亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

戊肝巴基斯坦毒株的重組蛋白及其在診斷方法和疫苗中的用途的制作方法

文檔序號(hào):1071661閱讀:1258來源:國(guó)知局
專利名稱:戊肝巴基斯坦毒株的重組蛋白及其在診斷方法和疫苗中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及肝炎病毒學(xué)領(lǐng)域。更具體地說,本發(fā)明涉及來自巴基斯坦的一種腸道傳染的戊肝毒株(SAR-55)衍生的重組蛋白,使用這種蛋白的診斷方法和疫苗。
背景技術(shù)
傳染性戊肝是一種非甲/非乙的腸道傳染性肝炎,已被報(bào)道發(fā)生在亞洲、非洲和中美洲(Balayan,M.S.(1987),Soviet Medical Reviews,Section E,VirologyReviews,Zhdanov,0-V.M(ed.),Chur,SwitzerlandHarwood Academic Publishers,vol.2,235-261;Pureell,R.G.等,(1988),Euckerman,A.J.(ed.)的“Viral Hepatitis andLiver Desease”New York;Alam,R.Liss,131-139;Bradley,D.W.(1980),BritishMedical Bulletin,46442-461;Ticehurst,J.R.(1991)in Hollinger,F(xiàn).B.,Lemon,S.M.,Margolis,H.S.(eds.)“Viral Hepatitis and Liver Disease”,Williams & Wilkins,Baltimore,501-513)。在戊肝病毒(HEV)流行的國(guó)家中,推測(cè)為戊肝的散發(fā)性肝炎占報(bào)道肝炎總數(shù)達(dá)90%。開發(fā)一種血清診斷方法來檢測(cè)受染個(gè)體血清內(nèi)的抗HEV抗體是本領(lǐng)域的共識(shí),但是,受感染的人或動(dòng)物排出的HEV濃度很低,這就不可能將這種HEV用作抗原來血清檢測(cè),雖然在細(xì)胞培養(yǎng)中繁殖HEV已經(jīng)獲得了有限的成功(Huang,R.T.等,(1992),J.Gen.Virol.,731143-1148),目前,細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以產(chǎn)生血清檢測(cè)所需的抗原量。
最近,由于全世界致力于戊肝相關(guān)性病毒基因組序列鑒定的巨大努力,已經(jīng)克隆了HEV的少數(shù)幾種毒株的基因組(Tam,A.W.等,(1991),Virology,185120-131;Tsarev,S.A.等,(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89559-563;Fry,K.E.等,(1992),Virus Genes,6173-185)。根據(jù)DNA序列分析,研究者假設(shè)HEV基因組分成3個(gè)開放讀碼框(ORF),并假設(shè)這些開放讀碼框編碼了完整的HEV蛋白。
Reyes等,1990,Science,2471335-1339公開了一段HEV緬甸(Myanmar)毒株基因組的部分DNA序列。Tam等,1991和Reyes等,公布于1991年10月17日的PCT專利申請(qǐng)WO91/15603公開了HEV緬甸毒株的完整核苷酸序列及其推定氨基酸序列。以上文獻(xiàn)的作者都假設(shè)該毒株序列內(nèi)有3個(gè)正向開放讀碼框(ORF)。
Ichikawa等,1991,Microbiol,Immunol.,35535-543,公開了用感染了HEV的Cynomolgus猴的血清篩選λgtll表達(dá)文庫(kù)后分離了一系列長(zhǎng)度為240至320核苷酸的克隆。以上克隆之一在大腸桿菌中表達(dá)了重組蛋白質(zhì)。該融合蛋白由HEV緬甸毒株ORF-2的3’末端編碼。
Yarbough等,1991,J.Virology,655790-5797說明了HEV墨西哥毒株和HEV緬甸毒株內(nèi)ORF-2的3’末端編碼的其它蛋白的表達(dá)。該論文說明了HEV兩個(gè)衍生cDNA克隆的分離。這些克隆編碼ORF-23’末端的蛋白質(zhì)。這些克隆在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)融合蛋白。
Purdy等,1992,Archives of Virology,123335-349和Favorov等,1992,J.ofMedical Virology,36246-250,公開了一種較大的緬甸毒株ORF-2蛋白片段在大腸桿菌內(nèi)的表達(dá)。以上參考文獻(xiàn)以及在此以前所公開的,都只記述了用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)ORF-2基因。在本發(fā)明之前,還沒有有關(guān)成功表達(dá)全長(zhǎng)ORF-2蛋白的報(bào)道。
對(duì)HEV基因組構(gòu)成和形態(tài)結(jié)構(gòu)所作的比較與萼狀病毒最相關(guān)。有趣的是,萼狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白是由其基因組的3’端部分編碼的(Neil,J.D.等,(1991),J.Virol.,655440-5447;和Carter,M.J.等,(1992)J.Arch.Virol.,122223-235),雖然沒有直接證據(jù)表明HEV基因組的3’端部分也編碼結(jié)構(gòu)蛋白,但是3’端基因組區(qū)域部分小片段在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)生了在ELISA和Western印跡法中與抗HEV血清反應(yīng)的蛋白質(zhì)(Yarborough等,(1991);Ichikawa等,(1991);Favorov等(1992)和Dawson,G.J.等(1991)J.Virol.Meth.;38175-186)。但是,在本發(fā)明之前,ORF-2蛋白作為結(jié)構(gòu)蛋白的功能始終沒有得到證明。
由ORF-2基因一部分編碼的一種小蛋白已經(jīng)被用在免疫測(cè)試中檢測(cè)動(dòng)物血清中抗HEV的抗體。在血清學(xué)免疫測(cè)試中使用細(xì)菌表達(dá)的小蛋白作為抗原存在著以下潛在缺點(diǎn)。首先,細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的這些小蛋白會(huì)造成溶解性問題,在將大腸桿菌裂解原液作為抗原用于免疫測(cè)試時(shí)還會(huì)造成患者血清與大腸桿菌蛋白的非特異交叉反應(yīng)性(Purdy等,1992)。其次,因?yàn)闀r(shí)間和費(fèi)用的限制,Western印跡印跡不適合用作檢測(cè)抗HEV抗體的一線血清學(xué)測(cè)試。使用來自HEV基因組3’末端部分的小肽進(jìn)行ELISA,在已知HEV感染者中只檢測(cè)到41%陽(yáng)性。其三,已經(jīng)證明,包括細(xì)小核糖核酸病毒在內(nèi)許多病毒的重要抗原和免疫原性表位與構(gòu)象高度相關(guān)(Lemon,S.M.等,1991,Hollinger,F(xiàn).B.,Lemon,S.M.,Margolis,H.S.編的“病毒性肝炎與肝臟疾病”(“Viral Hepatitis and Liver disease”),Williams&Wilkins,Baltimore,20-24)。因此,據(jù)信,在真核系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)編碼完整HEV基因的完整ORF將產(chǎn)生一種蛋白,它會(huì)形成HEV病毒樣顆粒。與只表達(dá)HEV結(jié)構(gòu)蛋白部分的上述小蛋白相比,這樣的完整ORF蛋白將具有更接近于天然衣殼蛋白的免疫結(jié)構(gòu)。所以,與目前使用的小蛋白相比,這類完整的ORF蛋白將是提呈性更高的抗原和更有效的免疫原。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及分離且基本純的人戊肝病毒SAR-55毒株制劑。
本發(fā)明還涉及分離且基本純的人戊肝病毒SAR-55毒株基因組RNA制劑。本發(fā)明還涉及人戊肝病毒SAR-55毒株的cDNA。
本發(fā)明的目的之一是提供能夠指導(dǎo)產(chǎn)生重組HEV蛋白的合成核酸序列及其與之相當(dāng)?shù)奶烊缓怂嵝蛄?。所述的天然核酸序列可以從cDNA或基因組文庫(kù)中篩選,從所述文庫(kù)中能夠鑒定和分離到能夠指導(dǎo)HEV蛋白合成的基因。就此目的而言,核酸序列指編碼蛋白的RNA、DNA、cDNA或它們的各種合成變異體。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)生物樣品中戊肝病毒的方法,所依據(jù)的是用來自SAR-55cDNA的引物選擇性擴(kuò)增戊肝基因片段。
本發(fā)明還涉及SAR-55 cDNA的反義聚或寡核苷酸單鏈抑制戊肝基因表達(dá)的用途。
本發(fā)明還涉及分離且基本純的HEV蛋白及其變異體,它們是由SAR-55的HEV基因組編碼的,或是由合成的核酸序列編碼的,本發(fā)明尤其涉及由HEV開放讀碼框2序列編碼的重組蛋白。
本發(fā)明還涉及制備HEV基因組序列編碼的重組HEV蛋白的方法,是通過克隆核酸,將cDNA插入表達(dá)載體,再在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白。
本發(fā)明還涉及重組HEV蛋白作為診斷試劑和作為疫苗的用途。
本發(fā)明還包括檢測(cè)生物樣品中戊肝病毒特異性抗體的方法。這類方法可用于診斷HEV引起的感染和疾病,還可用于監(jiān)測(cè)這類疾病的進(jìn)展。這類方法還可以在治療被HEV感染和至病的哺乳動(dòng)物過程中監(jiān)測(cè)治療藥物的藥效。
本發(fā)明還涉及用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物戊肝的藥物組合物。


圖1顯示用于表達(dá)HEV SAR-55毒株的完整ORF-2蛋白的重組載體。
圖2A和2B是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE),其中,被野生型桿狀病毒或重組桿狀病毒(含編碼基因的ORF-2)感染的昆蟲細(xì)胞裂解物或用考馬斯藍(lán)染色(A),或與HEV感染的大猩猩的血清進(jìn)行Western印跡雜交(B)。在2A和2B兩圖中,泳道1中都含非感染SF-9細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液;泳道2含被野生型桿狀病毒感染的細(xì)胞的裂解液;泳道3含被重組桿狀病毒感染的細(xì)胞的裂解液;泳道4含分子量標(biāo)記物。
圖3A和3B分別顯示30和20nm類病毒顆粒的免疫電子顯微照片(IE),這些顆粒是ORF-2蛋白在被重組病毒感染的昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而產(chǎn)生的。
圖4顯示以含有編碼完整ORF-2基因的昆蟲細(xì)胞所表達(dá)的重組ORF-2作為抗原的ELISA結(jié)果。將HEV的墨西哥毒株(Cyno-80A82、Cyno-9A97或Cyno-83)或巴基斯坦毒株(Cyno-374)接種給cynomologus猴子,此后在不同時(shí)刻測(cè)定血清抗HEV抗體水平。
圖5A-D顯示以含有編碼完整ORF-2基因的昆蟲細(xì)胞所表達(dá)的重組ORF-2作為抗原的ELISA結(jié)果。用HEV感染2個(gè)大猩猩,然后隨時(shí)測(cè)定血清IgG或IgM抗HEV水平。
圖6A-J顯示用SAR-55的重組完整ORF-2蛋白作為抗原的ELISA結(jié)果與用HEV緬甸株(Genelabs)的重組部分ORF-2蛋白作為抗原的ELISA結(jié)果的比較。
圖7A-J顯示cynomologus猴子接種了SAR-55 HEV 10%糞(fecal)懸浮液的10倍系列稀釋液(顯示在分圖上方的括弧內(nèi))后的抗HEV IgG ELISA和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)數(shù)據(jù)。ELISA所用的重組抗原是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST);3-2(M),這是3-2表位(Yarbough等,(1991)J.Virol,655790-5797)和GST的融合體;SG3(B),這是ORF-2的327個(gè)C末端氨基酸與GST融合體(Yarbough等,(1993)戊肝診斷實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)展,“病毒性肝炎和肝臟疾病國(guó)際年會(huì)。學(xué)科計(jì)劃與摘要卷。”TokyoVHFL p.87);和直接在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一種55kDa的ORF-2產(chǎn)物。
圖8A-E顯示接種了SAR-55 HEV 10%糞(fecal)懸浮液的10倍系列稀釋液(顯示在分圖上方的括弧內(nèi))后陽(yáng)性cynomologus猴子的抗HEV IgM ELISA和ALT數(shù)據(jù)。ELISA所用的的重組抗原是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST);3-2(M),這是3-2表位(Yarbough等,(1991))和GST的融合體;SG3(B),這是ORF-2的327個(gè)C末端氨基酸與GST的融合體(Yarbough等,(1993));和直接在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的一種55kDa的ORF-2產(chǎn)物。
圖9顯示溴乙錠染色的2%瓊脂糖凝膠,其上進(jìn)行的是用SAR-55 HEV的10%糞懸浮液的10倍系列稀釋液(顯示在凝膠上各泳道的上方)所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的分離。PCR產(chǎn)物的預(yù)計(jì)長(zhǎng)度為約640堿基對(duì),以M標(biāo)記的泳道含有的是DNA大小標(biāo)志。
圖10顯示用于在酵母中表達(dá)完整的ORF-2蛋白或低分子量片段的pPIC9載體。
圖11顯示戊肝病毒(HEV)基因組和編碼全長(zhǎng)(bHEV ORF2 fl)和截短HEVORF2(bHEV ORF2 5’tr和bHEV ORF2 5’-3’tr)衣殼基因的重組桿狀病毒的組織圖。
圖12A和12B顯示編碼HEV ORF2全長(zhǎng)基因的重組桿狀病毒的時(shí)序性蛋白表達(dá)。用bHEV ORF2 fl病毒以感染復(fù)數(shù)(MOI)5感染Sf-9昆蟲細(xì)胞。在4天的感染中,每天收集感染細(xì)胞和培養(yǎng)基上清液。通過8-16%蛋白質(zhì)梯度凝膠上的SDS-PAGE分離細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基上清液并用膠狀考馬斯藍(lán)染色(圖12A)。一式兩份蛋白質(zhì)凝膠上的蛋白質(zhì)通過電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上,抗體先與猩猩抗HEV初級(jí)抗血清(1∶500)結(jié)合(圖12B),然后用次級(jí)山羊抗人IgG2抗血清-堿性磷酸鹽(1∶5000),用層析法檢測(cè)HEV蛋白。泳道1,海藍(lán)(Sea-blue)分子量標(biāo)記物;泳道2,擬感染細(xì)胞;泳道3,感染后(p.i.)1天的細(xì)胞;泳道4,p.i.2天的細(xì)胞;泳道5,p.i.3天的細(xì)胞;泳道5,p.i.4天的細(xì)胞;泳道6,海藍(lán)蛋白分子量標(biāo)記物;泳道7,擬感染上清液;泳道8,p.i.1天的上清液;泳道9,p.i.2天的上清液;p.i.3天的上清液;泳道10,p.i.4天的上清液。分圖A和B中泳道的指定是相同的。
圖13A-13C顯示感染了bHEV ORF2 fl病毒的昆蟲細(xì)胞裂解物中蛋白質(zhì)層析洗脫曲線。圖13A顯示Q Sepharose快速?gòu)?qiáng)陰離子交換柱上,用NaCl在Q上樣緩沖液中0-300mM線性梯度洗脫的蛋白質(zhì)的陰離子交換層析洗脫曲線。圖13B顯示SOURCE 15Q高效強(qiáng)陰離子交換柱上,用NaCl在Q上樣緩沖液中0-300mM線性梯度洗脫的Q組份峰的HEV 55KDa蛋白質(zhì)的洗脫曲線。圖13C顯示SOURCE15Q層析流份集合的洗脫曲線,集合中包含55KDa蛋白質(zhì),然后對(duì)該蛋白進(jìn)行Sephacryl S 200柱上的凝膠過濾。
圖14顯示經(jīng)Sephacryl S 200柱凝膠過濾所得流份中HEV 55KDa蛋白的SDS-PAGE和Western印跡。在Sephacryl S 200柱時(shí),對(duì)含有55KDa蛋白質(zhì)的SOURCE 15Q層析組份集合進(jìn)行凝膠過濾。對(duì)選定柱層析流份中的等分樣品進(jìn)行SDS-PAGE和Western印跡分析(下分圖),或上樣在考馬斯藍(lán)染色的8-20%NOVEX梯度凝膠上(上分圖)。用恢復(fù)期感染HEV大猩猩的抗血清通過Western印跡檢測(cè)HEV蛋白。泳道1,海藍(lán)蛋白分子量標(biāo)記物;泳道2,Q流份集合;泳道3至12,流份的凝膠過濾。
圖15顯示重組HEV ORF2 55kD蛋白的Lys C消化肽曲線,該蛋白純化自感染了bHEV ORF2 fl病毒的Sf-9昆蟲細(xì)胞裂解液。
圖16顯示重組HEV ORF2 55kD蛋白的羧基末端氨基酸分析結(jié)果,該蛋白純化自感染了bHEV ORF2 fl病毒的Sf-9昆蟲細(xì)胞裂解液。
圖17顯示重組HEV 55kD蛋白的電噴質(zhì)譜曲線,該蛋白純化自感染了bHEVORF2 fl病毒的Sf-9昆蟲細(xì)胞裂解液。
圖18A和18B顯示編碼HEV ORF2基因的重組桿狀病毒的時(shí)序性蛋白表達(dá)。Sf-9昆蟲細(xì)胞以感染復(fù)數(shù)5被HEV ORF2 5’tr或5’-3’tr病毒感染,感染后共4天。在4天的感染中,每天收集感染細(xì)胞和培養(yǎng)基上清液,并如圖12圖例中所述進(jìn)行分析。圖18A和B分別顯示bHEV ORF2 5’tr(圖18A)和5’-3’tr(圖18B)病毒感染產(chǎn)生的與細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE(泳道1-5)和Western印跡(泳道6-10)的結(jié)果。圖18C和D分別顯示bHEV ORF2 5’tr(圖18C)和5’-3’tr(圖18D)病毒感染后分泌的蛋白的SDS-PAGE(泳道1-5)和Western印跡(泳道6-10)的結(jié)果。泳道1和6,擬感染細(xì)胞;泳道2和7,p.i.1天的細(xì)胞;泳道3和8,p.i.2天的細(xì)胞;泳道4和9,p.i.3天的細(xì)胞;泳道5和10,p.i.4天的細(xì)胞。
用海藍(lán)蛋白分子量標(biāo)記物來測(cè)定所述蛋白的分子量。感染了活HEV的大猩猩的抗HEV抗體被用來在Western印跡中檢測(cè)HEV蛋白。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及分離且基本純的戊肝(HEV)巴基斯坦毒株SAR-55。本發(fā)明還涉及編碼HEV蛋白的病毒基因的克隆和用表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白。更具體地說,本發(fā)明涉及SAR-55的開放讀碼框(ORF)的克隆與表達(dá)。
本發(fā)明涉及分離的HEV蛋白。較好的是,本發(fā)明的HEV蛋白與天然HEV蛋白基本同源,最好在生物學(xué)上相當(dāng)。本說明書和權(quán)利要求書中的“生物學(xué)上相當(dāng)”表示組合物是抗原性和/或免疫原性的。本發(fā)明的HEV蛋白可以在給哺乳動(dòng)物注射后激發(fā)保護(hù)性抗體的產(chǎn)生,因此可以在哺乳動(dòng)物受到野生型HEV攻擊時(shí)提供保護(hù)。本說明書和權(quán)利要求書中的“基本同源”表示的是氨基酸序列與天然HEV蛋白質(zhì)一定的同源程度。較好的是,同源程度超過70%,超過90%更好,特別好的一組蛋白與天然HEV蛋白在兩蛋白比較區(qū)域內(nèi)的同源性超過99%。
較好的是由ORF基因編碼的HEV蛋白。特別感興趣的是HEV ORF-2基因編碼的蛋白,特別是HEV SAR-55毒株的ORF-2基因編碼的蛋白。ORF-1、ORF-2和ORF-3蛋白的氨基酸序列見SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3
(SEQ ID NO.1)Met Glu Ala His Gln Phe Ile Lys Ala Pro Gly Ile Thr Thr Ala15 10 15Ile Glu Gln Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asn Ser Ala Leu Ala Asn20 25 30Ala Val Val Val Arg Pro Phe Leu Ser His Gln Gln Ile Glu Ile35 40 45Leu Ile Asn Leu Met Gln Pro Arg Gln Leu Val Phe Arg Pro Glu50 55 60Val Phe Trp Asn His Pro Ile Gln Arg Val Ile His Asn Glu Leu65 70 75Glu Leu Tyr Cys Arg Ala Arg Ser Gly Arg Cys Leu Glu Ile Gly80 85 90Ala His Pro Arg Ser Ile Asn Asp Asn Pro Asn Val Val His Arg95 100 105Cys Phe Leu Arg Pro Ala Gly Arg Asp Val Gln Arg Trp Tyr Thr110 115 120Ala Pro Thr Arg Gly Pro Ala Ala Asn Cys Arg Arg Ser Ala Leu125 130 135Arg Gly Leu Pro Ala Ala Asp Arg Thr Tyr Cys Phe Asp Gly Phe140 145 150Ser Gly Cys Asn Phe Pro Ala Glu Thr Gly Ile Ala Leu Tyr Ser155 160 165Leu His Asp Met Ser Pro Ser Asp Val Ala Glu Ala Met Phe Arg170 175 180His Gly Met Thr Arg Leu Tyr Ala Ala Leu His Leu Pro Pro Glu185 190 195Val Leu Leu Pro Pro Gly Thr Tyr Arg Thr Ala Ser Tyr Leu Leu200 205 210Ile His Asp Gly Arg Arg Val Val Val Thr Tyr Glu Gly Asp Thr215 220 225Ser Ala Gly Tyr Asn His Asp Val Ser Asn Leu Arg Ser Trp Ile230 235 240Arg Thr Thr Lys Val Thr Gly Asp His Pro Leu Val Ile Glu Arg245 250 255Val Arg Ala Ile Gly Cys His Phe Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala260 265 270Pro Glu Pro Ser Pro Met Pro Tyr Val Pro Tyr Pro Arg Ser Thr275 280 285Glu Val Tyr Val Arg Ser Ile Phe Gly Pro Gly Gly Thr Pro Ser290 295 300Leu Phe Pro Thr Ser Cys Ser Thr Lys Ser Thr Phe His Ala Val305 310 315Pro Ala His Ile Trp Asp Arg Leu Met Leu Phe Gly Ala Thr Leu320 325 330Asp Asp Gln Ala Phe Cys Cys Ser Arg Leu Met Thr Tyr Leu Arg335 340 345Gly Ile Ser Tyr Lys Val Thr Val Gly Thr Leu Val Ala Asn Glu350 355 360Gly Trp Asn Ala Ser Glu Asp Ala Leu Thr Ala Val Ile Thr Ala365 370 375Ala Tyr Leu Thr Ile Cys His Gln Arg Tyr Leu Arg Thr Gln Ala380 385 390Ile Ser Lys Gly Met Arg Arg Leu Glu Arg Glu His Ala Gln Lys395 400 405Phe Ile Thr Arg Leu Tyr Ser Trp Leu Phe Glu Lys Ser Gly Arg410 415 420Asp Tyr Ile Pro Gly Arg Gln Leu Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Arg425 430 435Arg Trp Leu Ser Ala Gly Phe His Leu Asp Pro Arg Val Leu Val440 445 450Phe Asp Glu Ser Ala Pro Cys His Cys Arg Thr Ala Ile Arg Lys455 460 465Ala Val Ser Lys Phe Cys Cys Phe Met Lys Trp Leu Gly Gln Glu470 475 480Cys Thr Cys Phe Leu Gln Pro Ala Glu Gly Val Val Gly Asp Gln485 490 495Gly His Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Gly Ser Asp Val Asp Pro Ala500 505 510Glu Ser Ala Ile Ser Asp Ile Ser Gly Ser Tyr Val Val Pro Gly515 520 525Thr Ala Leu Gln Pro Leu Tyr Gln Ala Leu Asp Leu Pro Ala Glu530 535 540Ile Val Ala Arg Ala Gly Arg Leu Thr Ala Thr Val Lys Val Ser545 550 555Gln Val Asp Gly Arg Ile Asp Cys Glu Thr Leu Leu Gly Ash Lys560 565 570Thr Phe Arg Thr Ser Phe Val Asp Gly Ala Val Leu Glu Thr Asn575 580 585Gly Pro Glu Arg His Asn Leu Ser Phe Asp Ala Ser Gln Ser Thr590 595 600Met Ala Ala Gly Pro Phe Ser Leu Thr Tyr Ala Ala Ser Ala Ala605 610 615Gly Leu Glu Val Arg Tyr Val Ala Ala Gly Leu Asp His Arg Ala620 625 630Val Phe Ala Pro Gly Val Ser Pro Arg Ser Ala Pro Gly Glu Val635 640 645Thr Ala Phe Cys Ser Ala Leu Tyr Arg Phe Asn Arg Glu Ala Gln650 655 660Arg Leu Ser Leu Thr Gly Asn Phe Trp Phe His Pro Glu Gly Leu665 670 675Leu Gly Pro Phe Ala Pro Phe Ser Pro Gly His Val Trp Glu Ser680 685 690Ala Asn Pro Phe Cys Gly Glu Ser Thr Leu Tyr Thr Arg Thr Trp695 700 705Ser Glu Val Asp Ala Val Pro Ser Pro Ala Gln Pro Asp Leu Gly710 715 720Phe Thr Ser Glu Pro Ser Ile Pro Ser Arg Ala Ala Thr Pro Thr725 730 735Pro Ala Ala Pro Leu Pro Pro Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Thr740 745 750Leu Ser Ala Pro Ala Arg Gly Glu Pro Ala Pro Gly Ala Thr Ala755 760 765Arg Ala Pro Ala Ile Thr His Gln Thr Ala Arg His Arg Arg Leu770 775 780Leu Phe Thr Tyr Pro Asp Gly Ser Lys Val Phe Ala Gly Ser Leu785 790 795Phe Glu Ser Thr Cys Thr Trp Leu Val Asn Ala Ser Asn Val Asp800 805 810His Arg Pro Gly Gly Gly Leu Cys His Ala Phe Tyr Gln Arg Tyr815 820 825Pro Ala Ser Phe Asp Ala Ala Ser Phe Val Met Arg Asp Gly Ala830 835 840Ala Ala Tyr Thr Leu Thr Pro Arg Pro Ile Ile His Ala Val Ala845 850 855Pro Asp Tyr Arg Leu Glu His Asn Pro Lys Arg Leu Glu Ala Ala860 865 870Tyr Arg Glu Thr Cys Ser Arg Leu Gly Thr Ala Ala Tyr Pro Leu875 880 885Leu Gly Thr Gly Ile Tyr Gln Val Pro Ile Gly Pro Ser Phe Asp890 895 900Ala Trp Glu Arg Asn His Arg Pro Gly Asp Glu Leu Tyr Leu Pro905 910 915Glu Leu Ala Ala Arg Trp Phe Glu Ala Asn Arg Pro Thr Cys Pro920 925 930Thr Leu Thr Ile Thr Glu Asp Val Ala Arg Thr Ala Asn Leu Ala935 940 945Ile Glu Leu Asp Ser Ala Thr Asp Val Gly Arg Ala Cys Ala Gly950 955 960Cys Arg Val Thr Pro Gly Val Val Gln Tyr Gln Phe Thr Ala Gly965 970 975Val Pro Gly Ser Gly Lys Ser Arg Ser Ile Thr Gln Ala Asp Val980 985 990Asp Val Val Val Val Pro Thr Arg Glu Leu Arg Asn Ala Trp Arg995 10001005Arg Arg Gly Phe Ala Ala Phe Thr Pro His Thr Ala Ala Arg Val101010151020Thr Gln Gly Arg Arg Val Val Ile Asp Glu Ala Pro Ser Leu Pro102510301035Pro His Leu Leu Leu Leu His Met Gln Arg Ala Ala Thr Val His104010451050Leu Leu Gly Asp Pro Asn Gln Ile Pro Ala Ile Asp Phe Glu His105510601065Ala Gly Leu Val Pro Ala Ile Arg Pro Asp Leu Ala Pro Thr Ser107010751080Trp Trp His Val Thr His Arg Cys Pro Ala Asp Val Cys Glu Leu108510901095Ile Arg Gly Ala Tyr Pro Met Ile Gln Thr Thr Ser Arg Val Leu110011051110Arg Ser Leu Phe Trp Gly Glu Pro Ala Val Gly Gln Lys Leu Val111511201125Phe Thr Gln Ala Ala Lys Ala Ala Asn Pro Gly Ser Val Thr Val113011351140His Glu Ala Gln Gly Ala Thr Tyr Thr Glu Thr Thr Ile Ile Ala114511501155Thr Ala Asp Ala Arg Gly Leu Ile Gln Ser Ser Arg Ala His Ala116011651170Ile Val Ala Leu Thr Arg His Thr Glu Lys Cys Val Ile Ile Asp117511801185Ala Pro Gly Leu Leu Arg Glu Val Gly Ile Ser Asp Ala Ile Val119011951200Asn Asn Phe Phe Leu Ala Gly Gly Glu Ile Gly His Gln Arg Pro120512101215Ser Val Ile Pro Arg Gly Asn Pro Asp Ala Asn Val Asp Thr Leu122012251230Ala Ala Phe Pro Pro Ser Cys Glu Ile Ser Ala Phe His Glu