專利名稱：用pADPRT抑制劑治療炎癥和炎性疾病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)炎癥和炎性疾病(包括關(guān)節(jié)炎)的方法。本發(fā)明還涉及治療患有因脂多糖全身性感染或侵襲而引起的革蘭陰性和革蘭陽性內(nèi)毒素癥狀的動(dòng)物或哺乳動(dòng)物的方法。這些方法涉及采用治療有效量的pADPRT抑制性化合物。
背景技術(shù)：
已經(jīng)報(bào)道pADPRT抑制性化合物可用來治療癌癥和病毒感染。這些方法的例子在美國專利No.5,464,871；5,473,074；5,482,975；5,484,951；5,516,941和5,583,155中有所描述，這些專利內(nèi)容均納入本文作參考。
在出版的文獻(xiàn)中，最近已經(jīng)表明，5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)(一種新的核酶多腺苷二磷酸核糖聚合酶(pADPRT)抑制劑)在Ha-ras轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞系中抑制體內(nèi)致腫瘤作用；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377。INH2BP的處理還導(dǎo)致拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II和MAP激酶活性發(fā)生改變；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377。根據(jù)觀察到的效果，已經(jīng)提出了關(guān)于INH2BP在治療癌癥中有潛在應(yīng)用的假設(shè)；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377。
惡性生長和發(fā)炎過程均具有某些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的激活作用，例如MAP激酶；Kyriakis等人，1996，″警告由應(yīng)力和發(fā)炎激活的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)″，J.BiolChem.27124313-24316；Ferrell，JE，1996，″打開難以置信的開關(guān)蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)怎樣能將分級(jí)的輸入轉(zhuǎn)變成類似開關(guān)的輸出″TIBS 21460-466。慢性炎癥通常導(dǎo)致致癌轉(zhuǎn)化作用，例如在腸上皮例子中所證明的；Kawai等人，1993，″脂多糖誘導(dǎo)炎癥增強(qiáng)大鼠膀胱致癌作用″Cancer Res.535172-5；Rosin等人，1994，″炎癥、染色體不穩(wěn)定和癌癥血吸蟲病模型″Caner Res.54(第7增版)1929s-1933s；Choi等人，1994，″Crohn疾病和潰瘍性結(jié)腸炎的結(jié)腸直腸癌的相似性致癌作用的暗示和預(yù)防″Gut 35950-4。根據(jù)慢性炎癥和致癌轉(zhuǎn)化之間的關(guān)聯(lián)，本研究的目的是調(diào)查INH2BP是否在體外和體內(nèi)影響炎癥過程。在我們的研究中，多種促炎中介體由細(xì)菌脂多糖(內(nèi)毒素，LPS)誘導(dǎo)產(chǎn)生。已知LPS誘導(dǎo)了大量細(xì)胞反應(yīng)，并觸發(fā)了全身性炎癥反應(yīng)。LPS誘導(dǎo)的促炎中介體包括腫瘤壞死因子α(TNF)、白細(xì)胞介素-1、γ干擾素，而抗炎性中介體包括白細(xì)胞介素-10(IL-10)和白細(xì)胞介素13；Deltenre等人，1995，″胃癌幽門螺桿菌蹤跡″Acta Gastroenterol Belg.58193-200；Beutler，1995，″TNF、免疫力和炎性疾病過去十年的教訓(xùn)″J.Invest.Med.42277-35；Liles等人，1995，″綜述參與炎癥和宿主免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子的命名法和生物意義″J.Infect.Dis.1721573-80；Giroir，1993，″膿毒休克的中介體打斷內(nèi)源性炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方法″Critical Car.Med.21780-9。由于產(chǎn)生了這些炎性細(xì)胞因子，LPS引發(fā)產(chǎn)生炎性自由基(氧集中的自由基如超氧化物，和氮集中的自由基如一氧化氮[NO])和前列腺素；Nathan，1992，″一氧化氮作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌型產(chǎn)物″FASEB J.63051-3064；Vane，J.R.，The Croonian Lecture 1993，″內(nèi)皮血液循環(huán)的大師(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343225-246；Szabo，C.；1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″New Horizons 33-32。炎癥時(shí)產(chǎn)生NO是由于NO合成酶的一種獨(dú)特的同種型(iNOS)的表達(dá)，而炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生則解釋成表達(dá)出環(huán)加氧酶的獨(dú)特同種型(環(huán)加氧酶-2，COX-2)；Nathan，1992，″一氧化氮作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌型產(chǎn)物″FASEB J.63051-3064；Vane，J.R.，The Croonian Lecture 1993，″內(nèi)皮血液循環(huán)的大師(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343225-246；Szabo，C.；1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″New Horizons 33-32。iNOS、COX-2以及上述促炎細(xì)胞因子和自由基在LPS誘導(dǎo)的發(fā)炎反應(yīng)中起重要作用；Nathan，1992，″一氧化氮作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌型產(chǎn)物″FASEB J.63051-3064；Vane，J.R.，The Croonian Lecture 1993，″內(nèi)皮血液循環(huán)的大師(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343225-246；Szabo，C.；1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″New Horizons 33-32。另外，已有暗示，NO(或其毒性副產(chǎn)物過氧亞硝酸鹽(peroxynitrite))是導(dǎo)致發(fā)炎反應(yīng)轉(zhuǎn)化成致癌過程的關(guān)鍵中介體；Bartsch等人，1994，″人癌癥病因?qū)W中內(nèi)源性形成的N-亞硝基化合物和亞硝基化試劑″Pharmacogenetics 2272-7；Liu等人，1992，″旱獺肝炎病毒表面抗原誘導(dǎo)肝細(xì)胞中合成NO在肝癌形成中可能的作用″Carcinogenesis152875-7；Ohshima等人，1994，″作為癌癥危險(xiǎn)因子的慢性感染和發(fā)炎過程一氧化氮在致癌作用中可能的作用″Mutation Res.305253-64。在目前的研究中，我們首次調(diào)查了INH2BP的處理是否影響LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中炎性中介體腫瘤壞死因子α[TNF]、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-6、NO和前列腺素的體內(nèi)產(chǎn)生。
有許多胞內(nèi)過程產(chǎn)生促炎中介體。酪氨酸激酶的激活；Levitzki，A.，1994，″信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)治療。治療疾病的一種新方法″Eur.J.Biochem.2261-13；Novogrodeky等人，1994，″通過酪氨酸激酶抑制劑防止脂多糖誘導(dǎo)的致死毒性″Science264U(Wash)1319-22；Marczin等人，1993，″酪氮酸激酶抑制劑阻抑大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的內(nèi)毒素和IL-1β誘導(dǎo)的NO合成″Am.J.Physiol.265H1014-1018；促細(xì)胞分裂原活化的蛋白激酶(MAP激酶)；Matsuda等人，1994，″促細(xì)胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶激酶/MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通道″J.Leukocyte Biol.56548-53；L′Allemain，G.，1994，″破譯MAP激酶通道″Progr.Growth Factor Res.5291-334；Cowley等人，1994，″MAP激酶激酶的激活對(duì)于PC12分化和轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞來說充分必要的″Cells 77841-52；和核因子κB(NF-κB)通道；Baeuerle等人，1994，″免疫系統(tǒng)中的NF-B的功能和活化″Ann.Rev.Immunol.12141-79；Schreck等人，1992，″核因子κB真核細(xì)胞的氧化應(yīng)力響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子(綜述)”Free Radical Res.Comm 17221-37；Muller等人，1993，″核因子κB，一種脂多糖效應(yīng)的中介體″Immunobiol.187233-56；它們被認(rèn)為是發(fā)炎反應(yīng)中的重要因子，并對(duì)炎性中介體的表達(dá)或產(chǎn)生有作用。因此，我們已經(jīng)調(diào)查了INH2BP是否還影響LPS誘導(dǎo)的MAP激酶和NF-κB活化。目前的研究結(jié)果表明，INH2BP具有通過調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)發(fā)炎反應(yīng)的多個(gè)組分的強(qiáng)效抗炎效果。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)炎癥或炎性疾病的方法，該方法包括給予所述動(dòng)物或哺乳動(dòng)物有效量的pADPRT抑制性化合物的步驟。
本發(fā)明另一方面是一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)炎癥或炎性疾病的方法，該方法包括給予有效量的pADPRT抑制性化合物的步驟，其中pADPRT抑制性化合物選自具有下式的化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各選自氫、羥基、氨基、烷基、烷氧基、環(huán)烷基或苯酚，這些基團(tuán)可任意被烷基、烷氧基、羥基或鹵素取代，R1、R2、R3、R4、R5和R6中只有一個(gè)是氨基；具有下式的化合物
其中R1、R2、R3、R4和R5各自選自氫、羥基、氨基、烷基、烷氧基、環(huán)烷基或苯酚，這些基團(tuán)可任意被烷基、烷氧基、羥基或鹵素取代，R1、R2、R3、R4、R5中只有一個(gè)是氨基；和具有下式的化合物
其中R1、R2、R3、R4和R5各自選自氫、羥基、氨基、烷基、烷氧基、環(huán)烷基或苯酚，這些基團(tuán)可任意被烷基、烷氧基、羥基或鹵素取代，R1、R2、R3、R4和R5中只有一個(gè)是氨基。
較佳的pADPRT化合物包括6-氨基-1，2-苯并吡喃酮、3-亞硝基苯甲酰胺、5-氨基-1(2H)-異喹啉酮、7-氨基-1(2H)-異喹啉酮和8-氨基-1(2H)-異喹啉酮。
本發(fā)明還有一個(gè)方面包括一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)革蘭陰性和革蘭陽性誘導(dǎo)的癥狀的方法，所述方法包括給予動(dòng)物或哺乳動(dòng)物治療有效量的pADPRT抑制性化合物的步驟。
本發(fā)明還有一個(gè)方面是一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)革蘭陰性和革蘭陽性菌誘導(dǎo)的內(nèi)毒素癥狀，該方法包括給予動(dòng)物或哺乳動(dòng)物治療有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物選自上述的化合物I、化合物II或化合物III。
本發(fā)明還有一方面涉及一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)革蘭陰性和革蘭陽性誘導(dǎo)的內(nèi)毒素癥狀，該方法包括給予動(dòng)物或哺乳動(dòng)物治療有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物具有上述化合物I、化合物II或化合物III所示的結(jié)構(gòu)式。
本發(fā)明還有一方面是一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)關(guān)節(jié)炎的方法，該方法包括給予有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物具有上述化合物I、化合物II或化合物III所示的結(jié)構(gòu)式。
本發(fā)明還有一方面是一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)Chron疾病的方法，該方法包括給予有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物具有上述化合物I、II或III所示的結(jié)構(gòu)式。
本發(fā)明還有一方面是一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)Barrett疾病的方法，該方法包括給予有效量的pADPRT抑制性化合物，其中所述化合物具有上述化合物I、II或III所示的結(jié)構(gòu)式。
