專利名稱：改進(jìn)的加工活化c蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣義上涉及在加工和純化期間使活化C蛋白自降解減少的方法。
背景技術(shù)：
C蛋白是一種絲氨酸蛋白酶，為天然存在的抗凝劑，它在凝血級(jí)聯(lián)中通過使因子Va和VIIIa失活而調(diào)節(jié)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起作用。人的C蛋白在體內(nèi)最初在肝臟中作為461個(gè)氨基酸的單一多肽制備。這種前體分子經(jīng)受了多步翻譯后修飾，包括1)切割一個(gè)42個(gè)氨基酸的信號(hào)序列；2)從一條鏈的酶原中水解去除156位的賴氨酸殘基和157位的精氨酸殘基，制備2鏈形式的該分子(即一條155個(gè)氨基酸殘基的輕鏈通過一個(gè)二硫橋連接至262個(gè)氨基酸殘基的含絲氨酸蛋白酶的重鏈)；3)將該輕鏈的前42個(gè)氨基酸中成簇的9個(gè)谷氨酸殘基進(jìn)行維生素K依賴性羧化，產(chǎn)生9個(gè)γ-羧基谷氨酸(GLA)殘基；和4)于4個(gè)位點(diǎn)(一個(gè)位于輕鏈中，3個(gè)位于重鏈中)連接碳水化合物。重鏈含有很好建立的Asp 257、His 211和Ser 360的絲氨酸蛋白酶三聯(lián)體。最后，在體內(nèi)在鈣離子存在下，在磷脂表面由凝血酶活化這種循環(huán)2鏈酶原。由于去除了重鏈N末端的十二肽，導(dǎo)致活化，產(chǎn)生了活化C蛋白(aPC)的加工酶活性?；罨疌蛋白與其它蛋白一起，作為對導(dǎo)致血栓形成的凝血可能是最重要的負(fù)調(diào)節(jié)物起作用。
不幸的是，aPC可以自降解，導(dǎo)致作為抗凝劑的功能性降低。本領(lǐng)域公認(rèn)的活化C蛋白的降解途徑是于重鏈的380位進(jìn)行蛋白水解剪除，產(chǎn)一個(gè)111個(gè)氨基酸的片段。在本領(lǐng)域中該降解產(chǎn)物確定為EAK片段。
先前減少自降解的嘗試集中于最大限度地減少EAK片段的形成。最值得注意的是，于1995年7月12日申請的Prouty等的EP 0 662513指出，通過將pH控制至約6.3-7.0；在3M尿素中溫育aPC；或?qū)PC暴露于極端的鹽環(huán)境中，極端的鹽環(huán)境的定義是高于0.4M或低于0.05M，而最大限度地減少aPC的自降解。
申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了第二種重要的降解途徑-導(dǎo)致于10位的組氨酸殘基任一端剪除的輕鏈N末端的自降解。這種降低途徑產(chǎn)生兩種無活性產(chǎn)物。輕鏈前9個(gè)殘基的N末端剪除產(chǎn)生des(1-9)活化C蛋白，而輕鏈前10個(gè)殘基的N末端剪除產(chǎn)生des(1-10)活化C蛋白。先前尚未報(bào)道過的這種降解途徑由于去除了6位和7位的關(guān)鍵的GLA殘基，導(dǎo)致抗凝劑活性的喪失。因此，在得到有效的高純度活化C蛋白藥用制劑方面，最大限度地降低des(1-9)和des(1-10)活化C蛋白自降解產(chǎn)物是重要的。這些變異體是先前未知的降解產(chǎn)物，通過常規(guī)純化技術(shù)去除這些變異體如果不是不可能，也是極其困難的。最大限度地減少其形成的條件是先前未知的。
申請人鑒定出活化C蛋白的這種重要的自降解途徑，使得能夠發(fā)現(xiàn)提高活化C蛋白的純度和效力的加工和配制條件。申請人已經(jīng)證明，于低pH(例如低于6.3)下，有利于des(1-9)aPC或des(1-10)aPC的自降解途徑比有利于308-309自降解途徑占優(yōu)勢，然而，于低于6.3的pH下使用提高的氯化鈉濃度(高于150mM)，顯著降低des(1-9)aPC和/或des(1-10)aPC自降解反應(yīng)的程度。
因此，本發(fā)明提供于高于150mM的離子強(qiáng)度和約5.5至低于6.3的pH下加工活化C蛋白的方法。在這些條件下，des(1-9)aPC和des(1-10)aPC的形成顯著減少。因此，本發(fā)明提供沒有不希望的降解的加工活性C蛋白水溶液的改進(jìn)方法。
附圖描述

