīng)期綜合癥組，分別比較了兩組類(lèi)異黃酮的攝取量和類(lèi)異黃酮的尿排泄量。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃豆原苷的攝取量無(wú)組間差異，高絕經(jīng)期綜合癥組染料木苷原的攝取量較低，p＝0.0643。至于類(lèi)異黃酮的尿排泄，無(wú)論黃豆苷原還是染料木苷原均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)組間差異，但是高絕經(jīng)期綜合癥組雌馬酚的排泄顯著降低(p＜0.01)。
從上述結(jié)果中本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在各種異類(lèi)黃酮中絕經(jīng)期婦女不明臨床綜合癥與染料木苷原的攝取量和雌馬酚的尿排泄量密切相關(guān)。
過(guò)去一直在探討總類(lèi)異黃酮的攝取量和尿排泄量與其生理作用之間的關(guān)系，而沒(méi)有具體考慮某種類(lèi)異黃酮例如黃豆苷原和染料木苷原的作用，但是本發(fā)明人在日本中老年婦女中展開(kāi)的調(diào)查結(jié)果卻清楚地表明，不但總類(lèi)異黃酮的攝取量和尿排泄量，而且染料木苷原的攝取量和雌馬酚的尿排泄量，特別是黃豆苷原到雌馬酚的代謝轉(zhuǎn)化率，與絕經(jīng)期婦女不明綜合癥關(guān)系十分密切。
本發(fā)明人對(duì)健康成年志愿者(25-33歲)進(jìn)行的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，單次攝入含有類(lèi)異黃酮的代表食品豆奶后，類(lèi)異黃酮(黃豆苷原和染料木苷原)的尿排泄以劑量相關(guān)模式增長(zhǎng)，但是對(duì)于尿排泄顯示無(wú)雌馬酚的受試者，即使豆奶的攝取量增加兩倍，尿中仍然檢測(cè)不到雌馬酚，表明黃豆苷原到雌馬酚的代謝途徑存在個(gè)體差異。
有報(bào)道黃豆苷原的代謝產(chǎn)物-雌馬酚在含類(lèi)異黃酮的食品，例如加工的豆制品中檢測(cè)不到，而且它也不能從常規(guī)飲食中攝入體內(nèi)(K.Reinli等，(1996)，營(yíng)養(yǎng)學(xué)與癌癥(Nutr.Cancer)，26，123-148)。
基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果成功地研制出一種新的組合物，該組合物含有具有促進(jìn)黃豆苷原代謝成為雌馬酚能力(代謝活性)的微生物菌株和黃豆苷原或一種含黃豆苷原組合物的適當(dāng)物質(zhì)；和另一種新組合物，該組合物含有由所述微生物菌株消化黃豆苷原而產(chǎn)生的雌馬酚。隨后本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)攝取上述任意一種組合物都能夠有效地防止和減緩中老年婦女的不明臨床綜合癥，從而形成本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
一方面本發(fā)明提供了一種食品或藥品形式的組合物，該組合物含有作為基本成份的一種含黃豆苷原的物質(zhì)和一種能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株(該組合物在下文將被稱(chēng)為“含異黃酮的組合物”)。
另一方面本發(fā)明提供了一種食品或藥品形式的組合物，該組合物含有雌馬酚，該雌馬酚是由能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株作用于含黃豆苷原的物質(zhì)而產(chǎn)生的(該組合物在下文將被稱(chēng)為“含雌馬酚的組合物”)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供所述含異黃酮的組合物和含雌馬酚的組合物，其中能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝稱(chēng)為雌馬酚的微生物菌株為至少一種選自卵形類(lèi)桿菌、中間型鏈球菌和constellatus鏈球菌的菌株。更具體地說(shuō)，所述含異黃酮的組合物和含雌馬酚的組合物中所述微生物菌株為至少一種選自類(lèi)桿菌E-23-15，它的保藏號(hào)為FERM BP-6435，鏈球菌E-23-17，它的保藏號(hào)為FERM BP-6436、和鏈球菌A6G-225，保藏號(hào)為FERM BP-6437的菌株。