本發(fā)明的pADPRT抑制性化合物可用美國專利No.5,464,871；5,473,074；5,482,975；5,484,951；5,516,941和5,583,155中描述的方法制得，這些專利公開內(nèi)容納入本文作參考。
用于本發(fā)明方法的較佳的化合物包括鹵素基團(tuán)是碘、一個(gè)R基團(tuán)是氨基、一個(gè)R基團(tuán)可以是亞硝基或硝基(如上述專利所述)的那些化合物，但是較佳的是R基團(tuán)為氨基。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)獯糠峙c氨基部分毗鄰時(shí)，pADPRT的抑制活性強(qiáng)顯示。在任何情況下，用于本發(fā)明方法的化合物應(yīng)具有pADPRT抑制活性。
化合物可單獨(dú)使用，或較佳的是和本領(lǐng)域已知的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽或其它合適的藥學(xué)載體組合使用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1。INH2BP對(duì)J774細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的(a)亞硝酸鹽的產(chǎn)生、(b)6-酮前列腺素F1α的產(chǎn)生、(c)TNF的產(chǎn)生和(d)線粒體呼吸作用的阻抑的影響。TNF在LPS后4小時(shí)測(cè)定，其它所有參數(shù)在LPS后24小時(shí)測(cè)定。**代表應(yīng)答LPS有顯著變化(與對(duì)照(p＜0.01)相比)；##代表INH2BP在LPS存在下有顯著效應(yīng)(與單用LPS相比(p＜0.01))；n＝6-12孔。
圖2。INH2BP抑制J774和RAW 264.7細(xì)胞中的iNOS表達(dá)。(a)在對(duì)照條件下(泳道1)、LPS處理后4小時(shí)(泳道2)和有INH2BP(100μM)存在的細(xì)胞經(jīng)LPS處理后4小時(shí)(泳道3)，J774細(xì)胞(A)和RAW 264.7巨噬細(xì)胞(B)中iNOS和18s mRNA的代表性的Northern印跡。(b)在對(duì)照條件(C和C+INH2BP)以及LPS處理后12小時(shí)(LPS和LPS+INH2BP)，INH2BP對(duì)J774細(xì)胞勻漿物的iNOS活性的影響。**代表LPS在與對(duì)照相比時(shí)的顯著效應(yīng)(p＜0.01)；##代表INH2BP有顯著的抑制性(p＜0.01)；n＝4。(c)J774對(duì)照細(xì)胞以及LPS處理后12小時(shí)存在或不存在INH2BP的細(xì)胞中的代表性的iNOS Western印跡。
圖3。(a)在給予LPS前2小時(shí)、給予LPS同時(shí)或給予LPS后2、4和6小時(shí)時(shí)，INH2BP(100μM)抑制亞硝酸鹽積累的時(shí)間依賴型損失。(b)INH2BP對(duì)經(jīng)LPS和IFN組合刺激的J774細(xì)胞中亞硝酸鹽累積的影響；n＝6-12孔。
圖4。INH2BP對(duì)RAW264.7細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)螢光素酶活性的影響，該細(xì)胞用全長(約1592bp)或缺失型(約367bp)iNOS啟動(dòng)子-螢光素酶構(gòu)建物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在經(jīng)全長或缺失型構(gòu)建物(黑條)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，LPS的處理(10微克/毫升，4小時(shí))導(dǎo)致螢光素酶活性的誘導(dǎo)是對(duì)照值的10-12倍。和INH2BP的共同處理抑制了經(jīng)全長構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中LPS介導(dǎo)的螢光素酶活性的增加，但是在經(jīng)約367bp的缺失型構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒有顯著的影響(灰色條)。數(shù)據(jù)表示成螢光素酶活性比對(duì)照細(xì)胞增加的倍數(shù)，并校正成各自的β葡糖苷酶活性。*代表在LPS存在時(shí)INH2BP有顯著的效應(yīng)(與單用LPS相比(p＜0.05))；n＝4次分開的轉(zhuǎn)染。
圖5。INH2BP阻抑神志清醒的大鼠中iNOS的誘導(dǎo)。在LPS前10分鐘(INH2BP+LPS)或LPS后2小時(shí)(LPS+INH2BP)時(shí)，對(duì)照大鼠(c)、注射了INH2BP的大鼠(INH2BP)、注射了LPS(15毫克/千克，腹膜內(nèi)，6小時(shí))的大鼠中的肺勻漿物(a)和血漿亞硝酸鹽-硝酸鹽濃縮物(b)的iNOS活性；以及用INH2BP處理(10毫克/千克，腹膜內(nèi))的效果。**代表與對(duì)照相比顯著的LPS效應(yīng)(p＜0.01)；##代表pADPRT抑制劑的顯著抑制性(p＜0.01)；n＝4-5。
圖6。給予LPS(4毫克/千克，腹膜內(nèi))后90分鐘時(shí)，INH2BP對(duì)小鼠中LPS誘導(dǎo)的TNF、IL-10和IL-6應(yīng)答的影響。##代表與對(duì)照相比顯著的LPS效應(yīng)(p＜0.01)；##代表INH2BP對(duì)應(yīng)答顯著的增強(qiáng)作用(p＜0.01)；n＝4-5。
圖7。INH2BP提高了經(jīng)受內(nèi)毒素休克的小鼠的存活I(lǐng)NH2BP預(yù)處理(0.3-10毫克/千克)對(duì)小鼠體內(nèi)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的(120毫克/千克，腹膜內(nèi))致死性的影響；每組有7-8只動(dòng)物。
圖8。(a)在100μM PD 98059或150μM INH2BP存在或不存在下，載體或LPS(10微克/毫升)處理后24小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞中的MAP激酶活性。數(shù)據(jù)代表典型試驗(yàn)中獲得的數(shù)值三個(gè)不同的試驗(yàn)日看到了類似的結(jié)果。(b)在150μMINH2BP存在或不存在下，載體或LPS處理后24小時(shí)的RAW264.7細(xì)胞中的典型凝膠內(nèi)MAP激酶試驗(yàn)。泳道1-4分別代表下列組1載體處理過的對(duì)照；2LPS處理組；3150μM INH2BP存在下的載體處理組；4150μM INH2BP存在下的LPS處理組。
圖9。用INH2BP抑制pADPRT沒有改變核抽提物的NF-κB Western印跡的核轉(zhuǎn)位，所述核抽提物來自對(duì)照J(rèn)74細(xì)胞以及在INH2BP(100μM)存在或不存在下經(jīng)LPS處理后90分鐘的細(xì)胞。
圖10。描述了INH2BP對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫(paw edema)發(fā)展的影響。數(shù)據(jù)顯示了注射角叉菜膠后1-4小時(shí)的獸爪體積(平均值±SEM，每組有6只動(dòng)物)。從1小時(shí)起，獸爪體積有顯著增加(p＜0.01)，且INH2BP在1-4小時(shí)顯著地抑制了獸爪水腫的發(fā)展。
圖11。描述了INH2BP對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的開始的影響。圖中示出了患關(guān)節(jié)炎小鼠的百分?jǐn)?shù)(關(guān)節(jié)炎臨床評(píng)分大于1的小鼠)。21天處的箭頭表示第二次膠原免疫的時(shí)間，從第25天起的水平條代表INH2BP(N＝6)或載體(N-10)處理開始的時(shí)間。
圖12。描述了INH2BP對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性的影響。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎期間的關(guān)節(jié)炎評(píng)分中值。21天處的箭頭表示第二次膠原免疫的時(shí)間，從25天起的水平條代表用INH2BP(n-6)或載體(n＝10)處理開始的時(shí)間。從第26天起，關(guān)節(jié)炎評(píng)分明顯增加(Ip＜0.01)，26-35天之間INH2BP對(duì)關(guān)節(jié)炎評(píng)分有顯著的阻抑作用(#p＜0.05)。
本發(fā)明較佳實(shí)例描述定義如本文所用的，“抗炎性”疾病指身體組織有發(fā)炎的疾病或病癥。這些疾病例如包括Chron疾病、Barrett疾病、關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、心肌病、結(jié)腸炎、感染性腦膜炎、腦炎等。
“藥學(xué)上可接受的酸加成鹽”指保留了生物效果和游離堿性質(zhì)的那些鹽，它們可通過和無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲磺酸、水楊酸等)反應(yīng)獲得。
“ADPRT”指腺苷二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，也稱為多腺苷二磷酸核糖聚合酶(EC2.4.99)，它是一種催化ADP-核糖聚合反應(yīng)的真核生物特異性DNA結(jié)合核蛋白。酶促過程取決于DNA。
“烷基”指飽和或不飽和的、支鏈或直鏈烴基。典型的烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等。
“烷氧基”指基團(tuán)-O-烷基。典型烷氧基是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基和戊氧基等。
“環(huán)烷基”指飽和的含有3-8個(gè)碳原子的單環(huán)烴基，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基等。
“取代的苯基”指所有可能的異構(gòu)苯基，如用選自烷基、烷氧基、羥基或鹵素的取代基單取代或雙取代的苯基。
“鹵素”指氯代、氟代、溴代或碘代，較佳的是碘代。
本發(fā)明的pADPRT抑制性化合物(尤其是上述的化合物I、II或III)是強(qiáng)效、專一和非毒性的抗炎化合物，它可用于通常已知是炎癥的病癥和疾病(例如關(guān)節(jié)炎、Chron疾病、Barrett疾病等)。另外，這些化合物可用來治療與革蘭陰性和革蘭陽性誘導(dǎo)的感染相關(guān)的病癥，尤其是與革蘭陰性感染相關(guān)的疾病，包括與脂多糖疾病和膿毒癥相關(guān)的疾病。該化合物是尤其適用的，因?yàn)樗词褂卸拘?，毒性也非常低?br> 在實(shí)踐中，本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可以足以抑制動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)炎性疾病或病癥和/或預(yù)防炎癥或炎性疾病的量來給予，并且可用于最適用于這些用途的藥物形式。
本文所述的活性化合物和鹽可通過接受的治療劑給藥方式來給藥。這些方法包括全身性或局部給藥，例如口服、腸胃外、經(jīng)皮(transdermal)、皮下或局部外用給藥方式。這些藥物的較佳的給藥方法是口服。在一些例子中，需要以其它腸胃外形式給予組合物。
根據(jù)所采用的給藥方式，組合物可以是固體、半固體或液體劑型，例如是可注射劑、片劑、栓劑、丸劑、時(shí)釋膠囊、粉劑、液體、懸浮液等，較佳的是單位劑型。組合物可包括有效量的活性pADPRT抑制性化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，另外它還可包括任何常規(guī)的藥物賦形劑和其它醫(yī)學(xué)或藥學(xué)上的藥物或制劑、載體、佐劑、稀釋劑等，這些均是藥學(xué)上常規(guī)的。
對(duì)于固體組合物，可采用這些賦形劑，包括藥用級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。利用例如聚二醇(如丙二醇)作為載體，還可將上述活性pADPRT抑制性化合物配制成栓劑。
液體、尤其是可注射組合物例如可這樣制得將活性化合物溶解、分散在藥用溶液(例如水、鹽水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等)中，從而形成可注射的溶液或懸浮液。
如果需要，待給予的藥物組合物還可含有少量無毒性的輔助物質(zhì)(如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑)，以及其它物質(zhì)(例如醋酸鈉、三乙醇胺油酸鹽等)。
另外，如果需要，待給予的藥物組合物可含有脂質(zhì)體配方，其包含磷脂、帶負(fù)電荷的磷脂和選自膽固醇、膽固醇脂肪酸酯或不飽和脂肪酸的化合物。典型的中性磷脂包括L-a-磷脂酰膽堿、L-a-磷脂酰肌醇、L-a-磷脂酰-絲氨酸、L-a-磷脂酰肌醇、L-a-磷脂酸、L-a-磷脂酰甘油、L-a-溶血磷脂酰膽堿、鞘磷脂和心肌磷脂。
典型的帶負(fù)電荷的磷脂包括二酰磷酸或磷酸二甘油酯，例如二月桂酰磷酸、二肉豆蔻酰磷酸、二棕櫚酰磷酸、二硬脂酰(disteroyl)磷酸。
典型的膽固醇和膽固醇醚包括膽固醇、3S-羥基-5-膽甾烯、聚氧乙烷膽甾醇癸二酸酯、膽固醇-5，6-環(huán)氧化物、膽甾醇乙酸酯、膽甾醇正丁基醚、膽甾醇癸酸酯、膽甾醇十二烷酸酯、膽甾醇乙醚、膽甾醇十七烷酸酯、膽甾醇甲酯。
典型的不飽和脂肪酸包括花生四烯酸、二十二烷六烯酸、反油酸、芥酸、亞油酸、亞麻酸、神經(jīng)酸、油酸、棕櫚油酸、巖芹酸。鹵代硝基化合物可根據(jù)1993年2月19日提交的題目為“脂質(zhì)體配方及其制備方法和使用”的專利申請(qǐng)No.08/020,035中的方法包封或分配到脂質(zhì)體配方的脂質(zhì)體雙層中，該專利納入本文作參考。
在第一個(gè)實(shí)例中，首先形成脂質(zhì)體，然后加入C-氨基、亞硝基或硝基化合物。C-氨基、亞硝基或硝基化合物分配入(即使其自身進(jìn)入)(而不是包封)脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層。為了制備該組合物，通常是將組分(例如磷脂酰膽堿、二乙酰磷酸和膽固醇)和溶劑(如氯仿)混合?；旌虾蟪ヂ确?。然后加入水。當(dāng)將水加入脂質(zhì)體后，它形成了多層脂質(zhì)體(即脂質(zhì)體與具有多層的洋蔥表皮類似)。下一步是對(duì)其進(jìn)行冷融。將其置于液氮中迅速冷卻。迅速凍融的目的是使脂質(zhì)體的大小更均一。此時(shí)脂質(zhì)體的大小是不同的，要處理一次或多次，通常再處理5次。融化在37℃水浴中進(jìn)行。在凍融前，超聲破碎混合物。超聲破碎和融化的組合減少了皮層的數(shù)量。目的是產(chǎn)生單層(unilamellar)系統(tǒng)。此時(shí)，加入C-亞硝基化合物至10毫摩爾的濃度。該濃度可超過15毫摩爾。就脂質(zhì)的這一濃度而言，對(duì)于60毫升批量來說，脂質(zhì)總濃度為648毫克，其中加入60毫升水。磷脂酰膽堿為500毫克，膽固醇為36毫克；二乙酰磷酸為112克。