Leu123512401245Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Pro Ala Pro Val Ala Ala Val Leu125012551260Pro Pro Cys Pro Glu Leu Glu Gln Gly Leu Leu Tyr Leu Pro Gln126512701275Glu Leu Thr Thr Cys Asp Ser Val Val Thr Phe Glu Leu Thr Asp128012851290Ile Val His Cys Arg Met Ala Ala Pro Ser Gln Arg Lys Ala Val129513001305Leu Ser Thr Leu Val Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Thr Lys Leu Tyr131013151320Asn Ala Ser His Ser Asp Val Arg Asp Ser Leu Ala Arg Phe Ile132513301335Pro Ala Ile Gly Pro Val Gln Val Thr Thr Cys Glu Leu Tyr Glu134013451350Leu Glu Glu Ala Met Val Glu Lys Gly Gln Asp Gly Ser Ala Val135513601365Leu Glu Leu Asp Leu Cys Ser Arg Asp Val Ser Arg Ile Thr Phe137013751380Phe Gln Lys Asp Cys Asn Lys Phe Thr Thr Gly Glu Thr Ile Ala138513901395His Gly Lys Val Gly Gln Gly Ile Ser Ala Trp Ser Lys Thr Phe140014051410Cys Ala Leu Phe Gly Pro Trp Phe Arg Ala Ile Glu Lys Ala Ile141514201425Leu Ala Leu Leu Pro Gln Gly Val Phe Tyr Gly Asp Ala Phe Asp143014351440Asp Thr Val Phe Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala Lys Ala Ser Met144514501455Val Phe Glu Asn Asp Phe Ser Glu Phe Asp Ser Thr Gln Asn Asn146014651470Phe Ser Leu Gly Leu Glu Cys Ala Ile Met Glu Glu Cys Gly Met147514801485Pro Gln Trp Leu Ile Arg Leu Tyr His Leu Ile Arg Ser Ala Trp149014951500Ile Leu Gln Ala Pro Lys Glu Ser Leu Arg Gly Phe Trp Lys Lys150515101515His Ser Gly Glu Pro Gly Thr Leu Leu Trp Asn Thr Val Trp Asn152015251530Met Ala Val Ile Thr His Cys Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Gln Val153515401545Ala Ala Phe Lys Gly Asp Asp Ser Ile Val Leu Cys Ser Glu Tyr155015551560Arg Gln Ser Pro Gly Ala Ala Val Leu Ile Ala Gly Cys Gly Leu156515701575Lys Leu Lys Val Asp Phe Arg Pro Ile Gly Leu Tyr Ala Gly Val158015851590Val Val Ala Pro Gly Leu Gly Ala Leu Pro Asp Val Val Arg Phe159516001605Ala Gly Arg Leu Thr Glu Lys Asn Trp Gly Pro Gly Pro Glu Arg161016151620Ala Glu Gln Leu Arg Leu Ala Val Ser Asp Phe Leu Arg Lys Leu162516301635Thr Asn Val Ala Gln Met Cys Val Asp Val Val Ser Arg Val Tyr164016451650Gly Val Ser Pro Gly Leu Val His Asn Leu Ile Glu Met Leu Gln165516601665Ala Val Ala Asp Gly Lys Ala His Phe Thr Glu Ser Val Lys Pro167016751680Val Leu Asp Leu Thr Asn Ser Ile Leu Cys Arg Val Glu16851690(SEQ ID NO.2)Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro15 10 15Met Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg20 25 30Gly Arg Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg35 40 45Val Asp Ser Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn50 55 60Pro Phe Ala Pro Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg
65 70 75Val Arg Gln Pro Ala Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln80 85 90Ala Gln Arg Pro Ala Ala Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala95 100 105Gly Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro110 115 120Pro Val Pro Asp Val Asp Ser Arg Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln125 130 135Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr Ser Ser Val Ala Thr Gly140 145 150Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro Leu Ser Pro Leu Leu Pro155 160 165Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met Ala Thr Glu Ala Ser170 175 180Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala Arg Ala Thr Ile Arg Tyr Arg185 190 195Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala Ile Ser Ile Ser200 205 210Phe Tyr Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp Met Asn215 220 225Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly Ile230 235 240Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Asn245 250 255Gln Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu Glu260 265 270Ala Thr Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val275 280 285Asn Ser Tyr Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu290 295 300Asp Phe Ala Leu Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn305 310 315Thr Asn Thr Arg Val Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg320 325 330Leu Arg Arg Gly Ala Asp Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala335 340 345Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly350 355 360Val Gly Glu Ile Gly Arg ly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu
365 370 375Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser380 385 390Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn395 400 405Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln410 415 420Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu425 430 435Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp440 445 450Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu455 460 465Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr470 475 480Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser485 490 495Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val500 505 510Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro515 520 525Leu Ser Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro530 535 540Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala545 550 555Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu560 565 570Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr575 580 585Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val590 595 600Leu Ala Pro His Ser Val Leu Ala Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp605 610 615Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp Asp Phe Cys Pro Glu Cys620 625 630Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe Gln Ser Thr Val Ala635 640 645Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly Lys Thr Arg Glu Leu650 655 660
(SEQ ID NO.3)Met Asn Asn Met Ser Phe Ala Ala Pro Met Gly Ser Arg Pro Cys15 10 15Ala Leu Gly Leu Phe Cys Cys Cys Ser Ser Cys Phe Cys Leu Cys20 25 30Cys Pro Arg His Arg Pro Val Ser Arg Leu Ala Ala Val Val Gly35 40 45Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Val Val Ser Gly Val Thr Gly Leu50 55 60Ile Leu Ser Pro Ser Gln Ser Pro Ile Phe Ile Gln Pro Thr Pro65 70 75Ser Pro Pro Met Ser Pro Leu Arg Pro Gly Leu Asp Leu Val Phe80 85 90Ala Asn Pro Pro Asp His Ser Ala Pro Leu Gly Val Thr Arg Pro95 100 105Ser Ala Pro Pro Leu Pro His Val Val Asp Leu Pro Gln Leu Gly110 115 120Pro Arg Arg三字母縮寫是遵照20種天然氨基酸的常規(guī)氨基酸速記法。
較好的重組HEV蛋白至少具有一種ORF蛋白??梢灾苽浒粋€(gè)或多個(gè)相同或不同ORF蛋白的其它重組蛋白來改變蛋白的生物學(xué)特性??梢岳斫獾氖?,分散的氨基酸或氨基酸序列的增加、取代或缺失可能加強(qiáng)HEV蛋白的生物學(xué)活性。
本發(fā)明還涉及能夠指導(dǎo)上述HEV蛋白或與之基本同源的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的核酸序列。這種核酸序列被稱為SAR-55,如SEQ ID NO.4所示,已于1992年9月17日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏,保藏號(hào)為75302。AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG GAGGCCCATC AGTTTATCAA 50GGCTCCTGGC ATCACTACTG CTATTGAGCA GGCTGCTCTA GCAGCGGCCA 100ACTCTGCCCT TGCGAATGCT GTGGTAGTTA GGCCTTTTCT CTCTCACCAG 150CAGATTGAGA TCCTTATTAA CCTAATGCAA CCTCGCCAGC TTGTTTTCCG 200CCCCGAGGTT TTCTGGAACC ATCCCATCCA GCGTGTTATC CATAATGAGC 250TGGAGCTTTA CTGTCGCGCC CGCTCCGGCC GCTGCCTCGA AATTGGTGCC 300CACCCCCGCT CAATAAATGA CAATCCTAAT GTGGTCCACC GTTGCTTCCT 350CCGTCCTGCC GGGCGTGATG TTCAGCGTTG GTATACTGCC CCTACCCGCG 400GGCCGGCTGC TAATTGCCGG CGTTCCGCGC TGCGCGGGCT CCCCGCTGCT 450GACCGCACTT ACTGCTTCGA CGGGTTTTCT GGCTGTAACT TTCCCGCCGA 500GACGGGCATC GCCCTCTATT CTCTCCATGA TATGTCACCA TCTGATGTCG 550CCGAGGCTAT GTTCCGCCAT GGTATGACGC GGCTTTACGC TGCCCTCCAC 600CTCCCGCCTG AGGTCCTGTT GCCCCCTGGC ACATACCGCA CCGCGTCGTA 650CTTGCTGATC CATGACGGCA GGCGCGTTGT GGTGACGTAT GAGGGTGACA 700CTAGTGCTGG TTATAACCAC GATGTTTCCA ACCTGCGCTC CTGGATTAGA 750ACCACTAAGG TTACCGGAGA CCACCCTCTC GTCATCGAGC GGGTTAGGGC 800CATTGGCTGC CACTTTGTCC TTTTACTCAC GGCTGCTCCG GAGCCATCAC 850CTATGCCCTA TGTCCCTTAC CCCCGGTCTA CCGAGGTCTA TGTCCGATCG 900ATCTTCGGCC CGGGTGGCAC CCCCTCCCTA TTTCCAACCT CATGCTCCAC 950CAAGTCGACC TTCCATGCTG TCCCTGCCCA TATCTGGGAC CGTCTCATGT 1000TGTTCGGGGC CACCCTAGAT GACCAAGCCT TTTGCTGCTC CCGCCTAATG 1050ACTTACCTCC GCGGCATTAG CTACAAGGTT ACTGTGGGCA CCCTTGTTGC 1100CAATGAAGGC TGGAACGCCT CTGAGGACGC TCTTACAGCT GTCATCACTG 1150CCGCCTACCT TACCATCTGC CACCAGCGGT ACCTCCGCAC TCAGGCTATA 1200TCTAAGGGGA TGCGTCGCCT GGAGCGGGAG CATGCTCAGA AGTTTATAAC 1250ACGCCTCTAC AGTTGGCTCT TTGAGAAGTC CGGCCGTGAT TATATCCCCG 1300GCCGTCAGTT GGAGTTCTAC GCTCAGTGTA GGCGCTGGCT CTCGGCCGGC 1350TTTCATCTTG ACCCACGGGT GTTGGTTTTT GATGAGTCGG CCCCCTGCCA 1400CTGTAGGACT GCGATTCGTA AGGCGGTCTC AAAGTTTTGC TGCTTTATGA 1450AGTGGCTGGG CCAGGAGTGC ACCTGTTTTC TACAACCTGC AGAAGGCGTC 1500GTTGGCGACC AGGGCCATGA CAACGAGGCC TATGAGGGGT CTGATGTTGA 1550CCCTGCTGAA TCCGCTATTA GTGACATATC TGGGTCCTAC GTAGTCCCTG 1600GCACTGCCCT CCAACCGCTT TACCAAGCCC TTGACCTCCC CGCTGAGATT 1650GTGGCTCGTG CAGGCCGGCT GACCGCCACA GTAAAGGTCT CCCAGGTCGA 1700CGGGCGGATC GATTGTGAGA CCCTTCTCGG TAATAAAACC TTCCGCACGT 1750CGTTTGTTGA CGGGGCGGTT TTAGAGACTA ATGGCCCAGA GCGCCACAAT 1800CTCTCTTTTG ATGCCAGTCA GAGCACTATG GCCGCCGGCC CTTTCAGTCT 1850CACCTATGCC GCCTCTGCTG CTGGGCTGGA GGTGCGCTAT GTCGCCGCCG 1900GGCTTGACCA CCGGGCGGTT TTTGCCCCCG GCGTTTCACC CCGGTCAGCC 1950CCTGGCGAGG TCACCGCCTT CTGTTCTGCC CTATACAGGT TTAATCGCGA 2000GGCCCAGCGC CTTTCGCTGA CCGGTAATTT TTGGTTCCAT CCTGAGGGGC 2050TCCTTGGCCC CTTTGCCCCG TTTTCCCCCG GGCATGTTTG GGAGTCGGCT 2100AATCCATTCT GTGGCGAGAG CACACTTTAC ACCCGCACTT GGTCGGAGGT 2150TGATGCTGTT CCTAGTCCAG CCCAGCCCGA CTTAGGTTTT ACATCTGAGC 2200CTTCTATACC TAGTAGGGCC GCCACACCTA CCCCGGCGGC CCCTCTACCC 2250CCCCCTGCAC CGGATCCTTC CCCTACTCTC TCTGCTCCGG CGCGTGGTGA 2300GCCGGCTCCT GGCGCTACCG CCAGGGCCCC AGCCATAACC CACCAGACGG 2350CCCGGCATCG CCGCCTGCTC TTTACCTACC CGGATGGCTC TAAGGTGTTC 2400GCCGGCTCGC TGTTTGAGTC GACATGTACC TGGCTCGTTA ACGCGTCTAA 2450TGTTGACCAC CGCCCTGGCG GTGGGCTCTG TCATGCATTT TACCAGAGGT 2500ACCCCGCCTC CTTTGATGCT GCCTCTTTTG TGATGCGCGA CGGCGCGGCC 2550GCCTACACAT TAACCCCCCG GCCAATAATT CATGCCGTCG CTCCTGATTA 2600TAGGTTGGAA CATAACCCAA AGAGGCTTGA GGCTGCCTAC CGGGAGACTT 2650GCTCCCGCCT CGGTACCGCT GCATACCCAC TCCTCGGGAC CGGCATATAC 2700CAGGTGCCGA TCGGTCCCAG TTTTGACGCC TGGGAGCGGA ATCACCGCCC 2750CGGGGACGAG TTGTACCTTC CTGAGCTTGC TGCCAGATGG TTCGAGGCCA 2800ATAGGCCGAC CTGCCCAACT CTCACTATAA CTGAGGATGT TGCGCGGACA 2850GCAAATCTGG CTATCGAACT TGACTCAGCC ACAGACGTCG GCCGGGCCTG 2900TGCCGGCTGT CGAGTCACCC CCGGCGTTGT GCAGTACCAG TTTACCGCAG 2950GTGTGCCTGG ATCCGGCAAG TCCCGCTCTA TTACCCAAGC CGACGTGGAC 3000GTTGTCGTGG TCCCGACCCG GGAGTTGCGT AATGCCTGGC GCCGCCGCGG 3050CTTCGCTGCT TTCACCCCGC ACACTGCGGC TAGAGTCACC CAGGGGCGCC 3100GGGTTGTCAT TGATGAGGCC CCGTCCCTTC CCCCTCATTT GCTGCTGCTC 3150CACATGCAGC GGGCCGCCAC CGTCCACCTT CTTGGCGACC CGAATCAGAT 3200CCCAGCCATC GATTTTGAGC ACGCCGGGCT CGTTCCCGCC ATCAGGCCCG 3250ATTTGGCCCC CACCTCCTGG TGGCATGTTA CCCATCGCTG CCCTGCGGAT 3300GTATGTGAGC TAATCCGCGG CGCATACCCT ATGATTCAGA CCACTAGTCG 3350GGTCCTCCGG TCGTTGTTCT GGGGTGAGCC CGCCGTTGGG CAGAAGCTAG 3400TGTTCACCCA GGCGGCTAAG GCCGCCAACC CCGGTTCAGT GACGGTCCAT 3450GAGGCACAGG GCGCTACCTA CACAGAGACT ACCATCATTG CCACGGCAGA 3500TGCTCGAGGC CTCATTCAGT CGTCCCGAGC TCATGCCATT GTTGCCTTGA 3550CGCGCCACAC TGAGAAGTGC GTCATCATTG ACGCACCAGG CCTGCTTCGC 3600GAGGTGGGCA TCTCCGATGC AATCGTTAAT AACTTTTTCC TTGCTGGTGG 3650CGAAATTGGC CACCAGCGCC CATCTGTTAT CCCTCGCGGC AATCCTGACG 3700CCAATGTTGA CACCTTGGCT GCCTTCCCGC CGTCTTGCCA GATTAGCGCC 3750TTCCATCAGT TGGCTGAGGA GCTTGGCCAC AGACCTGCCC CTGTCGCGGC 3800TGTTCTACCG CCCTGCCCTG AGCTTGAACA GGGCCTTCTC TACCTGCCCC 3850AAGAACTCAC CACCTGTGAT AGTGTCGTAA CATTTGAATT AACAGATATT 3900GTGCATTGTC GTATGGCCGC CCCGAGCCAG CGCAAGGCCG TGCTGTCCAC 3950GCTCGTGGGC CGTTATGGCC GCCGCACAAA GCTCTACAAT GCCTCCCACT 4000CTGATGTTCG CGACTCTCTC GCCCGTTTTA TCCCGGCCAT TGGCCCCGTA 4050CAGGTTACAA CCTGTGAATT GTACGAGCTA GTGGAGGCCA TGGTCGAGAA 4100GGGCCAGGAC GGCTCCGCCG TCCTTGAGCT CGACCTTTGT AGCCGCGACG 4150TGTCCAGGAT CACCTTCTTC CAGAAAGATT GTAATAAATT CACCACGGGG 4200GAGACCATCG CCCATGGTAA AGTGGGCCAG GGCATTTCGG CCTGGAGTAA 4250GACCTTCTGT GCCCTTTTCG GCCCCTGGTT CCGTGCTATT GAGAAGGCTA 4300TCCTGGCCCT GCTCCCTCAG GGTGTGTTTT ATGGGGATGC CTTTGATGAC 4350ACCGTCTTCT CGGCGGCTGT GGCCGCAGCA AAGGCATCCA TGGTGTTCGA 4400GAATGACTTT TCTGAGTTTG ATTCCACCCA GAATAATTTT TCCTTGGGCC 4450TAGAGTGTGC TATTATGGAG GAGTGTGGGA TGCCGCAGTG GCTCATCCGC 4500TTGTACCACC TTATAAGGTC TGCGTGGATT CTGCAGGCCC CGAAGGAGTC 4550CCTGCGAGGG TTTTGGAAGA AACACTCCGG TGAGCCCGGC ACCCTTCTGT 4600GGAATACTGT CTGGAACATG GCCGTTATCA CCCACTGTTA TGATTTCCGC 4650GATCTGCAGG TGGCTGCCTT TAAAGGTGAT GATTCGATAG TGCTTTGCAG 4700TGAGTACCGT CAGAGCCCAG GGGCTGCTGT CCTGATTGCT GGCTGTGGCC 4750TAAAGTTGAA GGTGGATTTC CGTCCGATTG GTCTGTATGC AGGTGTTGTG 4800GTGGCCCCCG GCCTTGGCGC GCTTCCTGAT GTCGTGCGCT TCGCCGGTCG 4850GCTTACTGAG AAGAATTGGG GCCCTGGCCC CGAGCGGGCG GAGCAGCTCC 4900GCCTCGCTGT GAGTGATTTT CTCCGCAAGC TCACGAATGT AGCTCAGATG 4950TGTGTGGATG TTGTCTCTCG TGTTTATGGG GTTTCCCCTG GGCTCGTTCA 5000TAACCTGATT GGCATGCTAC AGGCTGTTGC TGATGGCAAG GCTCATTTCA 5050CTGAGTCAGT GAAGCCAGTG CTTGACCTGA CAAATTCAAT TCTGTGTCGG 5100GTGGAATGAA TAACATGTCT TTTGCTGCGC CCATGGGTTC GCGACCATGC 5150GCCCTCGGCC TATTTTGCTG TTGCTCCTCA TGTTTCTGCC TATGCTGCCC 5200GCGCCACCGC CCGGTCAGCC GTCTGGCCGC CGTCGTGGGC GGCGCAGCGG 5250CGGTTCCGGC GGTGGTTTCT GGGGTGACCG GGTTGATTCT CAGCCCTTCG 5300CAATCCCCTA TATTCATCCA ACCAACCCCT TCGCCCCCGA TGTCACCGCT 5350GCGGCCGGGG CTGGACCTCG TGTTCGCCAA CCCGCCCGAC CACTCGGCTC 5400CGCTTGGCGT GACCAGGCCC AGCGCCCCGC CGCTGCCTCA CGTCGTAGAC 5450CTACCACAGC TGGGGCCGCG CCGCTAACCG CGGTCGCTCC GGCCCATGAC 5500ACCCCGCCAG TGCCTGATGT TGACTCCCGC GGCGCCATCC TGCGCCGGCA 5550GTATAACCTA TCAACATCTC CCCTCACCTC TTCCGTGGCC ACCGGCACAA 5600ATTTGGTTCT TTACGCCGCT CCTCTTAGCC CGCTTCTACC CCTCCAGGAC 5650GGCACCAATA CTCATATAAT GGCTACAGAA GCTTCTAATT ATGCCCAGTA 5700CCGGGTTGCT CGTGCCACAA TTCGCTACCG CCCGCTGGTC CCCAACGCTG 5750TTGGTGGCTA CGCTATCTCC ATTTCGTTCT GGCCACAGAC CACCACCACC 5800CCGACGTCCG TTGACATGAA TTCAATAACC TCGACGGATG TCCGTATTTT 5850AGTCCAGCCC GGCATAGCCT CCGAGCTTGT TATTCCAAGT GAGCGCCTAC 5900ACTATCGCAA CCAAGGTTGG CGCTCTGTTG AGACCTCCGG GGTGGCGGAG 5950GAGGAGGCCA CCTCTGGTCT TGTCATGCTC TGCATACATG GCTCACCTGT 6000AAATTCTTAT ACTAATACAC CCTATACCGG TGCCCTCGGG CTGTTGGACT 6050TTGCCCTCGA ACTTGAGTTC CGCAACCTCA CCCCCGGTAA TACCAATACG 6100CGGGTCTCGC GTTACTCCAG CACTGCCCGT CACCGCCTTC GTCGCGGTGC 6150AGATGGGACT GCCGAGCTCA CCACCACGGC TGCTACTCGC TTCATGAAGG 6200ACCTCTATTT TACTAGTACT AATGGTGTTG GTGAGATCGG CCGCGGGATA 6250GCGCTTACCC TGTTTAACCT TGCTGACACC CTGCTTGGCG GTCTACCGAC 6300AGAATTGATT TCGTCGGCTG GTGGCCAGCT GTTCTACTCT CGCCCCGTCG 6350TCTCAGCCAA TGGCGAGCCG ACTGTTAAGC TGTATACATC TGTGGAGAAT 6400GCTCAGCAGG ATAAGGGTAT TGCAATCCCG CATGACATCG ACCTCGGGGA 6450ATCCCGTGTA GTTATTCAGG ATTATGACAA CCAACATGAG CAGGACCGAC 6500CGACACCTTC CCCAGCCCCA TCGCGTCCTT TTTCTGTCCT CCGAGCTAAC 6550ATGTGCTTT GGCTTTCTCT CACCGCTGCC GAGTATGACC AGTCCACTTA 6600CGGCTCTTCG ACCGGCCCAG TCTATGTCTC TGACTCTGTG ACCTTGGTTA 6650ATGTTGCGAC CGGCGCGCAG GCCGTTGCCC GGTCACTCGA CTGGACCAAG 6700GTCACACTTG ATGGTCGCCC CCTTTCCACC ATCCAGCAGT ATTCAAAGAC 6750CTTCTTTGTC CTGCCGCTCC GCGGTAAGCT CTCCTTTTGG GAGGCAGGAA 6800CTACTAAAGC CGGGTACCCT TATAATTATA ACACCACTGC TAGTGACCAA 6850CTGCTCGTTG AGAATGCCGC TGGGCATCGG GTTGCTATTT CCACCTACAC 6900TACTAGCCTG GGTGCTGGCC CCGTCTCTAT TTCCGCGGTT GCTGTTTTAG 6950CCCCCCACTC TGTGCTAGCA TTGCTTGAGG ATACCATGGA CTACCCTGCC 7000CGCGCCCATA CTTTCGATGA CTTCTGCCCG GAGTGCCGCC CCCTTGGCCT 7050CCAGGGTTGT GCTTTTCAGT CTACTGTCGC TGAGCTTCAG CGCCTTAAGA 7100TGAAGGTGGG TAAAACTCGG GAGTTATAGT TTATTTGCTT GTGCCCCCCT 7150TCTTTCTGTT GCTTATTT7168所用的核酸縮寫是本領(lǐng)域中通用的。
作為RNA病毒的蛋白質(zhì)編碼鏈的這一方向的序列按常規(guī)稱為“正”序列,即如SEQ ID NO.4所示。
根據(jù)SAR-55的開放讀碼框推定的氨基酸序列有SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3。ORF-1從SEQ ID NO.4的核苷酸28開始,共5078個(gè)核苷酸;ORF-2從SEQ ID NO.4的核苷酸5147開始,共1979個(gè)核苷酸;ORF-3從SEQ ID NO.4的核苷酸5106開始,共368個(gè)核苷酸。