本發(fā)明還提供所述含異黃酮的組合物和含雌馬酚的組合物，它們還含有至少一種有利于維持和促進(jìn)所述微生物菌株生長(zhǎng)的成份，例如至少一種選自半乳糖苷蔗糖、大豆低聚糖、乳果糖、乳糖醇和果糖低聚糖的物質(zhì)。
本發(fā)明還提供所述含異黃酮的組合物和含雌馬酚的組合物，其中所述含黃豆苷原的物質(zhì)還含有至少一種選自染料木苷原、黃豆苷和染料木苷的成份，優(yōu)選大豆異黃酮。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及將所述含異黃酮的組合物和含雌馬酚的組合物用于預(yù)防和治療中老年婦女不明臨床綜合癥，包括絕經(jīng)期綜合癥。
本發(fā)明還提供了食品形式的所述含異黃酮的組合物和含雌馬酚的組合物，所述食品形式包括飲料、奶制品、發(fā)酵牛奶、棒狀食品、顆粒狀食品、粉末狀食品、膠囊狀食品和片狀食品。
本發(fā)明進(jìn)一步提供藥物制劑形式的所述含異黃酮的組合物和含雌馬酚的組合物，其中所述藥物制劑形式包括水溶液、乳劑、顆粒劑、粉劑、膠囊和片劑。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了預(yù)防和治療中老年婦女不明臨床綜合癥或絕經(jīng)期綜合癥的方法，該方法包括給所述需要預(yù)防或治療的中老年婦女服用有效量的所述含異黃酮組合物和含雌馬酚組合物。
本發(fā)明還提供了能夠利用含黃豆苷原的物質(zhì)或黃豆苷原生產(chǎn)雌馬酚的微生物在制備所述含異黃酮的組合物和含雌馬酚的組合物中的應(yīng)用，這些組合物對(duì)防止和治療中老年婦女不明臨床綜合癥和絕經(jīng)期綜合癥有效。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種生產(chǎn)雌馬酚的方法，該方法包括使能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝為雌馬酚的微生物菌株作用于黃豆苷原。
本發(fā)明還提供了一種選自類(lèi)桿菌E-23-15(保藏號(hào)為FERM BP-6435)、鏈球菌E-23-17(保藏號(hào)為FERM BP-6436)、和鏈球菌A6G-225(保藏號(hào)為FERM BP-6437)的微生物菌株。
下面將詳細(xì)描述本發(fā)明的含異黃酮的組合物。
在本發(fā)明的含異黃酮的組合物中，含黃豆苷原的物質(zhì)作為其中的基本成分之一。該含黃豆苷原的物質(zhì)不僅包括如所指的黃豆苷原，還包括黃豆苷原糖苷形式的黃豆苷以及大量含黃豆苷原和/或黃豆苷的物質(zhì)。黃豆苷原主要存在于大豆、野葛及類(lèi)似未加工食品、它們的加工產(chǎn)品例如豆腐、凍油豆腐片、豆奶等、以及它們的發(fā)酵產(chǎn)品例如日本豆豉、醬油、味噌、一種印尼全大豆發(fā)酵食品等中。在本發(fā)明中，任何這類(lèi)未加工食品、加工產(chǎn)品和發(fā)酵產(chǎn)品都可以用作所述含黃豆苷原的物質(zhì)。特別地，這類(lèi)物質(zhì)不僅含有黃豆苷原還含有其他具有類(lèi)雌激素活性的類(lèi)異黃酮，例如染料木苷原、黃豆苷、染料木苷等，染料木苷原和黃豆苷原等的部分甲基化前體生原單寧A和芒柄花黃素(formonetin)，也可以有效地應(yīng)用于本發(fā)明。
在本發(fā)明的實(shí)施中含黃豆苷原的物質(zhì)優(yōu)選還包括來(lái)源于大豆的大豆異黃酮，例如商品如來(lái)自福岡的“Fujiflavone(商品名)P10”，來(lái)源于植物的類(lèi)異黃酮，例如紅三葉草、alphalpha等。
在本發(fā)明的含異黃酮的組合物中，具有從黃豆苷原生成雌馬酚能力(代謝活性)的微生物菌株作為另一個(gè)基本成分。微生物包括卵形類(lèi)桿菌、中間型鏈球菌、和constellatus鏈球菌。在這些微生物中特別優(yōu)選的是類(lèi)桿菌E-23-15(FERM BP-6435)、鏈球菌E-23-17(FERMBP-6436)和鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)，所有這些微生物均從人糞便中分離得到，并由發(fā)明人登記保藏。
下面將詳細(xì)描述這些微生物菌株的細(xì)菌學(xué)特征。
(1)類(lèi)桿菌E-23-15，F(xiàn)ERM BP-5435I.培養(yǎng)學(xué)特征將這種菌株在填滿(mǎn)鋼絲棉的無(wú)氧瓶中于37℃無(wú)氧培養(yǎng)48小時(shí)，它們?cè)贓ggerth-gagnon(EG)瓊脂、Blood Liver(BL)瓊脂、或Gifu厭氧培養(yǎng)基(GAM)上生長(zhǎng)良好或中度生長(zhǎng)。菌落為圓形，凸面隆起狀，中心和周邊光滑或輕微粗糙。菌落在EG瓊脂上為灰白色，在BL瓊脂上為灰棕色。形態(tài)學(xué)上它是革蘭氏陰性桿菌，表現(xiàn)為從球桿菌、單桿菌、伸長(zhǎng)桿菌等的多態(tài)現(xiàn)象，但細(xì)胞發(fā)生是單一的或非鏈狀的。未發(fā)現(xiàn)孢子發(fā)生。