增加混合物中脂質(zhì)體濃度能使其含有更多的C-氨基、亞硝基或硝基化合物。例如，它可以濃縮成上述混合物中濃度的兩倍。對(duì)于60毫升批量來說，可使數(shù)量增加一倍至含有1000毫克磷脂酰膽堿、224毫克二乙酰磷酸和72毫克膽固醇。降低濃度則減少了進(jìn)入其中的C-亞硝基化合物的量。對(duì)于假定的60毫升批量而言，C-氨基化合物的上限達(dá)到15毫摩爾的C-氨基化合物濃度。對(duì)于3-亞硝基苯甲酰胺而言，該上限為135毫克(60毫升批量)。
下一步是重新水合。然后，該過程的下一步是用擠壓機(jī)(LipexBiomembranes，Inc.Vancouver，British Columbia，Canada)擠出。
擠出過程有兩個(gè)目的1)使脂質(zhì)體的大小均一；和2)滅菌。
擠出通常包括過濾通過j0.1微米的過濾器，然后通常是冷凍干燥混合物，將混合物凍干(從中除去水，使其變成細(xì)粉)。這提高了溶解度，可以建立大約40毫摩爾的溶液，該濃度比冷凍干燥前濃縮了大約3倍。冷凍干燥產(chǎn)生了粉末狀脂質(zhì)和粉末狀C-氨基化合物的混合物?，F(xiàn)在，就可用相同量的C-氨基化合物和更少量的脂質(zhì)來制成更濃縮的混合物。例如，可用相同重量的C-氨基、亞硝基或硝基化合物，但是體積只有原來體積的三分之一。
也可對(duì)上述過程的步驟進(jìn)行改進(jìn)，例如除去諸如冷凍干燥的步驟。
第一個(gè)實(shí)例的這種方法沒有顯著地包封C-氨基、亞硝基或硝基化合物。并非是脂質(zhì)體的中間有化合物，而是化合物本身在膜內(nèi)。分配到脂質(zhì)體膜中的C-氨基、亞硝基或硝基化合物將遷移至靶細(xì)胞，且脂質(zhì)會(huì)攜帶C-氨基、亞硝基或硝基化合物進(jìn)入細(xì)胞膜。
較佳的是，該過程制成了直徑大約為0.05-0.45微米、更佳的約為0.1-0.2微米的脂質(zhì)體。單層或多層脂質(zhì)體是有效的。
擠出的第二個(gè)目的是對(duì)混合物進(jìn)行除菌。為了除菌，脂質(zhì)體通常被制成直徑小于45微米。小于0.05微米的大小在理論上是能起作用的。第一個(gè)實(shí)例的方法具有如下的優(yōu)點(diǎn)，例如在水中，3NOBA僅有0.5毫摩爾的濃度。本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物達(dá)到了15毫摩爾的濃度。
另外，與只在水溶液中的3-NOBA不同，含有NOBA的脂質(zhì)體溶液對(duì)抗壞血酸有抵抗作用。這使得它能用于實(shí)驗(yàn)室小鼠試驗(yàn)。溶液可含有NOBA單體或NOBA二聚體。
在第二個(gè)實(shí)例中，可以從液體組分的薄膜開始，使該薄膜與藥物水溶液水合。這樣就自動(dòng)形成了捕獲(包封)藥物的脂質(zhì)。不能穿透脂質(zhì)體膜的化合物會(huì)發(fā)生這種情況。這些化合物的一個(gè)例子是美國專利No.5,262,564(1993年11月16日提交)中的那些化合物，例如3-NOBA的L-胱氨酸亞磺酸加合物。
腸胃外可注射給藥通常用于皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射和灌輸?？勺⑸鋭┛芍瞥沙Ｒ?guī)形式，如液體溶液、懸浮液或適合在注射前溶解在液體中的固體形式。
根據(jù)美國專利No.3,710,795，最近發(fā)明的一種腸胃外給藥方法采用植入一種緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)，該系統(tǒng)能確保維持恒定的劑量水平，該專利納入本文作參考。
上述任何藥物組合物可含有0.1-99％、較佳的為1-70％的活性pADPRT抑制性化合物(尤其是式I、II或III的鹵代-C-氨基、亞硝基或硝基化合物)作為活性組分。
已知慢性炎癥會(huì)促進(jìn)各種組織中的致癌性轉(zhuǎn)化。一種新的核酶聚(ADP)核糖聚合酶(pADPRT)的抑制劑(5-碘-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP))最近已被報(bào)道能調(diào)節(jié)Ha-ras轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞系的各種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道并除去體內(nèi)致腫瘤性。本發(fā)明的一個(gè)方面證明了pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)對(duì)內(nèi)毒素(細(xì)菌脂多糖(LPS))在體外和體內(nèi)產(chǎn)生炎性中介體腫瘤壞死因子α(TNF)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和白細(xì)胞介素(IL-6)、一氧化氮(NO)以及前列腺素的激活作用的效果。另外，本發(fā)明還顯示了pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)在體外對(duì)有絲分裂激活的蛋白激酶(MAP激酶)和核因子κB(NF-κB)的活化作用的影響。在培養(yǎng)的J774和RAW264.7巨噬細(xì)胞中，LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素代謝物，釋放TNF并表達(dá)出可誘導(dǎo)的NO合成酶同種型(iNOS)。前列腺素和NO的產(chǎn)生被INH2BP以劑量依賴方式抑制，而TNF-α的短期釋放卻不受影響。在經(jīng)全長(約1592bp)鼠巨噬細(xì)胞iNOS啟動(dòng)子-螢光素酶構(gòu)建物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的RAW細(xì)胞中，INH2BP顯著地阻抑了LPS介導(dǎo)的螢光素酶活性，但是在約367bp組成的缺失構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中卻不阻抑螢光素酶活性。在體內(nèi)，INH2BP的預(yù)處理抑制了大鼠體內(nèi)LPS對(duì)iNOS的誘導(dǎo)作用，不影響LPS誘導(dǎo)的TNF和IL-6應(yīng)答，但是增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)的IL-10產(chǎn)生。INH2BP的預(yù)處理顯著提高了內(nèi)毒素休克致死模型中的小鼠存活率。這些結(jié)果證明，pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)在體外和體內(nèi)具有強(qiáng)效的抗炎作用。
多腺苷二磷酸核糖合成酶(PARS)是一種由DNA單鏈斷裂激活的核酶。響應(yīng)過氧化氫、過亞硝酸鹽或電離輻射誘導(dǎo)的延伸性DNA單鏈斷裂而產(chǎn)生的大量PARS激活能引發(fā)耗能的無價(jià)值的循環(huán)達(dá)到細(xì)胞損傷。最近已經(jīng)證明，在各種形式的炎癥(包括關(guān)節(jié)炎和角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫)中有過亞硝酸鹽產(chǎn)生。本發(fā)明顯示了新的、強(qiáng)效的PARS抑制劑、pADPRT抑制性化合物(如5-碘-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP))在1-4小時(shí)的角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫大鼠模型和膠原誘導(dǎo)的獸爪水腫小鼠模型中的效果。在第1天和第21天注射II型膠原兩次，以誘導(dǎo)雄性DMA/1J小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。INH2BP口服治療小鼠(每日0.5克/千克)從關(guān)節(jié)炎發(fā)作(第25天)起開始，在26-35天間延遲了關(guān)節(jié)炎臨床癥狀的發(fā)展。經(jīng)INH2BP處理過的動(dòng)物表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎指標(biāo)降低(關(guān)節(jié)炎評(píng)分是用載體處理的小鼠中所見評(píng)分的20-50％)，并改善了組織學(xué)狀況(在膝和足中測(cè)定)。這些數(shù)據(jù)證明，PARS抑制劑INH2BP在體內(nèi)表現(xiàn)出抗炎效果，即使給予INH2BP的起始時(shí)間相對(duì)較晚，它也能延遲膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程。本發(fā)明的數(shù)據(jù)支持了這樣一個(gè)觀點(diǎn)即PARS活化在關(guān)節(jié)炎發(fā)展中起一定作用，并可能在其它形式的炎癥和炎性疾病中起作用。
下列實(shí)施例用來描述本發(fā)明。這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被理解成限制了本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)如以下這些文獻(xiàn)所述的，將小鼠巨噬細(xì)胞系J774和RAW264.7培養(yǎng)在Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中；Szabo等人，1996，″DNA鏈斷裂、多腺苷二磷酸核糖合成酶的激活以及細(xì)胞能量消耗參與了接觸過亞硝酸鹽的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.931753-1758；Zingarelli等人，1996，″經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中，過亞硝酸鹽介導(dǎo)的DNA鏈斷裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起細(xì)胞能量消耗″J.Immunol.156350-358。在分開的研究中，從雄性Wistar大鼠獲得腹膜內(nèi)巨噬細(xì)胞，在LPS存在或不存在以及有或沒有INH2BP下體外培育24小時(shí)。處死大鼠，取出腹膜內(nèi)巨噬細(xì)胞并培養(yǎng)在DMEM中。在各種濃度(1-150mM)的INH2BP或其它藥理學(xué)抑制劑存在或不存在下，用大腸桿菌LPS(10毫克/毫升)或LPS和INF(50μ/毫升)處理細(xì)胞數(shù)次。
MAP激酶相關(guān)測(cè)定用PBS洗滌Raw細(xì)胞，收集，每百萬細(xì)胞用100毫升裂解緩沖液裂解。(50mMTris-HCl，pH7.4，1％NP-40，0.4M NaCl，0.1mM NaVO3，50mM KF，1mM EGTA，2mM PMSF，25nM奧卡第酸(okadaic acid)，亮抑酶肽、抑酶肽、抑氨肽酶肽和抗蛋白酶各1毫克/毫升)。在冰上裂解20分鐘，然后在Eppendorf離心機(jī)中13000rpm離心14分鐘。保留上清，用Bio-Rad染色測(cè)定法測(cè)定蛋白含量。
凝膠內(nèi)MAP激酶試驗(yàn)在含有固定化穗磷脂堿性蛋白(MBP，250毫克/毫升凝膠)的100％SDS-PAGE凝膠中對(duì)蛋白樣品(50毫克/泳道)進(jìn)行電泳。電泳后，用50mM TRIS-HCl pH7.7緩沖液洗滌凝膠一次(25毫升，20分鐘)，然后和含有25％異丙醇的相同緩沖液培育兩次30分鐘。然后用Tris-HCl緩沖液洗滌凝膠一次，并在50毫摩爾Tris-HClpH7.7，mM 2-巰基乙醇，5M鹽酸胍(50毫升)的溶液中浸泡1小時(shí)，在30分鐘時(shí)改變培育的溶液。然后在16小時(shí)內(nèi)在換液5次的50mM TRIS-HCl pH7.7，Mm 2-巰基乙醇、0.04％NP-40的溶液中培育凝膠，來重新培育蛋白。然后洗滌凝膠兩次，用含50mM TRIS-HCl pH7.7，5mM MgCl27mm 2-巰基乙醇的溶液預(yù)先培育半小時(shí)。最后在添加了10mm32p-g ATP(50mCi/試驗(yàn))的相同溶液中培育1小時(shí)。在培育最后，用3×25毫升的10％TCA和3×25毫升的10％乙酸洗滌除去未結(jié)合的放射活性，干燥并放射自顯影；Sasaki等人，1995，″神經(jīng)酰胺對(duì)生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的受納效應(yīng)″Biochem.J.311829-34。
MAP激酶Western印跡。
將100毫克細(xì)胞抽提物蛋白加樣到10％SDS-PAGE凝膠上，電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上并進(jìn)行免疫探測(cè)。第一抗體(抗MAP激酶)購自UBI，第二抗體為堿性磷酸酶標(biāo)記，購自NEN Biolabs。檢測(cè)采用強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光法；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″Int.J.Oncol.8239-252。
核抽提物的制備和NF-κB Western印跡。
在INH2BP存在和不存在下處理細(xì)胞90分鐘。按Hassanain等人1993年″測(cè)定DNA結(jié)合因子的增強(qiáng)的凝膠移位分析″Anal.Biochem.213162-7中所述的方法制備微量核抽提物。簡(jiǎn)言之，刮下細(xì)胞，簡(jiǎn)單地離心，將沉淀重懸于400毫升冷的緩沖液A[Hepes pH7.9(10mM)，KCl(10mM)，EDTA(0.1mM)，EGTA(0.1mM)，DTT(1mM)，PMSF(0.5mM)，抑胃酶肽A(1毫克/毫升)、亮抑酶肽(10毫克/毫升)和抑酶肽(10毫克/毫升)]中，在25毫升1％NP-40存在下置于冰上15分鐘。然后，振蕩樣品，10000g離心1分鐘，將沉淀重懸于100毫升緩沖液B[HepespH7.9(20mM)，NaCl(400mM)，EDTA(1mM)，EGTA(1mM)，DTT(1mM)，PMSF(0.5mM)，抑胃酶肽A(毫克/毫升)、亮抑酶肽(10毫克/毫升)和抑酶肽(10毫克/毫升)]中。在搖臺(tái)上4℃振蕩15分鐘后，4℃ 15 100,000g離心樣品15分鐘。然后用150毫升SDS-PAGE樣品緩沖液處理70毫升等份。如上所述用家兔抗小鼠NF-κB第一抗體(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)(1∶750，用吐溫TBS(0.02％)配)進(jìn)行Western印跡。