圖1提供了活化的人C蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，以有助于說明本文描述的自降解途徑。本文采用的命名基于人活化C蛋白一級(jí)序列的編號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到其它種類的活化C蛋白可能在一級(jí)序列中略微變化，由此導(dǎo)致本文定義的命名改變。
發(fā)明概述本發(fā)明提供活化C蛋白水溶液和加工這類溶液的改進(jìn)方法，該方法包括在高于150mM的離子強(qiáng)度和約5.5至低于6.3的pH下進(jìn)行所述加工。
本發(fā)明還提供通過層析分離純化活化C蛋白的方法，該方法包括在所述層析分離期間，用離子強(qiáng)度高于150mM和pH為約5.5至低于6.3的洗脫水溶液洗脫所述活化C蛋白。
本發(fā)明還提供通過過濾濃縮活化C蛋白溶液的方法，該方法包括將所述活化C蛋白作為離子強(qiáng)度高于150mM和pH為約5.5至低于6.3的水溶液送至過濾膜。
本發(fā)明也提供通過本文所述方法制備的活化C蛋白。
本發(fā)明最后提供des(1-9)aPC和/或des(1-10)aPC低于10％(重量)的活化C蛋白藥用制劑。
發(fā)明詳述本說明書中所用的所有氨基酸縮寫均為美國專利和商標(biāo)局接受的、于37 C.F.R.§1.822(B)(2)中提出的縮寫。
對于本文公開和要求保護(hù)的本發(fā)明的目的，以下術(shù)語如下定義。
aPC或活化C蛋白-是指C蛋白，無論它是重組的還是來自血漿的。aPC包括人C蛋白，并且最好是人C蛋白，盡管aPC也可以包括具有C蛋白蛋白水解、酰胺分解、酯解和生物(抗凝劑或血纖溶酶原酶解)活性的其它種類或衍生物。Gerlitz等的美國專利第5,453,373號(hào)和Foster等的美國專利第5,516,650號(hào)描述了C蛋白衍生物的實(shí)例，這些專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。
APTT-活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間。
水性的-包括助溶劑體系以及僅使用水作為溶劑。水性的最好是指僅用水作為溶劑。
層析分離-包括本領(lǐng)域公認(rèn)和知道的層析技術(shù)，包括大小排阻層析、陰離子層析、陽離子層析、疏水層析、反相層析等。
交叉流過濾-是指通過跨濾膜的切向流的分配，其中該產(chǎn)物或者被該膜保留(如在濃縮或滲濾中)，或被該膜通過(如在病毒清除過濾中)。
PC-C蛋白酶原。
加工-是指可用于活化C蛋白生產(chǎn)中的單元操作，諸如柱層析、過濾(切向流過濾、交叉流過濾、死端式過濾)、凍干、泵送或貯存。
r-aPC-通過以下方法生產(chǎn)的重組活化C蛋白通過在體外活化，或通過直接從原核細(xì)胞、真核細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分泌活化形式的C蛋白，包括例如從人腎293細(xì)胞作為酶原分泌，然后通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并在Yan的美國專利第4,981,952號(hào)和Cottingham的WO97/20043中證明的技術(shù)純化和活化。
本發(fā)明涉及加工活化C蛋白的改進(jìn)方法。本發(fā)明特別涉及通過蛋白富集或濃縮以及蛋白純化操作加工活化C蛋白，而同時(shí)減少自降解。本發(fā)明的特征在于這類加工，尤其是具有在本文所述的條件下用該蛋白的水溶液進(jìn)行的這種修飾、富集和純化操作。
本文要求保護(hù)的條件的組合，最大限度地減少des(1-9)aPC和des(1-10)aPC的形成。des(1-9)aPC和des(1-10)aPC非常難以通過已知純化方法去除，所以最好是在aPC藥用制劑的生產(chǎn)期間最大限度的減少其形成。在要求保護(hù)的條件下制備的活化C蛋白大致不含des(1-9)aPC和des(1-10)aPC變異體。一般而言，在這些條件下制備的aPC的藥用制劑大致不含des(1-9)aPC和des(1-10)aPC，具有的單獨(dú)的或組合的這些變異體一般低于10％，優(yōu)選低于8％，更優(yōu)選低于5％，最優(yōu)選低于3％(重量)。采用按本文所述制備和要求保護(hù)的aPC制備的凍干藥用制劑，證明其溶液狀態(tài)(在凍干之前)的穩(wěn)定性增加，重建時(shí)穩(wěn)定24-48小時(shí)。觀察到于2-8℃下在多達(dá)5天、于15℃多達(dá)50小時(shí)、以及于25℃多達(dá)40小時(shí)，效力的損失不超過5％。在本發(fā)明之前，這種穩(wěn)定性以前不能達(dá)到。