II.生理學(xué)特征(1)優(yōu)選生長(zhǎng)溫度37℃(2)優(yōu)選生長(zhǎng)pH7.0(3)明膠液化+(4)可溶性淀粉的水解+(5)七葉苷的水解+(6)吲哚的產(chǎn)生-(7)脲酶-
(8)過(guò)氧化氫酶-(9)碳源的同化L-阿拉伯糖 +D-木糖 +D-葡萄糖+蔗糖+L-鼠李糖+D-棉子糖+D-甘露醇+吲哚+乳糖+麥芽糖 +水楊苷 +明膠+甘油+D-纖維素二糖+D-甘露糖+D-松三糖+D-山梨醇+D-海藻糖+(10)利用了蛋白胨或葡萄糖后的有機(jī)酸組成使用糖發(fā)酵試驗(yàn)中應(yīng)用的PYF(蛋白胨-酵母提取物-Fildes)培養(yǎng)基(約含5％蛋白胨)，并在PYF培養(yǎng)基中添加終濃度為0.5％的葡萄糖，于37℃厭氧培養(yǎng)上述菌株72小時(shí)，用HPLC分析終培養(yǎng)物中的有機(jī)酸。結(jié)果(單位mM)顯示在下表中。

nd＝未檢測(cè)到上述形態(tài)學(xué)和生化特征、糖發(fā)酵試驗(yàn)和有機(jī)酸產(chǎn)物譜表明該菌株是革蘭氏陰性棒狀卵形類(lèi)桿菌或單形類(lèi)桿菌，但由于它利用鼠李糖的能力斷定它是一種屬于卵形類(lèi)桿菌的微生物。因此該菌株命名為類(lèi)桿菌E-23-15，并于1997年7月7日保藏在國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(NIBH，Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，登記號(hào)為FERM P-16312。該保藏于1998年7月22日轉(zhuǎn)為布達(dá)佩斯保藏，授予登記號(hào)FERM BP-6435。
(2)鏈球菌E-23-17(FERM BP-6436)I.培養(yǎng)學(xué)特征將這種菌株在填滿(mǎn)鋼絲棉的無(wú)氧瓶中于37℃無(wú)氧培養(yǎng)48小時(shí)，它們?cè)贓G瓊脂、BL瓊脂、或GAM上生長(zhǎng)良好或中度生長(zhǎng)。菌落為中心凸面狀隆起的圓形或圓錐形，表面玻璃樣或顆粒狀質(zhì)地，邊緣光滑或輕微粗糙。菌落在EG瓊脂上為透明到灰棕色。形態(tài)學(xué)上它是革蘭氏陽(yáng)性球形、橢圓形或具有略尖的末端。細(xì)胞發(fā)生單個(gè)或雙球，形成不規(guī)則的集合。不形成鏈。該菌株無(wú)孢子發(fā)生。
II.生理學(xué)特征(1)優(yōu)選生長(zhǎng)溫度37℃(2)優(yōu)選生長(zhǎng)pH7.0(3)明膠液化-(4)可溶性淀粉的水解-(5)七葉苷的水解+(6)吲哚的產(chǎn)生-(7)脲酶-(8)過(guò)氧化氫酶-(9)碳源的同化L-阿拉伯糖+D-木糖-D-葡萄糖 +蔗糖 -L-鼠李糖 +D-棉子糖 -D-甘露醇 +吲哚 -乳糖 +麥芽糖+水楊苷+明膠 -甘油 -D-纖維素二+糖D-甘露糖 +D-松三糖 -
D-山梨醇 ±D-海藻糖 +(10)利用蛋白胨或葡萄糖后的有機(jī)酸組成使用糖發(fā)酵試驗(yàn)中應(yīng)用的PYF(蛋白胨-酵母提取物-Fildes)培養(yǎng)基(約含5％蛋白胨)，該P(yáng)YF培養(yǎng)基中另添加終濃度為0.5

登記號(hào)為FERM P-16313。該保藏于1998年7月22日轉(zhuǎn)為布達(dá)佩斯保藏，授予登記號(hào)FERM BP-6436。
(3)鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)I.培養(yǎng)學(xué)特征將這種菌株在填滿(mǎn)鋼絲棉的無(wú)氧瓶中于37℃無(wú)氧培養(yǎng)48小時(shí)，它們?cè)贓G瓊脂、BL瓊脂、或GAM上生長(zhǎng)良好或中度生長(zhǎng)。菌落為中心凸面狀隆起的圓形或圓錐形，表面玻璃樣或顆粒樣質(zhì)地，邊緣光滑或輕微粗糙。菌落在EG瓊脂上為透明到灰白色。形態(tài)學(xué)上它是革蘭氏陽(yáng)性球形、橢圓形或具有略尖的末端。細(xì)胞發(fā)生單個(gè)或雙球，形成不規(guī)則的集合。不形成鏈。該菌株也無(wú)孢子發(fā)生。