亞硝酸鹽或亞硝酸鹽/硝酸鹽濃度的測(cè)定用下述方法測(cè)定刺激后24小時(shí)培養(yǎng)上清中的亞硝酸鹽；Szabo等人，1996，″DNA鏈斷裂、多腺苷二磷酸核糖合成酶的激活以及細(xì)胞能量消耗參與了接觸過亞硝酸鹽的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.931753-1758；Zingarelli等人，1996，″經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中過亞硝酸鹽介導(dǎo)的DNA鏈斷裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起細(xì)胞能量消耗″J.Immunol.156350-358；Szabo等人，1994，″精胺抑制免疫刺激的J774.2巨噬細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生血清因子的需求″Br.J.Pharmacol.112355-356；在100毫升樣品介質(zhì)中加入100毫升Griess試劑(1％磺胺和0.1％萘乙二胺，5％磷酸配)。用Spectramax 250微板讀數(shù)儀(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)測(cè)定550nm下光密度(OD550)。為了測(cè)定血漿樣品中的亞硝酸鹽/硝酸鹽的總濃度，通過和硝酸鹽還原酶培育將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽；Zingarelli等人，1996，″經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中，過亞硝酸鹽介導(dǎo)的DNA鏈斷裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起細(xì)胞能量消耗″J.Immunol.156350-358。
測(cè)定6-酮前列腺素F12用特異性放射免疫試驗(yàn)測(cè)定LPS刺激后4小時(shí)100毫升細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品中6-酮前列腺素F12的產(chǎn)生；Szabo等人，1994，″精胺抑制免疫刺激的J774.2巨噬細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生血清因子的需求″Br.J.Pharmacol.112355-356。
細(xì)胞因子的測(cè)定用ELISA測(cè)定血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子水平。用購自Endogen(Endogen Inc.，Boston，MA)的ELISA試劑盒測(cè)定IL-10和IL-6的血漿水平。如Szabo等人，1997，″異丙基腎上腺素調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-6和一氧化氮的產(chǎn)生并保護(hù)防止內(nèi)毒素血癥中發(fā)生血管反應(yīng)不足″Immunology 9095-100中所述的那樣，用購自Genzyme(Genzyme Corp.，Boston，MA)的ELISA試劑盒測(cè)定血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α濃度。
線粒體呼吸的測(cè)定憑借線粒體將3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴鎓還原成甲臢，測(cè)定24小時(shí)的線粒體呼吸；Szabo等人，1996，″DNA鏈斷裂、多腺苷二磷酸核糖合成酶的激活以及細(xì)胞能量消耗參與了接觸過亞硝酸鹽的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性″Proc.Natl.Acad.Sci.USA.931753-1758；Zingarelli等人，1996，″經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中，過亞硝酸鹽介導(dǎo)的DNA鏈斷裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起細(xì)胞能量消耗″J.Immunol.156350-358。
iNOS mRNA的Northern印跡在INH2BP存在或不存在下使細(xì)胞接觸LPS 4小時(shí)后，如上所述用TRIZOL抽提總RNA。使含15毫克總RNA的等份在含3％甲醛的1％瓊脂糖凝膠上電泳。將RNA印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并進(jìn)行UV自交聯(lián)。如Lowenstein等人，1993，″巨噬細(xì)胞一氧化氮合成酶基因兩個(gè)上游區(qū)域通過干擾素γ和脂多糖介導(dǎo)誘導(dǎo)作用″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909730-9734所述的那樣，用隨機(jī)引導(dǎo)法(Pharmacia，Piscataway，NJ)使膜和[32P]dCTP(比活為3000Ci/mM；NEN)標(biāo)記的鼠iNOS cDNA探針(106.cpm/ml)42℃雜交過夜。雜交的濾膜于53℃用2X檸檬酸鈉、氯化鈉、0.1％SDS和25mM NAHPO4、1mM EDTA、0.1％SDS溶液連續(xù)洗滌。在探測(cè)了iNOS后，用沸騰的5mM EDTA剝?nèi)ツぃ⒑蚚32P]放射性標(biāo)記的18S核糖體RNA(作為管家基因)的寡核苷酸探針重新雜交。洗滌后，用Phosphor Imager屏曝光過夜。
iNOS Western印跡。
在pADPRT抑制劑存在和不存在下用LPS處理細(xì)胞20小時(shí)。然后將細(xì)胞刮到冷的PBS中，14000g離心30秒。除去上清，加入含有RIPA(500毫升)、抑酶肽(10毫克/毫升)和PMSF(0.5mM)的裂解緩沖液。使樣品通過22計(jì)量針(gaugeneedle)從而避開DNA。用Bradford方法(Bio-Rad)測(cè)定蛋白含量。將胞質(zhì)蛋白(200毫克/泳道)加入SDS-PAGE緩沖液中，沸騰5分鐘，用7.5％SDS-PAGE分離，用等速電泳緩沖系統(tǒng)通過Semi-Dry方法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(0.2mm)上。在3％明膠中封閉1小時(shí)和隨后的洗滌后，使樣品在吐溫Tris緩沖鹽溶液(TTBS)和0.1％明膠中和第一家兔抗小鼠iNOS(upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)(1∶1000配于0.0％TTBS中)免疫印跡2.5小時(shí)。用偶聯(lián)堿性磷酸酶的山羊抗家兔iGG抗體作為第二抗體。用碳酸鹽緩沖液中的氮藍(lán)四唑/5-溴-4-氯-吲哚磷酸(NBT/BCIP)使結(jié)合蛋白顯色。
iNOS活性的測(cè)定在pADPRT抑制劑存在和不存在下用LPS處理細(xì)胞12小時(shí)。如Szabo等人，1994，″精胺抑制免疫刺激的J774.2巨噬細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生血清因子的需求″Br.J.Pharmacol.112355-356所述的那樣，將J774細(xì)胞勻漿或肺勻漿中從1-精氨酸到L-瓜氨酸的鈣非依賴型轉(zhuǎn)變的測(cè)定結(jié)果作為iNOS活性的指標(biāo)。刮下細(xì)胞或?qū)⒎沃糜谟?0mM Tris HCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA和1mM苯甲磺酰氟(pH7.4)組成的勻漿緩沖液中，用Tissue Tearor 985-370勻漿器(Biospec Products，Racine，WI)在冰上緩沖液中勻漿。然后測(cè)定勻漿中[3H]-L-精氨酸到[3H]-L-瓜氨酸的轉(zhuǎn)變。在[3H]-L-精氨酸(10mM，5kBq/管)、NADPH(1mM)、鈣調(diào)蛋白(30nM)、四氫生物喋呤(5mM)和EGTA(5mM)存在下22℃培育勻漿(30毫升)20分鐘。用含有EGTA(2mM)和EDTA(2mM)的冰冷的HEPES緩沖液(pH5.5)稀釋來終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物施加到Dowex 50W(Na+型)柱上，用閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定洗脫的[3H]-L-瓜氨酸活性。
iNOS啟動(dòng)子的功能試驗(yàn)由于在我們的試驗(yàn)條件下，J774細(xì)胞對(duì)于用磷酸鈣、脂轉(zhuǎn)染法和脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺法的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染有抵抗作用，所以在RAW 264.7細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)染研究。用報(bào)道基因構(gòu)建物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AW264.7細(xì)胞，以評(píng)價(jià)iNOS啟動(dòng)子活性。該構(gòu)建物將5′鼠巨噬細(xì)胞iNOS啟動(dòng)子區(qū)插到報(bào)道基因螢光素酶的上游；Lowenstein等人，1993，″巨噬細(xì)胞一氧化氮合成酶基因兩個(gè)上游區(qū)域通過干擾素γ和脂多糖介導(dǎo)誘導(dǎo)作用″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909730-9734；(由Dr.Charles J.Lowenstein，JohnsHopkins University贈(zèng)與)。采用兩種構(gòu)建物全長啟動(dòng)子構(gòu)建物(1-1592bp)和由367bp組成的缺失型構(gòu)建物。將細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板中至50％鋪滿，利用陽離子脂質(zhì)體(Lipofectin，Giboco)用等摩爾量的各自的iNOS啟動(dòng)子-螢光素酶構(gòu)建物轉(zhuǎn)染。為了控制轉(zhuǎn)染效率的差異，細(xì)胞用pSV40-b-半乳糖苷酶共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，使細(xì)胞恢復(fù)過夜，隨后單用介質(zhì)(對(duì)照)、LPS(10毫克/毫升)或LPS加上INH2BP(100mM)處理。處理4小時(shí)后，用PBS洗細(xì)胞一次，在報(bào)道物裂解緩沖液(Promega)中裂解，并分析螢光素酶活性，校正各自原始的半乳糖苷酶活性并表達(dá)對(duì)照細(xì)胞(單用介質(zhì)轉(zhuǎn)染和處理)的增加倍數(shù)。
體內(nèi)實(shí)驗(yàn)雄性Wistar大鼠和雄性BALB/c小鼠購自Charles River Laboratories(Wilmington，MA或Budapest，Hungary)。動(dòng)物隨意接受食物和水，并在12小時(shí)周期內(nèi)維持照明。用大腸桿菌LPS(15毫克/千克)對(duì)大鼠腹膜內(nèi)注射，6小時(shí)后處死。取血漿樣品測(cè)定亞硝酸鹽/硝酸鹽，取肺樣品測(cè)定iNOS。其它組大鼠用INH2BP(10毫克/千克，腹膜內(nèi)注射)處理，處理在LPS前10分鐘或在LPS注射后2小時(shí)進(jìn)行。
在測(cè)定LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子應(yīng)答的研究中，對(duì)小鼠腹膜內(nèi)注射藥物載體、或INH2BP(10毫克/千克)，每10克體重體積為0.1毫升。半小時(shí)后用4毫克/千克LPS腹膜內(nèi)注射進(jìn)行攻擊。LPS處理后90分鐘處死動(dòng)物，將血液收集到冰冷的含有EDTA的Eppendorf管中，4℃離心10分鐘。將血漿-7℃保藏至測(cè)定。
在小鼠存活研究中，在0時(shí)對(duì)動(dòng)物腹膜內(nèi)注射LPS(120毫克/千克)并檢測(cè)LPS后42小時(shí)內(nèi)的存活。其它組小鼠在LPS處理前18小時(shí)、前4小時(shí)、0小時(shí)、后6小時(shí)、后24小時(shí)和后30小時(shí)接受載體或INH2BP處理(0.1-10毫克/千克，腹膜內(nèi))。
材料DMEM、RPM1、TRIZOL和胎牛血清購自Gibco(Grand Island，NY)。[3H]NAD+和[32P]NAD+購自DuPont NEN(Boston，MA)。乙醇脫氫酶和ND+購自BoehringerMannheim(Indianapolis，IN)。PD 98059購自Cal biochem(La Jolla，CA)。其它所有藥物購自Sigma(St.Louis，MO)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)圖中和文中所有數(shù)值表示成n次觀察(n＞4)的平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。用斯圖登特不成對(duì)t-測(cè)試比較組間的平均值。低于0.05的p值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果INH2BP抑制J774巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的一氧化氮和前列腺素但不抑制TNF-α的產(chǎn)生INH2BP的處理導(dǎo)致劑量依賴型地抑制J774巨噬細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的亞硝酸鹽形成(圖1a)。類似地，INH2BP抑制LPS誘導(dǎo)的6-酮前列腺素F12的產(chǎn)生(圖1b)，但是不抑制TNF的產(chǎn)生(圖1c)，并恢復(fù)了LPS誘導(dǎo)的對(duì)線粒體呼吸作用的抑制(圖1d)。INH2BP明顯抑制了iNOS mRNA和蛋白表達(dá)(圖2a-c)。當(dāng)試劑在LPS后數(shù)小時(shí)給予時(shí)，INH2BP對(duì)亞硝酸鹽產(chǎn)生的抑制作用被大大減少，這與在iNOS誘導(dǎo)刺激之前的情況相反(圖3a)。而且，當(dāng)LPS和γ干擾素(TNF-g 50u/ml)聯(lián)合用于免疫刺激時(shí)，INH2BP對(duì)iNOS的抑制效果大大減少(圖3b)。