我們考慮到了DNA序列的變異,這些變異將得到指導(dǎo)ORF-2蛋白同系物產(chǎn)生的DNA序列?!癘RF-2蛋白同系物”在說明書和權(quán)利要求書中都表示氨基酸序列與本文中的基本相同,但其中一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸被生物學(xué)上認(rèn)為相當(dāng)?shù)臍埢〈?,使得所得的蛋?即“同系物”)具有抗原性和/或免疫原性。需要指出的是,以上DNA序列代表的是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性,可以理解的是,可以對(duì)核苷酸做出各種選擇而產(chǎn)生能夠指導(dǎo)ORF-2蛋白或其同系物產(chǎn)生的DNA序列。所以,與上述序列功能相當(dāng)?shù)腄NA序列,或與指導(dǎo)ORF蛋白同系物(根據(jù)前文的氨基酸序列)產(chǎn)生的序列功能相當(dāng)?shù)腄NA序列都屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明涉及根據(jù)戊肝基因片段的選擇性擴(kuò)增來檢測(cè)生物樣品中戊肝病毒的方法。較好的是,本發(fā)明使用的單鏈引物對(duì)來自一段DNA雙鏈片段相對(duì)兩鏈的非同源區(qū),該DNA雙鏈片段則來自基因組所含某區(qū)域與SEQ ID NO.4的SAR-55序列同源的戊肝病毒。這樣的引物可在以后的過程中用于擴(kuò)增選定的核酸序列,正如美國(guó)專利4,683,202所述。
本發(fā)明還涉及來自SAR-55cDNA序列同系物的單鏈反義聚或寡核苷酸抑制戊肝基因表達(dá)的用途。這些反義聚或寡核苷酸可以是DNA或RNA。所針對(duì)的序列通常是信使RNA,如果是加工或翻譯RNA所必需的一段單鏈序列則更好。反義聚或寡核苷酸可以與聚賴氨酸(Lemaitre,M.等,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci USA84648-652)之類聚陽(yáng)離子共軛;將形成的共軛物以有效量給予哺乳動(dòng)物,以與信使RNA雜交并抑制其功能。
本發(fā)明包括制造HEV蛋白的重組DNA方法,以包含至少一個(gè)ORF蛋白的蛋白質(zhì)為佳,包含至少一個(gè)ORF-2蛋白的蛋白質(zhì)最好。重組ORF蛋白可以由一個(gè)ORF蛋白構(gòu)成,或由相同或不同的多個(gè)ORF蛋白組合而成??捎锰烊换蚝铣傻暮怂嵝蛄衼碇笇?dǎo)HEV蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在本發(fā)明實(shí)施例之一中,該方法包括a)制備一段能夠指導(dǎo)宿主產(chǎn)生HEV蛋白的核酸序列;b)將核酸序列克隆到能夠轉(zhuǎn)移到宿主內(nèi)并在其中復(fù)制的載體內(nèi),所述的載體含有該核酸序列的操作性元件;c)將含有核酸和操作性元件的載體轉(zhuǎn)移到能夠表達(dá)所述蛋白的宿主內(nèi);d)在適合載體擴(kuò)增和蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主;e)收獲蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明另一實(shí)施例中,利用重組DNA合成HEV核酸編碼的蛋白(編碼至少一個(gè)HEV ORF或相同或不同的多個(gè)ORF蛋白的核酸序列更好,編碼至少一個(gè)ORF-2氨基酸序列的核酸序列)的方法包括a)培養(yǎng)含有核酸序列的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主,所述核酸能夠指導(dǎo)宿主在適合蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下產(chǎn)生蛋白質(zhì),所述蛋白質(zhì)表現(xiàn)為與分離自HEV、氨基酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3的天然HEV蛋白質(zhì)基本同源,或它們的組合。
在實(shí)施例之一中,HEV SAR-55毒株的病毒基因組RNA序列如下所述被分離并克隆到cDNA中。從采自感染了SAR-55的cynomolgus猴的生物樣品中抽提病毒RNA,然后反轉(zhuǎn)錄病毒RNA并用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增,擴(kuò)增所用的引物與緬甸HEV毒株(Tam等(1991))的基因組或SAR-55基因組的正鏈和負(fù)鏈互補(bǔ)。將PCR片段亞克隆到pBR322或pGEM-32中,然后測(cè)定雙鏈PCR片段的序列。
選用于本發(fā)明的載體包括可以插入上述核酸序列與任何優(yōu)選或必需的操作性元件的任何載體,而且,這些載體可以接著轉(zhuǎn)移到宿主中并在其中復(fù)制。較好的載體是限制性位點(diǎn)已經(jīng)描述清楚并含有適合核酸序列轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選或必需操作元件的載體。
“操作元件”在此包括至少一個(gè)啟動(dòng)子,至少一個(gè)終止密碼子和載體核酸正確轉(zhuǎn)錄和其后的翻譯所優(yōu)選或必需的任意其它DNA序列。具體地說,我們認(rèn)為這樣的載體應(yīng)含有至少一段宿主能識(shí)別的復(fù)制起始序列和至少一個(gè)可選標(biāo)記,和至少一個(gè)能夠引發(fā)核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列。
在構(gòu)建本發(fā)明的克隆載體時(shí),還需要注意的是,可以在每個(gè)載體中插入核酸序列的多份拷貝及其輔助性操作元件。在一個(gè)這類實(shí)施例中,宿主中每一載體產(chǎn)生的所需HEV蛋白的產(chǎn)量更大??梢圆迦胼d體的DNA序列(1段序列或兩段不同的序列)的多拷貝數(shù)量只受所得載體根據(jù)其大小轉(zhuǎn)移到合適的宿主中并在其中輔助和轉(zhuǎn)錄的能力的限制。
在另一實(shí)施例中,可將含有HEV蛋白編碼序列的限制性消化片段插入可用于原核或真核細(xì)胞的合適的表達(dá)載體?!昂线m”的意思是載體能夠攜帶和表達(dá)編碼HEV蛋白,最好是至少一個(gè)ORF蛋白的完整核酸序列。較好的表達(dá)載體是用于真核細(xì)胞的載體。這類載體的例子包括但不限于用于在酵母中表達(dá)疫苗病毒載體(如pPIC9,vector-Invitrogen)、腺病毒或皰疹病毒的載體,以桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體為佳。較好的載體是包含完整ORF-2基因的p63-2,和包含完整ORF-3和ORF-2基因的p59-4。以上載體在1992年9月10日與美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(12301Parklawn Drive,Rockvill,MD20852USA)保藏,保藏號(hào)為75299(p63-2)和75300(p59-4)。更好的載體是編碼ORF-2的第112至660位氨基酸的bHEV ORF-25’tr,編碼ORF-3的第112至607位氨基酸的bHEV ORF-2 5’-3’tr,和編碼HEVORF-2的第112至578位氨基酸的桿狀病毒。實(shí)施例1說明了將ORF-2基因克隆到pBlueBac中形成p63-2。該方法包括用限制性酶NruI和BglII消化HEV SAR-55毒株的基因組,將含有BlnI和BglII位點(diǎn)的多接頭插入載體的獨(dú)特NheI位點(diǎn),用銜接子將NruI-BglII ORF-2片段插入BlnI-BglII pBlueBac。
在另一實(shí)施例中,然后可將選定的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到合適的真核細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)重組蛋白。所述的真核細(xì)胞系統(tǒng)包括但不限于酵母和諸如HeLa、MRC-5、CV-1、HuH7或HepG2等細(xì)胞系。較好的真核細(xì)胞系統(tǒng)之一是Sf9昆蟲細(xì)胞。較好的方法包括使用桿狀病毒表達(dá)載體和Sf9昆蟲細(xì)胞系。
可以用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)來檢測(cè)表達(dá)出的重組蛋白,其中包括實(shí)施例2中用含抗HEV抗體的抗血清進(jìn)行的考馬斯藍(lán)染色和Western印跡。另一種方法是通過實(shí)施例3中的免疫電子顯微鏡法檢測(cè)類病毒顆粒。
在另一實(shí)施例中,可以獲得裂解原液形式的SF9細(xì)胞系所表達(dá)的重組蛋白,或者可以通過本領(lǐng)域各種已知蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化裂解液,所述方法包括差異沉淀、分子篩層析、離子交換層析、等電聚焦、凝膠電泳、親和性和免疫層析等。在親和性層析法中,可以通過一根含有結(jié)合了ORF蛋白的特異性抗體的樹脂的層析柱來純化重組蛋白。實(shí)施例16舉例說明了分別從桿狀病毒感染的細(xì)胞裂解液及其上清液中純化重組法表達(dá)的HEV ORF2蛋白的方法。
另一實(shí)施例中,可將表達(dá)出的本發(fā)明重組蛋白用于免疫試驗(yàn)來診斷包括人、大猩猩、舊世界猴類、新世界猴類及其它靈長(zhǎng)類動(dòng)物等在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的戊肝感染。在更好的實(shí)施例中,該免疫試驗(yàn)被用來檢測(cè)人中的戊肝感染。使用HEV蛋白(尤其是ORF蛋白,更特殊的是ORF2蛋白)的免疫試驗(yàn)與使用部分ORF蛋白的免疫試驗(yàn)相比,是診斷戊肝感染的高特異性、靈敏度和重復(fù)性方法。
本發(fā)明的免疫測(cè)試可以是放射性免疫試驗(yàn)、Western印跡試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)試驗(yàn)等。ELISA的業(yè)內(nèi)已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)參見Methods in Immunodiagnosis,第2版,Rose&Bigazzi編輯,John Wiley&Sons,1980,和Campell等,Methods of Immunology,W.A.Benjamin,Inc.,1964,以上兩篇都在此納為參考。所述的試驗(yàn)可以是業(yè)內(nèi)所說的直接、間接、競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性免疫試驗(yàn)。(Oellerich,M.1984.J.Clin.Chem.Clin.,BioChem.22895-904)。適合這類檢測(cè)的生物樣品包括但不限于組織活檢抽提液、全血、血漿、血清、腦脊液、胸膜液、尿液等。
在實(shí)施例之一中,測(cè)試血清與固相反應(yīng)物反應(yīng),所說固相反應(yīng)物的表面結(jié)合了作為抗原的重組HEV蛋白,ORF蛋白或諸如ORF-2與ORF-3、ORF-1與ORF-3等不同ORF蛋白組合更好。最好,HEV蛋白主要由HEV ORF2的氨基酸112-607構(gòu)成??梢岳靡阎夹g(shù)來制備固相表面反應(yīng)物,用于將蛋白質(zhì)與固相支持物結(jié)合。所說的結(jié)合方法包括蛋白質(zhì)在支持物上的非特異性吸附或蛋白質(zhì)與支持物上反應(yīng)性基團(tuán)的共價(jià)結(jié)合。在抗原與抗HEV抗體反應(yīng)后,洗滌去除未結(jié)合的血清成份,抗原-抗體復(fù)合體與諸如帶標(biāo)記的抗人抗體等第二抗體反應(yīng)。標(biāo)記可以是某種酶,該酶可以通過固相支持物在合適的熒光或比色試劑存在下培養(yǎng)來檢測(cè)。也可以是其它可測(cè)標(biāo)記,例如放射性標(biāo)記或膠體金等。
在一優(yōu)選實(shí)施例中,重組桿狀病毒載體表達(dá)的蛋白被用作特異性結(jié)合劑來檢測(cè)抗HEV抗體,以IgG或IgM抗體為宜,所說的重組桿狀病毒載體含有SAR-55的ORF-2序列,該序列編碼HEV ORF2的氨基酸112-607。實(shí)施例10顯示ELISA的結(jié)果,其中固相以氨基酸112至607構(gòu)成的重組55kD蛋白質(zhì)作為表面抗原。這種蛋白能夠檢測(cè)響應(yīng)不同HEV毒株而產(chǎn)生的抗體,但是不能檢測(cè)響應(yīng)甲肝、乙肝、丙肝或丁肝所產(chǎn)生的抗體。
HEV蛋白和類似物可以單獨(dú)或與諸如第二抗體之類其它反應(yīng)試劑一起制備成試劑盒的形式用于免疫試驗(yàn)。
重組HEV蛋白,較好的是一種ORF蛋白或多種ORF蛋白的組合,更好的是ORF2蛋白,以及本發(fā)明的基本同源蛋白質(zhì)及類似物可用作疫苗保護(hù)哺乳動(dòng)物抵抗戊肝的攻擊。作為免疫原的這類疫苗可以是細(xì)胞、來自被重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的裂解液或含有表達(dá)蛋白的培養(yǎng)物上清液?;蛘?,免疫原是部分或基本純化的重組蛋白。雖然免疫原可以以純或基本純的形式給予,但以藥物組合物、配方或制劑的形式給予為宜。
本發(fā)明制劑既可人用也可獸用,包含上述免疫原,和一種或多種藥學(xué)上認(rèn)可的載體,和可選性的其它治療性成份。載體必須是“認(rèn)可的”即與制劑的其它成份相容,而且不損害接受者。制劑以單位劑型的形式給予較為方便,這可以用制藥業(yè)的常規(guī)方法來制備。
所有的方法都包括將活性成份與包含一種或多種輔助成份的載體相結(jié)合的步驟。通常,將活性成份與液相載體或精細(xì)粉碎的固體載體或以上兩者均勻而密切結(jié)合,然后根據(jù)需要將產(chǎn)物成形為所需的制劑。
適合靜脈、肌內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)給藥的劑型宜包含活性成份的無菌水溶液,所說溶液最好與接受者的血液是等滲的。這樣的制劑宜如下制備將固體活性成份溶解在含有生理相容性物質(zhì)例如氯化鈉(0.1-2.0M),甘油等,且緩沖后的pH與生理?xiàng)l件相容的水中,形成水溶液,然后將所說的溶液滅菌。以上溶液可以裝在單位劑量或多劑量容器中,例如密封在安瓿瓶或小瓶中。
本發(fā)明制劑可以含有穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑的例子是聚乙二醇、蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、無機(jī)酸和有機(jī)酸,它們可以單獨(dú)或混合使用。這些穩(wěn)定劑的含量宜為每重量份免疫原0.11-10,000重量份。如果要用2種以上穩(wěn)定劑,以它們的總量落在上述范圍內(nèi)為宜。以合適的濃度和pH將這些穩(wěn)定劑用在水溶液中。這類水溶液具體的滲透壓在0.1-3.0摩爾滲透壓之間,以0.8-1.2為宜。水溶液的pH調(diào)在5.0-9.0之間,以6-8之間為佳。在配制本發(fā)明免疫原時(shí),可以使用抗吸附劑。
可用其它制藥方法來控制作用的持續(xù)時(shí)間。用聚合物來復(fù)合或吸附蛋白質(zhì)或其衍生物可以獲得控釋制劑。選擇合適的大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚精蛋白)及其濃度,以及以控釋為目的的摻入方法,可以做到控釋。另一種利用控釋制劑來控制作用持續(xù)時(shí)間的方法是將蛋白質(zhì)、蛋白類似物或其功能性衍生物摻入聚酯、聚氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯和乙酸乙烯酯的共聚物等聚合材料顆粒中?;蛘?,不是將上述物質(zhì)摻入聚合物顆粒,而是分別用例如團(tuán)聚技術(shù)或界面聚合將上述物質(zhì)包裹在制備好的例如羥甲基纖維素或明膠微米級(jí)膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微米級(jí)膠囊中,或者摻入例如脂質(zhì)體、白蛋白微球粒、微米級(jí)乳液、微米級(jí)顆粒和納米級(jí)膠束或粗乳液等膠態(tài)藥物傳遞系統(tǒng)中。如果需要的是口服劑型,可將組合物與半乳糖、蔗糖、淀粉、滑石粉、硬脂酸鎂、晶體纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、甘油、藻酸鈉或阿拉伯樹膠等常用載體混合。
如前文所述,本發(fā)明蛋白質(zhì)可以試劑盒的形式給予,可以是純蛋白質(zhì)的形式也可以是藥物組合物形式。
可以按常規(guī)方法進(jìn)行疫苗接種。例如,可將免疫原溶解在諸如鹽水或水等合適的吸收劑、或完全或不完全佐劑中使用。而且為使蛋白質(zhì)具有免疫原性,免疫原與載體可以結(jié)合或不結(jié)合。所述的載體分子包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)、破傷風(fēng)類毒素等。免疫原可以通過各種途徑給予,只要該途徑對(duì)產(chǎn)生抗體來說合適,例如靜脈、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下等。免疫原可以一次性給予,或者分幾次間隔地給予,直到產(chǎn)生明顯的抗HEV抗體效價(jià)。血清中的抗體可以用免疫試驗(yàn)來檢測(cè)。
另一實(shí)施例中,免疫原是能夠指導(dǎo)宿主合成HEV ORF蛋白的核酸序列。所述的核酸序列可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法插入到合適的表達(dá)載體中。能夠高效體內(nèi)轉(zhuǎn)移的表達(dá)載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和牛痘病毒載體。這類表達(dá)載體的操作元件已經(jīng)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中公開,并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這樣的表達(dá)載體可以靜脈、肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或口服給予。
另一實(shí)施例中,直接基因轉(zhuǎn)移通過肌內(nèi)注射(例如)含有指導(dǎo)宿主合成HEVORF蛋白的核酸序列的質(zhì)粒性真核表達(dá)載體來完成。這樣的方法曾被用于體內(nèi)生產(chǎn)乙肝表面抗原,并得到了抗該表面抗原的抗體應(yīng)答(Davis等,(1993)HumanMolecular Genetics,21847-1851;另外參見Davis等,(1993)Human Gene Therapy,4151-159&733-740)和Davis,H.L.等,Proc Natl Acad Sci USA(1996)937213-7218)。
當(dāng)免疫原是部分純化或基本純化的重組HEV ORF蛋白時(shí),引發(fā)抗HEV的保護(hù)性抗體應(yīng)答的有效劑量范圍是約0.1μg至約100μg。更好的范圍是約0.5μg至約70μg,而最好的范圍是約10μg至50μg。
引發(fā)抗HEV的保護(hù)性抗體應(yīng)答的HEV-ORF蛋白編碼核酸序列的有效劑量范圍是約1至約5000μg;更好的范圍是約300至2000μg。
含有能夠指導(dǎo)宿主合成HEV ORF蛋白的核酸序列的表達(dá)載體可以以試劑盒的形式提供,如前所述,它們可以是單獨(dú)的純形式,或者是藥物組合物的形式。
給予本發(fā)明的免疫原可以是為了預(yù)防或者是為了治療。在用于預(yù)防時(shí),免疫原須在接觸HEV之前或在HEV感染癥狀出現(xiàn)之前給予。預(yù)防性給予免疫原的作用是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)防止或減弱此后可能的HEV感染。在用于治療時(shí),免疫原在各種HEV感染癥狀或疾病表現(xiàn)剛開始時(shí)(或在此后立即)給予。治療性給予免疫原的作用是減弱感染或疾病。
優(yōu)選實(shí)施例之一是用HEV SAR-55毒株的ORF-2序列或其對(duì)等序列表達(dá)的重組ORF-2蛋白制備的疫苗。因?yàn)橹亟MORF-2蛋白已被證明提供抗異源或同源HEV毒株攻擊的保護(hù),所以它們可用于抗各種HEV毒株而提供保護(hù)。
除了作為疫苗的用途,組合物可以用來制備抗類HEV病毒顆粒的抗體。所述抗體可以作為抗病毒藥物直接使用。為了制備抗體,將病毒顆?;虿《绢w粒的非顆粒性抗原與前述用于疫苗的載體結(jié)合,然后用來免疫動(dòng)物宿主。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔后收集宿主的血清或血漿,得到含有與病毒顆粒反應(yīng)的抗體的組合物。用飽和硫酸銨或DEAE Sephadex,或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以獲得γ球蛋白或IgG抗體。這些抗體沒有與諸如藥物等其它抗病毒物質(zhì)相關(guān)的許多副作用。
通過將可能的不良免疫系統(tǒng)應(yīng)答減小到最低程度可以制備出與宿主系統(tǒng)相容性更高的抗體組合物。這是通過去除異種抗體的全部或部分Fc或使用宿主動(dòng)物的同種抗體(例如使用來自人/人雜交瘤的抗體)做到的。例如,用相應(yīng)的非免疫原性部分代替抗體中的免疫原性部分可以制備出人源化抗體(例如嵌合抗體)(在人體中是非免疫原性的)。這樣的嵌合抗體可含有一種物種抗體的反應(yīng)性部分或抗原結(jié)合部分,和另一物種抗體的Fc部分(非免疫原性的)。嵌合抗體的實(shí)例包括但不限于非人哺乳動(dòng)物-人嵌合抗體,嚙齒類-人嵌合抗體,小鼠-人抗體和大鼠-人嵌合抗體(Robinson等,國(guó)際專利申請(qǐng)184,187;Taniguchi M.,歐洲專利申請(qǐng)171,496;Morrison等,歐洲專利申請(qǐng)173,494;Neuberger等,PCT專利申請(qǐng)WO86/01533;Cabilly等,1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439;Nishimura等,1987 Canc.Res.47999;Wood等,1985 Nature 314446;Shaw等,1988 J.Natl.Cancer Inst.8015553,以上文獻(xiàn)均在此納為參考)。
有關(guān)“人源化”嵌合抗體的綜合論述可參見Morrison S.,1985 Science2291202和Oi等,1986 BioThechiques 4214。
合適的“人源化”抗體還可以用CDR或CEA取代法來制備(Jones等,1986Nature 321552;Verhoeyan等,1988 Science 2391534;Biedleret等,1988 J.Immunol.1414053,以上文獻(xiàn)均在此納為參考)。
抗體或抗原結(jié)合性片段還可以通過基因工程來制備。在大腸桿菌內(nèi)同時(shí)表達(dá)重鏈和輕鏈基因的技術(shù)正是PCT專利申請(qǐng)WO901443、WO901443和9014424,Huse等,1989 Science 2461275-1281的主題。
抗體還可以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答??贵w的用量可以與用于其它治療性目的時(shí)的抗體用量相似。例如,在例如狂犬病、麻疹和乙肝等其它病毒病潛伏期的早期,按0.02-0.1ml/lb體重給予混合γ球蛋白,用以干擾病毒進(jìn)入細(xì)胞。這樣,與HEV病毒顆粒反應(yīng)的抗體可以以純形式或與其它抗病毒物質(zhì)一起被動(dòng)給予感染了HEV的宿主,用以加強(qiáng)抗病毒藥物的效力。
或者,可以通過給予抗獨(dú)特型抗體作為免疫原來誘導(dǎo)抗HEV抗體。通常,用如前制備的純抗HEV抗體制劑在宿主中誘導(dǎo)抗獨(dú)特型抗體。宿主被給予適當(dāng)稀釋的組合物。在給予后,通常是重復(fù)給予后,宿主產(chǎn)生抗獨(dú)特型抗體。為了消除對(duì)Fc區(qū)的免疫原性應(yīng)答,可以使用宿主動(dòng)物同種產(chǎn)生的抗體或去除所給抗體的Fc區(qū)。給宿主引入抗獨(dú)特型抗體后,采集血清或血漿得到抗體組合物。如前文為得到抗HEV抗體那樣純化組合物,或用結(jié)合于親和性基質(zhì)上的抗HEV抗體進(jìn)行親和性層析來純化組合物。所產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體在構(gòu)象上類似原HEV抗原,可以不用HEV顆粒抗原而用它來制備HEV疫苗。
用于在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)抗病毒抗體時(shí),注入抗體的方式與用作疫苗時(shí)是相同的,即通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下等方式注射在含或不含佐劑的生理學(xué)合適稀釋劑中所成的有效濃度溶液。一次或多次加強(qiáng)劑量注射是需要的。
本發(fā)明的HEV衍生蛋白還將用于產(chǎn)生抗血清,所述抗血清是用于接觸前或接觸后預(yù)防的。此時(shí),HEV蛋白或蛋白混合物與合適的佐劑配制在一起,按照產(chǎn)生人抗血清的已知方法注射給志愿受試人。免疫后的數(shù)周內(nèi)監(jiān)視注射蛋白引起的抗體應(yīng)答,即間期內(nèi)取樣,然后用前文所述的免疫試驗(yàn)來檢測(cè)是否存在抗HEV抗血清抗體。
可以將免疫個(gè)體的抗血清給予存在被感染危險(xiǎn)的個(gè)體作為接觸前預(yù)防??寡暹€可以用于治療接觸后患者,這類似用高效價(jià)抗乙肝病毒的抗血清來進(jìn)行接觸后預(yù)防。當(dāng)然,本領(lǐng)域技術(shù)人員不難理解,用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從免疫個(gè)體的抗血清中純化得到的免疫球蛋白(HEV免疫球蛋白)可以用作接觸前預(yù)防或用于接觸后患者的治療。
就抗類HEV病毒顆粒及蛋白的抗體和抗獨(dú)特型抗體的體內(nèi)用途和診斷性用途而言,都以使用單克隆抗體為佳。可以如下制得抗病毒顆?;蚩躬?dú)特型的單克隆抗體。取免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞用已知方法無限繁殖化或制備雜交瘤。(Goding,J.W.1983.Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice,Pladermic Press,Inc.NY,NY,pp.56-97)。為了生成人-人雜交瘤應(yīng)選用人淋巴細(xì)胞供體。合適的淋巴細(xì)胞供體可以是已知感染了HEV的供體(因血液中存在抗病毒抗體或通過病毒培養(yǎng)證明已經(jīng)被感染)。可以從外周血樣品中分離淋巴細(xì)胞,或者用接受了脾切除的供體的脾細(xì)胞??梢杂肊pstein-Barr病毒(EBV)將人淋巴細(xì)胞無限繁殖化,或用人融合伴(human fusion partner)產(chǎn)生人-人雜交瘤。用肽體外初次免疫也可以用于產(chǎn)生人單克隆抗體。
篩選免疫細(xì)胞分泌的抗體,確定分泌具有所需特異性的抗體的克隆??共《绢w粒的單克隆抗體必須結(jié)合HEV病毒顆粒??躬?dú)特型抗體的單克隆抗體必須結(jié)合抗病毒顆粒的抗體。選擇產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的細(xì)胞。
另一實(shí)施例中,通過收集編碼人或大猩猩B細(xì)胞的V基因的信使RNA得到單克隆抗體,所述的人或大猩猩是經(jīng)感興趣的抗原免疫的。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈的信使RNA,隨機(jī)組合,克隆到絲狀噬菌體內(nèi)展示。在與固相結(jié)合的選定抗原上“篩選”,挑取帶有感興趣抗體的噬菌體?;厥照故境隹乖纯贵w的結(jié)合位點(diǎn)的噬菌體,擴(kuò)增,將它們所帶的抗體基因組裝成編碼完整的抗體分子。在大腸桿菌中表達(dá)這類抗感興趣抗原的特異性抗體,如前文就人單克隆抗體那樣純化和使用。從組合文庫(kù)中獲得人單克隆抗體可參見例如Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,(1992)Journal of Molecular Biology,第227卷,pp.381-388;和Chanock,R.M.等,(1993)Infectious Agents and Disease,第2卷,pp.118-l31。
以上所述抗體或其抗原結(jié)合性片段可單獨(dú)或配制成藥物組合物以試劑盒的形式供體內(nèi)使用??贵w可以用于治療、用于免疫試驗(yàn)診斷、或作為免疫親和性物質(zhì)用于純化本發(fā)明的ORF蛋白。
物質(zhì)實(shí)施例使用了以下物質(zhì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物。黑猩猩(Chimp)(Pan troglodytes)。舊世界猴類犬猴(Cynomolgusmonkeys)(Cyno)(Macaca fascicularis)、恒河猴(Rhesus)(M.mulatta)、pigtail猴(PT)(M.nemestrina)和非洲綠猴(AGM)(Cercopithecus aethiops)。新世界猴類mustarched tamarins(Tam)(Saguinus mystax)、栗鼠猴(SQM)(Saimiri sciureus)和owl猴(OWL)(Aotus trivigatus)。靈長(zhǎng)類動(dòng)物單獨(dú)籠養(yǎng)在控制事物危害的條件下。動(dòng)物的居住、維持和照顧均符合或超過科學(xué)管理靈長(zhǎng)類動(dòng)物的各項(xiàng)要求。
通過靜脈注射給大多數(shù)動(dòng)物接種含于0.5ml胎牛血清稀釋的糞懸浮液中的HEV,SAR-55毒株,參見(Tsarev,S.A.等,(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89559-563;和Tsarev,S.A.等(1993),J.Infect.Dis.(1671302-1306))。用匯集自7名巴基斯坦戊肝患者的糞液接種Chimp-1313和1310。
約在接種前和后1周時(shí)2次采集血清樣品。用市售的測(cè)試試劑盒(Medpath Inc.,Rockville,MD)測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、異檸檬酸脫氫酶(ICD)和γ谷氨?;D(zhuǎn)移酶(GGT)等血清內(nèi)肝酶水平。如前所述進(jìn)行血清學(xué)測(cè)試。
實(shí)施例1鑒定HEV SAR-55毒株基因組的DNA序列制備用于PCR的病毒RNA模板。感染了HEV犬猴的膽汁(10μl),20%(重量/體積)SDS(最終濃度為1%)、K蛋白酶(10mg/ml)、1μltRNA(10mg/ml)和3μl0.5MEDTA混合成最終體積250μl,55℃孵育30分鐘。用苯酚/氯仿(1∶1(體積/體積))65℃從膽汁中抽提總核酸2次,再用氯仿抽提1次,然后乙醇沉淀,95%乙醇洗滌,用于RT-PCR。當(dāng)RNA更純時(shí),RT-PCR擴(kuò)增來自糞便特別是血清的HEV RNA更高效。如前所述用K蛋白酶處理血清(100μl)或10%糞便懸浮液(200μl)。孵育30分鐘后,加入300μl CHAOS緩沖液(4.2M硫氰酸胍/0.5 N-十二烷基肌氨酸/0.025M Tris-HCl,pH8.0)。用苯酚/氯仿65℃2次抽提核酸接著用氯仿室溫抽提。然后在上層相中加入7.5M乙酸銨(225μl),用0.68ml 2-丙醇沉淀核酸。將沉淀溶于300μl CHAOS緩沖液,加入100μl水。重復(fù)氯仿抽提和2-丙醇沉淀。將核酸溶于水,乙醇沉淀,95%乙醇洗滌,用于RT-PCR。