II.生理學(xué)特征(1)優(yōu)選生長(zhǎng)溫度37℃(2)優(yōu)選生長(zhǎng)pH7.0(3)明膠液化-(4)可溶性淀粉的水解-(5)七葉苷的水解+(6)吲哚的產(chǎn)生-(7)脲酶-(8)過(guò)氧化氫酶-(9)碳源的同化L-阿拉伯糖 -D-木糖 -D-葡萄糖 +蔗糖 +L-鼠李糖 -D-棉子糖 +D-甘露醇 -吲哚 -乳糖 +麥芽糖 +
水楊苷 +明膠 -甘油 -D-纖維素二 +糖D-甘露糖 +D-松三糖 -D-山梨醇 -D-海藻糖 -(10)利用蛋白胨或葡萄糖后的有機(jī)酸組成使用糖發(fā)酵試驗(yàn)中應(yīng)用的PYF(蛋白胨-酵母提取物-Fildes)培養(yǎng)基(約含5％蛋白胨)，該P(yáng)YF培養(yǎng)基中另添加終濃度為0.5％的葡萄糖，于37℃厭氧培養(yǎng)上述菌株72小時(shí)，用HPLC分析終培養(yǎng)物中的有機(jī)酸。結(jié)果(單位mM)顯示在下表中。<

nd＝未檢測(cè)到上述形態(tài)學(xué)和生化特征、糖發(fā)酵試驗(yàn)和有機(jī)酸產(chǎn)物譜表明該菌株屬于革蘭氏陽(yáng)性中間型鏈球菌，但是該菌株在利用L-鼠李糖和D-海藻糖的能力方面與中間型鏈球菌的典型培養(yǎng)菌株存在差異。因此本發(fā)明人命名該菌株為鏈球菌A6G-225，并于1997年7月7日保藏在國(guó)立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所(NIBH，Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，登記號(hào)為FERM P-16314。該保藏于1998年7月22日轉(zhuǎn)為布達(dá)佩斯保藏，授予登記號(hào)FERM BP-6437。
本發(fā)明人分離到的上述三種微生物菌株的最顯著特征在于具有利用黃豆苷原轉(zhuǎn)化為雌馬酚的能力。黃豆苷原包括作為異黃酮糖苷，例如黃豆苷，糖苷配基的黃豆苷原。黃豆苷由所述微生物利用轉(zhuǎn)化成黃豆苷原，然后從該黃豆苷原生成雌馬酚。
關(guān)于能夠產(chǎn)生雌馬酚的微生物還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了能夠產(chǎn)生雌馬酚的新的微生物菌株。
在本發(fā)明含異黃酮的組合物中用作基本成分的上述微生物菌株通常為該微生物的活菌株。然而，不限于此，還包括它的培養(yǎng)物、其粗產(chǎn)物或純化產(chǎn)物，以及它們的凍干品。它的含量沒(méi)有特別限制，但可以根據(jù)微生物類(lèi)型，在其他因素中明智地選擇。例如，對(duì)于發(fā)酵牛奶中的中間型鏈球菌，細(xì)菌數(shù)最好控制在約108到109個(gè)細(xì)胞/毫升(ml)范圍內(nèi)。通過(guò)用稀釋樣品接種瓊脂培養(yǎng)基確定細(xì)菌數(shù)，37℃厭氧培養(yǎng)所述接種的培養(yǎng)基，對(duì)形成的菌落記數(shù)。對(duì)于其他微生物菌株，同樣以上述方式作為經(jīng)驗(yàn)法則確定數(shù)目。
本發(fā)明含異黃酮的組合物中還優(yōu)選含有特別適合特定微生物菌株維持和生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分。所述營(yíng)養(yǎng)成分包括各種低聚糖，例如半乳糖苷蔗糖、大豆低聚糖、乳果糖、乳糖醇、果糖低聚糖、和半乳糖低聚糖。這類(lèi)營(yíng)養(yǎng)成分在配方中的量沒(méi)有特別限制，但通常優(yōu)選約為本發(fā)明組合物總重量的1-3％(重量)范圍內(nèi)。
通常通過(guò)混合預(yù)定量的所述基本成分和其他任選成分制備本發(fā)明的組合物，然后將所述混合物加工成為合適的食品或藥物制劑形式，用作食品的形式包括如飲料、奶制品、發(fā)酵奶、棒狀品、顆粒狀物、粉狀品、膠囊、片狀品等，用作藥物制劑的形式包括如水溶液、乳劑、顆粒劑、粉劑、膠囊劑、片劑等?？梢詰?yīng)用常規(guī)方法生產(chǎn)上述劑型。在上述劑型的生產(chǎn)中用到的載體包括食用載體和藥物可接受賦形劑和稀釋劑。具體對(duì)于食品時(shí)，優(yōu)選可口的并能改善味覺(jué)的載體。
具體的優(yōu)選載體的實(shí)例包括如海藻糖(Hayashibara產(chǎn))、環(huán)糊精、Benekote BMI(Kao Corporation產(chǎn))等掩蔽劑。
所述含黃豆苷原的物質(zhì)、特定的微生物菌株、和任選的用于維持和促進(jìn)所述微生物生長(zhǎng)的成分的混合比例沒(méi)有特別嚴(yán)格的限制。然而，對(duì)于100克(g)本發(fā)明組合物，含黃豆苷原的物質(zhì)的比例優(yōu)選該組合物中含有約10-50mg黃豆苷原。在同樣100g本發(fā)明組合物中，微生物的比例優(yōu)選109到1010個(gè)細(xì)胞(活細(xì)胞)，低聚糖的比例優(yōu)選約在1-5g范圍內(nèi)。