選擇性調(diào)節(jié)INH2BP對(duì)iNOS啟動(dòng)子的誘導(dǎo)作用為了進(jìn)一步研究INH2BP對(duì)iNOS啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用，我們用鼠巨噬細(xì)胞iNOS啟動(dòng)子-螢光素酶構(gòu)建物進(jìn)行瞬時(shí)測(cè)定。我們發(fā)現(xiàn)鼠巨噬細(xì)胞iNOS的LPS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)起重要作用(從LPS誘導(dǎo)出10-12倍的螢光素酶活性的證據(jù)可以看出(圖4))，這與以前的結(jié)果相符(Lowenstein等人，1993，″巨噬細(xì)胞一氧化氮合成酶基因兩個(gè)上游區(qū)域通過干擾素γ和脂多糖介導(dǎo)誘導(dǎo)作用″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909730-9734)。用INH2BP共同處理經(jīng)全長(至1592bp)啟動(dòng)子構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，結(jié)果完全抑制了LPS介導(dǎo)的螢光素酶活性(圖4)。然而，類似地用INH2BP共同處理經(jīng)缺失型構(gòu)建物(至367bp)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞卻沒有明顯影響LPS-介導(dǎo)的螢光素酶活性(圖4)。
INH2BP的體內(nèi)抗炎效果INH2BP的預(yù)處理明顯減少了LPS誘導(dǎo)的神志清醒的大鼠體內(nèi)血漿亞硝酸鹽-硝酸鹽的增加以及肺中iNOS活性的增加(圖5)。當(dāng)試劑是在LPS刺激后數(shù)小時(shí)才加入細(xì)胞或給予動(dòng)物時(shí)，INH2BP對(duì)NO產(chǎn)生的抑制效果大大減少。與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系類似，用100mM INH2BP處理明顯減少(56±7％，p＜0.01)了經(jīng)LPS體外(10毫克/毫升)刺激的原代細(xì)胞(從大鼠獲得的腹膜巨噬細(xì)胞)中亞硝酸鹽的產(chǎn)生(n＝4)。
與體外結(jié)果類似(圖1c)，INH2BP沒有明顯影響小鼠中LPS誘導(dǎo)的血漿TNF水平的增加(圖6a)。INH2BP也沒有影響LPS誘導(dǎo)的IL-6的產(chǎn)生(圖6C)。然而，INH2BP導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的IL-10血漿應(yīng)答增加(圖6b)。
INH2BP對(duì)小鼠的預(yù)處理使受LPS致死劑量的大鼠存活顯著地、劑量依賴性地提高(圖7)。
INH2BP活性消除了LPS誘導(dǎo)的MAP激酶激活，但沒有改變NF-κB的激活和核轉(zhuǎn)位有許多胞內(nèi)過程在iNOS的誘導(dǎo)和其它炎性中介體產(chǎn)生之前。酪氨酸激酶的激活；Levitzki，A.，1994，″信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)治療。治療疾病的一種新方法″Eur.J.Biochem.2261-13；Novogrodsky等人，1994，″通過酪氨酸激酶抑制劑防止脂多糖誘導(dǎo)的致死毒性″Science 264U(Wash)1319-22；Marczin等人，1993，″酪氨酸激酶抑制劑阻抑大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的內(nèi)毒素和IL-1β誘導(dǎo)的NO合成″Am.J.Physiol.265H1014-1018；促細(xì)胞分裂原活化的蛋白激酶(MAP激酶)；Matsuda等人，1994，″促細(xì)胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶激酶/MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通道″J.Leukocyte Biol.56548-53；L′Allemain，G.，1994，″破譯MAP激酶通道″Progr.Growth Factor Res.5291-334；Cowley等人，1994，″MAP激酶激酶的激活對(duì)于PC12分化和轉(zhuǎn)化NIH 3T3細(xì)胞來說充分必要的″Cells 77841-52；和NF-κB通道；Baeuerle等人，1994，″免疫系統(tǒng)中的NF-κB的功能和活化″Ann.Rev.Immunol.12141-79；Schreck等人，1992，″核因子κB真核細(xì)胞的氧化應(yīng)力響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子(綜述)”Free Radical Res.Comm 17221-37；Muller等人，1993，″核因子κB，一種脂多糖效應(yīng)的中介體″Immunobiol.187233-56；這些均被認(rèn)為是炎性中介體中的重要因子。因此，我們調(diào)查INH2BP是否影響MPA激酶和NF-κB響應(yīng)LPS刺激的激活作用，以便闡述炎性過程中這些通道參與INH2BP的抑制效應(yīng)的可能性。
在未刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中有顯著的MAP激酶基礎(chǔ)活性。LPS處理(10毫克/毫升，24小時(shí))誘導(dǎo)MAP激酶活性增加約2.5倍(圖8)，但不影響免疫反應(yīng)性MAP激酶的量(通過Western印跡證明，結(jié)果未顯示)。用INH2BP(150mM)預(yù)處理細(xì)胞3天使MAP激酶基礎(chǔ)活性受約50％的抑制，并且消除了LPS誘導(dǎo)的MAP激酶的增加(未顯示)。MAP激酶基礎(chǔ)活性被MAP激酶激酶抑制劑稍稍阻抑；Pang等人，1995，″MAP激酶激酶的抑制阻斷了神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞分化″J.Biol.Chem.27013585-8；PD 98059(100mM)以及LPS誘導(dǎo)的MAP激酶的激活也被抑制(圖8)。LPS誘導(dǎo)的亞硝酸鹽的產(chǎn)生也被PD 98059阻抑(在100mM下阻抑53％，n＝3)，這與最近在心肌細(xì)胞中的數(shù)據(jù)相符(Singh等人，1996，″心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的一氧化氮合成的調(diào)節(jié)″J.Biol.Chem.2711111-1117)。
與最近在一系列單核細(xì)胞系中的觀察結(jié)果(Baeuerle等人，1994，″免疫系統(tǒng)中的NF-B的功能和活化″Ann.Rev.Immunol.12141-79)類似，我們發(fā)現(xiàn)J774細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞中有基礎(chǔ)性(組成型)核NF-κB。LPS刺激導(dǎo)致NF-κB核轉(zhuǎn)位增加，而INH2BP的抑制沒有影響NF-κB響應(yīng)LPS的核轉(zhuǎn)位(圖9)。
討論多腺苷二磷酸核糖合成酶(pADPRT)是豐富存在于細(xì)胞核中的修飾蛋白和聚合ADP的酶；Ueda等人，1985，″ADP核糖基化″Ann.Rev.Biochem.5473-100。pADPRT的生理功能已成為許多辯論的主題。與最初的建議(聲稱pADPRT是一種DNA修復(fù)酶)相反，現(xiàn)在已經(jīng)清楚pADPRT并不直接參與DNA的修復(fù)；Lindahl等人，1995，″DNA鏈斷裂誘導(dǎo)的多腺苷二磷酸核糖聚合酶翻譯后修飾″TrendsBiochem.Sci.20405-411；pADPRT基因已被脫離的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞具有正常的DNA修復(fù)特征；Buki等人，1995，″用于蛋白結(jié)合和自身締合的多腺苷二磷酸核糖聚合酶結(jié)構(gòu)域的鑒定″J.Biol.Chem.2703370-3377。在生理性條件下，pADPRT能結(jié)合許多細(xì)胞蛋白和DNA位點(diǎn)，并能發(fā)揮多效性細(xì)胞調(diào)節(jié)功能；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377；Buki等人，1995，″用于蛋白結(jié)合和自身締合的多腺苷二磷酸核糖聚合酶結(jié)構(gòu)域的鑒定″J.Biol.Chem.2703370-3377。pADPRT激活還被指出在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(尤其在輻射損傷和氧化應(yīng)力后)中起作用；Cochrane，1991，″細(xì)胞氧化性損傷的機(jī)制″Molec.Aspects Med.12137-147；Berger，1991，″氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性代謝調(diào)節(jié)的攻擊″Am.J.Respir.Cell.Biol.Biol.41-3。pARPRT的一個(gè)重要的生理性功能可能是調(diào)節(jié)酶的誘導(dǎo)作用、基因表達(dá)和細(xì)胞分化；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377；Minaga等人，1978，″用煙酰胺誘導(dǎo)心臟L-鳥氨酸脫羧酶和用腐胺對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)″Eur.J.Biochem.91577-85；Griffin等人，1984，″苯甲酰胺和苯巴比妥對(duì)肝酶—多腺苷二磷酸核糖聚合酶、細(xì)胞色素P-450、苯氧化乙烯水解酶、膽固醇氧化物水解酶、谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶和UDP葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶—的體內(nèi)效應(yīng)″Biochem.Biophys.Res.Comm.122770-5。INH2BP對(duì)堿性磷酸酶的誘導(dǎo)作用(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252)是某些磷酸化依賴型酶(如MAP激酶拓?fù)洚悩?gòu)酶I和拓?fù)洚悩?gòu)酶II)滅活的可能原因。經(jīng)Ha-ras轉(zhuǎn)染的牛內(nèi)皮細(xì)胞中的INH2BP消除了致腫瘤作用，使細(xì)胞復(fù)制停止，提高了拓?fù)洚悩?gòu)酶I、拓?fù)洚悩?gòu)酶II和MAP激酶活性，下調(diào)了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和蛋白激酶C，且ODC增加了Rb蛋白的磷酸化過少，并抑制了ras基因的表達(dá)而不喪失癌基因的表達(dá)，Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377。
根據(jù)最近描述的INH2BP的抗癌作用(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377)以及慢性炎癥和癌癥之間的聯(lián)系(尤其是NO產(chǎn)生方面)(見引言)，我們?cè)谶@里調(diào)查了INH2BP是否在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，受研究的通道和中介體中有一些(MAP激酶、前列腺素、NO)受INH2BP阻抑，而另一些(TNF、IL-6、NF-κB)未受影響，或有所增加(IL-10)?？傊?，本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明，pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)發(fā)揮了抗炎作用，而這些效應(yīng)的組合可能是經(jīng)這種pARPRT抑制劑預(yù)處理過的動(dòng)物存活率增加的原因。
實(shí)施例2INH2BP阻抑LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOS通過背景技術(shù)知道，在各種細(xì)胞中一氧化氮(NO)合成酶的可誘導(dǎo)同種型(iNOS)響應(yīng)促炎刺激而表達(dá)。iNOS過度產(chǎn)生NO在休克和發(fā)炎中起重要作用(Nathan，1992，″一氧化氮作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌型產(chǎn)物″FASEB J.63051-3064；Vane，J.R.，The Croonian Lecture 1993，″內(nèi)皮血液循環(huán)的大師(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343225-246；Szabo，C.；1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″New Horizons 33-32)，并可能傾向于致癌性轉(zhuǎn)化(Bartsch等人，1994，″人癌癥病因?qū)W中內(nèi)源性形成的N-亞硝基化合物和亞硝基化試劑″Pharmacogenetics 2272-7；Liu等人，1992，″旱獺肝炎病毒表面抗原誘導(dǎo)肝細(xì)胞中合成NO在肝癌形成中可能的作用″Carcinogenesis 152875-7；Ohshima等人，1994，″作為癌癥危險(xiǎn)因子的慢性感染和發(fā)炎過程一氧化氮在致癌作用中可能的作用″Mutation Res.305253-64?，F(xiàn)在已經(jīng)克隆出鼠iNOS的啟動(dòng)子區(qū)域，并已鑒定出負(fù)責(zé)應(yīng)答LPS和IFN的誘導(dǎo)能力的分開的區(qū)域。LPS介導(dǎo)的iNOS的誘導(dǎo)作用看來參與了NF-κB的活動(dòng)和核轉(zhuǎn)位，隨后與iNOS啟動(dòng)子結(jié)合。iNOS的誘導(dǎo)也會(huì)受酪氨酸激酶和NF-κB激活的藥物抑制劑抑制；Szabo，C.；1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″New Horizons 33-32。