小心控制pH、離子強(qiáng)度和最好控制溫度，可以將加工期間水溶液中的和制劑中的活性C蛋白的自降解降低至先前不能達(dá)到的水平，特別是在缺乏尿素或其它變性劑、組氨酸、賴氨酸鹽酸鹽或清蛋白的情況下。
在本發(fā)明的廣泛實(shí)踐中，設(shè)想了加工C蛋白包括種類繁多的單元操作、物理分離和純化操作，包括層析處理和交叉流過濾(諸如用于純化該蛋白組合物、濃縮該蛋白溶液或用于溶劑交換)以及可能的化學(xué)處理和酶處理。本發(fā)明設(shè)想的蛋白加工特別包括通過標(biāo)準(zhǔn)層析法(諸如離子交換層析、疏水層析等)的純化以及通過超濾和相似方法的蛋白濃縮。蛋白加工也計(jì)劃包括蛋白溶液在準(zhǔn)備用于這種純化和濃縮步驟的存儲(chǔ)器等中的保留。為了降低不穩(wěn)定性，活化C蛋白溶液的所有加工包括各種蛋白純化和蛋白濃縮步驟，均在本文所述的條件下進(jìn)行。這類加工步驟涉及最終的蛋白分離，通常作為凍干粉，用于配制為藥用制劑。
該水性加工溶液的pH為約5.5至低于6.3。更優(yōu)選的是，為5.7至低于6.3。再更優(yōu)選的是，pH在約5.6至約6.2之間。甚至更優(yōu)選的是約5.8至約6.2之間的pH。再更優(yōu)選的是約5.9至約6.1之間的pH。最優(yōu)選的pH為約6.0。維持有效pH控制的代表性的緩沖液系統(tǒng)包括Tris-乙酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸鹽-甘氨酸和磷酸鈉。更優(yōu)選的緩沖液系統(tǒng)包括檸檬酸鈉和磷酸鈉。最優(yōu)選的緩沖液為檸檬酸鈉。該緩沖液系統(tǒng)的優(yōu)選的體積摩爾濃度為10mM-50mM。最優(yōu)選的體積摩爾濃度為20-40mM。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可利用許多其它緩沖液系統(tǒng)，它們也可以用來將pH維持在要求保護(hù)的范圍內(nèi)。
加工溶液的離子強(qiáng)度是本發(fā)明的第二個(gè)關(guān)鍵的因素。離子強(qiáng)度一般得自藥用可接受鹽的加入-最好是加入氯化鈉或氯化鉀。離子強(qiáng)度最好高于或等于150mM，得自緩沖溶液中高于150mM的鹽濃度。優(yōu)選的是，鹽濃度不高于約1000mM，以有利于下游加工。最優(yōu)選的是，鹽濃度為約200mM至1000mM。以前認(rèn)為，高于50mM并低于400mM的濃度是不可接受的。
確保最小自降解的另一條件是溫度。溶液加工期間的加工溫度優(yōu)選為0-10℃之間，更優(yōu)選在2-8℃之間，在這些溫度范圍以外，活性C蛋白的自降解發(fā)生顯著。然而，如果不包括活化C蛋白的完整性，則短時(shí)間超過10℃可以耐受。
活化C蛋白的濃度不是本發(fā)明的關(guān)鍵。重要的是，在本文所述的條件下于高濃度下加工該蛋白的能力顯著增強(qiáng)。優(yōu)選的蛋白濃度為約1mg/ml至約50mg/ml，更優(yōu)選為1-30mg/ml，再更優(yōu)選為1-20mg/ml，最優(yōu)選為1-10mg/ml，盡管考慮到較高或較低的濃度是可操作的。
按本文所述制備的活化C蛋白可用于治療各種各樣的涉及血管內(nèi)凝血的獲得性疾病狀態(tài)，包括血栓形成性中風(fēng)、深靜脈血栓形成、肺栓塞、外周動(dòng)脈血栓形成、源自心臟或外周動(dòng)脈的栓子、急性心肌梗死、彌散性血管內(nèi)凝血和急性毛細(xì)血管前或毛細(xì)血管后閉合，包括移植或視網(wǎng)膜血栓形成。
理想的是用填充劑將活化C蛋白配制為凍干狀態(tài)。理想的是選擇填充劑，使得它提高該分子的固態(tài)穩(wěn)定性。這種賦形劑的實(shí)例是蔗糖、海藻糖和棉子糖。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可利用許多其它填充劑，它們也可以用于活化C蛋白中。制劑的填充劑濃度是冷凍干燥過程的關(guān)鍵性配制變量。優(yōu)選的填充劑是蔗糖，待凍干溶液中的其濃度為15-30mg/ml。待凍干溶液中最優(yōu)選的蔗糖濃度為2.5mg/ml aPC制劑中15mg/ml。待凍干溶液中最優(yōu)選的蔗糖濃度為5.0mg/ml aPC制劑中30mg/ml。