因?yàn)楸景l(fā)明含異黃酮的組合物含有上述微生物菌株(主要是活細(xì)胞)，在加工成終產(chǎn)品的過(guò)程中，該組合物最好不要受熱和/或受壓。因此，在將本發(fā)明的組合物加工成為棒狀、顆粒狀、粉狀、片狀等形式時(shí)，最好加入所述微生物的凍干細(xì)胞或用適當(dāng)包衣材料包衣的凍干細(xì)胞。
本發(fā)明的組合物可以任意添加各種其他具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的食品添加劑或各種制藥領(lǐng)域常規(guī)使用的添加劑。上述食品添加劑包括鈣、維生素B、維生素D、維生素C、維生素E、和維生素K(具體說(shuō)是來(lái)源于蒸豆發(fā)酵菌的MK-7(甲基萘醌-7))?？梢约尤胛镔|(zhì)的其他實(shí)例包括鋅和硒。
得到的本發(fā)明含異黃酮的組合物用于防止和治療不明臨床綜合癥、絕經(jīng)期后的骨質(zhì)疏松和其他絕經(jīng)期綜合癥以及中老年婦女綜合癥。使需要接受這種預(yù)防和治療的中老年婦女服用或攝取有效量的本發(fā)明上述組合物，可以成功地實(shí)現(xiàn)這種預(yù)防和治療目的。該組合物的有效量沒(méi)有特別限制，只要它能成功地預(yù)防和治療不明臨床綜合癥、絕境期后的骨質(zhì)疏松或絕經(jīng)期綜合癥。通常，有效量?jī)?yōu)選如下，每天約攝取10-50mg黃豆苷原，及至少約10mg染料木苷原。
下面詳細(xì)描述本發(fā)明的含雌馬酚的組合物。
本發(fā)明的含雌馬酚的組合物包括使能夠利用黃豆苷原生產(chǎn)雌馬酚的微生物菌株作用于含黃豆苷原的物質(zhì)而得到的雌馬酚。
微生物菌株可以與上述本發(fā)明的含異黃酮的組合物中用到的微生物相同。所述微生物作用的含黃豆苷原的物質(zhì)也可以與本發(fā)明含異黃酮的組合物中提到的物質(zhì)相同，因此包括分離形式和純化形式的黃豆苷原、含黃豆苷原的食物、其加工產(chǎn)品和發(fā)酵產(chǎn)品、大豆異黃酮和來(lái)源于野葛、紅三葉草、alphalpha等的異黃酮、含這類(lèi)異黃酮的產(chǎn)品例如豆腐、豆奶、煮過(guò)的大豆、日本豆豉、大豆胚軸提取物等。
本發(fā)明的含雌馬酚的組合物非常安全，因?yàn)榫拖笄懊嫣岬降脑摻M合物的活性成分是一種天然物質(zhì)。而且，因?yàn)樵摻M合物通過(guò)微生物制備，因此它不僅不存在化學(xué)物質(zhì)等的污染物，還具有高產(chǎn)量和低成本的優(yōu)點(diǎn)。
可以通過(guò)常規(guī)發(fā)酵技術(shù)，利用所述含黃豆苷原的物質(zhì)，優(yōu)選大豆異黃酮或含大豆異黃酮的食物作為底物制備本發(fā)明的含雌馬酚的組合物。
更具體地說(shuō)，該技術(shù)包括對(duì)溶液形式的底物進(jìn)行滅菌，將預(yù)定的微生物菌株加入其中，在厭氧條件或恒定的需氧條件下37℃培養(yǎng)該混合物約48-96小時(shí)，以便進(jìn)行發(fā)酵。(如果需要，可以加入pH控制劑、還原物質(zhì)(例如酵母提取物、維生素K1))。
以中間型鏈球菌作為例子，可以如下述具體地進(jìn)行上述培養(yǎng)過(guò)程。首先，將黃豆苷原以0.01-0.5mg/ml范圍的濃度溶解于用于培養(yǎng)厭氧菌的改良GAM(改良的Gifu厭氧培養(yǎng)基)。使微生物在改良GAM中生長(zhǎng)約14小時(shí)制備種子培養(yǎng)物，然后將該種子培養(yǎng)物接種到上述含黃豆苷原的GAM中。接種量可以為培養(yǎng)基體積的1/100。接種后的培養(yǎng)基在37℃恒定條件下厭氧培養(yǎng)48-96小時(shí)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種利用所述微生物菌株制備雌馬酚的方法。
在上述發(fā)酵系統(tǒng)中，可以加入一種特別適于所述微生物維持和生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括低聚糖，例如半乳糖苷蔗糖、大豆低聚糖、乳果糖、乳糖醇、果糖低聚糖、和半乳糖低聚糖。所述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量沒(méi)有特別限制，但是通常優(yōu)選約為本發(fā)明組合物總重量的1-3％(重量)范圍內(nèi)。