引物。用Applied Biosystems391型DNA合成儀合成94段引物,長(zhǎng)21至40核苷酸(nt),與HEV緬甸毒株(BUR-121)基因組(Tam,A.W.等,(1991),Virology,185120-131)或SAR-55基因組的正鏈和負(fù)鏈互補(bǔ)。這94段引物的序列如下所示,從SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.98HEV引物引物ORF區(qū) 序列D3042B 1 ACATTTGAAT TCACAGACAT TGTGC (SEQ ID NO.5)R3043B 1 ACACAGATCT GAGCTACATT CGTGAG (SEQ ID NO.6)D3044B 1 AAAGGGATCC ATGGTGTTTG AGAATG (SEQ ID NO.7)R3045B 1 ACTCACTGCA GAGCACTATC GAATC (SEQ ID NO.8)R261S 1 CGGTAAACTG GTACTGCACA AC (SEQ ID NO.9)D261S 1 AAGTCCCGCT CTATTACCCA AG (SEQ ID NO.10)D259S 1 ACCCACGGGT GTTGGTTTTT G (SEQ ID NO.11)R255S 1 TTCTTGGGGC AGGTAGAGAA G(SEQ ID NO.12)R254S 2 TTATTGAATT CATGTCAACG GACGTC (SEQ ID NO.13)D242S 1 AATAATTCAT GCCGTCGCTC C(SEQ ID NO.14)R241S 1 AAGCTCAGGA AGGTACAACT C(SEQ ID NO.15)R231S 1 AAATCGATGG CTGGGATCTG ATTC (SEQ ID NO.16)R230S 1 GAGGCATTGT AGAGCTTTGT G(SEQ ID NO.17)R229S 1 GATGTTGCAC GGACAGCAAA TC (SEQ ID NO.18)R228S 1 ATCTCCGATG CAATCGTTAA TAAC (SEQ ID NO.19)R227B I TAATCCATTC TGTGGCGAGA G(SEQ ID NO.20)R218B 2 AAGTGTGACC TTGGTCCAGT C(SEQ ID NO.21)D217B 2 TTGCTCGTGC CACAATTCGC TAC (SEQ ID NO.22)D211B 1 CATTTCACTG AGTCAGTGAA G(SEQ ID NO.23)D202B 2 TAATTATAAC ACCACTGCTA G(SEQ ID NO.24)R201B 2 GATTGCAATA CCCTTATCCT G(SEQ ID NO.25)R200S 1 ATTAAACCTG TATAGGGCAG AAC (SEQ ID NO.26)R199S 1 AAGTTCGATA GCCAGATTTG C(SEQ ID NO.27)R198S 2 TCATGTTGGT TGTCATAATC C(SEQ ID NO.28)R193B 1 GATGACGCAC TTCTCAGTGT (SEQ ID NO.29)R192B 1 AGAACAACGA ACGGAGAAC (SEQ ID NO.30)D191B 1 AGATCCCAGC CATCGACTTT G(SEQ ID NO.31)R190S 2 TAGTAGTGTA GGTGGAAATA G(SEQ ID NO.32)D189B 2 GTGTGGTTAT TCAGGATTAT G(SEQ ID NO.33)D188B 2 ACTCTGTGAC CTTGGTTAAT G(SEQ ID NO.34)R187S 2 AACTCAAGTT CGAGGGCAAA G(SEQ ID NO.35)D186S 2 CGCTTACCCT GTTTAACCTT G(SEQ ID NO.36)D185B 2,3 ATCCCCTATA TTCATCCAAC CAAC (SEQ ID NO.37)D184S 2,3 CTCCTCATGT TTCTGCCTAT G(SEQ ID NO.38)R181S 2 GCCAGAACGA AATGGAGATA GC (SEQ ID NO.39)R180B 1 CTCAGACATA AAACCTAAGT C(SEQ ID NO.40)D179S 1 TGCCCTATAC AGGTTTAATC G(SEQ ID NO.41)D178B 1 ACCGGCATAT ACCAGGTGC (SEQ ID NO.42)D177B 2 ACATGGCTCA CTCGTAAATT C(SEQ ID NO.43)R174B 1 AACATTAGAC GCGTTAACGA G (SEQ ID NO.44)D173S 1 CTCTTTTGAT GCCAGTCAGA G (SEQ ID NO.45)D172B 1 ACCTACCCGG ATGGCTCTAA GG(SEQ ID NO.46)R166B 2 TATGGGAATT CGTGCCGTCC TGAAG(EcoR I) (SEQ ID NO.47)R143B 1 AGTGGGAGCA GTATACCAGC G (SEQ ID NO.48)D141B 1 CTGCTATTGA GCAGGCTGCT C (SEQ ID NO.49)R142S 1 GGGCCATTAG TCTCTAAAAC C (SEQ ID NO.50)D135B 1 GAGGTTTTCT GGAATCATC(SEQ ID NO.51)R134B 1 GCATAGGTGA GACTG(SEQ ID NO.52)R133B 1 AGTTACAGCC AGAAAACC (SEQ ID NO.52)D132S 2,3 CCATGGATCC TCGGCCTATT TTGCTGTTGC TCC(SEQ ID NO.54)(BamHI)D131B 5’NC AGGCAGACCA CATATGTG (SEQ ID NO.55)R119B 1 GGTGCACTCC TGACCAAGCC (SEQ ID NO.56)D118B 1 ATTGGCTGCC ACTTTGTTC(SEQ ID NO.57)R117B 1 ACCCTCATAC GTCACCACAA C (SEQ ID NO.58)R116B 1 GCGGTGGACC ACATTAGGAT TATC (SEQ ID NO.59)D115B 1 CATGATATGT CACCATCTG(SEQ ID NO.60)D114B 1 GTCATCCATA ACGAGCTGG(SEQ ID NO.61)R112B 2 AGCGGAATTC GAGGGGCGGC ATAAAGAACC AG (SEQ ID NO.62)(EcoRI)R111B 2 GCGCTGAATT CGGATCACAA GCTCAGAGGC(SEQ ID NO.63)TATGCC(EcoRI)D110B 2 GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC(BamHI) (SEQ ID NO.64)D109B 2 TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG(BamHI) (SEQ ID NO.65)D108B 1 AAATTGGATC CTGTGTCGGG TGGAATGAAT(SEQ ID NO.66)AACATGTC(BamHI)R107B 1 ATCGGCAGAT CTGATAGAGC GGGGACTTGC CGGATCC(SEQ ID NO.67)D101B 2 TACCCTGCCC GCGCCCATAC TTTTGATG (SEQ ID NO.68)R100B 1 GGCTGAGATC TGGTTCGGGT CGCCAAGAAG GTG(SEQ ID NO.69)(BglII)R99B 2 TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG (BglII) (SEQ ID NO.70)R98B 2 GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC(BglII) (SEQ ID NO.71)D97S 1 CCGTCGGATC CCAGGGGCTG CTGTCCTG(BamHI) (SEQ ID NO.72)R96B 2 AAAGGAATTC AAGACCAGAG GTAGCCTCCT(SEQ ID NO.73)C(EcoRI)D95B 2 GTTGATATGA ATTCAATAAC CTCGACGG (SEQ ID NO.74)R94B 3’NC TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA(SEQ ID NO.75)AATGAG(BglII)D90B 2 TCACTCGTGA ATTCCTATAC TAATAC(EcoRI) (SEQ ID NO.76)R89B 3’NC TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA(SEQ ID NO.77)AATG(BamHI)R88B 1 TGATAGAGCG GGACTTGCCG GATCC(BamHI) (SEQ ID NO.78)R87B 1 TTGCATTAGG TTAATGAGGA TCTC (SEQ ID NO.79)D86B 1 ACCTGCTTCC TTCAGCCTGC AGAAG (SEQ ID NO.80)R81B 1 GCGGTGGATC CGCTCCCAGG CGTCAAAAC(BamHI) (SEQ ID NO.81)D80B 1 GGGCGGATCG AATTCGAGAC CCTTCTTGG (EcoRI) (SEQ ID NO.82)R79B 1 AGGATGGATC CATAAGTTAC CGATCAG (BamHI) (SEQ ID NO.83)D78B 1 GGCTGGAATT CCTCTGAGGA CGCCCTCAC(EcoRI) (SEQ ID NO.84)R77B 1 GCCGAAGATC TATCGGACAT AGACCTC(BglII)(SEQ ID NO.85)R76B 2 CAGACGACGG ATCCCCTTGG ATATAGCCTG(BamHI) (SEQ ID NO.86)D75B 5’NC GGCCGAATTC AGGCAGACCA CATATGTGGT(SEQ ID NO.87)CGATGCCATG (EcoRI)D72B 1 GCAGGTGTGC CTGGATCCGG CAAGT(BamHI) (SEQ ID NO.88)R71B 1 GTTAGAATTC CGGCCCAGCT GTGGTAGGTC (EcoRI)(SEQ ID NO.89)D63B 1 CCGTCCGATT GGTCTGTATG CAGG (SEQ ID NO.90)D61B 1 TACCAGTTTA CTGCAGGTGT GC(SEQ ID NO.91)D60B 1 CAAGCCGATG TGGACGTTGT CG(SEQ ID NO.92)R59B 2,3GGCGCTGGGC CTGGTCACGC CAAG (SEQ ID NO.93)D50B 1 GCAGAAACTA GTGTTGACCC AG(SEQ ID NO.94)R49B 2 TAGGTCTACG ACGTGAGGCA AC(SEQ ID NO.95)R48B 1 TACAATCTTT CAGGAAGAAG G (SEQ ID NO.96)R47B I CCCACACTCC TCCATAATAG C (SEQ ID NO.97)D46B 1 GATAGTGCTT TGCAGTGAGT ACCG (SEQ ID NO.98)
序列左側(cè)的縮寫表示R和D分別表示反向和正向引物;B和S分別表示來自戊肝緬甸-121毒株和戊肝SAR-55毒株的序列;5’NC和3’NC分別表示HEV基因組5前導(dǎo)和3前導(dǎo)非編碼區(qū);1、2和3分別表示來自開放讀碼框1、2或3的序列。部分序列右側(cè)的()表示在這些序列中插入了一個(gè)人工限制性位點(diǎn)。
為了克隆PCR片段,在引物的5’端增加了長(zhǎng)3至7nt的EcoRI、BamHI或BglII限制性位點(diǎn)。
RT-PCR。通常,100μl的RT-PCR混合物包含模板,10mM Tris-HCl(pH8.4),50mM KCl,2.5mM MgCl2,全部4種dNTP(各0.2mM),50pmol正向引物,50pmol反向引物,40單位RNasin(Promega),16單位禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega),4單位AmpliTaq(Cetus),覆蓋以100μl輕礦物油。混合物42℃孵育1小時(shí),然后35輪PCR循環(huán)擴(kuò)增94℃1分鐘,45℃1分鐘,72℃1分鐘。在1%瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。
PCR片段的克隆。末端含限制性位點(diǎn)的PCR片段用EcoRI和BamHI,或EcoRI和BglII限制性酶消化,克隆到EcoRI/BamHI消化的pBR322或pGEM-3Z(Promega)中?;蛘撸肨A克隆試劑盒(Invitrogen)將PCR片段克隆到pCR1000(Invitrogen)中。
PCR片段和質(zhì)粒測(cè)序。從1%瓊脂糖凝膠切取PCR片段,用Geneclean(Bio101,La Jolla,CA)純化。用Sequenase(United States Biochemical),如Winship,P.R.(1984),Nucleic Acids Rev.,171266所述測(cè)定雙鏈PCR片段的序列。用CsCl梯度純化雙鏈質(zhì)粒,用Sequenase試劑盒(United States Biochemical)測(cè)定質(zhì)粒的序列。
序列的計(jì)算機(jī)分析。用Genetics Computer Group(Madison,WI)的軟件包(Devereaux,J.等(1984),Nucleic Acids Rev.,12387-395,第7.5版,VAX8650計(jì)算機(jī)上(National Cancer Institute,F(xiàn)rederick,MD))比較各HEV毒株的核苷酸序列。
實(shí)施例2構(gòu)建重組表達(dá)載體P63-2用含有HEV毒株SAR-55(Tsarev,S.A.等(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89559-563)基因組完整ORF-2的質(zhì)粒獲得限制性片段NruI-BglII。NruI在ORF-2起始密碼子ATG上游5核苷酸處剪切HEV cDNA。預(yù)先在HEV基因組的3’末端加一個(gè)人工BgIII位點(diǎn),就在聚A序列之前(Tsarev,S.A.等(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89559-563)。為了將該片段插入pBlueBac轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(Invitrogen),在載體的獨(dú)特NheI位點(diǎn)引入一個(gè)合成多接頭。該多接頭含有的HEV cDNA和pBlueBac序列中都沒有的BlnI和BglII位點(diǎn)。用圖1中的銜接子(adapter)將NruI-BglII ORF-2片段插入BlnI-BglII pBlueBac。
實(shí)施例3P63-2在SF9昆蟲細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)按照Invitrogen的程序,用鈣沉淀法將P63-2和AcMNPV桿狀病毒DNA(Invitrogen)共轉(zhuǎn)染給SF9細(xì)胞(Invitrogen),AcMNPV桿狀病毒DNA能夠產(chǎn)生活性完整桿狀病毒,病毒包裝P63-2成為重組桿狀病毒。該重組桿狀病毒經(jīng)噬斑純化4次。用所得的重組桿狀病毒63-2-IV-2感染SF9細(xì)胞。
SDS-PAGE和Western blot。昆蟲細(xì)胞重懸于加樣緩沖液(50mM Tris-HCl,pH6.8,100mM DTT,2%SDS,0.1%溴酚藍(lán)和10%甘油),按Laemmli,U.K.(1970),Nature,227680所述進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。凝膠以考馬斯藍(lán)染色,或?qū)⒌鞍踪|(zhì)電印跡到BA-85硝酸纖維素濾膜(Schleicher&schuell)上。轉(zhuǎn)移后,在含10%胎牛血清和0.5%明膠的PBS中封閉硝酸纖維素膜。1∶1000稀釋的大猩猩-1313的超免疫血清被用作原初抗體(primary antibody)。1∶2000稀釋的帶磷酸酶標(biāo)記經(jīng)親和性純化的山羊抗人IgG(Kirkegaard&Perry Laboratories,Inc.)被用作次級(jí)抗體。濾膜孵育在Western blue穩(wěn)化的堿性磷酸酶底物(Promega)中。孵育均在封閉溶液中進(jìn)行,并用含0.05%Tween-20(Sigma)的PBS洗滌。
HEV ORF-2的表達(dá)。感染了重組桿狀病毒63-2-IV-2的SF9細(xì)胞合成的主要蛋白其表觀分子量為74KD(圖2A,泳道3)。這一大小略大于對(duì)完整ORF-2所做的估計(jì)(71KD)。這一大小差異可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的糖基化作用,因?yàn)樵贜末端至少有一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(Asn-Leu-Set)。未感染細(xì)胞(圖2A,泳道1)或用野生型非重組桿狀病毒感染的細(xì)胞(圖2A,泳道2)中沒有該蛋白。后一種情況中,檢測(cè)到的以多角體蛋白為主。用Chimp-1313血清(經(jīng)HEV超免疫)進(jìn)行Western印跡分別分析相同的裂解液(圖2B),只有重組細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)(泳道3),主條帶仍然對(duì)應(yīng)于74KD的蛋白(圖2B)??捡R斯藍(lán)染色的凝膠中約25、29、35、40至45和55至70KDa的次要條帶(圖2A,泳道3)在Western印跡法中也與血清反應(yīng)(圖2B中泳道3)。其中有些分子量大于74KD的條帶是糖基化程度不同的結(jié)果,分子量更低的條帶則表示發(fā)生了加工和/降解。在Western印跡中,HEV接種前Chimp-1313的血清與以上蛋白都不反應(yīng)。
實(shí)施例4重組感染SF9細(xì)胞的免疫電子顯微鏡檢在含10mM Tris-HCl,pH7.4,0.3%十二烷基肌氨酸鈉的CsCl(1.30g/ml)中超聲波裂解5×106個(gè)重組感染SF9細(xì)胞,然后以40,000rpm離心68小時(shí)(SW60Ti)。取其中ELISA應(yīng)答性最高,浮密度1.30g/ml的50μl稀釋在1ml PBS中,加5μlchimp-1313超免疫血清。用另一戊肝毒株(Mexican HEV)再次攻擊感染過的大猩猩,如此制備超免疫血清。樣品室溫孵育1小時(shí),然后4℃孵育過夜。用SW60Ti轉(zhuǎn)子以30,000rmp,4℃離心2小時(shí)沉淀出免疫復(fù)合物。沉淀重懸于蒸餾水,3%PTA反染色,放在碳網(wǎng)上,用放大40,000倍的電子顯微鏡EM-10,Carl Zeiss,Oberkochen,Germany,檢查。
VLP的檢測(cè)。感染了野生型或重組桿狀病毒63-2-IV-2的昆蟲細(xì)胞的裂解液經(jīng)CsCl梯度離心分離。感染重組病毒的昆蟲細(xì)胞的CsCl梯度流份與大猩猩-1313超免疫血清一起孵育時(shí),在浮密度為1.30g/ml的流份中發(fā)現(xiàn)兩種被抗體覆蓋的類病毒顆粒第一種(圖3A),被抗體覆蓋的單個(gè)顆粒,其大小(30nm)和形態(tài)結(jié)構(gòu)都表示是HEV;第二種(圖3B),包裹了抗體的顆粒聚集體,顆粒除較小(約20nm)之外其它都很象HEV。直接EM顯示存在著一個(gè)異源性很高的物質(zhì)群,直徑分別約為30和20nm,它們看似病毒顆粒,但因?yàn)闆]有結(jié)合抗體,所以不能確認(rèn)是HEV。大量IEM實(shí)驗(yàn)顯示,HEV基因組ORF-2區(qū)合成的蛋白質(zhì)中至少部分被組裝成顆粒結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn),感染后期的昆蟲細(xì)胞,此時(shí)小蛋白比例較高,ELISA的結(jié)果都較好。所以在以后的測(cè)試中,在ELISA中使用感染后期重組昆蟲細(xì)胞的全裂解液作為抗原。
實(shí)施例5以昆蟲細(xì)胞的抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè)感染不同HEV毒株后完整抗HEV ORF-2的表達(dá)5×106個(gè)感染了63-2-IV-2病毒的SF9細(xì)胞重懸于1ml 10mM Tris-HCl,pH7.5,0.15M NaCl,然后凍融3次。取10μl該懸浮液溶解于10ml碳酸鹽緩沖液(pH9.6),用它覆蓋一塊彈性微滴測(cè)試板(Falcon)。血清稀釋成1∶20,1∶400和1∶8000,或1∶100,1∶1000和1∶10000。ELISA使用的封閉液和洗滌液與Western印跡中的相同。過氧化物酶偶合的抗人IgG的山羊IgG,或辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗舊世界或新世界猴免疫球蛋白被用作次級(jí)抗體。通過測(cè)定405nm處的光密度(O.D.)來確定結(jié)果。
對(duì)3個(gè)猴子進(jìn)行了檢查,以確定代表HEV巴基斯坦毒株的昆蟲細(xì)胞抗原是否能夠在感染了HEV墨西哥毒株的犬猴中測(cè)出抗HEV抗體(圖4)。cyno-80A82和cyno-9A97用含墨西哥’86HEV毒株的糞便感染(Ticehurst,J.等(1992),J.Infect.Dis.,165835-845),另一個(gè)猴子cyno-83用以上毒株的第二代感染。作為對(duì)照,在該實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了感染巴基斯坦HEV毒株SAR-55的cyno-374的血清樣品。感染墨西哥毒株的3只猴子的血清都轉(zhuǎn)為抗HEV陽(yáng)性。感染第一代病毒的動(dòng)物最遲在15周血清轉(zhuǎn)陽(yáng),感染第二代的不晚于5周。有趣的是,4個(gè)動(dòng)物中抗HEV效價(jià)最高的是接種了墨西哥毒株第二代的cyno-83。接種墨西哥毒株第一代的cyno猴的效價(jià)最低,接種巴基斯坦毒株第一代的猴效價(jià)中等。
實(shí)施例6基于表達(dá)完全ORF-2的昆蟲細(xì)胞的抗原的抗HEV ELISA的特異性為了評(píng)價(jià)在此所述的ELISA是否排除任何其它肝炎相關(guān)性抗體而只特異性檢測(cè)抗HEV,取感染了其它肝炎病毒的大猩猩的血清樣品進(jìn)行分析,4只1組(Garci,P.等(1992),J.Infect.Dis.,1651006-1011;Farci,P.等(1992),Science;Ponzetto,A.等(1987)J Infect.Dis.,15572-77;Rizzetto,m.等(1981)Hepatology1567-574;涉及大猩猩-1413,1373,1442,1551(HAV);和大猩猩-982,1442,1420,1410(HBV)的參考資料來自Purcell等,尚未公開)(表1)。對(duì)接種前、接種后5周和15周的血清樣品進(jìn)行HEV ELISA分析,血清稀釋度為1∶100,1∶1000和1∶10000。感染HAV、HBV、HCV和HDV的動(dòng)物的血清與檢測(cè)HEV抗體都不發(fā)生ELISA反應(yīng),但是4只接種了HEV的大猩猩都產(chǎn)生了抗HEV的IgM和IgG抗體。表1.對(duì)感染不同肝炎病毒(甲、乙、丙、丁、戊肝)大猩猩進(jìn)行的抗HEV抗體血清學(xué)測(cè)試大猩猩接種病毒血清轉(zhuǎn)陽(yáng)周前血清接種后周數(shù)5 15 20/25IgG IgM IgGIgM IgGIgMIgG IgMChimp-1413HAV 5--- -- -Chimp-1373HAV 7--- -- -Chimp-1442HAV 5--- -- -Chimp-1451HAV 5--- -- -Chimp-982 HBV 3--- -- -Chimp-1442HBV 7--- -- - - -Chimp-1420HBV 9--- -- -Chimp-1410HBV 5--- -- -Chimp-51 HCV 10 --- -- -Chimp-502 HCV 12 --- -- -Chimp-105 HCV 28 --- -- -Chimp-793 HCV 13 --- -- -Chimp-904 HDV 8--- -- -Chimp-814 HDV 7--- -- -Chimp-800 HDV 10 --- -- -Chimp-29 HDV 10 --- -- - - -Chimp-1310HEV 5--1∶10.000 1∶100 1∶10.000 -Chimp-1374HEV 3--1∶8000-*1∶8000-Chimp-1375HEV 3--1∶80001∶400 1∶400 -Chimp-1313HEV1st°**5--1∶10.000 1∶100 1∶1000-Chimp-1313HEV2end°**0.5 1∶100 -1∶10.000 -1∶10.000 -*Chimp-1374在接種后3和4周轉(zhuǎn)為IgM抗HEV陽(yáng)性(見圖5)**Chimp-1313兩次接種HEV。第一次用來自7名巴基斯坦患者樣品混合物接種。第二次時(shí)在45個(gè)月后接種HEV墨西哥毒株。
實(shí)施例7測(cè)定HEV SAR-55毒株除人之外靈長(zhǎng)類動(dòng)物宿主范圍不同靈長(zhǎng)類動(dòng)物靜脈接種含HEV的標(biāo)準(zhǔn)糞便懸浮液,收集血清樣品監(jiān)測(cè)感染情況。測(cè)定血清ALT水平作為肝炎指標(biāo),血清轉(zhuǎn)陽(yáng)即抗HEV升高。結(jié)果與犬猴和大猩猩的結(jié)果相比較。
接種HEV的只恒河猴(表2)都顯示十分明顯的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性峰和強(qiáng)抗HIV應(yīng)答。兩動(dòng)物的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性峰都出現(xiàn)在第35天,血清轉(zhuǎn)陽(yáng)發(fā)生在第21天。第29天達(dá)到最高抗HEV效價(jià)。所用的2只非洲綠猴(表2)都發(fā)生丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性和抗HEV效價(jià)升高。雖然非洲綠猴230在接種后第7周死亡,但在此之前已經(jīng)獲得了感染的證據(jù)。猴74的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性峰高出接種前血清約3倍,猴230的則高出約5倍。猴74和230同時(shí)于第28天和第21天分別出現(xiàn)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性峰和血清轉(zhuǎn)陽(yáng)。表2.8種靈長(zhǎng)類動(dòng)物中HEV感染的生物化學(xué)和血清學(xué)特征丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(單位/L) 抗HEV IgG動(dòng)物接種前平均值(SD)天 值 首次測(cè)得日最大效價(jià)(效價(jià))大猩猩1374 51(12) 27 114 27(1∶400)1∶80001375 41(14) 27 89 27(1∶400)1∶8000犬猴374*46(20) 26 608 19(1∶400)1∶8000381*94(19) 35 180 28(1∶20) 1∶8000恒河猴72643(6) 35 428 21(1∶20) 1∶800023029(10) 35 189 21(1∶20) 1∶8000非洲綠猴74 72(21) 28 141 28(1∶400)1∶8000938 102(45) 21 334 21(1∶8000) 1∶8000pigtail猴98 37(8) 21 47 21(1∶400)1∶800099 41(6) 28 59 21(1∶400)1∶8000Tamarin61628(7) 70 41 -63619(4) 7,56 30 -Squirrel猴868 90(35) 40 355 41(1∶20) 1∶20869 127(63) 40 679 35(1∶20) 1∶20Owl猴924 41(7) 35 97 21(1∶20) 1∶8000925 59(6) 49,91+ 78,199+ 21(1∶20) 1∶8000注-沒有測(cè)得抗HEV。*先前用細(xì)菌表達(dá)的HEV蛋白片段作為抗原進(jìn)行的研究[18]。+丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的生物模量(biomodal)升高。
SD=標(biāo)準(zhǔn)偏差。
pigtail短尾猿99表現(xiàn)出丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性>3SD高于接種前血清的該值,但pigtail短尾猿98則不。但是,兩只猴子在第21天都血清轉(zhuǎn)陽(yáng),而且抗HEV效價(jià)與大猩猩和舊世界猴的相當(dāng)。因?yàn)閜igtail短尾猿的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶峰值較低,所以尚不能完全排除是免疫而不是被HEV感染的可能性,總之,不可能是免疫有幾條理由。首先,在兩個(gè)只有pigtail短尾猿四分之一大但接種量相同的tamarine中沒有發(fā)現(xiàn)免疫作用。其次,眾所周知,分泌到糞便中的HEV通常很少,實(shí)驗(yàn)中所用0.5ml 10%糞便懸浮液不可能含有免疫動(dòng)物所需的足量抗原,尤其是在靜脈接種時(shí)。
本實(shí)驗(yàn)中的tamarin既沒有丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的顯著升高也沒有產(chǎn)生抗HEV(表2)。所以,這些動(dòng)物表現(xiàn)為沒有被感染。松鼠猴產(chǎn)生了抗HEV,但水平比大猩猩或舊世界猴的低得多(表2)。此外,血清轉(zhuǎn)陽(yáng)在其它動(dòng)物中出現(xiàn)得較晚。松鼠猴868在第41天血清轉(zhuǎn)陽(yáng),869在第35天轉(zhuǎn)陽(yáng)。在3個(gè)月以上的觀察期內(nèi),抗HEV效價(jià)都不超過1∶20,而且,在第47至54天達(dá)到峰值后,兩個(gè)動(dòng)物體內(nèi)的該效價(jià)都顯著降低。但是,兩動(dòng)物中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性的升高卻很明顯,而且與血清轉(zhuǎn)陽(yáng)的時(shí)間短暫相關(guān)。
owl猴子對(duì)HEV感染的應(yīng)答大致與舊世界猴的相同(表2)。兩只owl猴都在第21天血清轉(zhuǎn)陽(yáng),抗HEV效價(jià)在第28天達(dá)到1∶8000。owl猴924的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性在第35天達(dá)到峰值,但是猴925直到第49天才達(dá)到峰值。
實(shí)施例8檢測(cè)大猩猩IgM和IgG的抗HEV大約接種后4周,兩個(gè)大猩猩的血清ALT水平升高(表2,圖5)。當(dāng)ALT酶升高時(shí)或在此之前,兩個(gè)大猩猩都血清轉(zhuǎn)陽(yáng)(圖5A,5C)。還測(cè)定了大猩猩的IgM抗HEV水平。大猩猩-1374的IgM抗HEV效價(jià)(圖5B)不及IgG(圖5A)的效價(jià)高并在2周后下降。雖然該動(dòng)物的IgG和IgM抗體最早都是在第20天測(cè)得的,但此時(shí)的IgM抗HEV效價(jià)最高而IgG的則最低,IgG的效價(jià)隨后升高并在大致相同的水平上維持了3個(gè)月以上。大猩猩1375在第20日只測(cè)得IgM抗HEV(圖5D)。效價(jià)高于大猩猩1374,而且在整個(gè)過程期內(nèi)都測(cè)得IgM抗HEV。該大猩猩的IgG抗HEV最早出現(xiàn)在第27日(圖5C),在實(shí)驗(yàn)全過程中保持在大致相同的水平。
實(shí)施例9
昆蟲細(xì)胞表達(dá)的完整ORF-2蛋白ELISA與大腸桿菌表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白片段ELISA的比較為了說明與大腸桿菌表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白的片段相比,真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)HEV基因組完整ORF-2蛋白是否具有優(yōu)越性,我們用前一抗原在ELISA中對(duì)先前用細(xì)菌表達(dá)的抗原片段分析過(Tsarve,S.A.等(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89559-563;和Tsarve,S.A.等(1993),J.Infect.Dis.(1671302-1306))的犬猴血清重新進(jìn)行了測(cè)試(表3)。
表3.表達(dá)完整ORF-2的昆蟲細(xì)胞抗原ELISA與表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白片段的大腸桿菌抗原ELISA的比較犬猴來自細(xì)菌細(xì)胞的抗原 來自昆蟲細(xì)胞的抗原(部分ORF-2)*(完整ORF-2)首次測(cè)得抗HEV日 首次測(cè)得日 效價(jià) 最大效價(jià)Cyno-37628 21 1∶400 1∶8000Cyno-36954 40 1∶100 1∶8000Cyno-37419 19 1∶400 1∶8000Cyno-37526 26 1∶400 1∶8000Cyno-37921 19 1∶100 1∶8000Cyno-38128 28 1∶400 1∶8000*還用靈敏度較低的ORF-3抗原對(duì)該血清進(jìn)行了測(cè)試。
Tsarev,S.A.等(1993),J.Infect.Dis.,168369-378ELISA檢查的6只猴子中有3只,昆蟲細(xì)胞表達(dá)抗原的血清轉(zhuǎn)陽(yáng)早于大腸桿菌表達(dá)抗原。用昆蟲細(xì)胞抗原,我們能夠在全部6只猴子血清的最高稀釋度(1∶8000)測(cè)得抗HEV抗體。用大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的抗原(緬甸毒株)則沒有獲得抗HEV效價(jià)信息,因?yàn)閮H在1∶100稀釋度測(cè)試了全部血清(Tsarve,S.A.等(1992),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89559-563;和Tsarve,S.A.等(1993),J.Infect.Dis.(1671302-1306))。
在另一實(shí)驗(yàn)中,戊肝病毒SAR-55以10倍增量連續(xù)稀釋,取10-1至10-5稀釋度接種數(shù)對(duì)犬猴,測(cè)定病毒效價(jià)。通過測(cè)定血清ALT水平來檢測(cè)肝炎,用本發(fā)明ELISA法(數(shù)據(jù)見圖)或Genelab的ELISA法測(cè)定血清中抗HEV抗體(3次ELISA,分別使用抗原4-2、3-2和612中的一種,Yarbrough等,(J.Virol.,(1991)655790-5797)(圖6a-g的底端,數(shù)據(jù)以陽(yáng)性(+)測(cè)試或陰性(-)測(cè)試顯示))。所有樣品均編號(hào)接受測(cè)試。
本發(fā)明ELISA方法在全部接種犬猴和各病毒稀釋度都測(cè)得對(duì)IgG抗HEV的血清轉(zhuǎn)陽(yáng)。
相比之下,Genelab的結(jié)果則很不確定,概括如下表4.