提出以下實(shí)施例，以說明和解釋本發(fā)明。不應(yīng)認(rèn)為本發(fā)明的范圍限于這些實(shí)施例。除非另外陳述，否則所有份數(shù)和百分率的參比均基于重量，而所有溫度均以攝氏度表示。
制備1人C蛋白的制備用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，諸如在Yan的美國專利第4,981,952號(hào)(其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中提出的那些方法，在人腎293細(xì)胞中生產(chǎn)重組人C蛋白(酶原)。在Bang等的美國專利第4,775,624(其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中公開和要求保護(hù)了編碼人C蛋白的基因。在293細(xì)胞中表達(dá)人C蛋白的質(zhì)粒是質(zhì)粒pLPC，該質(zhì)粒公開于Bang等的美國專利第4,992,373號(hào)，該專利的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。質(zhì)粒pLPC的構(gòu)建也描述于歐洲專利申請第0445 939號(hào)和Grinnell等，1987，Bio/Technology 51189-1192中，其內(nèi)容通過引用也結(jié)合到本文中。簡而言之，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞中，然后鑒定出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，傳代培養(yǎng)并在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵后，通過微量過濾獲得無細(xì)胞培養(yǎng)基。
通過采用Yan的美國專利第4,981,952號(hào)的技術(shù)(其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)，從培養(yǎng)基流體中分離人C蛋白酶原。在將培養(yǎng)基吸附至陰離子交換樹脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)之前，將澄清的培養(yǎng)基在EDTA中制備為4mM。用4倍柱體積的20mM Tris、200mM NaClpH 7.4和2倍柱體積的20mM Tris、150mM NaCl pH 7.4洗滌后，用20mM Tris、150mM NaCl、10mM CaCl2pH 7.4洗脫結(jié)合的重組人C蛋白酶原。洗脫后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷，洗脫的蛋白的純度高于95％。
通過將蛋白在NaCl中制備為3M，然后吸附至在20mM Tris、3M NaCl、10mM CaCl2pH 7.4中平衡的疏水互作樹脂(ToyopearlPhenyl 650M，TosoHaas)，完成該蛋白的進(jìn)一步純化。用2倍柱體積無CaCl2的平衡緩沖液洗滌后，用20mM Tris pH 7.4洗脫重組的人C蛋白酶原。通過去除殘留的鈣制備用于活化的洗脫蛋白，。使該酶原通過金屬親和柱(Chelex-100，Bio-Rad)，以去除鈣并再次結(jié)合至陰離子交換樹脂(Fast Flow Q，Pharmacia)。串聯(lián)布置這兩個(gè)柱子，并在20mMTris、150mM NaCl、5mM EDTA pH 7.4中平衡。將該蛋白上柱后，用1倍柱體積的相同緩沖液洗滌Chelex-100柱，然后將該蛋白從該串聯(lián)柱上分離出來。用3倍柱體積的平衡緩沖液洗滌陰離子交換柱，然后用0.4M NaCl、20mM Tris-乙酸鹽pH 6.5洗脫該蛋白。根據(jù)UV280nm消光度E0.1％＝1.81，測量重組人C蛋白的蛋白濃度。
制備2重組人C蛋白的活化在50mM HEPES pH 7.5存在下，于4℃將牛凝血酶偶聯(lián)至活化的CH-Sepharose 4B(Pharmacia)。在已經(jīng)裝入柱子的樹脂上，用約5000單位凝血酶/ml樹脂進(jìn)行該偶聯(lián)反應(yīng)。將凝血酶溶液通過該柱循環(huán)約3小時(shí)，然后向循環(huán)溶液中加入2-氨基乙醇(MEA)至0.6ml/L濃度。將含MEA的溶液再循環(huán)10-12小時(shí)，以確保完全封閉該樹脂上未反應(yīng)的胺。封閉后，用10倍柱體積的1M NaCl、20mM Tris pH 6.5洗滌凝血酶偶聯(lián)樹脂，以去除所有的非特異性結(jié)合的蛋白，并在活化緩沖液中平衡后用于活化反應(yīng)。