由此可以得到所需的含雌馬酚的培養(yǎng)液。
可以用常規(guī)方法從該發(fā)酵液中分離和純化雌馬酚。典型的程序可以包括將發(fā)酵液吸附到離子交換樹(shù)脂(例如DIAION HP20，MitsubishiKasei Corporation)上，用甲醇洗脫目標(biāo)物質(zhì)，然后濃縮活性組分至干，這樣就得到了粗雌馬酚。
通過(guò)將上述制備的含雌馬酚的培養(yǎng)液或從中分離出來(lái)的雌馬酚與其他任選食品材料調(diào)配，制備適當(dāng)?shù)氖称坊蛩幬镏苿┬问降谋景l(fā)明含雌馬酚的組合物。
食品形式包括飲料、奶制品、發(fā)酵奶、棒狀物、顆粒、粉末、膠囊、和片狀物。藥物制劑形式包括水溶液、乳劑、顆粒劑、粉劑、膠囊、和片劑。可以用已知技術(shù)生產(chǎn)上述食品或藥物劑型。在生產(chǎn)這些劑型中用到的載體可以是任何食用載體和藥物可接受賦形劑和稀釋劑。具體到食品，載體優(yōu)選可口且能夠改善味覺(jué)的載體。
在得到的本發(fā)明組合物中雌馬酚的含量沒(méi)有特別限制，但是應(yīng)該可以根據(jù)想要的是食品形式還是藥物制劑形式確定該含量。然而，以總組合物量為100g計(jì)，雌馬酚的重量通常優(yōu)選約為10-50mg。
對(duì)于本發(fā)明組合物的攝取量沒(méi)有具體限制，但是通常如此選擇，即服用該組合物后雌馬酚的尿排泄量不低于5μmol/天。
本發(fā)明的含雌馬酚的組合物用于防止和治療中老年婦女不明臨床綜合癥、典型的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松綜合癥和絕經(jīng)期綜合癥。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式為了進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，如下提供了制備本發(fā)明的含異黃酮組合物和含雌馬酚組合物的實(shí)施例。然而應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍不因這些實(shí)施例而受到限制。實(shí)施例1飲料的制備按照下列配方稱(chēng)重混合各成分，以提供飲料形式的本發(fā)明的組合物。
水溶性大豆蛋白質(zhì)發(fā)酵液 10ml半乳糖苷蔗糖(含量為55％) 10.0g維生素和礦物質(zhì) q.s.
香精 q.s.
水q.s.
總量 150ml上述水溶性大豆蛋白質(zhì)發(fā)酵液通過(guò)如下方法制備，即將2.2g水溶性大豆蛋白質(zhì)溶解于10ml水中，然后向其中加入108個(gè)鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)細(xì)胞，最后于37℃培養(yǎng)該混合物48小時(shí)。實(shí)施例2發(fā)酵奶的制備按照下列配方稱(chēng)重并混合各成分，以提供發(fā)酵奶形式的本發(fā)明的含異黃酮組合物。
水溶性大豆蛋白質(zhì)2.2g半乳糖苷蔗糖(含量為55％) 10.0g鏈球菌A6G-225發(fā)酵奶 100ml維生素和礦物質(zhì) q.s.
香精 q.s.
水q.s.
總量 50ml水溶性大豆蛋白質(zhì)約含3-4％黃豆苷原(高效液相分析結(jié)果；下文同樣分析)。通過(guò)將108個(gè)鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)細(xì)胞加入到1升牛奶中，并于37℃培養(yǎng)該混合物24小時(shí)制備鏈球菌A6G-225發(fā)酵奶。實(shí)施例3
發(fā)酵豆奶凍干品的制備將1ml濃度約為107個(gè)細(xì)胞/ml的鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)懸浮液，作用于100g豆奶，于37℃進(jìn)行乳酸發(fā)酵24小時(shí)，以制備雌馬酚。冷凍干燥該產(chǎn)物。該凍干粉中雌馬酚的含量為0.1-0.3％(重量)。
按照下列配方稱(chēng)重并混合上述粉末和其他成分，以提供發(fā)酵豆奶凍干品形式的本發(fā)明組合物。
發(fā)酵豆奶凍干品2.2g賦形劑q.s.
維生素和礦物質(zhì)q.s.
香精 q.s.
總量 20g17g玉米淀粉用作賦形劑。實(shí)施例4粉狀物的制備按照下列配方稱(chēng)重并混合各成分，以提供粉末形式的本發(fā)明的組合物。
粗大豆異黃酮粉4.1g半乳糖苷蔗糖(含量為55％) 10.0g鏈球菌E-23-17凍干品 1.0g維生素和礦物質(zhì) q.s.
香精 q.s.