病毒稀釋度 Genelab的ELISA 本發(fā)明ELISA10-1 未測(cè) 陽(yáng)性10-2兩個(gè)動(dòng)物都呈陽(yáng)性, 陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間有限10-3 兩動(dòng)物都呈陰性 陽(yáng)性10-4Cyno 389IgM和IgG陽(yáng)性 陽(yáng)性Cyno 388陰性 陽(yáng)性10-5 Cyno 386陰性 陽(yáng)性Cyno 385陽(yáng)性 陽(yáng)性因?yàn)镃yno 385(10-5)在Genelab和本發(fā)明的ELISA都呈陽(yáng)性,估計(jì)10-4(接種病毒多10倍)和10-3(接種病毒多100倍)也將呈陽(yáng)性。本發(fā)明將它們定為陽(yáng)性,而在Genelab的ELISA中,雖然Cyno 383和393的ALT水平都顯示有活性肝炎,但在10-4和10-3都沒有測(cè)得陽(yáng)性。所以,以上數(shù)據(jù)證明本發(fā)明ELISA方法檢測(cè)HEV的抗體優(yōu)于現(xiàn)有方法。
實(shí)施例10不同重組ORF-2抗原的ELISA的比較由HEV巴基斯坦毒株SAR-55完整ORF-2區(qū)表達(dá)的55KDa蛋白構(gòu)成,或由細(xì)菌表達(dá)的含較短ORF-2區(qū)的融合蛋白構(gòu)成如實(shí)施例3所述,如圖2A和2B所示,用含完整ORF-2的桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞表達(dá)大量不同分子量的蛋白質(zhì)。如下所述,接種后7天,從回收的5×108個(gè)SF9昆蟲細(xì)胞中部分純化分子量約55KDa的蛋白質(zhì)離心感染細(xì)胞,重懸于10ml 10mM Tris-HCl(pH8.0),50mM NaCl,含40μg/ml苯基甲基磺酰氯(Sigma,St.Louis,Missouri),超聲波裂解細(xì)胞,裂解液以90,000xg4℃離心30分鐘。上清液上樣在DEAE-瓊脂糖CL-6B層析柱(Pharmacia,Uppsala,Sweden)上,層析柱已用10mM Tris-HCl(pH8.0),50mM NaCl平衡。用上樣緩沖液洗柱,用10mM Tris-HCl(pH8.0),250mM NaCl洗脫55kDa的蛋白質(zhì)。合并含55kDa蛋白質(zhì)的流份,在10ml蛋白質(zhì)溶液中加3g(NH4)2SO4沉淀蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)沉淀溶于10mMTris-HCl(pH8.0),50mM NaCl。然后將55kDa的蛋白質(zhì)作為昆蟲表達(dá)的HEV抗原用于ELISA,與細(xì)菌表達(dá)的兩HEV抗原之一,3-2(墨西哥)(Goldsmith等(1992),Lancet,339328-331)或SG3(緬甸)(Yarbough等,(1993)戊肝診斷測(cè)試的發(fā)展,“病毒性肝炎和肝臟疾病國(guó)際學(xué)會(huì)。科學(xué)項(xiàng)目和摘要卷”TokyoVHFL,p.87,摘要#687)的ELISA相比較。這些細(xì)菌抗原是26kDa谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)與以下兩抗原之一的融合蛋白ORG-2的C末端上游6氨基酸處42氨基酸的抗原序列3-2(M)(Yarbough等,(1991),J.Virol.,655790-5797),或ORF-2的327個(gè)C末端氨基酸(Yarbough等,(1993))。ELISA如下進(jìn)行。
在聚苯乙烯微滴測(cè)試板(Dynateck,S.Windham,ME)的測(cè)試格中,60ng/格55kDa蛋白質(zhì)或200ng/格融合抗原的碳酸鹽緩沖液溶液(pH9.6)37℃孵育2小時(shí)。測(cè)試板用含10%胎牛血清和0.5%明膠的PBS封閉。用糞便稀釋液(如表5和圖7A-7J和8A-8D所示,稀釋液含10-1至10-8HEV SAR-55毒株)靜脈接種的犬猴血清樣品(注犬猴387和392經(jīng)口接種)按1∶100稀釋在封閉溶液中。1∶1000或1∶2000稀釋的過氧化物酶共軛的山羊抗人IgM(Zymed,San Francisco,CA)或1∶1000稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗人免疫球蛋白用作檢測(cè)劑抗體。
除經(jīng)口接種的犬猴387和392之外的全部ELISA測(cè)試中,在同一實(shí)驗(yàn)室同時(shí)測(cè)試55kDa抗原和融合抗原,這樣就只存在所用抗原的差異。在用55kDa抗原的抗HEV ELISA中評(píng)為陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)是光密度≥0.2,而且比同一動(dòng)物接種前血清樣品高出兩倍。此外,因?yàn)榧?xì)菌表達(dá)的兩種抗原都是與GST的融合蛋白,用這些抗原測(cè)試的樣品的光密度必須比用非融合GST獲得的光密度高出3倍才能認(rèn)為是陽(yáng)性(Goldsmith等,(1992))。
結(jié)果用10-1標(biāo)準(zhǔn)HEV糞便懸浮液接種的兩只犬猴(377和378)在接種后4至5周,ALT活性都升高,表明患上肝炎(表5,圖7A和7B)。表5.犬猴接種10-1至10-8標(biāo)準(zhǔn)SAR-55 HEV接種物儲(chǔ)備液后出現(xiàn)的生物化學(xué)和血清學(xué)現(xiàn)象概括病毒儲(chǔ)備液稀釋度 ALT 55kDa抗原接種后 融合抗原接種后測(cè)得抗HEV的周數(shù)接種前平均 峰值周 峰值 測(cè)得抗HEV的周 IgG IgM犬猴接種物 值(SD)&(U/L) IgGIgM SG33-2(M) SG33-2(M)377 10-176(39) 5 264 4-15+ 3-74-10 4-5 3-4 3-5378 10-1 50(9) 4 2854-15- -- - -394 10-2 62(14) 4 893-15 3-10- 4-6 - -395 10-2121(21) 15 3145-15- -- - -380 10-3 89(20) 1 1355-15*- 6-15 - - -383 10-3 29(8) 4 775-15 5-13-- - -389 10-4 60(7) 15 1146-15 6-8 -- - -393 10-4 41(4) 5 876-15- -- - -385 10-5 59(32) 7 56 11-15- - 7-15 - -386 10-5 31(4) 4 348-15 8-13-- - -397 10-6 60(4) 8 94 - - -- - -398 10-6 36(3) 2 55 - - -- - -399 10-7102(16) 2 93 - - -- - -400 10-7 57(4) 9 188 - - -- - -403 10-8 33(3) 2-3 49 - - -- - -406 10-8 56(4) 2 73 - - -- - -387 10-1(經(jīng)口) 32(4)4 38 - - ND- ND -392 10-1(經(jīng)口) 49(6) 3 70 - - ND- ND -&接種前血清的ALT平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)+15周后終止使用*用55kDa抗原的ELISA測(cè)試時(shí),犬猴380接種前血清的OD值是其它犬猴接種前血清平均OD值的2倍。§除犬猴387和392之外,全部ELISA都用相同的實(shí)驗(yàn)測(cè)試。-沒有測(cè)得。ND沒有進(jìn)行。
被測(cè)的3種抗原在接種后3周在犬猴377的樣品中都測(cè)得了抗HEV IgM(表5,圖8A),但在另一犬猴378的各種樣品中都沒有測(cè)得抗HEV IgM。用55kDa的ELISA在兩動(dòng)物中都測(cè)得抗HEV IgG,但用融合抗原的ELISA只在犬猴377中測(cè)得??笻EV IgG的OD值顯著高于抗HEV IgM。用55kDa獲得的ELISA值也明顯高于用兩種融合抗原中任一種所得(圖7A和7B)。兩種抗原的ELISA中的OD值模式具有顯著差異。在融合抗原的ELISA中,陽(yáng)性信號(hào)在血清轉(zhuǎn)陽(yáng)后很快達(dá)到最大值,然后在實(shí)驗(yàn)的15周中減弱。在55kDa抗原的ELISA中,陽(yáng)性信號(hào)在血清轉(zhuǎn)陽(yáng)后很快達(dá)到最大值,并在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期(15周)內(nèi)大致保持在同一水平。
標(biāo)準(zhǔn)HEV糞便懸浮液10-2稀釋液接種的兩猴(394和395)在預(yù)期的肝炎發(fā)作時(shí)ALT活性升高,幅度明顯小于用高10倍劑量接種的動(dòng)物(表5,圖7C和7D)。實(shí)際上,犬猴395在接種前和在接種后15周時(shí)的ALT活性較高。后者可能與HEV感染無關(guān)。只在犬猴394中,只有用55kDa抗原的ELISA測(cè)得微弱的抗HEV IgM陽(yáng)性(圖8B)。但是,兩個(gè)猴子都被感染,因?yàn)樵趦蓜?dòng)物中都測(cè)得抗HEV IgG血清轉(zhuǎn)陽(yáng)。在犬猴394中,用55kDa抗原最早在第3周測(cè)得抗HEV IgG,用3-2(M)抗原則遲一周測(cè)得。SG3(B)抗原在犬猴395中沒有測(cè)得血清轉(zhuǎn)陽(yáng),只有用55kDa抗原測(cè)得抗HEV IgG。在該動(dòng)物中,抗HEV效價(jià)隨時(shí)間逐漸降低。
犬猴380和383接種標(biāo)準(zhǔn)HEV糞便懸浮液的10-3稀釋液(表5,圖7E、7F、8C)。犬猴380的ALT活性在接種前后有波動(dòng),所以在該動(dòng)物中ALT活性不能用來確認(rèn)戊肝。在犬猴383中觀察到ALT活性在血清轉(zhuǎn)陽(yáng)的同時(shí)略有升高(圖7F),所以可能是野生型戊肝引起的。用三種抗原都沒有在犬猴380的血清中測(cè)得抗HEV IgM。用SG3(B)ELISA測(cè)得犬猴380 IgG抗HEV血清轉(zhuǎn)陽(yáng),而用3-2(M)抗原則沒有測(cè)得。用55kDa抗原測(cè)得該猴原先已有抗HEV IgG,但從第5周起,抗HEV IgG顯著升高(圖7E)。先前已經(jīng)報(bào)道了在另一犬猴血清中鑒定到原先已有抗體(Ticehurst等(1992)J.Infect.Dis.,165835-845;Tsarev等,(1993)J.Infect.Dis.,168369-378)。血清轉(zhuǎn)陽(yáng)在預(yù)期時(shí)刻發(fā)生,但是犬猴383樣品中的抗HEV IgG水平仍然很低,而且只能用55kDa抗原測(cè)得。
犬猴389和393接種標(biāo)準(zhǔn)HEV糞便懸浮10-4液稀釋液(表5,圖7G、7H、8D)。兩猴的ALT活性都沒有明顯升高,但是第5周在犬猴393血清中出現(xiàn)雖小但清楚的ALT峰提示臨界肝炎。用SG3(B)或3-2(M)的ELISA都認(rèn)為兩動(dòng)物為HEV感染陰性。相反,55kDa抗原在接種后6至8周在犬猴398血清中測(cè)得抗HEV IgM(圖8D),而從6至15周在兩猴中都測(cè)得抗HEV IgG。
在接種標(biāo)準(zhǔn)HEV糞便懸浮液10-5稀釋液的兩猴中都沒有測(cè)得ALT活性的升高(表5,圖7I、7J),但在犬猴386中,用55kDa抗原分別于第8至13周和8至15周測(cè)得抗HEV IgM和抗HEV IgG(圖7J,8E)。用55kDa抗原和3-2(M)抗原能夠測(cè)得犬猴385的抗HEV IgG,但是用SG3(B)抗原則不能。與過去相反,用融合抗原測(cè)得的IgG抗HEV早于55kDa抗原4周,而且水平也更高。
接種標(biāo)準(zhǔn)HEV糞便懸浮液10-6-10-8稀釋液的猴子對(duì)3種HEV抗原都沒有產(chǎn)生抗體。在這些猴子中沒有發(fā)現(xiàn)ALT活性升高,只有犬猴400第9周一個(gè)比較明顯的ALT活性峰是例外(表5)。但是,該動(dòng)物沒有血清轉(zhuǎn)陽(yáng),表明該峰可能與HEV感染無關(guān)。
至于經(jīng)口接種10%糞便懸浮液10-1稀釋液的兩個(gè)犬猴(387和392),它們都沒有被感染,因?yàn)锳LT水平?jīng)]有升高,而且用3-2(M)和55kDa抗原進(jìn)行的ELISA都沒有檢測(cè)到HEV血清轉(zhuǎn)陽(yáng)(表5)。
最后,在接種糞便懸浮液10-5稀釋液的猴子中都發(fā)現(xiàn)了HEV感染的血清學(xué)證據(jù);接受高于此稀釋度接種的猴子中都沒有該證據(jù)。在10-1接種的兩猴中發(fā)現(xiàn)以ALT升高,確認(rèn)有顯性肝炎。在用更高稀釋度糞便懸浮液接種的有些猴子中,ALT活性升高明顯較少,其它猴子則沒有升高。僅考慮這一現(xiàn)象,上述低ALT升高不能診斷為肝炎,但是,血清轉(zhuǎn)陽(yáng)和這些ALT峰的同時(shí)出現(xiàn)表明在這些猴子中存在野生型肝炎。在用10-1-10-5稀釋度的糞便懸浮液接種的猴子中都測(cè)得抗HEV IgG血清轉(zhuǎn)陽(yáng)。用更高稀釋度該儲(chǔ)備液接種的猴子則表現(xiàn)出IgG抗HEV減弱和血清轉(zhuǎn)陽(yáng)延遲的趨勢(shì)。
總之,在檢測(cè)感染HEV巴基斯坦毒株的犬猴的抗HEV IgM和IgG方面,55kDa的巴基斯坦ORF-2抗原比3-2(M)和SG3(B)都更有效。例如,除犬猴385血清之外,對(duì)各種猴子的血清來說,用55kDa抗原的ELISA檢測(cè)抗HEV IgM和IgG比用3-2(M)和SG3(B)的都更有效。55kDa ELISA檢測(cè)的結(jié)果具有內(nèi)在一致性和可重復(fù)性,可在用10-5或濃度更低糞便稀釋液接種全部10個(gè)猴子中測(cè)得IgG抗HEV。隨接種物被稀釋,ELISA信號(hào)的強(qiáng)度也減弱。融合抗原不能在成對(duì)的兩動(dòng)物之間產(chǎn)生一致的結(jié)果。在10-1、10-2、10-3或10-5接種的每對(duì)猴子中只有一只表現(xiàn)出抗HEV IgG血清轉(zhuǎn)陽(yáng),用上述抗原只在一個(gè)猴子中測(cè)得抗HEV IgM血清轉(zhuǎn)陽(yáng)。10-4原接種物接種的兩猴都沒有發(fā)生兩種融合抗原血清轉(zhuǎn)陽(yáng),雖然其中之一(犬猴393)的血清在用55kDa抗原測(cè)試時(shí)曾維持高抗HEV IgG水平。雖然,如前所述,檢測(cè)抗HEV IgM的ELISA遠(yuǎn)不如檢測(cè)犬猴抗HEV IgG的ELISA靈敏,比起3-2(M)抗原或SG3(M)抗原,55kDa抗原能夠在更多動(dòng)物中測(cè)得抗HEV IgM??傊?,在本研究中,用3-2(M)和SG3(B)ELISA的綜合數(shù)據(jù)不能得出有關(guān)巴基斯坦病毒接種物感染效價(jià)的確定結(jié)論,但是僅用55kDa巴基斯坦ELISA獲得的數(shù)據(jù)就可以。
在犬猴385中,檢測(cè)抗HEV IgG兩測(cè)試結(jié)果的差異為4周。以上數(shù)據(jù)提示,3-2(M)有一個(gè)獨(dú)特的55kDa抗原和SG3(B)抗原所沒有的為該猴識(shí)別的表位。當(dāng)用既含完整ORF-2(75kDa)蛋白又含55kDa蛋白的總昆蟲細(xì)胞裂解液作為抗原再次測(cè)試這些樣品時(shí),結(jié)果與僅用55kDa相同。這一結(jié)果顯示,55kDa蛋白質(zhì)可能具有3-2表位氨基酸,但是,實(shí)驗(yàn)所用3種抗原3-2表位序列的構(gòu)象互不相同。最后,必須指出的是,雖然SG3(B)抗原含較長(zhǎng)的部分ORF-2并包含完整的表位3-2序列,它測(cè)得的陽(yáng)性血清并不比3-2(M)抗原多。
實(shí)施例11用RT-PCR測(cè)定HEV SAR-55病毒儲(chǔ)備液的感染效價(jià)知道接種物的感染效價(jià)對(duì)于解釋動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)?zāi)P椭蝎@得的許多數(shù)據(jù)十分重要。但是,迄今還不曾有過HEV病毒儲(chǔ)備液效價(jià)的任何報(bào)道。抽提含HEVSAR-55毒株的糞便懸浮液的10倍稀釋液,進(jìn)行如下RT-PCR,測(cè)定能測(cè)得HEV基因組的最高稀釋度。
200μl糞便懸浮液與0.4ml 1.5M NaCl加15%聚乙二醇(PEG)8000混合,4℃放置過夜。在微離心機(jī)(Beckman,Palo Alto,CA)中16,000g離心3分鐘收集沉淀,溶于475μl含4.2M硫氰酸胍、0.5%N-十二烷基肌氨酸、0.2M Tris-HCl(pH8.0)、0.15M二硫蘇糖醇(DTT)和1.0μg tRNA的溶液。然后加50μl Tris-HCl(pH8.0)、100mM EDTA和10%SDS。用苯酚-氯仿(1∶1)65℃抽提RNA兩次,然后室溫氯仿抽提。上相中加250μl 7.5M乙酸銨,用0.6ml 2-丙醇沉淀核酸,75%乙醇洗滌,100%乙醇洗滌,然后用于逆轉(zhuǎn)錄(RT)PCR。
為了檢測(cè)HEV基因組,使用兩組嵌套引物,它們代表SAR-55基因組3’區(qū)(ORG-2)序列。用于逆轉(zhuǎn)錄和第一次PCR的引物是SEQ ID NO99GTATAACGGATCCACATCTC CCCTTACCTC和SEQ ID NO100TACAGATCTATACAACTTAA CAGTCGG。第二次PCR所用引物是SEQ ID NO101GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC和SEQ ID NO102TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG。RNA沉淀溶于20μl 0.05MTris-HCl(pH7.6),0.06M KCl,0.01M MgCl2,0.001M DTT,40單位RNasin(PromegaBiotec,Madison,WI),16單位禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆錄酶(Promega Biotec),和10pmol反相引物,42℃孵育1小時(shí)。在20μl逆轉(zhuǎn)錄酶混合物中加100μl 0.01MTris-HCl(pH8.4),0.05M KCl,0.0025M MgCl2,0.0002M各種dNTP,50pmol正向引物,50pmol反相引物和4單位AmpliTaq(Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT),覆蓋100μl礦物油。35輪PCR循環(huán)擴(kuò)增HEV cDNA94℃1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘。在1%瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。然后將5μl該混合物用于相同條件的第二輪擴(kuò)增,不同的是延伸時(shí)間增加至3分鐘。
在2%瓊脂糖凝膠上分離10-1至10-5(圖9)范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)HEV糞便所有稀釋液產(chǎn)生的RT-PCR產(chǎn)物,用溴乙錠染色凝膠進(jìn)行檢測(cè)。隨稀釋度升高,特異性PCR產(chǎn)物減少,能夠測(cè)得HEV基因組的10%糞便懸浮液的最高稀釋度是10-5。所以,考慮到稀釋度因素,HEV基因組的效價(jià)約106.7/g糞便。
此外,RT-PCR顯示只有含HEV基因組的稀釋液才對(duì)犬猴具有感染性。所以,標(biāo)準(zhǔn)糞便懸浮液的感染效價(jià)與RT-PCR測(cè)得的基因組效價(jià)大致相同。在一種丙肝毒株中也發(fā)現(xiàn)類似的RT-PCR與感染性效價(jià)間的關(guān)聯(lián)性。(Cristiano等,(1991),Hepatology,1451-55;Farci等,(1991)N.Engl.J.Med.,2598-104;Bukh等,(1992);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89187-191)。
實(shí)施例12用ORF-2蛋白作為疫苗的主動(dòng)免疫和用抗HEV陽(yáng)性恢復(fù)期血漿的被動(dòng)免疫在55kDa ORF-2蛋白ELISA中為HEV抗體陰性(<1∶10)的犬猴(Macacafascicularis)單獨(dú)關(guān)在BL-2生物防害(biohazard)籠中,用稀釋至含10,000或1,000CID50的含SAR-55巴基斯坦毒株的糞便懸浮液(在胎牛血清中)靜脈接種猴子。
為了研究主動(dòng)免疫,如實(shí)施例10所述在接種后7天收獲5×108個(gè)SF9細(xì)胞,從中純化桿狀病毒重組表達(dá)的55kDa ORF-2蛋白。3mg的純化55kD蛋白質(zhì)用明礬沉淀,給8只犬猴肌內(nèi)注射0.5ml含用50μg明礬沉淀的55kDa蛋白的疫苗進(jìn)行免疫。其中4只免疫一次,另4只在4周后免疫第二次。最后一次免疫后4周,通過靜脈注射1,000-10,000 CID50的HEV攻擊猴子。4只犬猴在主動(dòng)免疫研究中作為對(duì)照。犬猴412和413接受一劑空白對(duì)照劑(0.5ml磷酸鹽緩沖液),犬猴397和849接受2次空白對(duì)照劑。用1,000-10,000 CID50的HEV攻擊對(duì)照猴。
為了研究被動(dòng)免疫,用0.5ml 10%混合糞便懸浮液感染犬猴384,懸浮液中含2種中國(guó)HEV分離株、KS1-1987和KS2-1987,在恢復(fù)期反復(fù)采集血漿。(Yin等,(1993)J.Med.Virol.,41230-241;)。犬猴396和犬猴399的約1%血液和犬猴401和402的約10%血液用HEV抗體效價(jià)為1∶10,000的犬猴384的恢復(fù)期的血漿代替。輸注血漿后2天,用1000 CID50的HEV攻擊猴子。作為對(duì)照,用在感染前獲得的犬猴384的抗HEV陰性血漿代替犬猴405的10%血液。然后,用1000CID50的HEV攻擊犬猴405。
被動(dòng)和主動(dòng)免疫研究中,在接種前和接種后的15周,用穿刺針活檢進(jìn)行肝臟活檢和采集血清樣品,并收集糞便樣品。用購(gòu)得的測(cè)試盒(Metpath Inc.,Rockville,MD)測(cè)定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平,肝炎的生物化學(xué)證據(jù)定義為ALT升高2倍或以上。編號(hào)檢查肝臟活檢樣本,所用的是實(shí)施例10所述的抗HEV的ELISA。如實(shí)施例11所述抽提RNA和RT-PCR,所不同的是來自100μl血清或100μl 10%糞便懸浮液的RNA是用TRIzol試劑(Gibco BRL,Gaithersburg,Maryland)按照廠商說明抽提的。為了定量,PCR陽(yáng)性的血清或各動(dòng)物的糞便合并后以10倍增量用胎牛血清稀釋。各用100μl稀釋液如前所述抽提RNA和RT-PCR。此處所用PCR能夠測(cè)出少至10 CID50 HEV/ml血清,或少至100 CID50HEV/g糞便。
接種前5周內(nèi)和接種后15周內(nèi)每周采取的血清樣品的ALT峰值表示成比例(后/前)。將對(duì)照的幾何平均值與Simes測(cè)試的被動(dòng)免疫或主動(dòng)免疫動(dòng)物比較(Simes,R.J.(1986)Biometrika,73751-754)。
用Wilcoxon測(cè)試,將對(duì)照的(Noether,G.(1976)Elements of nonparametricstatistics(John Wiley & Sons Inc.,NewYork),pp.31-36)病毒血癥和病毒進(jìn)入糞便的時(shí)間、HEV基因組效價(jià)與被動(dòng)或主動(dòng)免疫動(dòng)物相比較。用該測(cè)試比較被動(dòng)免疫與主動(dòng)免疫動(dòng)物的上述參數(shù)。
在統(tǒng)計(jì)分析中,將1ml血清中HEV基因組少于100的血清樣品定義效價(jià)為1∶1,1g糞便中所含HEV少于10的糞便樣品定義效價(jià)為1∶10。
結(jié)果未免疫動(dòng)物中戊肝感染的過程未免疫的5個(gè)動(dòng)物中有3個(gè)在受HEV攻擊后,作為肝炎的生物化學(xué)證據(jù)的血清ALT至少升高2倍。2個(gè)動(dòng)物中沒有測(cè)得ALT活度的顯著升高。但是,組織病理學(xué)數(shù)據(jù)顯示5個(gè)動(dòng)物都患肝炎,見表6。表6.接種疫苗和對(duì)照動(dòng)物受HEV攻擊后的組織病理學(xué)、生物化學(xué)、血清學(xué)和病毒學(xué)特征動(dòng)物標(biāo)號(hào) 抗HEV陽(yáng)性 組織病理學(xué)值U/L中ALT峰值攻擊時(shí)的HEV HEV基因組血漿(%)與種類 或55kD蛋白累積 (周) 抗體效價(jià) 血清 糞便(測(cè)得周數(shù))*(μg)接種前 接種后 測(cè)得周(持續(xù)) 平均log10效價(jià)/ml 測(cè)得周(持續(xù))平均log10效價(jià)/g對(duì)照404 010+(8)67(0) 143(9) <1∶101-11(11)3 1-11(11) 5.7412 02+(1) 34(0) 45(3) <1∶10 1-4(4) 32-5(4) 7413 04+(4) 44(0) 261(6) <1∶10 2-7(6)4.7 1-7(7) 7849 01+(1) 79(-2) 133(2) <1∶10 1-4(4)3.7 1-4(4) 7397 03+(3) 52(-3) 139(7) <1∶10 2-6(5)4.7 1-7(7) 7被動(dòng)IP+396 1% 1+(1)++33(0) 53(6) 1∶40 3-5(3) 41-6(6)5.7399 1% 0(0) 69(0) 63(11)1∶40 2-4(3) 31-4(4) 440110% 0(0) 55(0) 45(5) 1∶200 3(1) 3.6 1-3(3)5.740210% 0(0) 59(0) 35(2) 1∶2004-6(3) 12-6(5)5.7主動(dòng)IP+003 50μg 0(0) 34(-3) 50(6) 1∶10.000 0 <1 2-4(3) 3009 50μg 0(0) 34(-2) 38(6)1∶1,000 0 <1 0 <2013§ 50μg 0(0) 44(-3) 36(7) 1∶100 0 <1 1-2(2) 3414 50μg 0(0) 65(0) 73(8)1∶1.000 0 <12(1) 2398 2×50μg 0(0) 31(0) 41(2) 1∶10.000 0 <1 0 <2407 2×50μg 0(0) 150(0) 213(4) 1∶10.000 0 <1 0 <2*壞死性炎癥病變定級(jí)為1+,2+,3+,4+,每周測(cè)定級(jí)數(shù)。+免疫預(yù)防。++犬猴396在2周中測(cè)得1級(jí)壞死性炎癥病變,但是它們只在第一周與病毒性肝炎有關(guān)?!欤蝗?13在攻擊后9周死亡。
壞死性炎癥1至4級(jí)中的1至2級(jí)在兩猴中都與ALT活性升高在時(shí)間上相關(guān)。
對(duì)照猴在攻擊后3至5周HEV血清轉(zhuǎn)陽(yáng),產(chǎn)生的HEV抗體最高效價(jià)為1∶1,000至1∶32,000。在感染、肝炎的嚴(yán)重程度與抗HEV應(yīng)答水平間存在良好的關(guān)聯(lián)性。肝炎累積分值最高的犬猴405病毒血癥和病毒排出的時(shí)間也最長(zhǎng),而且抗HEV水平最高(表6)。病毒進(jìn)入糞便的時(shí)間與病毒血癥相同或比之略長(zhǎng)。對(duì)全部對(duì)照來說,血清中HEV基因組效價(jià)(10-3-l0-4.7)比糞便中的(10-5.7-10-7)高。在這5個(gè)猴子中,在4至11周測(cè)得病毒血癥和病毒進(jìn)入糞便,并在血清轉(zhuǎn)陽(yáng)(2至9周)后平均4.2周被檢測(cè)到。
被動(dòng)免疫。犬猴396和399約1%的血液用抗HEV陽(yáng)性的恢復(fù)期血漿代替,在接種后2天(即攻擊時(shí)間)測(cè)定,它們的HEV抗體效價(jià)為1∶40(表6)。輸血1周后,兩猴子的HEV抗體效價(jià)都下降2倍,輸血后2周,HEV抗體下降到可測(cè)水平以下(<1∶10)。攻擊后5周再次測(cè)得犬猴396的抗HEV,攻擊后4周后再次測(cè)得犬猴399的抗HEV,結(jié)果顯示出現(xiàn)了HEV感染。攻擊后9至10周,HEV抗體效價(jià)到達(dá)最大值(1∶8000)。兩只犬猴在攻擊后都沒有表現(xiàn)出明顯的ALT活性升高。但是,在犬猴396中發(fā)現(xiàn)了肝炎的組織學(xué)證據(jù),在兩猴的血清和糞便中都測(cè)到HEV基因組(表6)。
犬猴401和402約10%的血液用恢復(fù)期血漿代替。輸血后2天進(jìn)行攻擊,兩猴的HEV抗體效價(jià)都是1∶200(表7)。表7.免疫犬猴和對(duì)照猴中HEV抗體特征對(duì)照動(dòng)物HEV抗體 被動(dòng)免疫 HEV抗體 被動(dòng)免疫HEV抗體效價(jià) 最大效價(jià)的動(dòng)物 攻擊時(shí) 最大效價(jià) 的動(dòng)物最大效價(jià)最大效價(jià)(首次最大效價(jià)(攻(測(cè)得首周)(周) 的效價(jià)(攻擊后的周數(shù)) (首次免疫后1周)免疫后1周) 擊后1周)cyno-4051∶801∶32,000 cyno-396 1∶401∶8,000 cyno-0031∶10,000 1∶10,000(3)(9) (10) (3) (5)cyno-412 1∶1001∶10,000 cyno-399 1∶401∶8,000 cyno-0091∶10,000 1∶10,000(5)(7) (9)(3) (1)cyno-413 1∶1001∶10,000 cyno-401 1∶200 1∶4,000 cyno-013 1∶100 1∶10,000(5)(7) (6) (2) (3)cyno-849 1∶1001∶1,000 cyno-402 1∶200 1∶80cyno-414 1∶1,000 1∶1,000(3)(5) (12)(3) (0)cyno-397 1∶1001∶10,000cyno-398 1∶1,000 1∶10,000 1∶10,000(3)(7) (3)(5) (0)cyno-407 1∶1,000 1∶10,0001∶10,000(4)(5) (0)