純化的rHPC在DETA(以螯合任何殘留的鈣)中制備為5mM，并用20mM Tris pH 7.4或20mM Tris-乙酸鹽pH 6.5稀釋至2mg/ml的濃度。使該物質(zhì)通過于37℃用50mM NaCl和或者20mM Tris pH7.4或者20mM Tris-乙酸鹽pH 6.5平衡的凝血酶柱。調(diào)節(jié)流速，以允許rHPC和凝血酶樹脂之間的接觸時(shí)間約為20分鐘。收集流出液，并立即分析其酰胺分解活性。如果該物質(zhì)的比活(酰胺分解)與建立的aPC標(biāo)淮不相當(dāng)，則將其再次在凝血酶柱上循環(huán)，以將rHPC完全活化。然后用20mM上述緩沖液1∶1稀釋該物質(zhì)料。
通過在活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)凝血測定中測量凝血時(shí)間的延長，測定活化C蛋白的抗凝劑活性。在稀釋緩沖液(1mg/ml放射免疫級(jí)BSA、20mM Tris pH 7.4、150mM NaCl、0.02％NaN3)中，制備C蛋白范圍為125-1000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)在該濃度范圍內(nèi)以幾個(gè)稀釋度制備樣品。向每個(gè)樣品杯中加入50μl冷的馬血漿和50μl重建的活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間試劑(APTT試劑，Sigma)，于37℃溫育5分鐘。溫育后，向每個(gè)杯中加入50μl適當(dāng)?shù)臉悠坊驑?biāo)準(zhǔn)。用稀釋緩沖液取代樣品或標(biāo)準(zhǔn)，以測定基礎(chǔ)凝固時(shí)間。將50μl 37℃的30mM CaCl2加入每種樣品或標(biāo)準(zhǔn)后，立即啟動(dòng)fibrometer(CoA篩止血分析僅(Screener Hemostasis Analyzer)，American Labor)的計(jì)時(shí)器。從標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸等式計(jì)算樣品中活化C蛋白的濃度。凝固時(shí)間是三次平行測定的最小值的平均值，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。根據(jù)UV 280nm消光度E0.1％＝1.85，測量重組活化C蛋白的蛋白濃度。
實(shí)施例1aPC的層析分離將電導(dǎo)率約為14mMho、pH為5.7的aPC溶液上樣至9.5cm×9cm(h×d)的S-Sepharose Fast Flow陽離子交換樹脂柱，該柱與25cm×14cm(h×d)的Q Sepharose Fast Flow陰離子交換樹脂柱串聯(lián)連接。這兩個(gè)柱子均在20mM檸檬酸鈉pH 6.0、150mM NaCl中預(yù)平衡。該柱的上樣量為每升陰離子交換樹脂10克aPC。該柱用大于2倍柱體積的平衡緩沖液洗滌，用20mM檸檬酸鈉pH 6.0、400mMNaCl分步洗脫。所有的操作均在2-8℃下進(jìn)行，線性流速為60cm/hr。
盡管所述aPC具有高活性(根據(jù)APTT測定為539單位/mg)，且在層析期間被相當(dāng)濃縮(峰值＞20g/L)并處于聚集主流中(10克/L)，但該產(chǎn)物仍保持穩(wěn)定。通過減小和未減小的胰蛋白酶消化輕鏈的質(zhì)譜證實(shí)了這些觀察，所述質(zhì)譜表明沒有可檢測的(＜2％)含308-309內(nèi)源蛋白水解剪除的同種型，也不存在des(1-9)aPC和des(1-10)(＜5％)。
實(shí)施例2病毒過濾用切向流過濾(Millopore VirusolveTM180膜)，過濾20mM Tris、150mM NaCl和20mM EDTA緩沖液中的活化C蛋白(4mg/ml)。用滲濾緩沖液促進(jìn)aPC通過該濾膜。滲濾緩沖液為20mM檸檬酸鈉和150mM NaCl。過濾在20mM Tris、150mM NaCl和20mM EDTA緩沖液中的4mg/ml aPC溶液(10L)。檸檬酸鈉和氯化鈉緩沖液用作滲濾緩沖液，以產(chǎn)生終體積為21.5L的aPC溶液。