INH2BP對(duì)iNOS表達(dá)的抑制效果表現(xiàn)在抑制亞硝酸鹽產(chǎn)生、iNOS mRNA表達(dá)和iNOS蛋白表達(dá)方面。調(diào)節(jié)作用發(fā)生在iNOS誘導(dǎo)作用的早期，因?yàn)殡S著誘導(dǎo)iNOS的刺激后施加的時(shí)間增加，INH2BP的效力逐漸喪失。INH2BP對(duì)iNOS誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用發(fā)生于體外和整個(gè)動(dòng)物體內(nèi)。另外，我們的數(shù)據(jù)表明，LPS誘導(dǎo)的環(huán)加氧酶代謝物的產(chǎn)生與iNOS的誘導(dǎo)類似，是受INH2BP調(diào)節(jié)的。促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生環(huán)加氧酶代謝物是由于通過類似與iNOS誘導(dǎo)過程的過程來合成新的mRNA和蛋白并表達(dá)COX-2；Vane等人，1995，″對(duì)抗炎藥物作用方式的新洞察″Inflamm.Res.441-10。然而，對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎性中介體表達(dá)的抑制作用不是對(duì)INH2BP的非特異性的反應(yīng)，因?yàn)樵贘774細(xì)胞中LPS對(duì)TNF的誘導(dǎo)作用并不受該試劑影響。
感興趣的是，當(dāng)LPS與INF結(jié)合用于免疫刺激時(shí)，INH2BP對(duì)iNOS的抑制效果大大減少。這種效應(yīng)可能是由于IFN誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子(如干擾素調(diào)節(jié)因子，Martin等人，1994，″干擾素調(diào)節(jié)因子I在誘導(dǎo)一氧化氮合成酶中的作用″J.Exp.Med.180977-84)繞開了上述試劑對(duì)iNOS誘導(dǎo)的抑制作用。
以前的體外研究已經(jīng)暗示，在體外在巨噬細(xì)胞中，iNOS的誘導(dǎo)受pADPRT的藥物抑制劑調(diào)節(jié)；Hauschildt等人，1992，″腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)L929細(xì)胞中一氧化氮合成酶被多腺苷二磷酸核糖聚合酶的抑制劑所抑制″Biochem J.288255-260；Pellat-Seceunyk等人，1994，″煙酰胺抑制活化的巨噬細(xì)胞中一氧化氮合成酶mRNA的誘導(dǎo)″Biochem.J.29753-58。然而，在這些研究中，采用的pADPRT抑制劑30氨基苯甲酰胺和煙酰胺的濃度很高(10-30mM)，它們抑制全部的蛋白和RNA合成，并可能有其它藥學(xué)作用(如清除自由基)；Hauschildt等人，1992，″腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)L929細(xì)胞中一氧化氮合成酶被多腺苷二磷酸核糖聚合酶的抑制劑所抑制″Biochem J.288255-260?，F(xiàn)在采用INH2BP的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步暗示，pADPRT多效性參與iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄過程。為了研究INH2BP對(duì)iNOS啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用，用小鼠巨噬細(xì)胞iNOS啟動(dòng)子螢光素酶構(gòu)建物進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。缺失型構(gòu)建物的這些數(shù)據(jù)間接暗示，INH2BP調(diào)節(jié)了涉及-1592和-367bp之間鼠iNOS啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄行為。組蛋白和核酶的ADP核糖基化可能參與維持松弛的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377；Ueda等人，1985，″ADP核糖基化″Ann.Rev.Biochem.5473-100。以前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie 77347-377)合理地暗示，在這些實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)預(yù)處理抑制pADPRT和組蛋白的自身多腺苷二磷酸核糖基化。已經(jīng)知道這種作用引發(fā)松弛型染色質(zhì)向稠密型染色質(zhì)轉(zhuǎn)變，并且通過利用核酸酶和其它DNA結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)酶的上調(diào)作用(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252；Bauer等人，1995，″用一種多腺苷二磷酸核糖聚合酶的非共價(jià)結(jié)合配體5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤表型″Biochimie77347-377)，它可能影響啟動(dòng)子的功能。
實(shí)施例3INH2BP對(duì)MAP激酶和NF-κB激活的抑制效果這些結(jié)果已經(jīng)證明，INH2BP的處理抑制了LPS誘導(dǎo)的MAP激酶的激活。在這方面，這些數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞很相似；Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252。對(duì)MAP激酶激活的抑制作用可能是通過INH2BP觸發(fā)的多效性細(xì)胞反應(yīng)來產(chǎn)生的。已經(jīng)表明，MAP激酶可在經(jīng)LPS或各種促炎細(xì)胞因子(TNF-α、白細(xì)胞介素-1、神經(jīng)生長因子)處理過的各種細(xì)胞類型中被激活；Kyriakis等人，1996，″警告由應(yīng)力和發(fā)炎激活的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)″，J.Biol Chem.27124313-24316；Matsuda等人，1994，″促細(xì)胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶激酶/MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通道″J.Leukocyte Biol.56548-53；Cowley等人，1994，″MAP激酶激酶的激活對(duì)于PC12分化和轉(zhuǎn)化NIH 3T3細(xì)胞來說充分必要的″Cells 77841-52；Pang等人，1995，″MAP激酶激酶的抑制阻斷了神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞分化″J.Biol.Chem.27013585-8；Willis等人，1996，″培養(yǎng)的單核細(xì)胞和星形細(xì)胞中細(xì)菌脂多糖對(duì)促分裂原激活的蛋白激酶通道的分化誘導(dǎo)作用″Biochem.J.313519-524；Saklatvala等人，1993，″白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α激活培養(yǎng)細(xì)胞中的促分裂原激活的蛋白(MAP)激酶激酶″FEBS Lett.334189-92。各種胞內(nèi)信號(hào)通過不同的MAP激酶激酶-激酶匯聚在MAP激酶激酶/MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)并引發(fā)了細(xì)胞反應(yīng)次譜(vice spectrum)；Kyriakis等人，1996，″警告由應(yīng)力和發(fā)炎激活的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)″，J.Biol Chem.27124313-24316；Ferrell，JE，1996，″打開難以置信的開關(guān)蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)怎樣能將分級(jí)的輸入轉(zhuǎn)變成類似開關(guān)的輸出″TIBS21460-466。MAP激酶或MAP激酶激酶的阻斷修飾了許多胞內(nèi)通道并抑制細(xì)胞分化和增殖；Kyriakis等人，1996，″警告由應(yīng)力和發(fā)炎激活的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)″，J.Biol Chem.27124313-24316；Matsuda等人，1994，″促細(xì)胞分裂原活化蛋白(MAP)激酶激酶/MAP激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通道″J.Leukocyte Biol.56548-53；Cowley等人，1994，″MAP激酶激酶的激活對(duì)于PC12分化和轉(zhuǎn)化NIH3T3細(xì)胞來說充分必要的″Cells 77841-52；Pang等人，1995，″MAP激酶激酶的抑制阻斷了神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞分化″J.Biol.Chem.27013585-8；Willis等人，1996，″培養(yǎng)的單核細(xì)胞和星形細(xì)胞中細(xì)菌脂多糖對(duì)促分裂原激活的蛋白激酶通道的分化誘導(dǎo)作用″Biochem.J.313519-524；Saklatvala等人，1993，″白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α激活培養(yǎng)細(xì)胞中的促分裂原激活的蛋白(MAP)激酶激酶″FEBS Lett.334189-92。最近，用PD98059抑制MAP激酶激酶已經(jīng)表明能在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞中阻抑iNOS mRNA的表達(dá)。Singh等人，1996，″心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞因子可誘導(dǎo)的一氧化氮合成的調(diào)節(jié)″J.Biol.Chem.2711111-1117。該發(fā)現(xiàn)與我們的觀察結(jié)果(即PD98059導(dǎo)致RAW巨噬細(xì)胞中LPS所誘導(dǎo)的亞硝酸鹽的產(chǎn)生受到顯著抑制)相符。
由于NF-κB的激活是炎性反應(yīng)中的主要通道，且它參與了LPS(而不是INF)對(duì)iNOS的誘導(dǎo)(Szabo，C.；1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″New Horizons 33-32；Martin等人，1994，″干擾素調(diào)節(jié)因子I在誘導(dǎo)一氧化氮合成酶中的作用″J.Exp.Med.180977-84)，因此我們?cè)噲D調(diào)查INH2BP對(duì)NF-κB的潛在效應(yīng)。我們的結(jié)果證明，INH2BP沒有改變NF-κB激活的核轉(zhuǎn)位，或是INH2BP對(duì)NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)作用(如果有的話)可能發(fā)生在遠(yuǎn)離NF-κB核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞行為中。
實(shí)施例4病理生理學(xué)和治療上的暗示INH2BP在多種水平上調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)促炎基因iNOS和COX-2表達(dá)的pADPRT抑制劑的還原，以及隨之還原形成的NO和前列腺素可能在各種形式的炎癥是有利的(Nathan，1992，″一氧化氮作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌型產(chǎn)物″FASEB J.63051-3064；Vane，J.R.，The CroonianLecture 1993，″內(nèi)皮血液循環(huán)的大師(maestro)″Proc.Roy.Soc.Lond B 343225-246；Szabo，C.；1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″NewHorizons 33-32；Vane等人，1995，″對(duì)抗炎藥物作用方式的新洞察″Inflamm.Res.441-10)。另外，IL-10釋放的增強(qiáng)可能也有其它抗炎作用；Liles等人，1995，″綜述參與發(fā)炎和宿主免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子的命名法和生物意義″J.Infect.Dis.1721573-80；Giroir，1993，″膿毒休克的中介體打斷內(nèi)源性炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方法″Critical Car.Med.21780-9；Szabo等人，1997，″異丙基腎上腺素調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-6和一氧化氮的產(chǎn)生并保護(hù)防止內(nèi)毒素血癥中發(fā)生血管反應(yīng)不足″Immunology 9095-100?？梢韵胂?，這些效果明顯導(dǎo)致pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)預(yù)處理以及經(jīng)致死性劑量內(nèi)毒素攻擊的小鼠存活率的提高。然而，要描述INH2BP發(fā)揮對(duì)LPS誘導(dǎo)各種炎性中介體表達(dá)的效應(yīng)的確切機(jī)制還需要進(jìn)一步詳細(xì)的研究。一方面，可以相信pADPRT活性或pADPRT蛋白的結(jié)合參與調(diào)節(jié)炎性中介體的產(chǎn)生和/或發(fā)炎過程組分編碼基因的表達(dá)。另一方面，INH2BP對(duì)MAP激酶活性的間接下調(diào)作用(Bauer等人，1995，″用5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)處理修飾了ras轉(zhuǎn)化的牛內(nèi)皮細(xì)胞系的生長相關(guān)性酶促通道且導(dǎo)致致腫瘤作用明顯喪失″，Int.J.Oncol.8239-252)可能也導(dǎo)致了如其它研究所預(yù)計(jì)的觀察到的效應(yīng)；Kyriakis等人，1996，″警告由應(yīng)力和發(fā)炎激活的蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)″，J.Biol Chem.27124313-24316；Ferrell，JE，1996，″打開難以置信的開關(guān)蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)怎樣能將分級(jí)的輸入轉(zhuǎn)變成類似開關(guān)的輸出″TIBS 21460-466。該結(jié)果證明了pADPRT抑制性化合物(如INH2BP)在各種炎性疾病中有治療潛力。