總量 20g
鏈球菌E-23-17凍干品如下制備，使鏈球菌E-23-17(FERM BP-6436)在適當(dāng)?shù)囊后w生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GAM液體培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)(37℃，24-48小時(shí))，冷凍干燥得到的培養(yǎng)物。該凍干粉末中細(xì)菌細(xì)胞的含量為109-1010個(gè)細(xì)胞/g。實(shí)施例5顆粒物的制備按照下列配方稱(chēng)重并混合各成分，以制備顆粒物形式的本發(fā)明的組合物。
粗大豆異黃酮粉4.1g半乳糖苷蔗糖(含量為55％) 10.0g鏈球菌E-23-17凍干品 1.0g山梨醇 q.s.
維生素和礦物質(zhì) q.s.
香精q.s.
總量20g與實(shí)施例4中相同的凍干粉用作鏈球菌E-23-17凍干品。實(shí)施例6雌馬酚的微生物制品用水溶性大豆異黃酮材料(“Fujiflavone P10”，F(xiàn)ujicco)作為底物，將1ml含107-109個(gè)鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)細(xì)胞的培養(yǎng)厭氧細(xì)菌的GAM懸浮液加入到2.2％的上述底物水溶液中。在37℃，恒定條件下厭氧培養(yǎng)該混合物96小時(shí)，發(fā)酵液中生成的雌馬酚的含量通過(guò)HPLC測(cè)定。上述水溶液中黃豆苷的含量為1.083mg/ml，黃豆苷原的含量為0.014mg/ml。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管水溶性大豆異黃酮材料中沒(méi)有檢測(cè)到雌馬酚，但是培養(yǎng)96小時(shí)后的發(fā)酵液中雌馬酚的含量為613.0±8.7μg/ml(5次檢測(cè)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。該發(fā)酵液中沒(méi)有檢測(cè)到黃豆苷和黃豆苷原。
用含0.01mg/ml黃豆苷原(Funakoshi產(chǎn)，純度≥99％)的底物溶液(5mg黃豆苷原懸浮于2ml特級(jí)甲醇，然后用BHI(腦心浸劑)培養(yǎng)基稀釋到50ml)替換上述水溶性大豆異黃酮材料，然后用如上述同樣的方法制備雌馬酚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)96小時(shí)后的發(fā)酵液中，雌馬酚的含量為17.4±1.4μg/ml(5次檢測(cè)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。
因此，顯然通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的微生物，可以利用黃豆苷原高效生產(chǎn)雌馬酚。實(shí)施例7飲料的制備含雌馬酚的發(fā)酵液1.55g葡萄糖 5.00g檸檬酸 0.5g維生素和礦物質(zhì) q.s.
香精 q.s.
水 q.s.
總量 200ml以實(shí)施例6中的同樣方式，即將1ml含107-109個(gè)鏈球菌A6G-225(FERM BP-6437)細(xì)胞的培養(yǎng)厭氧細(xì)菌的GAM懸浮液加入到2.2％水溶性大豆異黃酮材料(“Fujiflavone P10”，F(xiàn)ujicco)的水溶液中，在37℃，恒定條件下厭氧培養(yǎng)該混合物96小時(shí)。按照上述配方混合如此得到含雌馬酚的發(fā)酵液和其他成分，制備飲料形式的本發(fā)明的組合物。實(shí)施例8棒狀物的制備含雌馬酚的發(fā)酵液 1.55g黃油 20.0g糖20.0g鹽少量蛋1/2小麥粉 80.0g維生素和礦物質(zhì) q.s.
香精 q.s.
牛奶 30.0g用實(shí)施例7中描述的含雌馬酚的發(fā)酵液按照上述配方，制做生面團(tuán)，放入適當(dāng)?shù)陌魻钅＞咧谐尚?，然后放入烤箱中?70℃烘烤15分鐘，從而制的棒狀餅。實(shí)施例9果凍的制備含雌馬酚的發(fā)酵液 1.55g果汁 50.0g糖50.0g瓊脂 2.5g維生素和礦物質(zhì) q.s香精 q.s.