實(shí)施例3冷凍干燥通過將適量的蔗糖、氯化鈉和檸檬酸鈉加入預(yù)定體積的r-aPC中，在小瓶中制備溶液，產(chǎn)生2.5mg/ml aPC、15mg/ml蔗糖、325mM氯化鈉和20mM檸檬酸鈉pH 6.0。用常規(guī)冷凍干燥器將溶液凍干，產(chǎn)生適用于重建和給予患者的凍干aPC小瓶。該凍干制劑的des(1-9)aPC和des(1-10)aPC低于10％。
實(shí)施例4冷凍干燥通過將適量的蔗糖、氯化鈉和檸檬酸鈉加入預(yù)定體積的r-aPC中，在小瓶中制備溶液，產(chǎn)生5mg/ml aPC、30mg/ml蔗糖、650mM氯化鈉和40mM檸檬酸鈉pH 6.0。用常規(guī)冷凍干燥器將溶液凍干，產(chǎn)生適用于重建和給予患者的凍干aPC小瓶。該凍干制劑的des(1-9)aPC和des(1-10)aPC低于10％。
在前述說明書中已經(jīng)描述了本發(fā)明的原理、優(yōu)選實(shí)施方案和操作模式。然而，本文計(jì)劃保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)解釋為限于公開的具體形式，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為是說明性的，而不是限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行變化和修改，而不違背本發(fā)明的精神。
權(quán)利要求
1.加工活化C蛋白水溶液的改進(jìn)方法，所述方法包括在高于150mM的離子強(qiáng)度和約5.5至低于6.3的pH下進(jìn)行這種加工。
2.權(quán)利要求1的方法，其中C蛋白為人活化C蛋白。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述pH為5.6-6.2。
4.權(quán)利要求3的方法，其中這種溶液包含氯化鈉。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述氯化鈉的濃度為200mM至1000mM。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述加工選自層析分離、冷凍干燥或過渡。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述pH用檸檬酸鈉緩沖。
8.加工活化C蛋白水溶液的方法，所述方法包括在氯化鈉濃度為150mM至1000mM和用檸檬酸鈉緩沖的pH約5.8至約6.2的水溶液中、于約0℃至約10℃的溫度下進(jìn)行所述加工。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述pH用檸檬酸鈉緩沖。
10.加工活化C蛋白水溶液的方法，所述方法包括在氯化鈉濃度為200mM至1000mM和用檸檬酸鈉緩沖的pH約5.8至約6.2的水溶液中、于約0℃至約10℃的溫度下進(jìn)行所述加工。
11.權(quán)利要求10的水溶液，其des(1-9)活化C蛋白和des(1-10)活化C蛋白低于10％(重量)。
12.權(quán)利要求11的水溶液，其des(1-9)活化C蛋白和des(1-10)活化C蛋白低于5％(重量)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法制備的活化C蛋白。
14.包含活化C蛋白和一種填充劑的藥用制劑；所述制劑的des(1-9)活化C蛋白和des(1-10)活化C蛋白低于約10％(重量)。
15.權(quán)利要求14的藥用制劑；所述制劑的des(1-9)活化C蛋白和des(1-10)活化C蛋白低于約5％(重量)。
全文摘要
本發(fā)明廣義上涉及在加工和純化期間使活化C蛋白自降解減少的方法。本發(fā)明提供活化C蛋白水溶液和加工這類溶液的改進(jìn)方法,該方法包括在高于150mM的離子強(qiáng)度和約5.5至低于6.3的pH下進(jìn)行這種加工。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1261280SQ98806382
公開日2000年7月26日 申請日期1998年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月28日
發(fā)明者J·C·貝克, A·D·卡爾森, 黃立華, T·A·舍利加 申請人:伊萊利利公司