實(shí)施例5一氧化氮(NO)的一些細(xì)胞毒性效應(yīng)與過亞硝酸鹽(一種NO和超氧化物迅速反應(yīng)形成的反應(yīng)性氧化劑)的產(chǎn)生有關(guān)；Crow等人，1995，″過亞硝酸鹽在一氧化氮介導(dǎo)的毒性中的作用″，Current Top Microbiol.Immunol.19657-73；Pryor等人，1995，″過亞硝酸鹽的化學(xué)性質(zhì)一氧化氮和超氧化物反應(yīng)的產(chǎn)物″，Am.J.Physiol.L699-L772。過亞硝酸鹽的形成已經(jīng)在各種炎性癥狀中得到證實(shí)，這些癥狀包括內(nèi)毒素誘導(dǎo)的系統(tǒng)性發(fā)炎(Szabo等人，1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″New Horizons 33-32)、關(guān)節(jié)炎(Kaur等人，″慢性發(fā)炎中一氧化氮介導(dǎo)的氧化性損傷的證據(jù)。類風(fēng)濕性患者的血清和滑液中的硝基酪氨酸″FEBS Lett.13599-12)、以及角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫(*Salvemini等人，1996)。實(shí)際上，從利用NO合成酶(NOS)抑制劑和超氧化物歧化酶模擬物的藥理學(xué)研究得出結(jié)論，過亞硝酸鹽在炎性過程發(fā)展中起重要的致病作用(Szabo C，1996，″過亞硝酸鹽在休克、發(fā)炎和局部缺血(schemia)再灌輸損傷的生理病理學(xué)中的作用″Shock 679-88；*Salvemini等人，1996；*Zingarelli等人，1997)。而且，已經(jīng)證實(shí)，目前用于治療關(guān)節(jié)炎的一些試劑實(shí)際上是過亞硝酸鹽的凈化劑(Whiteman等人，1996″用某些抗炎藥物和四環(huán)素抗生素保護(hù)抵抗依賴過亞硝酸鹽的酪氨酸硝酸化和α1-抗蛋白酶滅活″Annals.of the Rheumatic Disease 55383-7)。由于認(rèn)識(shí)到與NO有關(guān)的細(xì)胞毒性的重要部分是由于形成過亞硝酸鹽，因此就有必要圍繞過亞硝酸鹽的形成和作用來開發(fā)新的治療方法。
過亞硝酸鹽觸發(fā)的一種胞內(nèi)通道與DNA單鏈斷裂以及多腺苷二磷酸核糖合成酶(PARS)的激活有關(guān)(Szabo等人，1996，″過亞硝酸鹽在休克、發(fā)炎和局部缺血再灌輸損傷的生理病理學(xué)中的作用″Shock 679-88；*Szabo，1996b)。PARS的顯著激活會(huì)迅速消耗其底物NAD+的胞內(nèi)濃度，降低糖酵解、電子轉(zhuǎn)運(yùn)速度，從而減少ATP的形成而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙(*Berger，1991；*Cochrane，1991)。因此，PARS的抑制劑在這些情況下保護(hù)防止了細(xì)胞損傷。該機(jī)理稱為“PARS自殺假設(shè)”，在以前的H2O2誘導(dǎo)的氧化劑損傷和輻射損傷中曾作過分析(*Berger，1991；*Cochrane，1991)，最近已表明其涉及了內(nèi)毒性休克、中風(fēng)、局部缺血再灌輸損傷和糖尿病中與NO和過亞硝酸鹽有關(guān)的細(xì)胞損傷(Szabo等人，1996，″過亞硝酸鹽在休克、發(fā)炎和局部缺血再灌輸損傷的生理病理學(xué)中的作用″Shock 679-88；*Zhang等人，1994，*Heller等人，1995)。
Kroger及其同事最近提出了PARS在關(guān)節(jié)炎中的潛在作用。在過氧化鉻酸鉀誘導(dǎo)的模型中，煙酰胺處理導(dǎo)致平均關(guān)節(jié)炎評(píng)分減少25-35％(*Miesel等人，1996)。然而，該研究仍未確定抑制機(jī)理，因?yàn)槠錄]有指明煙酰胺清除自由基活性和PARS抑制效應(yīng)之間有明顯的不同(*Miesel等人，1995)。在本研究中，利用一種新的強(qiáng)效的PARS活性抑制劑(5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP))(*Bauer等人，1995a，*Bauer等人，1995b)，我們研究了PARS在角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的歷程中的藥理學(xué)抑制效果。我們的研究結(jié)果支持了這樣一個(gè)觀點(diǎn)，即PARS的抑制具有抗炎可能性。
實(shí)施例6角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫的誘導(dǎo)和評(píng)價(jià)在這些研究中采用雄性Wister大鼠(250-300克，Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。在動(dòng)物右后足爪的跖底下(subplantar)注射含1％1-角叉菜膠的0.1毫升鹽水。將這種致炎癥試劑給予經(jīng)INH2BP處理的動(dòng)物或載體處理的動(dòng)物。動(dòng)物在注射角叉菜膠前24小時(shí)和2小時(shí)受INH2BP(0.5克/千克p.o.)處理。如*Sautebin等人1995中所述的，在注射后立即用器官充滿度測(cè)量法(phlethysmometry)測(cè)定獸爪體積。隨后間隔60分鐘讀取同一獸爪的體積并與初始值比較。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，采用6只載體處理的動(dòng)物和6只INH2BP處理的動(dòng)物。
實(shí)施例7膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的誘導(dǎo)和評(píng)價(jià)這些研究采用雄性DBA/1J小鼠(9周，Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。將雞II型膠原(CII)在0.01M乙酸中至濃度為2毫克/毫升4℃攪拌過夜使溶解。-70℃冷凍溶解的CII待用。通過加入結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosisH37ra)至2毫克/毫升制得完全的Freund佐劑(CFA)。注射前，用等體積CFA乳化CII。如Hughes等人1994，″用非促有絲分裂性抗-CD3單克隆抗體在自身免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭姓T導(dǎo)T輔助細(xì)胞超反應(yīng)性″J.Immunol.1533319-3325中所述的那樣誘導(dǎo)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。在第1天，在小鼠尾根部經(jīng)皮注射100毫升CII。第21天，第二次注射給予CFA中的CII。從第25天起，每隔24小時(shí)用載體(n＝10)或INH2BP(n＝60(0.5克/千克p.o))處理動(dòng)物。每天用級(jí)別為0至4的肉眼評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)小鼠的關(guān)節(jié)炎(1-獸爪或一個(gè)腳趾溶脹和/或發(fā)紅；2-涉及到兩個(gè)關(guān)節(jié)；3-涉及到兩個(gè)以上的關(guān)節(jié)；3-涉及到兩個(gè)以上的關(guān)節(jié)；4＝整個(gè)獸爪和腳趾有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎)。累加個(gè)別獸爪的四種評(píng)分，計(jì)算每個(gè)小鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)。在實(shí)驗(yàn)最后(第35天)，麻醉處死動(dòng)物，取下獸爪和膝蓋并固定，以進(jìn)行組織學(xué)檢查。組織學(xué)檢查由不知道治療方案的調(diào)查人員進(jìn)行。
數(shù)據(jù)分析和表示對(duì)于角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫的研究，用不成對(duì)的斯圖登特測(cè)試比較處理組和未處理組動(dòng)物的獸爪體積。對(duì)于關(guān)節(jié)炎的研究，用Mann-Whitney U測(cè)試(雙尾，不相關(guān)的)來測(cè)試關(guān)節(jié)炎指數(shù)中的統(tǒng)計(jì)差別。用此非參數(shù)統(tǒng)計(jì)比較中值(而不是平均值)，因?yàn)闇y(cè)定規(guī)模是按序的，而分布值通常是非正態(tài)分布的(Hughes等人1994，″用非促有絲分裂性抗-CD3單克隆抗體在自身免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭姓T導(dǎo)T輔助細(xì)胞超反應(yīng)性″J.Immunol.1533319-3325)。
圖10中的數(shù)值表示成n個(gè)觀察值的平均值±平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差，其中n代表大鼠的數(shù)目(每組6只動(dòng)物)。圖11中的數(shù)值代表發(fā)病率(％)，而圖12中的數(shù)值代表中值。認(rèn)為p值低于0.05在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義(I′＜0.05；**p＜0.02)。
材料如前所述(*Bauer等人，1995a；*Bauer等人，1995b)，制得5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮(INH2BP)。雞II型膠原購自Elastin Products Company，Inc.(Owensville，MO)。結(jié)核分支桿菌H37Ra購自Difco(Detroit，MI)。所有其它化學(xué)物質(zhì)均購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。角叉菜膠跖底下注射大鼠獸爪導(dǎo)致獸爪體積依賴于時(shí)間增加，最大反應(yīng)在3小時(shí)處(圖10)。這種角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫被INH2BP處理明顯減少(圖10)。
在膠原誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)的關(guān)節(jié)炎模型中，在第一次膠原免疫后26-35天之間，從關(guān)節(jié)炎發(fā)病率增加以及關(guān)節(jié)炎評(píng)分增加的證據(jù)(圖11-12)看出，動(dòng)物關(guān)節(jié)炎的發(fā)展日益增加。INH2BP的處理減少關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率直至第33天，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間降低了疾病的嚴(yán)重性。在第30天，關(guān)節(jié)炎評(píng)分增加至10，而INH2BP處理的動(dòng)物中關(guān)節(jié)炎評(píng)分中值仍維持在5左右(圖12)。在第35天，所有經(jīng)載體處理的動(dòng)物以及大多數(shù)受INH2BP處理的動(dòng)物均具有一定程度的關(guān)節(jié)炎(圖11)。然而，即使在第35天，INH2BP處理仍顯著降低了關(guān)節(jié)炎評(píng)分中值(圖12)。
在第35天，對(duì)載體處理的患關(guān)節(jié)炎動(dòng)物的獸爪進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，揭示有嚴(yán)重的化膿性關(guān)節(jié)炎癥狀，大量混合(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)浸潤到更大的踝關(guān)節(jié)和終腳趾中。另外，可以看到嚴(yán)重或中度的壞死、增生和滑膜腐肉分離，以及炎癥延伸到毗鄰的肌肉系統(tǒng)導(dǎo)致纖維化和增多的粘液產(chǎn)生。在INH2BP處理的動(dòng)物體內(nèi)，關(guān)節(jié)炎的程度顯著降低。盡管如此，在這些動(dòng)物體內(nèi)仍有程度明顯的關(guān)節(jié)炎，有中等程度的、主要是中性粒細(xì)胞浸潤到一些較大的關(guān)節(jié)中，還伴有輕度至中度的壞死和滑膜增生。與獸爪中的發(fā)現(xiàn)類似，在膝蓋中發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重的化膿性關(guān)節(jié)炎癥狀被INH2BP的治療減輕(結(jié)果未顯示)。