攻擊后的15周內(nèi)在兩猴中可持續(xù)測(cè)得抗HEV,犬猴401的最大效價(jià)為1∶1,4000,而犬猴402的最大效價(jià)僅為1∶80。生物化學(xué)和組織學(xué)分析都沒有在兩猴中測(cè)出肝炎,然而在兩猴中可觀察到HEV病毒血癥和糞中排毒,這表明發(fā)生了感染(表6)。所以,獲得高抗體效價(jià)的被動(dòng)免疫預(yù)防能夠在HEV攻擊后保護(hù)犬猴抵抗肝炎。
主動(dòng)免疫。50μg 55kDa蛋白質(zhì)免疫的4只靈長(zhǎng)類動(dòng)物產(chǎn)生了對(duì)重組蛋白的抗體,效價(jià)為1∶100至1∶10,000(表7)。其中一只(犬猴031)在攻擊后第9周死于麻醉事故,但包括在研究中(表6)。用抗原免疫兩次的4個(gè)動(dòng)物產(chǎn)生效價(jià)為1∶10,000的HEV抗體。其中兩只在用HEV靜脈攻擊后死亡。這也可能是因?yàn)槁樽硎鹿?,但是無法確定病因。這兩只猴子不再包括在以后的實(shí)驗(yàn)中。攻擊后剩余的6只動(dòng)物都沒有出現(xiàn)ALT水平異常升高或組織學(xué)證據(jù)(表6)。用55kDa蛋白免疫1次或2次的犬猴沒有發(fā)生病毒血癥。但是,接受1次免疫原的4只動(dòng)物中的3只在其糞便中有病毒。相反,兩次接種疫苗的兩動(dòng)物中都沒有發(fā)現(xiàn)糞中排毒。
大多數(shù)動(dòng)物主動(dòng)免疫產(chǎn)生的抗HEV抗體效價(jià)高于被動(dòng)免疫。但是,犬猴013在攻擊時(shí)的HEV抗體效價(jià)為1∶100,而用抗HEV血漿被動(dòng)免疫的兩猴的效價(jià)則為1∶200。但是,犬猴013表現(xiàn)出抗HEV感染的能力高于被動(dòng)免疫動(dòng)物。攻擊時(shí)HEV抗體效價(jià)為1∶1,000的犬猴009能夠完全抗肝炎和不受HEV感染(表6)。相反,犬猴003被感染,并將HEV排至糞便中,雖然它在攻擊時(shí)的HEV抗體效價(jià)高達(dá)1∶10,000。但是,在該猴中,肝炎和病毒血癥都沒有測(cè)得,在接受一次抗原且HEV抗體效價(jià)1∶10,000或更高的犬猴中也沒有。
對(duì)照和免疫動(dòng)物中HEV感染進(jìn)程的比較。
以組織病理血來衡量所有免疫動(dòng)物除一只被動(dòng)免疫的之外,在HEV靜脈攻擊后都抗肝炎。比較對(duì)照組、被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫動(dòng)物之間肝炎嚴(yán)重程度和病毒復(fù)制水平的平均值顯示總的說來,感染的嚴(yán)重程度與攻擊時(shí)的HEV抗體效價(jià)成反比,并按以下次序減弱非免疫>被動(dòng)免疫(1%)>被動(dòng)免疫(10%)>主動(dòng)免疫(1劑)>主動(dòng)免疫(2劑)(表6,8)。但是,被動(dòng)和主動(dòng)免疫兩亞組每組的動(dòng)物數(shù)量不足以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所以,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析是將合并的被動(dòng)免疫組和合并的主動(dòng)免疫組進(jìn)行的分別與合并的對(duì)照組進(jìn)行比較。分析結(jié)果見表8。表8對(duì)照和免疫動(dòng)物的HEV感染平均值

GM*幾何平均值+被動(dòng)和主動(dòng)免疫預(yù)防αP<0.01βP<0.05γ不明顯對(duì)照組的組織病理學(xué)分值和組織變化與被動(dòng)免疫或主動(dòng)免疫動(dòng)物相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。相比被動(dòng)或主動(dòng)免疫動(dòng)物,對(duì)照組更高的ALT峰值接種前后之比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,表明兩種免疫動(dòng)物組都具有抗肝炎生物化學(xué)表現(xiàn)的保護(hù)作用。兩免疫動(dòng)物組的病毒血癥持續(xù)時(shí)間和糞便中HEV效價(jià)顯著低于對(duì)照組。但是,血清中病毒清除時(shí)間和HEV效價(jià)在對(duì)照組和被動(dòng)免疫組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是對(duì)照組的這些參數(shù)與主動(dòng)免疫組相比則有顯著差別。病毒血癥和糞便排毒時(shí)間以及HEV效價(jià)在主動(dòng)和被動(dòng)免疫動(dòng)物組織也有顯著差異。
總之,表6至8結(jié)果顯示被動(dòng)和主動(dòng)獲取HEV抗體都保護(hù)犬猴抵抗以后病毒性HEV攻擊所致的肝炎。雖然在用1,000-10,000 CID50的SAR-55攻擊時(shí)5個(gè)非免疫犬猴都出現(xiàn)肝炎組織學(xué)證據(jù),但是兩個(gè)被動(dòng)獲得1∶200效價(jià)抗體的猴子都沒有發(fā)生肝炎,而且抗體效價(jià)低達(dá)1∶40的兩猴之一也沒有發(fā)生肝炎。
但是,必須指出的是與被動(dòng)免疫動(dòng)物相比,主動(dòng)免疫動(dòng)物表現(xiàn)出抗肝炎的完全保護(hù)作用且抗HEV感染更有效。例如,與被動(dòng)免疫動(dòng)物的結(jié)果比較,主動(dòng)免疫動(dòng)物在受HEV攻擊后沒有發(fā)生病毒血癥。在用重組55kDa蛋白免疫1次或2次后,犬猴中的HEV抗體效價(jià)可高達(dá)1∶10,000。雖然1只猴子(013)在主動(dòng)免疫后的效價(jià)為1∶100,但是這一水平仍然可防肝炎和病毒血癥。
主動(dòng)免疫研究還顯示,雖然單劑疫苗能夠防止HEV病毒血癥,但糞便中仍有病毒排入。但是,2劑疫苗則完全防止了肝炎和HEV感染的全部表征。以上數(shù)據(jù)顯示,給予1劑疫苗,例如在出境旅游之前,能夠在戊肝高危環(huán)境中保護(hù)個(gè)體。
最后必須指出的是,以上結(jié)果與過去報(bào)道的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物被動(dòng)免疫和主動(dòng)免疫預(yù)防甲肝結(jié)果十分相似報(bào)道免疫預(yù)防可防肝炎但不防感染,而疫苗接種則不僅防肝炎而且防HAV感染(Purcell,R.H.等(1992),Vaccine,105148-5149)。有意義的是,在測(cè)定保護(hù)性抗體效價(jià)(<1∶100)和活病毒靜脈攻擊后的結(jié)果方面,本發(fā)明的HEV免疫預(yù)防研究都與過去HAV免疫預(yù)防研究相似。既然其它研究已經(jīng)顯示了被動(dòng)和主動(dòng)獲得的抗HAV類似效價(jià)對(duì)人的效果,并證實(shí)了在肝炎研究方面靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究的預(yù)計(jì)性價(jià)值(Stapleton,J.等(1985)Gastoenterology 89637-642;Innes,B.L.(1992)Vaccine,10S159),所以此處犬猴中的結(jié)果很可能預(yù)示了對(duì)人的保護(hù)作用。
實(shí)施例13完整ORF-2蛋白和低分子量片段的在酵母中直接表達(dá)用質(zhì)粒P63-2為模板,用以下合成寡核苷酸
SEQ ID NO.103(反向引物#1703)GCACAACCTA GGTTACTATAACTCCCGAGT TTTACC;SEQ ID NO.104(正向引物#1778)GGGTTCCCTAGGATGCGCCC TCGGCCTATT TTG;SEQ ID NO.105(正向引物#1779)CGTGGGCCTA GGAGCGGCGG TTCCGGCGGT GGT;SEQ ID NO.106(正向引物#1780)GCTTGGCCTA GGCAGGCCCA GCGCCCCGCC GCT;SEQ IDNO.107(正向引物#1781)CCGCCACCTA GGGATGTTGA CTCCCGCGGCGCC;PCR制備4段cDNA ORF-2片段,分別編碼完整ORF-2蛋白(aa1-660,MW70979),片段1778-1703。(片段編號(hào)為后文給出的引物編號(hào))第34aa開始的ORF-2蛋白(aa34-660,MW67206),片段1779-1703。
第96aa開始的ORF-2蛋白(aa96-660,MW60782),片段1780-1703。
第124aa開始的ORF-2蛋白(aa124-660,MW58050),片段1781-1703。
SEQ ID NO.103-107在5’端4個(gè)核苷酸之后都具有人造序列CCTAGG。這段人造序列由Avr II(Bln I)限制性酶識(shí)別。用BlnI剪切PCR合成片段,克隆到pPIC9載體(Invitrogen)的Avr II位點(diǎn)(圖10)。用限制性酶切分析,用ORF-2序列和載體中的不對(duì)稱EcoRI位點(diǎn)來驗(yàn)證片段方向正確。按照Invitrogen程序,純化以下重組質(zhì)粒pPIC9-1778(含片段1778-1703);pPIC9-1779(含片段1779-1703);pPIC9-1780(含片段1780-1703);pPIC9-1781(含片段1781-1703),轉(zhuǎn)化酵母(Picha株)原生質(zhì)球。以同一程序篩選重組克隆并分析表達(dá)。表達(dá)出的蛋白可用作疫苗中的免疫原或本發(fā)明免疫實(shí)驗(yàn)中的抗原。最后,本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn),以上實(shí)施例所用的載體和酵母株可換用它載體(例如,pHIL-F1;Invitrogen)或酵母株(例如,釀酒酵母)。
實(shí)施例14對(duì)重組桿狀病毒63-2-IV-2感染的SF-9昆蟲細(xì)胞合成的HEV ORF-2基因產(chǎn)物的純化和氨基酸末端序列分析如實(shí)施例10所述,用重組桿狀病毒63-2-IV-2感染SF-9細(xì)胞,接種后7天收獲。昆蟲細(xì)胞裂解液在SDS-PAGE上的主條帶蛋白分子量約55kDa。用DEAE瓊脂糖離子交換層析柱,150-450mM NaCl梯度,進(jìn)一步純化該55kDa條帶。用SDS-PAGE再用考馬斯藍(lán)染色,檢測(cè)DEAE流分中有55kDa條帶。然后用無SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳將層析峰流份區(qū)分成55kDa、61kDa和中間分子量3條條帶。對(duì)聚丙烯酰胺凝膠上各蛋白帶的氨基末端蛋白微測(cè)序(microprotein)顯示55和61kDa蛋白都有一段獨(dú)特的SEQ ID NO.2中Ala-122處的N末端。這兩種ORF-2剪切產(chǎn)物的大小差異被認(rèn)為反映了大產(chǎn)物COOH-末端的兩種不同剪切。
聚丙烯酰胺凝膠上的第三種中等蛋白經(jīng)證實(shí)為桿狀病毒幾丁質(zhì)酶蛋白。對(duì)DEAE峰流份進(jìn)行反向HPLC,用微孔系統(tǒng),NaCl和乙腈溶劑,將55和61kDa的ORF-2蛋白分離成無任何幾丁質(zhì)酶的對(duì)稱單峰。
實(shí)施例1555和61kDa剪切產(chǎn)物的直接表達(dá)以p63-2為模板,PCR獲取自氨基酸112開始(ORF-2的氨基酸112-660)的編碼ORF-2蛋白的cDNA ORF-2片段。然后將該片段插入pBlueBac-3轉(zhuǎn)移載體內(nèi)的BamHI-PstI位點(diǎn)。用該載體形成的重組桿狀病毒感染SF9昆蟲細(xì)胞。用考馬斯藍(lán)染色聚丙烯酰胺凝膠分析昆蟲細(xì)胞裂解液中有否55 kDa和61kDa的ORF-2蛋白。直接表達(dá)的蛋白可用作疫苗中的免疫原和本發(fā)明免疫試驗(yàn)中的抗原。
實(shí)施例16HEV ORF-2蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的動(dòng)力學(xué)測(cè)定全長(zhǎng)和截短HEV ORF-2(巴基斯坦毒株)在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)動(dòng)力學(xué)和純化。本實(shí)施例所述72和63kDa的ORF-2蛋白分別相同于實(shí)施例3和14所述的74和61kDa蛋白;分子量差異符合通過凝膠電泳遷移率測(cè)定分子量時(shí)公稱偏差小范圍Cell culture。Spodoptera frugiperda細(xì)胞,9號(hào)克隆(Sf-9)單層培養(yǎng)以進(jìn)行噬斑試驗(yàn)和轉(zhuǎn)染,振蕩懸浮培養(yǎng)物用于病毒感染產(chǎn)生高效價(jià)病毒儲(chǔ)備液和重組蛋白。Sf-9細(xì)胞維持在28℃,150rpm,Sf-900 II無血清培養(yǎng)基(SFM)(Life Technologies,Inc.,Gaithersburg,MD),干燥培養(yǎng)箱中,從起始密度0.2×106個(gè)細(xì)胞/ml開始,傳代達(dá)70次,至最終密度1.0×107個(gè)細(xì)胞/ml。
病毒感染。
重組Autographa californica多核多角體桿狀病毒(AcMNPV)以低感染復(fù)數(shù)(MOI0.01)在Sf-9細(xì)胞(0.2×106個(gè)細(xì)胞/ml)傳代。為產(chǎn)生重組蛋白,在MOI=5時(shí)啟動(dòng)病毒感染,持續(xù)4天,直至活度<10%。在6格測(cè)試板上用鋪滿率75%的Sf-9細(xì)胞單層以標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行瓊脂糖噬斑試驗(yàn)。
重組桿狀病毒的構(gòu)建。
在Sf-9細(xì)胞內(nèi)用標(biāo)準(zhǔn)同源重組法構(gòu)建含全長(zhǎng)(bHEV ORF2 fl)和5’截短(bHEVORF2 5’tr)缺省HEV ORF-2(巴基斯坦毒株)的重組桿狀病毒(圖11)。用桿粒載體構(gòu)建含5’-3’截短缺省HEV ORF-2的重組桿狀病毒(Luckow,V.A.等,(1993)J.Virol.,674566-4579)寡核苷酸引物)和HEV-140(5’-TTCGGATCCA TGGCGGTCGC TCCGGCC-3’)(SEQ ID NO.108)和HEV-141(5’-TCAAGCTTAT CATCATAGCACAGAGTGGGG GGC-3’)(SEQ ID NO.109)用于將一段1512bp的PCR產(chǎn)生的DNA片段(p61.2內(nèi),編碼HEV ORF2的氨基酸112至607,帶自己的ATG翻譯起始密碼子和多個(gè)終止密碼子)用T/A PCR克隆到pCR2.1(InVitrogen,San Diego,CA)。含HEV ORF2 DNA序列的一段1520bp BamHI-EcoRI DNA片段插入桿狀病毒供體質(zhì)粒pFASTBAC-1(Life Technologies,Inc.)內(nèi)ploh基因座中ploh啟動(dòng)子下游。用陽(yáng)離子脂質(zhì)體CELLFECTIN(Life Technologies,Inc.)從重組桿粒DNA感染的Sf-9細(xì)胞中分離出含HEV ORF2 DNA的重組桿狀病毒。篩選經(jīng)噬斑純化病毒分離株的HEV ORF2 DNA插入片段完整性和昆蟲細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá),并擴(kuò)展為一個(gè)主要病毒種子庫(kù),命名為bHEV ORF5’-3’tr病毒。
感染細(xì)胞和上清液的處理。
在指定時(shí)間500×g,4℃離心5分鐘回收感染細(xì)胞和培養(yǎng)基清液,并處理獲取重組HEV ORF2蛋白。制備細(xì)胞裂解液2ml/mg細(xì)胞沉淀重懸于裂解緩沖液(0.5%NP-40,50mM Tris-HCl,pH8.0,2mM EDTA),補(bǔ)充新鮮抑蛋白酶肽至0.2mg/ml的最終濃度,略微攪拌,冰上孵育20分鐘。3000×g,4℃低速離心15分鐘沉淀細(xì)胞核,收集細(xì)胞質(zhì)用作細(xì)胞裂解原液。用Sorvall SS34離心機(jī),12,000×g,4℃離心60分鐘澄清感染細(xì)胞清液和細(xì)胞裂解液。
HEV ORF2蛋白產(chǎn)物純化。
分別從澄清的桿狀病毒感染細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基清液中純化重組HEV ORF2蛋白。用上樣緩沖液(50mM Tris-HCl,pH8.0,10mM NaCl)1∶10稀釋細(xì)胞裂解原液。
澄清的感染細(xì)胞清液在Amicon Proflux M-12超濾系統(tǒng)上,用螺旋環(huán)繞纖維素超濾柱(SlY10;1平方英寸;截留分子量10,000;Amicon,Beverly,MA),循環(huán)速度4L/分鐘,跨膜壓力20psi,切向流超濾濃縮10倍。用4體積上樣緩沖液透析濃縮清液。
透析液或裂解原液(1.5床層體積)上樣在Q瓊脂糖快速?gòu)?qiáng)離子交換柱(XK50柱,5.0×7.5cm,150ml;Pharmacia Piscataway,NJ)上,流速為5.0ml/min。先用1.0床層體積上樣緩沖液以5ml/min流速洗柱,接著用1.0床層體積上樣緩沖液以20ml/min流速洗柱。用10至300mM NaCI連續(xù)線性梯度的6.5床層體積相同緩沖液,20ml/min流速洗脫蛋白質(zhì)。
取10μl Q瓊脂糖層析柱峰蛋白流份用SDS-PAGE鑒定是否HEV ORF2(+)蛋白流份。合并(+)流份,用瓊脂糖G-25(Pharmacia)和上樣緩沖液凝膠過濾脫鹽。收集峰蛋白流份,上樣在Source 15Q高效強(qiáng)離子交換柱上離析各HEV ORF2多肽。用與Q瓊脂糖液體層析相同的方法洗柱和洗脫。如前所述合并HEV ORF2蛋白(+)流份進(jìn)行鑒定,合并,在Sephacryl S-200柱(Pharmacia)上用上樣緩沖液進(jìn)行凝膠過濾最后純化蛋白質(zhì)。如下所述用SDS-PAGE和Western印跡試驗(yàn)鑒定HEV ORF2流份。
用BAC/Pierce蛋白微試驗(yàn)60℃測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,以牛血清白蛋白作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物。所有層析都用配有Millenniun2021過程控制和檢測(cè)軟件的Waters 600E層析工作站系統(tǒng)(Medford,MA)進(jìn)行。用AccuMet20電導(dǎo)測(cè)定儀測(cè)定緩沖液的電導(dǎo)。用Corning 220 pH計(jì)測(cè)定緩沖液的pH。所有緩沖組份都是USP或分子生物學(xué)級(jí)原料。
SDS-PAGE,和Western印跡試驗(yàn)用蛋白變性樣品緩沖液(126mM Tris-HCl,pH6.8,5%β巰基乙醇,20%乙二醇,2%SDS和0.005%溴酚藍(lán))將蛋白質(zhì)稀釋2倍,99℃變性5分鐘。變性樣品在8-16%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝膠(NOVEX)上(Laemmli,U.K.等(1970)Nature227680-685)上電泳。根據(jù)生產(chǎn)商的說明,用膠體考馬斯藍(lán)染色溶液染色蛋白凝膠來顯示蛋白質(zhì)(NOVEX,San Diego,CA)。
用電印跡技術(shù)(Tsarev,S.A.等(1993)J.Inf.Dis.,168369-378)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF薄膜上。層析檢測(cè)HEV ORF2蛋白結(jié)合第一抗血清(大猩猩多克隆α-HEV;1∶500),再結(jié)合第二抗血清(與堿性磷酸酶共軛的山羊α-人IgG2(1∶5000;LifeTechnologies,Inc.))。用NBT/BCIP(Life Technologies,Inc.)作為生色底物。
氨基末端序列分析用Laemmli緩沖系統(tǒng)(Laemmli,U.K.等(1970)Nature 227680-685),在SDS存在下,聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)。按照生產(chǎn)商的說明,將蛋白質(zhì)從凝膠上電泳轉(zhuǎn)移到Pro Blot膜(Applied Biosystems,F(xiàn)oster City,CA)上??捡R斯藍(lán)染色顯示蛋白質(zhì),切取63kDa和55kDa的HEV ORF2蛋白,用配有聯(lián)機(jī)(on-line)PTH分析儀的Applied Biosystems 473型氣體/脈沖-液相蛋白測(cè)序儀分析氨基末端序列。
內(nèi)部氨基酸序列分析如上電泳蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,Ponceau S染色顯現(xiàn)。從膜上切取相關(guān)條帶,處理,按Abersold等的方法進(jìn)行原位Lys C蛋白酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)消化(Abersold,R.H.等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846970-6974)。用Waters Associates(Medford,MA)高壓液相層析系統(tǒng)和Vydac C4(Hesperia,CA)反向柱分離Lys C產(chǎn)生的片段。用AppliedBiosystems 477A型蛋白測(cè)序儀和120A型聯(lián)機(jī)PTH分析儀測(cè)定分離肽的氨基酸序列。
氨基酸序列分析6N Hcl 150℃汽相水解1小時(shí)后用Waters Pico Tag工作站分析上述Lys C產(chǎn)生片段的氨基酸組成。用異硫氰酸苯酯(PTC)衍生氨基酸,用Waters Pico Tag氨基酸分析系統(tǒng)分離和定量所得的PTC氨基酸。
羧基末端序列分析用固定化羧基肽酶Y(Pierce,Rockford,IL)從55kDa HEV蛋白羧基末端開始依次釋放氨基酸。800μl 0.05mM乙酸鈉緩沖液pH5.5中約150μg蛋白質(zhì)與200μl樹脂懸浮液在37℃混合。在0、5、15、30、60、90和120分鐘取多份清液(100μl)。最后一份在第16小時(shí)采集。真空干燥樣品,如上所述,但不水解,進(jìn)行氨基酸分析。
質(zhì)譜用配有一個(gè)大氣壓連接(articulated)離子噴霧源的Perkin-Elmer Sciex API-III三相四極(triple stage quadrupole mass spectrometer)質(zhì)譜儀(Foster City,CA)測(cè)定純化蛋白的質(zhì)譜。高純氮?dú)饧茸鳛殪F化氣(操作壓力=0.5MPa),又作為簾氣(流速=0.8I/min)。氬氣以3×1015原子/cm2的沖擊氣量用作目標(biāo)氣體。用HarvordApparatus 11型針筒泵(Southnatick,MA)以50μl/ml直接注射1∶200稀釋于移動(dòng)相中的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液獲得質(zhì)譜掃描范圍mIz 100-1500正離子。以1.0秒的間隔集取質(zhì)譜。毛細(xì)管電壓維持在2kV和60℃。
檢測(cè)HEV ORF2基因產(chǎn)物的臨時(shí)表達(dá)來鑒定加工后重組HEV蛋白。懸浮培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中的Sf-9昆蟲細(xì)胞用編碼全長(zhǎng)戊肝病毒(巴基斯坦株)衣殼基因的桿狀病毒感染(圖11)。從病毒感染起連續(xù)4天每日收集細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基清液。HEV細(xì)胞裂解液的SDS-PAGE和Western印跡分析結(jié)果顯示有一種HEVORF2 72kDa蛋白存在于感染后(p.i.)第1天但隨后消失(圖12)。p.i.第2天,感染細(xì)胞內(nèi)有63 kDa和55kDa的HEV蛋白。p.i.第3天,感染細(xì)胞內(nèi)主要是55kDa的HEV蛋白(圖12)。感染后第2至4日豐富的63kDa至65kDa蛋白經(jīng)鑒定是桿狀病毒幾丁質(zhì)酶而不是HEV 63kDa蛋白。早在p.i.第1天就有53kDa的蛋白分泌到感染細(xì)胞培養(yǎng)基清液中,在p.i.第3天達(dá)到最多。以上結(jié)果顯示,原72kDa的HEV蛋白被蛋白酶隨機(jī)剪切產(chǎn)生最終的55kDa(細(xì)胞裂解液)和53kDa(培養(yǎng)基)HEV蛋白產(chǎn)物。
HEV蛋白質(zhì)純化在p.i.第4天收獲重組bHEV ORF2全長(zhǎng)(fl)病毒或截短病毒感染的Sf-9細(xì)胞,經(jīng)NP-40裂解產(chǎn)生的細(xì)胞裂解液,用陰離子交換層析和凝膠過濾從中分離重組HEV 63kDa和55kDa蛋白。從收獲的病毒感染培養(yǎng)基清液中純化53kDa的分泌蛋白,培養(yǎng)基清液事先離心澄清并經(jīng)切向流超濾濃縮10倍。將5’雙重travented結(jié)構(gòu)感染細(xì)胞的細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基清液濃縮液用Q上樣緩沖液(50mM Tris-HCl,pH8.0,10mM NaCl)稀釋10倍并透析。平衡的細(xì)胞裂解液(55kDa蛋白)和培養(yǎng)基清液(53kDa蛋白)分開上樣在Q瓊脂糖快速?gòu)?qiáng)陰離子交換柱上。HEV 55kDa蛋白被結(jié)合,在140mM NaCl的離子強(qiáng)度被洗脫(圖13A)。合并層析后細(xì)胞裂解液和清液的HEV蛋白流份,經(jīng)過Sephacryl G-25柱脫鹽,用SOURE 15Q強(qiáng)陰離子高效柱進(jìn)行第二次陰離子交換層析。HEV蛋白被結(jié)合,然后在140mM NaCl時(shí)洗脫(圖13B)。合并HEV蛋白峰流份,用Sephacryl S200柱(圖13C)凝膠過濾分離。對(duì)55kDa蛋白流份的SDS-PAGE和Western印跡分析顯示該55kDa蛋白來自HEV(圖14,下分圖)。據(jù)考馬斯藍(lán)染色的蛋白凝膠估計(jì),該55kDa蛋白的純度為99%或更高(圖14,上分圖)。
氨基末端序列分析為了確定bHEV感染昆蟲細(xì)胞期間測(cè)得的重組HEV 63kDa和55kDa蛋白的氨基末端進(jìn)行了氨基末端的氨基酸序列分析。bHEV ORF2 fl病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞,p.i.第2天收獲細(xì)胞,細(xì)胞裂解液稀釋后上樣在Q瓊脂糖快速柱上,合并從柱上洗脫的HEV蛋白流份。在140mM NaCl時(shí)從Q峰中純化得到兩種蛋白,比例為1∶20(63kDa∶55kDa)。從ProBlot膜上切取HEV 63kDa和55kDa蛋白條帶,20輪直接Edman降解得到相同的氨基酸序列(表9)。
表9.純化自細(xì)胞裂解液的重組HEV 63 SEQ ID NO.110和HEV 55 SEQ ID NO.111蛋白質(zhì)氨基末端的氨基酸序列分析

該序列對(duì)應(yīng)于HEV基因組開放讀碼框2的殘基112至131。以上結(jié)果顯示兩種免疫活性蛋白質(zhì)表觀分子量差異是羧基末端截?cái)嘣斐傻摹?br> 內(nèi)部氨基酸序列分析為了進(jìn)一步測(cè)定重組HEV63和55kDa蛋白的相同性,進(jìn)行肽酶消化和分離。用Lys C蛋白酶消化純化的55kDa HEV蛋白,因?yàn)樵撁讣羟匈嚢彼狒然┒说膶R恍员徽J(rèn)為比胰蛋白酶更適合由55kDa HEV蛋白產(chǎn)生肽和測(cè)定氨基酸序列。圖15顯示Lys C消化產(chǎn)生的肽特征。
取洗脫峰分析氨基酸序列。重組HEV ORF2 55kDa蛋白內(nèi)部肽的氨基酸序列與預(yù)計(jì)的HEV ORF2(巴基斯坦株)氨基酸序列一致。沒有發(fā)現(xiàn)含HEV ORF2內(nèi)607至670氨基酸序列的肽。特別有意義的是流份24,其52輪循環(huán)明顯對(duì)應(yīng)于HEVORF2內(nèi)氨基酸殘基554至606。沒有發(fā)現(xiàn)第53和55輪(殘基606和608)時(shí)PTH亮氨酸的增加,雖然在第54輪循環(huán)時(shí)觀察到PTH丙氨酸的增加。因?yàn)樵谖覀兊膶?shí)驗(yàn)室中超過50個(gè)氨基酸殘基的可讀氨基酸序列并不常見,所以不能確定未獲得另外的序列數(shù)據(jù)是因?yàn)榈竭_(dá)肽末端(蛋白質(zhì)的羧基末端)導(dǎo)致信號(hào)丟失還是因?yàn)镋dman chemistry的失讀。所以需要用其它方法來測(cè)定重組HEV ORF2 55kDa蛋白的羧基末端。
氨基酸組成分析確定Lys C消化流份24中有否重組HEV ORF2 55kDa蛋白內(nèi)氨基酸606至608的另一種方法是分析肽的氨基酸組成。對(duì)一份流份24氨基酸序列分析的結(jié)果見表10。