用實(shí)施例7中描述的含雌馬酚的發(fā)酵液按照上述配方，混合各種成分，加熱到90℃并不斷攪拌以使瓊脂溶解，然后全部注入適當(dāng)?shù)谋又校鼓z在5-10℃冷卻，從而制得果凍形式的本發(fā)明的組合物。
工業(yè)實(shí)用性當(dāng)攝取或服用食品或藥品形式的本發(fā)明的組合物后，證明對(duì)預(yù)防和減緩中老年婦女不明臨床綜合癥或絕經(jīng)期綜合癥有效。
權(quán)利要求
1.一種將含黃豆苷原的物質(zhì)和能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株作為基本成分的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株為至少一種選自卵形類(lèi)桿菌、中間型鏈球菌和constellatus鏈球菌的菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株為至少一種選自保藏號(hào)為FERM BP-6435的類(lèi)桿菌E-23-15，保藏號(hào)為FERM BP-6436的鏈球菌E-23-17，和保藏號(hào)為FERMBP-6437的鏈球菌A6G-225的菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，該組合物進(jìn)一步含有至少一種有利于維持和生長(zhǎng)能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株的成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其中有利于維持和生長(zhǎng)能夠使黃豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株的成分為至少一種選自半乳糖苷蔗糖、大豆低聚糖、乳果糖、乳糖醇和果糖低聚糖的物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中含黃豆苷原的物質(zhì)進(jìn)一步含有至少一種選自染料木苷原、黃豆苷和染料木苷的成分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中含黃豆苷原的物質(zhì)為大豆異黃酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，該組合物用于預(yù)防和治療中老年婦女不明臨床綜合癥，包括絕經(jīng)期綜合癥。
9.權(quán)利要求8的組合物，該組合物為食品形式。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中食品形式選自飲料、奶制品、發(fā)酵奶、棒狀品、顆粒物、粉狀物、膠囊和片劑。
11.權(quán)利要求8的組合物，該組合物為藥物制劑形式。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中藥物制劑形式選自水溶液、乳劑、顆粒劑、粉劑、膠囊和片劑。
13.預(yù)防和治療中老年婦女不明臨床綜合癥或絕經(jīng)期綜合癥的方法，該方法包括給需要所述預(yù)防和治療的中老年婦女服用有效量的權(quán)利要求1的組合物。
14.一種微生物的應(yīng)用，該微生物能夠利用含黃豆苷原的物質(zhì)或黃豆苷原加工出雌馬酚用于有效預(yù)防和治療中老年婦女不明臨床綜合癥或絕經(jīng)期綜合癥的本發(fā)明組合物的制備。
15.一種含雌馬酚的組合物，其中雌馬酚是由能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株作用于含黃豆苷原的物質(zhì)而得到的。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株為至少一種選自卵形類(lèi)桿菌、中間型鏈球菌和constellatus鏈球菌的菌株。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株為至少一種選自保藏號(hào)為FERM BP-6435的類(lèi)桿菌E-23-15，保藏號(hào)為FERM BP-6436的鏈球菌E-23-17，和保藏號(hào)為FERM BP-6437的鏈球菌A6G-225的菌株。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，該組合物進(jìn)一步含有至少一種有利于維持和生長(zhǎng)能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株的成分。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中有利于維持和生長(zhǎng)能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株的成分為至少一種選自半乳糖苷蔗糖、大豆低聚糖、乳果糖、乳糖醇和果糖低聚糖的物質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中所述含黃豆苷原的物質(zhì)進(jìn)一步含有至少一種選自染料木苷原、黃豆苷和染料木苷的成分。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中含黃豆苷原的物質(zhì)為大豆異黃酮。
22.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，該組合物用于預(yù)防和治療中老年婦女不明臨床綜合癥，包括絕經(jīng)期綜合癥。
23.權(quán)利要求22的組合物，該組合物為食品形式。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的組合物，其中所述食品形式選自飲料、奶制品、發(fā)酵奶、棒狀品、顆粒物、粉狀物、膠囊和片劑。
25.權(quán)利要求22的組合物，該組合物為藥物制劑形式。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其中所述藥物制劑形式選自水溶液、乳劑、顆粒劑、粉劑、膠囊和片劑。
27.預(yù)防和治療中老年婦女不明臨床綜合癥或絕經(jīng)期綜合癥的方法，該方法包括給需要所述預(yù)防和治療的中老年婦女服用有效量的權(quán)利要求15的組合物。
28.一種微生物的應(yīng)用，該微生物能夠利用含黃豆苷原的物質(zhì)或黃豆苷原加工出雌馬酚用于有效預(yù)防和治療中老年婦女不明臨床綜合癥或絕經(jīng)期綜合癥的本發(fā)明組合物的制備。
29.制備雌馬酚的方法，該方法包括使能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株作用于黃豆苷原。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株為至少一種選自卵形類(lèi)桿菌、中間型鏈球菌和constellatus鏈球菌的菌株。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝成為雌馬酚的微生物菌株為至少一種選自保藏號(hào)為FERM BP-6435的類(lèi)桿菌E-23-15，保藏號(hào)為FERM BP-6436的鏈球菌E-23-17，和保藏號(hào)為FERMBP-6437的鏈球菌A6G-225的菌株。
32.一種選自保藏號(hào)為FERM BP-6435的類(lèi)桿菌E-23-15，保藏號(hào)為FERM BP-6436的鏈球菌E-23-17，和保藏號(hào)為FERM BP-6437的鏈球菌A6G-225的微生物菌株。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種組合物,該組合物含有作為基本成分的含黃豆苷原的物質(zhì)和能夠?qū)ⅫS豆苷原代謝為雌馬酚的微生物菌株。該組合物在預(yù)防和減緩包括絕經(jīng)期綜合癥在內(nèi)的中老年婦女不明臨床綜合癥有效,迄今為止沒(méi)有發(fā)現(xiàn)預(yù)防和減緩這類(lèi)綜合癥的有效方法。
文檔編號(hào)A61K31/35GK1265596SQ98807930
公開(kāi)日2000年9月6日 申請(qǐng)日期1998年8月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年8月8日
發(fā)明者內(nèi)山成人, 上野友美, 今泉記代子, 久米村惠, 正木恭介, 清水精一 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社