討論過亞硝酸鹽、含氧基團(tuán)以及可誘導(dǎo)的環(huán)加氧酶的產(chǎn)物已經(jīng)被獨(dú)立地認(rèn)為是各種形式的炎癥(包括關(guān)節(jié)炎)發(fā)病機(jī)理中的重要因素(見引言，另見Brahn，1991，″類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型。病因?qū)W和治療的線索″Clin.Orthop.Rel.Res.26542-53；Kaur等人，″慢性發(fā)炎中一氧化氮介導(dǎo)的氧化性損傷的證據(jù)。類風(fēng)濕性患者的血清和滑液中的硝基酪氨酸″FEBS Lett.13599-12；Oyanagui Y，1994，″一氧化氮和超氧化物自由基參與大鼠體內(nèi)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎的起始和發(fā)展(envelopment)″Life Sci.54PL285-9；Miesel等人，1994，″別嘌呤醇阻抑小鼠體內(nèi)關(guān)節(jié)炎的效果以及在活體外調(diào)節(jié)人全血中吞噬細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基″Inflammation6597-612；Whiteman等人，1996，″用某些抗炎藥物和四環(huán)素抗生素保護(hù)抵抗依賴過亞硝酸鹽的酪氨酸硝化和α1-抗蛋白酶滅活″Annals.of the Rheumatic Disease55383-7；Anderson等人，1996，″選擇性抑制環(huán)加氧酶(COX)-2逆轉(zhuǎn)了大鼠反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎中COX-2和白細(xì)胞介素6的發(fā)炎和表達(dá)″J.Clin.Invest.972672-2679)。本研究證實(shí)了INH2BP在角叉菜膠誘導(dǎo)的獸爪水腫模型和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中的抗炎效果，這支持了這樣一個(gè)觀點(diǎn)，即PARS參與發(fā)炎過程的進(jìn)展且PARS的藥理學(xué)抑制具有抗炎的潛在可能。
INH2BP的初步作用模式可能與以DNA損傷為特征的瑣碎的胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)被打斷有關(guān)。PARS激活、腺苷二磷酸核糖化以及NAD+和ATP的清除在發(fā)炎關(guān)節(jié)的各種細(xì)胞類型中。用PARS的各種抑制劑(如3-氨基苯甲酰胺、煙酰胺和INH2BP)抑制該通道已經(jīng)顯示出能保護(hù)多種細(xì)胞免受損傷(Berger，1911；*Cochrane，1991；Szabo等人，1996，″過亞硝酸鹽在休克、發(fā)炎和局部缺血(schemia)再灌輸損傷的生理病理學(xué)中的作用″Shock 679-88；*Sazbo，1996b)。
炎性病情中過度產(chǎn)生NO是由于可誘導(dǎo)的NOS同種型(iNOS)受阻抑(Nathan，1992，″一氧化氮作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分泌型產(chǎn)物″FASEB J.63051-3064；Szabo；1995，″各種形式的循環(huán)性休克中一氧化氮的產(chǎn)生的變化″New Horizons 33-32；Southan等人，1996，″氨基烷基胍自發(fā)重排成巰基烷基胍-一類新的對(duì)于可誘導(dǎo)同種型有選擇性的一氧化氮合成酶抑制劑″Br.J.Pharmacol.117619-632)。幾條證據(jù)暗示了iNOS和NO過度產(chǎn)生在關(guān)節(jié)炎致病機(jī)理中的作用(綜述參見Stenovic-Racic等人，1993，″一氧化氮和關(guān)節(jié)炎″Arthr.Rhemat.361036-1044；*Evans等人，1995)。第一，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的軟骨細(xì)胞中已經(jīng)證明有iNOS表達(dá)和NO大量產(chǎn)生(Haeselmann等人，1994，″海藻酸鹽培養(yǎng)中人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成一氧化氮和蛋白聚糖″FEBS Lett.352361-364；Sakurai等人，1995，″炎性關(guān)節(jié)炎中的一氧化氮產(chǎn)生和可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶表達(dá)″J.Clin.Invest.962357-63；Grabowski等人，1996，″人關(guān)節(jié)衍生獲得的細(xì)胞中產(chǎn)生一氧化碳″Br.J.Rheumatol.35207-12；Murrell等人，1996，″一氧化氮重要的關(guān)節(jié)自由基″J.Bone Joint Sur.-Am.78265-74)。第二，在關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)已經(jīng)證實(shí)亞硝酸鹽/硝酸鹽(NO的降解產(chǎn)物)的循環(huán)水平有所增加(Farrell等人，1992，″滑液和血清樣品中亞硝酸鹽的濃度增加提示類風(fēng)濕性疾病中的一氧化氮合成增加″Ann.Rhem.Dis.511219-22；Stichtenoth等人，1995，″類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的尿液硝酸鹽分泌增加，并由強(qiáng)的松龍(predisolone)使其減少″Ann.Rhem.Dis.54820-4)。第三，關(guān)節(jié)炎的發(fā)展已經(jīng)表現(xiàn)出被NOS的非同種型選擇性抑制劑降低(*Ialential等人，1993；McCartney-Francis等人，1993，″一氧化氮合成酶的抑制劑阻抑關(guān)節(jié)炎″J.Exp.Med.178749-753；Weinberg等人，1994，″一氧化氮在自發(fā)性鼠自身免疫疾病的致病機(jī)理中的作用，增加MRL-1 pr/1pr小鼠中一氧化氮的產(chǎn)生和一氧化氮合成酶的表達(dá)，以及通過口服NG-一甲基-L-精氨酸減少了自發(fā)產(chǎn)生的腎小球性腎炎和關(guān)節(jié)炎″J.Exp.Med.1979651-60；Stefanovic-Racic等人，1994，″一種一氧化氮合成酶的抑制劑N-一甲基精氨酸阻抑大鼠體內(nèi)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展″Arthr.Rheumat.371062-9)，以及更近期，被對(duì)iNOS有選擇性的抑制劑降低(Connor等人，1995，″用可誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶的選擇性抑制來阻抑佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎″Eur.J.Pharmacol.27315-24)。在這方面，值得注意的是，在免疫刺激前用PARS抑制劑(包括3-氨基苯甲酰胺、煙酰胺和INH2BP)預(yù)處理多種細(xì)胞已經(jīng)顯示能阻抑iNOS的mRNA表達(dá)并減少NO的產(chǎn)生(*Hauschildt等人，1992，*Pellat-Scecunyk等人，1994；Zingarelli等人，1996，″經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中，過亞硝酸鹽介導(dǎo)的DNA鏈斷裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起細(xì)胞能量消耗″J.Immunol.156350-358；*Szabo等人，1997)。從這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出結(jié)論，PARS通過一個(gè)還未確定的機(jī)制也能調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)過程，該效應(yīng)可能代表了PARS抑制在不同形式的發(fā)炎中其它有利的作用模式。然而，在解釋上述發(fā)現(xiàn)時(shí)應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎。例如，在上述體外研究中，為了證實(shí)能阻抑iNOS誘導(dǎo)，需要非常高濃度(10-30mM)的PARS抑制劑3-氨基苯甲酰胺和煙酰胺。這些試劑的高濃度可能有其它的藥理學(xué)作用，例如抑制總蛋白和RNA合成和/或清除自由基的作用(*Hauschildt，1992，*Pellat-Seceunyk等人，1994；Zingarelli等人，1996，″經(jīng)細(xì)菌脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞中，過亞硝酸鹽介導(dǎo)的DNA鏈斷裂激活了多腺苷二磷酸核糖合成酶并引起細(xì)胞能量消耗″J.Immunol.156350-358)。另一方面，即使在較低的非細(xì)胞毒性濃度(10-300mM)下，INH2BP有效地阻抑了iNOS的表達(dá)。然而，在INH2BP情況下，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為有幾種作用模式，因?yàn)樵撛噭┦菈A性磷酸酶的誘導(dǎo)物，具有細(xì)胞反應(yīng)的補(bǔ)充的、多效調(diào)節(jié)作用(*Bauer等人，1996；*Szabo等人，1997)。要在消除PARS基因的細(xì)胞或動(dòng)物中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以便確切地解決PARS的抑制是否本身阻抑了iNOS誘導(dǎo)過程的問題。
在Ehrlich及其同事最近的研究中，表明在培養(yǎng)的家兔滑液成纖維細(xì)胞中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的膠原酶活性的表達(dá)被3-氨基苯甲酰胺阻抑(*Ehrlich等人，1995)?，F(xiàn)在可能可以確定其藥理學(xué)作用(但是預(yù)計(jì)將阻抑關(guān)節(jié)炎的過程)、所用特定抑制劑的性質(zhì)或者它真正與PARS催化活性的減少有關(guān)。在這方面，值得注意的是，根據(jù)對(duì)藥理學(xué)抑制劑的研究，PARS已經(jīng)參與了各種基因的調(diào)節(jié)，這些基因包括主要組織相容型復(fù)合體II類基因(*Hiromatsu等人，1992；Taniguchi等人，1993)、ras c-myc(*Bauer等人，1996，*Nagao等人，1991)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因(*Bauer等人，1996)和蛋白激酶C基因(*Bauer等人，1996)。
總之，這個(gè)研究工作證實(shí)了INH2BP改善了局部炎性反應(yīng)的發(fā)展并抑制了膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。雖然在過去的10年中已經(jīng)報(bào)道了PARS在DNA修復(fù)中的作用，但是最近的觀察表明消除PARS基因不會(huì)損害到DNA的修復(fù)PARS敲除的動(dòng)物表現(xiàn)正常并存活(*Wang等人，1995)。這一觀察加強(qiáng)了藥理學(xué)抑制劑PARS的抗炎趨勢(shì)。PARS抑制(與iNOS抑制相反)不可能干擾NO的重要的抗微生物的效果，因?yàn)榍秩氲奈⑸锊缓琍ARS。另一方面，預(yù)計(jì)PARS抑制不僅能抑制氧化劑誘導(dǎo)的部分細(xì)胞毒性，而且在和其它自由基清除劑或其它免疫阻抑劑結(jié)合應(yīng)用時(shí)更有效。本發(fā)明研究結(jié)果支持了這樣一個(gè)觀點(diǎn)，即單獨(dú)的PARS抑制或與其它抗炎劑的組合代表了一種有前景的新的抗炎方法。
用上述實(shí)施例所示類似方式，用式II和式III化合物治療炎癥或炎性疾病，并治療革蘭陰性和革蘭陽性感染。
認(rèn)為前述說明足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。實(shí)際上，對(duì)上述用于實(shí)施發(fā)明的方式進(jìn)行各種修飾對(duì)于藥物制劑領(lǐng)域或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，這些均在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)炎癥或炎性疾病的方法，所述方法包括給予所述動(dòng)物或哺乳動(dòng)物有效量的pADPRT抑制性化合物的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中pADPRT抑制性化合物選自下列化合物具有下式的化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6各選自氫、羥基、氨基、烷基、烷氧基、環(huán)烷基或苯酚，這些基團(tuán)可任意被烷基、烷氧基、羥基或鹵素取代，R1、R2、R3、R4、R5和R6中只有一個(gè)是氨基；具有下式的化合物
其中R1、R2、R3、R4和R5各自選自氫、羥基、氨基、烷基、烷氧基、環(huán)烷基或苯酚，這些基團(tuán)可任意被烷基、烷氧基、羥基或鹵素取代，R1、R2、R3、R4、R5中只有一個(gè)選自氨基、亞硝基或硝基；和具有下式的化合物
其中R1、R2、R3、R4和R5各自選自氫、羥基、氨基、烷基、烷氧基、環(huán)烷基或苯酚，這些基團(tuán)可任意被烷基、烷氧基、羥基或鹵素取代，R1、R2、R3、R4和R5中只有一個(gè)是氨基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述化合物選自6-氨基-1，2-苯并吡喃酮、3-氨基苯甲酰胺、5-氨基-1(2H)-異喹啉酮、7-氨基-1(2H)-異喹啉酮和8-氨基-1(2H)-異喹啉酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化合物是5-碘代-6-氨基-1，2-苯并吡喃酮。
5.一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)革蘭陰性和革蘭陽性菌誘導(dǎo)的內(nèi)毒素癥狀的方法，所述方法包括給予動(dòng)物或哺乳動(dòng)物治療有效量的pADPRT抑制性化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中化合物選自具有下式的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療動(dòng)物或哺乳動(dòng)物體內(nèi)炎癥或炎性疾病的方法,該方法包括給予所述動(dòng)物或哺乳動(dòng)物有效量的pADPRT抑制性化合物的步驟。
文檔編號(hào)A61K31/366GK1261278SQ98806389
公開日2000年7月26日 申請(qǐng)日期1998年5月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月13日
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