表10.Lys C消化的55kDa蛋白的流份24的氨基酸組成分析


以上分析顯示未能獲得54輪(殘基607)以后的氨基酸序列數(shù)據(jù)是因?yàn)榘被釡y(cè)序已經(jīng)到達(dá)55kDa蛋白的羧基末端。該結(jié)果與肽終止于亮氨酸607一致。雖然該分析包含其它微小變化,但是它清楚地表明肽在超過HEV ORF2內(nèi)前一賴氨酸(殘基600)后完全終止。
羧基末端序列分析測(cè)定重組HEV ORF2 55kDa蛋白質(zhì)羧基末端的另一種方法是用羧基肽酶消化55kDa蛋白后的羧基末端氨基酸分析。用固定化羧基肽酶Y孵育一定的時(shí)間,對(duì)期間釋放的游離氨基酸的氨基酸分析顯示亮氨酸迅速增加,然后是纈氨酸、絲氨酸和組氨酸(圖16)。未發(fā)現(xiàn)其它氨基酸的明顯增加。該結(jié)果證實(shí)重組HEV ORF255kDa蛋白的羧基末端是亮氨酸607。
質(zhì)譜分析根據(jù)HEV ORF2(巴基斯坦株)的核苷酸序列,預(yù)計(jì)HEV 55kDa蛋白(HEVORF2的氨基酸112至607)的分子量為53kDa。為了獲得該肽的實(shí)際質(zhì)量,進(jìn)行純化重組HEV 55kDa蛋白的電噴質(zhì)譜分析。數(shù)輪MS測(cè)定的結(jié)果為蛋白純制劑中只有一種分子量約56,000Da的多肽(圖17)。因?yàn)橘|(zhì)譜的精確度為0.01%,所以證實(shí)了55kDa蛋白是N末端和C末端蛋白酶剪切產(chǎn)生的這一結(jié)論。
昆蟲細(xì)胞內(nèi)HEV ORF2截短蛋白表達(dá)動(dòng)力學(xué)為了確定在HEV ORF2氨基和/或羧基末端缺失的原蛋白是否能在昆蟲細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定而高水平地表達(dá),將HEV ORF2的5’和5’-3’截短缺失突變體克隆到桿狀病毒載體內(nèi)。bHEV ORF2 5’tr和bHEV ORF2 5’-3’tr病毒感染的結(jié)果顯示63和55kDa的蛋白質(zhì)都在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖18)。但是,到p.i.第3天時(shí),55kDa kDa蛋白在bHEV ORF2 5’tr感染細(xì)胞內(nèi)的豐度高出50倍以上,而在ORF2 5’-3’tr感染細(xì)胞內(nèi)是唯一的。兩種病毒感染后第一天,53kDa蛋白還分泌到培養(yǎng)基清液中,并在p.i.第3天達(dá)到最大值。ORF2 5’-3’tr病毒感染的昆蟲細(xì)胞內(nèi)53kDa分泌蛋白的豐度比ORF2 5’tr病毒感染的細(xì)胞內(nèi)高20倍。根據(jù)前文純化步驟,從兩種病毒感染的細(xì)胞裂解液中純化到55kDa蛋白,從培養(yǎng)基清液中純化到53kDa蛋白。已經(jīng)確定,53kDa分泌蛋白的氨基末端和羧基末端為HEV ORF2的氨基酸112和578,而且53kDa蛋白在ELISA中表現(xiàn)出抗原性。53kDa蛋白的預(yù)計(jì)分子量是50kDa,但質(zhì)譜顯示其分子量約為53kDa。
實(shí)施例17HEV ORF2 3’蛋白酶剪切突變病毒表11.用標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變技術(shù)由bHEV ORF2 fl產(chǎn)生HEV ORF2 3’蛋白酶剪切突變病毒,該病毒感染的Sf-9昆蟲細(xì)胞內(nèi)HEV ORF2基因的表達(dá)<

1感染后第24小時(shí)收獲的病毒感染2感染后第48小時(shí)收獲的病毒感染另用含AUU密碼子和相鄰核苷酸的寡核苷酸引物在112-607bHEV的氨基酸578處(HEV ORF2巴基斯坦株)進(jìn)行PCR定點(diǎn)誘變,以異亮氨酸代替第578位精氨酸。112-607bHEV的其它突變體還包括以甘氨酸、絲氨酸或谷氨酸代替第578位精氨酸。如前所述,用含有產(chǎn)生所需氨基酸改變的密碼子的寡核苷酸構(gòu)建這些突變體。據(jù)信,112-607bHEV突變體將推動(dòng)HEV ORF2蛋白生產(chǎn)平衡向單一蛋白移動(dòng)。
實(shí)施例18Phesus恒河猴內(nèi)的疫苗研究靈長(zhǎng)類動(dòng)物。本研究使用32只在靈敏ELISA(Tsarev SA.等,J.InfectDis.(1993);89369-78)中呈HEV抗體(抗HEV)陰性(<1.10)的恒河猴(Macaccamulatta)。
HEV攻擊儲(chǔ)備液。以巴基斯坦HEV毒株SAR-55(Iqbal M.等,J.Trop.Med.Hyg.1989;40,438-443)(人糞便)或墨西哥HEV毒株Mex-14(Velazquez O.等,JAMA(1990);2633281-5)(猴糞便,CDC提供)作為攻擊病毒源。稀釋含巴基斯坦或墨西哥HEV毒株的糞便懸浮液(懸浮于犬猴(Macacca fascicularis)血清陰性血清)至含有10,000猴感染劑量(MID50),用于給動(dòng)物靜脈接種。
用于免疫的接種物。從被含完整ORF2的重組桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中純化55kDa的ORF2蛋白(Tsarev SA等,戊肝預(yù)防的前景腸道傳染肝炎病毒(Y.Buisson,P.Coursaget,M.Kane編輯)。La Simmarre,Joueles-Tours,F(xiàn)rance,(1996)p.373-383),明礬沉淀(Tsarev SA等,Proc.Natl.Acad.Sic.USA,(1994);19110189-202)。根據(jù)ELISA測(cè)定殘留可溶性抗原的結(jié)果,沉淀率高于99%。蛋白-明礬復(fù)合物在4℃保存至多1年。
接種方案給恒河猴靜肌內(nèi)注射0.5ml含50μg、10μg、2μg或0.4μg明礬沉淀55kDa蛋白的疫苗。以一個(gè)月為間隔進(jìn)行兩次接種。其它猴子注射沒有重組蛋白的明礬懸浮液(空白劑)0.5ml。
對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的觀測(cè)接種前和接種后15周中的每一周用透皮針進(jìn)行肝臟活組織檢查獲取血清樣品和糞便樣品。用市售測(cè)試試劑盒(Metpath Inc.,Rochville,MD)測(cè)定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平。肝炎的生物化學(xué)表征為ALT的接種后/前之比升高2倍或以上。如(Tsarev S.A.等Proc.Natl.Acad.Sic.USA,(1994)19110189-202)所述進(jìn)行肝臟活檢和組織病理學(xué)測(cè)評(píng)。對(duì)動(dòng)物進(jìn)盲法臨床評(píng)價(jià)。如(Tsarev S.A.等Proc.Natl.Acad.Sic.USA,(1994)19110189-202)所述進(jìn)行抗HEV ELISA和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。為了定量,合并各動(dòng)物連續(xù)的PCR陽(yáng)性血清或糞便,以10倍增量稀釋于牛血清。用100μl各稀釋液抽提RNA和進(jìn)行RT-PCR。本研究所用PCR方法可測(cè)得低至10MID50HEV/ml血清和低至100MID50/g糞便。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用Student T測(cè)試(Student T-test)成對(duì)比較空白組和接觸后接種組,以及空白組和異源病毒攻擊組肝炎和HEV感染的定量參數(shù)。用Dunnett測(cè)試進(jìn)行空白組與不同劑量重組疫苗接種組之間的多重比較(multiple comparison)。用Tukley多項(xiàng)測(cè)試比較不同劑量接種動(dòng)物在攻擊時(shí)的抗HEV效價(jià)。
為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,規(guī)定每ml血清少于10個(gè)HEV基因組的血清樣品的效價(jià)為1∶1,每g糞便少于100個(gè)HEV基因組的糞便樣品效價(jià)為1∶10。
結(jié)果僅接種明礬,受HEV SAR-55毒株攻擊的4只獼猴都患上肝炎這些動(dòng)物的前后峰ALT之比明顯高于臨界值2.0,在3.1至10.6之間(表12)。
表12以同源病毒攻擊前接種空白或不同量重組HEV ORF2蛋白的恒河猴內(nèi)的HEV感染接種(Sar-55 ORF2蛋白) 攻擊(Sar-55毒株)接種物和動(dòng)物 一次接種后抗 攻擊時(shí)的抗HEV ALT峰后/前 組織病理學(xué) 血清中的HEV基因組*糞便的HEV基因組*HEV效價(jià) 效價(jià)(2次接種) 之比 (累積值)Log10效價(jià)+ 周數(shù)Log10效價(jià)+ 周數(shù)空白R(shí)h6051 <1∶10<1∶103.1 4.5+ 46 66Rh6067 <1∶10<1∶103.9 6.0+ 45 87Rh5984 <1∶10<1∶10 10.6 5.0+ 45 67Rh5985 <1∶10<1∶108.5 4.5+ 35 65疫苗2×50μgRh60681∶10,000 1∶10,000 1.1 0+23 34Rh6063 1∶1,000 1∶10,000 1.2 0+32 43Rh60741∶10,000 1∶10,000 1.1 0+ <1 0 21Rh6071 1∶1,000 1∶1,0001.1 0+25 56疫苗2×10μgRh5991 1∶1,000 1∶1,0001.4 0+36 45Rh5989 1∶1,000 1∶10,000 1.1 0+34 35Rh5974 1∶1,000 1∶10,000 1.0 0+26 47Rh5972 1∶1,0001∶1,000 0.9 0+ <1 0 31疫苗2×2μgRh5976 1∶1,000 1∶10,000 1.0 0+23 52Rh5978 1∶1,000 1∶10,000 0.9 0.5+ 25 45Rh6049 1∶1001∶1,0001.2 0+24 34Rh6050 1∶100 1∶100 1.0 0+22 33疫苗2×0.4μgRh5986 1∶100 1∶1.000 1.2 0+ 2131Rh5987 1∶100 1∶1,000 0.9 0+ 1221Rh5988 <1∶1001∶10,000 1.1 0+ 2222Rh5992 1∶100 1∶1.000 1.11.0+ 2233*用RT-PCR測(cè)定+合并陽(yáng)性樣品的測(cè)定值用組織學(xué)測(cè)試的結(jié)果確認(rèn)肝炎。累積的組織病理學(xué)評(píng)分在4.5+至6.0+之間。觀測(cè)每個(gè)動(dòng)物體內(nèi)的病毒血癥和排毒。病毒血癥持續(xù)5至6周,排毒持續(xù)5至7周。合并陽(yáng)性血清或糞便樣品,測(cè)定各動(dòng)物的HEV基因組效價(jià)。合并血清中HEV基因組效價(jià)為103至104,合并的糞便樣品中為106至108。HEV基因組效價(jià)與我們先前報(bào)道的以相同HEV SAR-55毒株攻擊的犬猴中的效價(jià)相當(dāng)(Tsarev S.A.等Proc.Natl.Acad.Sic.USA,(1994)19110189-202)。病毒血癥和排毒的持續(xù)時(shí)間也相當(dāng)。
用HEV Mex-14毒株攻擊的4個(gè)動(dòng)物都患上肝炎,組織病理學(xué)評(píng)分除外的各疾病定量參數(shù)均與用SAR-55毒株攻擊的動(dòng)物類似(表13)。表13以同源病毒攻擊前接種空白或不同量重組HEV ORF2蛋白的恒河猴內(nèi)的HEV感染接種(Sar-55 ORF2蛋白)攻擊(Sar-55毒株)接種物和動(dòng)物 一次接種后抗攻擊時(shí)的抗HEV ALT峰后/前 組織病理學(xué)血清中的HEV基因組*糞便的HEV基因組*HEV效價(jià) 效價(jià)(2次接種)之比 (累積值) Log10效價(jià)+周數(shù)Log10效價(jià)+ 周數(shù)空白R(shí)h5996 <1∶10 <1∶10 4.81.0+4 4 6 5Rh6044 <1∶10 <1∶10 4.71.0+4 4 6 4Rh6045 <1∶10 <1∶10 7.61.5+3 4 7 6Rh6046 <1∶10 <1∶10 2.71.0+3 4 7 5疫苗2×50μgRh5982 1∶1,000 1∶10,000 1.0 0+ 1 1 1 2Rh5983 1∶10,000 1∶10,000 0.9 0+ 2 3 3 4Rh5994 1∶1,000 1∶1,000 1.0 0+ 2 4 5 2Rh5995 1∶10,000 1∶10,000 1.8 0+<1 0<20*用RT-PCR測(cè)定+合并陽(yáng)性樣品的測(cè)定值這兩組動(dòng)物的感染定量參數(shù)也相似。所以,HEV攻擊儲(chǔ)備液能夠在所有受攻擊動(dòng)物中導(dǎo)致肝炎,因此可用于證實(shí)抗戊肝疫苗的效力。
接觸后接種組內(nèi)的戊肝感染用SAR-55攻擊4只動(dòng)物。攻擊后48小時(shí),給它們接種50μg疫苗,一個(gè)月后進(jìn)行一次加強(qiáng)(50μg)。這組的疾病或感染參數(shù)與對(duì)照組相比沒有顯著差別,只有病毒血癥和排毒的持續(xù)時(shí)間分別降低1.5和1.7倍。(數(shù)據(jù)未顯示)接種接種50μg、10μg或2μg疫苗的全部靈長(zhǎng)類動(dòng)物和接種0.4μg重組蛋白的4只動(dòng)物中的3個(gè)在首次免疫后都轉(zhuǎn)為HEV血清陽(yáng)性(表12和13)。在首次免疫后觀察到疫苗劑量與抗HEV效價(jià)間的正比關(guān)系;0.4μg的幾何平均值(GM)為1∶32,2μg的為1∶316,10μg的為1∶1,000,50μg的為1∶3,200。第二次接種疫苗后的1個(gè)月內(nèi)仍可觀察到劑量相關(guān)性GM效價(jià)差異,但是差異范圍變窄(如表14所示,在1∶1,800至1∶5,600之間)。表14同源攻擊或異源攻擊后的HEV感染接種(Sar-55 ORF2蛋白)攻擊結(jié)果分類 抗HEV ALT峰GM*組織病理學(xué) 血清中的HEV基因組+糞便的HEV基因組+(4動(dòng)物/類) GM*效價(jià) 后/前之比 (平均累積值) Log10效價(jià)*周數(shù) GM效價(jià)*(Log10) 平均周數(shù)Sar-55空白 <1∶10 5.7 5+ 3.8 5.36.5 6.3疫苗2×50μg 1∶5,600 1.1(s) 0+(s) 1.8(s)2.5(N) 3.5(s)3.5(s)2×10μg 1∶3,200 1.1(s) 0+(s) 2.0(s)4.0(N) 3.5(s)4.5(s)2×2μg1∶1,800 1.0(s) 0.1+(s) 2.0(s)3.5(N) 3.5(s)3.8(s)2×0.4μg 1∶1,800 1.1(s) 0.3+(s) 1.8(s)1.8(s) 1.8(s)2.5(s)Mex-14空白 <1∶10 4.61.1+3.54 6.5 5.0疫苗2×50μg 1∶5,600 0.9(s) 0+(s) 1.3(s)2.0(N) 2.3(s)2.0(s)*幾何平均值+用RT-PCR測(cè)定(S)與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p<0.05)(N)與空白對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p>0.05)
用多重比較測(cè)試進(jìn)行的抗HEV GM效價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,兩次接種后GM效價(jià)的劑量相關(guān)差異不明顯。此次攻擊的是恒河猴。
同源攻擊根據(jù)生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn),接種4種劑量中任一種的16個(gè)動(dòng)物都獲得抗肝炎保護(hù),因?yàn)槠溲錋LT水平都沒有升高(表12)。只在其中2個(gè)接種最低劑量疫苗的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)組織學(xué)變化。所述的組織異常極小,其中之一(恒河猴5978)的異常甚至可能與HEV感染無關(guān),因?yàn)樵诮臃N前的肝樣品中也發(fā)現(xiàn)類似的異常??傊?,兩次接種50μg、10μg、2μg或0.4μg疫苗的4組動(dòng)物都獲得抗肝炎保護(hù),而且,各組的戊肝定量參數(shù)都與空白組有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表14)。
雖然接種組的動(dòng)物都獲得抗戊肝保護(hù),但是它們并沒有抗HEV感染的保護(hù)。即使接種動(dòng)物的病毒效價(jià)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯低于空白組,大多數(shù)情況下,病毒血癥和排毒的持續(xù)時(shí)間并沒有明顯縮短。與空白組相比,接種動(dòng)物的病毒血癥水平平均降低約80倍,排毒水平平均降低約1,000倍。兩次接種50μg重組蛋白的兩動(dòng)物獲得抗Mex-14HEV毒株病毒血癥的保護(hù)和抗肝炎保護(hù),該毒株在基因和地理上與疫苗株差異最大(表13)。在這些動(dòng)物中都沒有發(fā)現(xiàn)肝炎的組織學(xué)和生物化學(xué)證據(jù)。將免疫動(dòng)物與空白組相比時(shí),疾病的表現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(表14)。但是,和同源攻擊情況相同,大多數(shù)動(dòng)物沒有抗HEV感染保護(hù)。3只動(dòng)物中可測(cè)得病毒血癥和排毒,而第4只試驗(yàn)動(dòng)物既無病毒血癥也不排毒,得到了完全的抗感染保護(hù)。與空白接種組相比,病毒血癥和排毒水平明顯降低(約180倍和1,800倍)。排毒持續(xù)時(shí)間的差異明顯,病毒血癥持續(xù)時(shí)間差異不明顯。
總之,以上實(shí)驗(yàn)表明,兩次接種低達(dá)0.4μg的重組蛋白可保護(hù)恒河猴不患肝炎。兩次接種0.4μg至50μg后,抗HEV GM效價(jià)沒有明顯差異。用同源毒株攻擊時(shí),根據(jù)測(cè)定ALT是否升高,接種動(dòng)物都獲得抗戊肝保護(hù),只有兩個(gè)接種最低劑量疫苗的動(dòng)物發(fā)生最小組織病變。通過多組比較定量評(píng)價(jià)了疫苗的保護(hù)效力,所述的比較顯示除接觸后接種組之外,接種靈長(zhǎng)類動(dòng)物的肝炎定量參數(shù)都低于空白組,所述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。而且,兩次接種50μg疫苗(唯一測(cè)定的劑量)的動(dòng)物都獲得抗異源攻擊保護(hù),所述的異源攻擊是用迄今鑒定到的基因和地理差異最大的HEV毒株。相反,接觸后的接種無效。根據(jù)生物化學(xué)和組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn),攻擊后48小時(shí)接種的動(dòng)物都患上肝炎。
雖然血清陽(yáng)性的靈長(zhǎng)類動(dòng)物能夠在高劑量HEV攻擊后免患戊肝,它們大多不抗HEV感染。這可能并不出人意料,因?yàn)闉榱舜_保接觸一致性,通常經(jīng)口傳播的該病毒是通過靜脈給予的。但是,根據(jù)病毒血癥和排毒水平測(cè)定,接種動(dòng)物的感染程度都比空白組顯著降低。實(shí)際上,用異源毒株攻擊的一個(gè)動(dòng)物獲得完全的抗HEV感染保護(hù),用同源HEV毒株攻擊的兩動(dòng)物排毒但沒有發(fā)現(xiàn)病毒血癥。在我們先前的研究中,獲得抗HEV感染完全保護(hù)的動(dòng)物百分比更高(Tsarev S.A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1994);19110198-202),可用如下事實(shí)解釋在先前的研究中,我們同時(shí)使用1,000和10,000 MID50的攻擊病毒劑量,但在這次的研究中,我們只使用了高劑量。因?yàn)殪`長(zhǎng)類動(dòng)物具有劑量依賴性HEV感染應(yīng)答(Tsarev SA等,戊肝預(yù)防的前景腸道傳染肝炎病毒(Y.Buisson,P.Coursaget,M.Kane編輯)。La Simmarre,Joueles-Tours,F(xiàn)rance,(1996)p.373-383),所以選用高劑量來確保非接種動(dòng)物都發(fā)生明顯的肝炎。
這次和先前的研究表明所有空白和接種靈長(zhǎng)類動(dòng)物血清中的病毒效價(jià)都高于糞便中的效價(jià)(平均約10,000倍),無一例外。這一結(jié)果符合HEV經(jīng)糞-口途徑傳遞這一事實(shí)。在所有接種動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)病毒血癥和排毒水平比空白動(dòng)物降低。然而在多數(shù)情況下,所有接種靈長(zhǎng)類動(dòng)物的病毒血癥持續(xù)時(shí)間雖然較短,但與空白動(dòng)物相比并沒有明顯降低。在數(shù)十個(gè)被測(cè)動(dòng)物中,病毒血癥總是與HEV排入糞便相并行。所以,可用血清樣品作為病毒感染的主要指標(biāo)反映HEV感染水平。這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn),因?yàn)檠鍢悠吠ǔ1燃S便樣品更易得到。
實(shí)施例19純化HEV ORF2蛋白產(chǎn)物的其它方法以下純化程序時(shí)不同于本申請(qǐng)前文所述純化方法的另一種實(shí)施方式分別從澄清的桿狀病毒感染細(xì)胞裂解液和培養(yǎng)基清液中純化重組HEV ORF2蛋白。細(xì)胞裂解原液用上樣緩沖液(50mM Tris-HCl,pH8.0,10mM NaCl)1∶10稀釋。
澄清的感染細(xì)胞清液在Amicon Proflux M-12超濾系統(tǒng)上,用螺旋環(huán)繞纖維素超濾柱(S1Y10;1平方英寸;截留分子量10,000;Amicon,Beverly,MA),循環(huán)速度4L/分鐘,跨膜壓力20psi,切向流超濾濃縮10倍。用4體積上樣緩沖液透析濃縮清液。
透析液或裂解原液(1.5床層體積)上樣在Q瓊脂糖快速?gòu)?qiáng)離子交換柱(XK50柱,5.0×7.5cm,150ml;Pharmacia Piscataway,NJ)上,流速為10.0ml/min。先用1.0床層體積上樣緩沖液以10.0ml/min流速洗柱,接著用1.0床層體積上樣緩沖液以20ml/min流速洗柱。用10至300mM NaCl連續(xù)線性梯度的7.5床層體積相同緩沖液,20ml/min流速洗脫蛋白質(zhì)。
取10μl Q瓊脂糖層析(Pharmacia Piscataway,NJ)柱峰蛋白流份用SDS-PAGE鑒定是否HEV ORF2(+)蛋白流份。合并(+)流份,用瓊脂糖G-25(Pharmacia)和上樣緩沖液凝膠過濾脫鹽。收集峰蛋白流份,上樣在Source 15Q高效強(qiáng)離子交換柱上離析各HEV ORF2多肽。用與Q瓊脂糖液體層析相同的方法洗柱和洗脫。如前所述合并HEV ORF2蛋白(+)流份進(jìn)行鑒定,合并,在Superdex 75柱(Pharmacia)上用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)進(jìn)行凝膠過濾最后純化蛋白質(zhì)。用SDS-PAGE和Western印跡試驗(yàn)鑒定HEV ORF2流份。
由此純化的HEV ORF2蛋白適合配制HEV疫苗,用于I期和II期臨床研究。
序列表(1) 一般信息(i)申請(qǐng)人美國(guó)政府健康及人類服務(wù)部(ii) 發(fā)明名稱戊肝巴基斯坦毒株的重組蛋白及其在診斷方法和疫苗中的用途(iii) 序列數(shù)目111(iv) 通信地址(A) 收件人MORGAN &amp; FINNEGAN(B) 街道345 PARK AVENUE(C) 城市紐約(D) 州紐約州(E) 國(guó)家USA(F) 郵編10154(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A) 記錄介質(zhì)類型軟盤(B) 計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C) 操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D) 軟件WORDPERFECT 5.1(vi) 本申請(qǐng)資料(A) 申請(qǐng)?zhí)?B) 申請(qǐng)日09-APR-1998(C) 分類(vii) 在先申請(qǐng)資料(A) 申請(qǐng)?zhí)?8/840,316(B) 申請(qǐng)日11-APR-1997(C) 分類(viii) 律師/代理人信息(A) 姓名Richard W.Bork(B) 登記號(hào)36,459
(C) 參考/案卷號(hào)2026-4255PC(ix) 通訊信息(A) 電話(212)758-4800(B) 電傳(212)751-6849(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度1693氨基酸殘基(B) 類型氨基酸(C) 鏈型未知(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(xi) 序列描述SEQ ID NO1Met Glu Ala His Gln Phe Ile Lys Ala Pro Gly Ile Thr Thr Ala1 5 10 15Ile Glu Gln Ala Ala Leu Ala Ala Ala Asn Ser Ala Leu Ala Asn20 25 30Ala Val Val Val Arg Pro Phe Leu Ser His Gln Gln Ile Glu Ile35 40 45Leu Ile Asn Leu Met Gln Pro Arg Gln Leu Val Phe Arg Pro Glu50 55 60Val Phe Trp Asn His Pro Ile Gln Arg Val Ile His Asn Glu Leu65 70 75Glu Leu Tyr Cys Arg Ala Arg Ser Gly Arg Cys Leu Glu Ile Gly80 85 90Ala His Pro Arg Ser Ile Asn Asp Asn Pro Asn Val Val His Arg95 100 105Cys Phe Leu Arg Pro Ala Gly Arg Asp Val Gln Arg Trp Tyr Thr110 115 120Ala Pro Thr Arg G1y Pro Ala Ala Asn Cys Arg Arg Ser Ala Leu125 130 135Arg Gly Leu Pro Ala Ala Asp Arg Thr Tyr Cys Phe Asp Gly Phe140 145 150Ser Gly Cys Asn Phe Pro Ala Glu Thr Gly Ile Ala Leu Tyr Ser155 160 165Leu His Asp Met Ser Pro Ser Asp Val Ala Glu Ala Met Phe Arg
170 175 180His Gly Met Thr Arg Leu Tyr Ala Ala Leu His Leu Pro Pro Glu185 190 195Val Leu Leu Pro Pro Gly Thr Tyr Arg Thr Ala Ser Tyr Leu Leu200 205 210Ile His Asp Gly Arg Arg Val Val Val Thr Tyr Glu Gly Asp Thr215 220 225Ser Ala Gly Tyr Asn His Asp Val Ser Asn Leu Arg Ser Trp Ile230 235 240Arg Thr Thr Lys Val Thr Gly Asp His Pro Leu Val Ile Glu Arg245 250 255Val Arg Ala Ile Gly Cys His Phe Val Leu Leu Leu Thr Ala Ala260 265 270Pro Glu Pro Ser Pro Met Pro Tyr Val Pro Tyr Pro Arg Ser Thr275 280 285Glu Val Tyr Val Arg Ser Ile Phe Gly Pro Gly Gly Thr Pro Ser290 295 300Leu Phe Pro Thr Ser Cys Ser Thr Lys Ser Thr Phe His Ala Val305 310 315Pro Ala His Ile Trp Asp Arg Leu Met Leu Phe Gly Ala Thr Leu320 325 330Asp Asp Gln Ala Phe Cys Cys Ser Arg Leu Met Thr Tyr Leu Arg335 340 345Gly Ile Ser Tyr Lys Val Thr Val Gly Thr Leu Val Ala Asn Glu350 355 360Gly Trp Asn Ala Ser Glu Asp Ala Leu Thr Ala Val Ile Thr Ala365 370 375Ala Tyr Leu Thr Ile Cys His Gln Arg Tyr Leu Arg Thr Gln Ala380 385 390Ile Ser Lys Gly Met Arg Arg Leu Glu Arg Glu His Ala Gln Lys395 400 405Phe Ile Thr Arg Leu Tyr Ser Trp Leu Phe Glu Lys Ser Gly Arg410 415 420Asp Tyr Ile Pro Gly Arg Gln Leu Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Arg425 430 435Arg Trp Leu Ser Ala Gly Phe His Leu Asp Pro Arg Val Leu Val440 445 450Phe Asp Glu Ser Ala Pro Cys His Cys Arg Thr Ala Ile Arg Lys
455 460 465Ala Val Ser Lys Phe Cys Cys Phe Met Lys Trp Leu Gly Gln Glu470 475 480Cys Thr Cys Phe Leu Gln Pro Ala Glu Gly Val Val Gly Asp Gln485 490 495Gly His Asp Ash Glu Ala Tyr Glu Gly Ser Asp Val Asp Pro Ala500 505 510Glu Ser Ala Ile Ser Asp Ile Ser Gly Ser Tyr Val Val Pro Gly515 520 525Thr Ala Leu Gln Pro Leu Tyr Gln Ala Leu Asp Leu Pro Ala Glu530 535 540Ile Val Ala Arg Ala Gly Arg Leu Thr Ala Thr Val Lys Val Ser545 550 555Gln Val Asp Gly Arg Ile Asp Cys Glu Thr Leu Leu Gly Asn Lys560 565 570Thr Phe Arg Thr Ser Phe Val Asp Gly Ala Val Leu Glu Thr Asn575 580 585Gly Pro Glu Arg His Asn Leu Ser Phe Asp Ala Ser Gln Ser Thr590 595 600Met Ala Ala Gly Pro Phe Ser Leu Thr Tyr Ala Ala Ser Ala Ala605 610 615Gly Leu Glu Val Arg Tyr Val Ala Ala Gly Leu Asp His Arg Ala620 625 630Val Phe Ala Pro Gly Val Ser Pro Arg Ser Ala Pro Gly Glu Val635 640 645Thr Ala Phe Cys Ser Ala Leu Tyr Arg Phe Asn Arg Glu Ala Gln650 655 660Arg Leu Ser Leu Thr Gly Asn Phe Trp Phe His Pro Glu Gly Leu665 670 675Leu Gly Pro Phe Ala Pro Phe Ser Pro Gly His Val Trp Glu Ser680 685 690Ala Asn Pro Phe Cys Gly Glu Ser Thr Leu Tyr Thr Arg Thr Trp695 700 705Ser Glu Val Asp Ala Val Pro Ser Pro Ala Gln Pro Asp Leu Gly710 715 720Phe Thr Ser Glu Pro Ser Ile Pro Ser Arg Ala Ala Thr Pro Thr725 730 735Pro Ala Ala Pro Leu Pro Pro Pro Ala Pro Asp Pro Ser Pro Thr
740 745 750Leu Ser Ala Pro Ala Arg Gly Glu Pro Ala Pro Gly Ala Thr Ala755 760 765Arg Ala Pro Ala Ile Thr His Gln Thr Ala Arg His Arg Arg Leu770 775 780Leu Phe Thr Tyr Pro Asp Gly Ser Lys Val Phe Ala Gly Ser Leu785 790 795Phe Glu Ser Thr Cys Thr Trp Leu Val Asn Ala Ser Asn Val Asp800 805 810His Arg Pro Gly Gly Gly Leu Cys His Ala Phe Tyr Gln Arg Tyr815 820 825Pro Ala Ser Phe Asp Ala Ala Ser Phe Val Met Arg Asp Gly Ala830 835 840Ala Ala Tyr Thr Leu Thr Pro Arg Pro Ile Ile His Ala Val Ala845 850 855Pro Asp Tyr Arg Leu Glu His Ash Pro Lys Arg Leu Glu Ala Ala860 865 870Tyr Arg Glu Thr Cys Ser Arg Leu Gly Thr Ala Ala Tyr Pro Leu875 880 885Leu Gly Thr Gly Ile Tyr Gln Val Pro Ile Gly Pro Ser Phe Asp890 895 900Ala Trp Glu Arg Asn His Arg Pro Gly Asp Glu Leu Tyr Leu Pro905 910 915Glu Leu Ala Ala Arg Trp Phe Glu Ala Asn Arg Pro Thr Cys Pro920 925 930Thr Leu Thr Ile Thr Glu Asp Val Ala Arg Thr Ala Asn Leu Ala935 940 945Ile Glu Leu Asp Ser Ala Thr Asp Val Gly Arg Ala Cys Ala Gly950 955 960Cys Arg Val Thr Pro Gly Val Val Gln Tyr Gln Phe Thr Ala Gly965 970 975Val Pro Gly Ser Gly Lys Ser Arg Ser Ile Thr GIn Ala Asp Val980 985 990Asp Val Val Val Val Pro Thr Arg Glu Leu Arg Asn Ala Trp Arg995 10001005Arg Arg Gly Phe Ala Ala Phe Thr Pro His Thr Ala Ala Arg Val101010151020Thr Gln Gly Arg Arg Val Val Ile Asp Glu Ala Pro Ser Leu Pro
102510301035Pro His Leu Leu Leu Leu His Met Gln Arg Ala Ala Thr Val His1040104 1050Leu Leu Gly Asp Pro Asn Gln Ile Pro Ala Ile Asp Phe Glu His105510601065Ala Gly Leu Val Pro Ala Ile Arg Pro Asp Leu Ala Pro Thr Ser107010751080Trp Trp His Val Thr His Arg Cys Pro Ala Asp Val Cys Glu Leu108510901095Ile Arg Gly Ala Tyr Pro Met Ile Gln Thr Thr Ser Arg Val Leu110011051110Arg Ser Leu Phe Trp Gly Glu Pro Ala Val Gly Gln Lys Leu Val111511201125Phe Thr Gln Ala Ala Lys Ala Ala Ash Pro Gly Ser Val Thr Val113011351140His Glu Ala Gln Gly Ala Thr Tyr Thr Glu Thr Thr Ile Ile Ala114511501155Thr Ala Asp Ala Arg Gly Leu Ile Gln Ser Ser Arg Ala His Ala116011651170Ile Val Ala Leu Thr Arg His Thr Glu Lys Cys Val Ile Ile Asp117511801185Ala Pro Gly Leu Leu Arg Glu Val Gly Ile Ser Asp Ala Ile Val119011951200Asn Asn Phe Phe Leu Ala Gly Gly Glu Ile Gly His Gln Arg Pro120512101215Ser Val Ile Pro Arg Gly Asn Pro Asp Ala Asn Val Asp Thr Leu122012251230Ala Ala Phe Pro Pro Ser Cys Glu Ile Ser Ala Phe His Glu Leu123512401245Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Pro Ala Pro Val Ala Ala Val Leu125012551260Pro Pro Cys Pro Glu Leu Glu Gln Gly Leu Leu Tyr Leu Pro Gln126512701275Glu Leu Thr Thr Cys Asp Ser Val Val Thr Phe Glu Leu Thr Asp128012851290Ile Val His Cys Arg Met Ala Ala Pro Ser Gln Arg Lys Ala Val129513001305Leu Ser Thr Leu Val Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Thr Lys Leu Tyr
1310131 1320Asn Ala Ser His Ser Asp Val Arg Asp Ser Leu Ala Arg Phe Ile132513301335Pro Ala Ile Gly Pro Val Gln Val Thr Thr Cys Glu Leu Tyr Glu134013451350Leu Glu Glu Ala Met Val Glu Lys Gly Gln Asp Gly Ser Ala Val135513601365Leu Glu Leu Asp Leu Cys Ser Arg Asp Val Ser Arg Ile Thr Phe137013751380Phe Gln Lys Asp Cys Ash Lys Phe Thr Thr Gly Glu Thr Ile Ala138513901395His Gly Lys Val Gly Gln Gly Ile Ser Ala Trp Ser Lys Thr Phe140014051410Cys Ala Leu Phe Gly Pro Trp Phe Arg Ala Ile Glu Lys Ala Ile141514201425Leu Ala Leu Leu Pro Gln Gly Val Phe Tyr Gly Asp Ala Phe Asp143014351440Asp Thr Val Phe Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala Lys Ala Ser Met144514501455Val Phe Glu Asn Asp Phe Ser Glu Phe Asp Ser Thr Gln Asn Asn146014651470Phe Ser Leu Gly Leu Glu Cys Ala Ile Met Glu Glu Cys Gly Met147514801485Pro Gln Trp Leu Ile Arg Leu Tyr His Leu Ile Arg Ser Ala Trp149014951500Ile Leu Gln Ala Pro Lys Glu Ser Leu Arg Gly Phe Trp Lys Lys150515101515His Ser Gly Glu Pro Gly Thr Leu Leu Trp Asn Thr Val Trp Asn152015251530Met Ala Val Ile Thr His Cys Tyr Asp Phe Arg Asp Leu Gln Val153515401545Ala Ala Phe Lys Gly Asp Asp Ser Ile Val Leu Cys Ser Glu Tyr155015551560Arg Gln Ser Pro G1y Ala Ala Val Leu Ile Ala Gly Cys Gly Leu156515701575Lys Leu Lys Val Asp Phe Arg Pro Ile Gly Leu Tyr Ala Gly Val158015851590Val Val Ala Pro Gly Leu Gly Ala Leu Pro Asp Val Val Arg Phe
159516001605Ala Gly Arg Leu Thr Glu Lys Asn Trp Gly Pro Gly Pro Glu Arg161016151620Ala Glu Gln Leu Arg Leu Ala Val Ser Asp Phe Leu Arg Lys Leu162516301635Thr Asn Val Ala Gln Met Cys Val Asp Val Val Ser Arg Val Tyr164016451650Gly Val Ser Pro Gly Leu Val His Asn Leu Ile Glu Met Leu Gln165516601665Ala Val Ala Asp Gly Lys Ala His Phe Thr Glu Ser Val Lys Pro167016751680Val Leu Asp Leu Thr Asn Ser Ile Leu Cys Arg Val Glu16851690(2) SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度660氨基酸殘基(B) 類型氨基酸(C) 鏈型未知(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(xi) 序列描述SEQ ID N02Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro1 5 l0 15Met Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg20 25 30Gly Arg Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg35 40 45Val Asp Ser Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn50 55 60Pro Phe Ala Pro Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg65 70 75Val Arg Gln Pro Ala Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln80 85 90Ala Gln Arg Pro Ala Ala Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala95 100 105G1y Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro110 115 120Pro Val Pro Asp Val Asp Ser Arg Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln125 130 135Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr Ser Ser Val Ala Thr Gly140 145 150Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro Leu Ser Pro Leu Leu Pro155 160 165Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met Ala Thr Glu Ala Ser170 175 180Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala Arg Ala Thr Ile Arg Tyr Arg185 190 195Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala Ile Ser Ile Ser200 205 210Phe Tyr Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp Met Asn215 220 225Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly Ile230 235 240Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Asn245 250 255Gln Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu Glu260 265 270Ala Thr Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val275 280 285Asn Ser Tyr Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu290 295 300Asp Phe Ala Leu Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn305 310 315Thr Asn Thr Arg Val Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg320 325 330Leu Arg Arg Gly Ala Asp Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala335 340 345Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly350 355 360Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu365 370 375Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser380 385 390Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn395 400 405Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln410 415 420Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu425 430 435Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp440 445 450Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu455 460 465Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr470 475 480Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser485 490 495Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val500 505 510Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro515 520 525Leu Ser Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro530 535 540Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala545 550 555Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu560 565 570Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr575 580 585Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val590 595 600Leu Ala Pro His Ser Val Leu Ala Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp605 610 615Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp Asp Phe Cys Pro Glu Cys620 625 630Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe Gln Ser Thr Val Ala635 640 645Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly Lys Thr Arg Glu Leu650 655 660(2)SEQ ID NO3的信息
(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度123氨基酸殘基(B) 類型氨基酸(C) 鏈型未知(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(xi) 序列描述SEQ ID NO3Met Asn Asn Met Ser Phe Ala Ala Pro Met Gly Ser Arg Pro Cys1 5 10 15Ala Leu Gly Leu Phe Cys Cys Cys Ser Ser Cys Phe Cys Leu Cys20 25 30Cys Pro Arg His Arg Pro Val Ser Arg Leu Ala Ala Val Val Gly35 40 45Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Val Val Ser Gly Val Thr Gly Leu50 55 60Ile Leu Ser Pro Ser Gln Ser Pro lle Phe Ile Gln Pro Thr Pro65 70 75Ser Pro Pro Met Ser Pro Leu Arg Pro Gly Leu Asp Leu Val Phe80 85 90Ala Asn Pro Pro Asp His Ser Ala Pro Leu Gly Val Thr Arg Pro95 100 105Ser Ala Pro Pro Leu Pro His Val Val Asp Leu Pro Gln Leu Gly110 115 120Pro Arg Arg(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度7168堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO4AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG GAGGCCCATC AGTTTATCAA 50GGCTCCTGGC ATCACTACTG CTATTGAGCA GGCTGCTCTA GCAGCGGCCA 100ACTCTGCCCT TGCGAATGCT GTGGTAGTTA GGCCTTTTCT CTCTCACCAG 150CAGATTGAGA TCCTTATTAA CCTAATGCAA CCTCGCCAGC TTGTTTTCCG 200CCCCGAGGTT TTCTGGAACC ATCCCATCCA GCGTGTTATC CATAATGAGC 250TGGAGCTTTA CTGTCGCGCC CGCTCCGGCC GCTGCCTCGA AATTGGTGCC 300CACCCCCGCT CAATAAATGA CAATCCTAAT GTGGTCCACC GTTGCTTCCT 350CCGTCCTGCC GGGCGTGATG TTCAGCGTTG GTATACTGCC CCTACCCGCG 400GGCCGGCTGC TAATTGCCGG CGTTCCGCGC TGCGCGGGCT CCCCGCTGCT 450GACCGCACTT ACTGCTTCGA CGGGTTTTCT GGCTGTAACT TTCCCGCCGA 500GACGGGCATC GCCCTCTATT CTCTCCATGA TATGTCACCA TCTGATGTCG 550CCGAGGCTAT GTTCCGCCAT GGTATGACGC GGCTTTACGC TGCCCTCCAC 600CTCCCGCCTG AGGTCCTGTT GCCCCCTGGC ACATACCGCA CCGCGTCGTA 650CTTGCTGATC CATGACGGCA GGCGCGTTGT GGTGACGTAT GAGGGTGACA 700CTAGTGCTGG TTATAACCAC GATGTTTCCA ACCTGCGCTC CTGGATTAGA 750ACCACTAAGG TTACCGGAGA CCACCCTCTC GTCATCGAGC GGGTTAGGGC 800CATTGGCTGC CACTTTGTCC TTTTACTCAC GGCTGCTCCG GAGCCATCAC 850CTATGCCCTA TGTCCCTTAC CCCCGGTCTA CCGAGGTCTA TGTCCGATCG 900ATCTTCGGCC CGGGTGGCAC CCCCTCCCTA TTTCCAACCT CATGCTCCAC 950CAAGTCGACC TTCCATGCTG TCCCTGCCCA TATCTGGGAC CGTCTCATGT1000TGTTCGGGGC CACCCTAGAT GACCAAGCCT TTTGCTGCTC CCGCCTAATG1050ACTTACCTCC GCGGCATTAG CTACAAGGTT ACTGTGGGCA CCCTTGTTGC1100CAATGAAGGC TGGAACGCCT CTGAGGACGC TCTTACAGCT GTCATCACTG1150CCGCCTACCT TACCATCTGC CACCAGCGGT ACCTCCGCAC TCAGGCTATA1200TCTAAGGGGA TGCGTCGCCT GGAGCGGGAG CATGCTCAGA AGTTTATAAC1250ACGCCTCTAC AGTTGGCTCT TTGAGAAGTC CGGCCGTGAT TATATCCCCG1300GCCGTCAGTT GGAGTTCTAC GCTCAGTGTA GGCGCTGGCT CTCGGCCGGC1350TTTCATCTTG ACCCACGGGT GTTGGTTTTT GATGAGTCGG CCCCCTGCCA1400CTGTAGGACT GCGATTCGTA AGGCGGTCTC AAAGTTTTGC TGCTTTATGA1450AGTGGCTGGG CCAGGAGTGC ACCTGTTTTC TACAACCTGC AGAAGGCGTC1500GTTGGCGACC AGGGCCATGA CAACGAGGCC TATGAGGGGT CTGATGTTGA1550CCCTGCTGAA TCCGCTATTA GTGACATATC TGGGTCCTAC GTAGTCCCTG1600GCACTGCCCT CCAACCGCTT TACCAAGCCC TTGACCTCCC CGCTGAGATT1650GTGGCTCGTG CAGGCCGGCT GACCGCCACA GTAAAGGTCT CCCAGGTCGA1700CGGGCGGATC GATTGTGAGA CCCTTCTCGG TAATAAAACC TTCCGCACGT1750CGTTTGTTGA CGGGGCGGTT TTAGAGACTA ATGGCCCAGA GCGCCACAAT1800CTCTCTTTTG ATGCCAGTCA GAGCACTATG GCCGCCGGCC CTTTCAGTCT1850CACCTATGCC GCCTCTGCTG CTGGGCTGGA GGTGCGCTAT GTCGCCGCCG1900GGCTTGACCA CCGGGCGGTT TTTGCCCCCG GCGTTTCACC CCGGTCAGCC1950CCTGGCGAGG TCACCGCCTT CTGTTCTGCC CTATACAGGT TTAATCGCGA2000GGCCCAGCGC CTTTCGCTGA CCGGTAATTT TTGGTTCCAT CCTGAGGGGC2050TCCTTGGCCC CTTTGCCCCG TTTTCCCCCG GGCATGTTTG GGAGTCGGCT2100AATCCATTCT GTGGCGAGAG CACACTTTAC ACCCGCACTT GGTCGGAGGT2150TGATGCTGTT CCTAGTCCAG CCCAGCCCGA CTTAGGTTTT ACATCTGAGC2200CTTCTATACC TAGTAGGGCC GCCACACCTA CCCCGGCGGC CCCTCTACCC2250CCCCCTGCAC CGGATCCTTC CCCTACTCTC TCTGCTCCGG CGCGTGGTGA2300GCCGGCTCCT GGCGCTACCG CCAGGGCCCC AGCCATAACC CACCAGACGG2350CCCGGCATCG CCGCCTGCTC TTTACCTACC CGGATGGCTC TAAGGTGTTC2400GCCGGCTCGC TGTTTGAGTC GACATGTACC TGGCTCGTTA ACGCGTCTAA2450TGTTGACCAC CGCCCTGGCG GTGGGCTCTG TCATGCATTT TACCAGAGGT2500ACCCCGCCTC CTTTGATGCT GCCTCTTTTG TGATGCGCGA CGGCGCGGCC2550GCCTACACAT TAACCCCCCG GCCAATAATT CATGCCGTCG CTCCTGATTA2600TAGGTTGGAA CATAACCCAA AGAGGCTTGA GGCTGCCTAC CGGGAGACTT2650GCTCCCGCCT CGGTACCGCT GCATACCCAC TCCTCGGGAC CGGCATATAC2700CAGGTGCCGA TCGGTCCCAG TTTTGACGCC TGGGAGCGGA ATCACCGCCC2750CGGGGACGAG TTGTACCTTC CTGAGCTTGC TGCCAGATGG TTCGAGGCCA2800ATAGGCCGAC CTGCCCAACT CTCACTATAA CTGAGGATGT TGCGCGGACA2850GCAAATCTGG CTATCGAACT TGACTCAGCC ACAGACGTCG GCCGGGCCTG2900TGCCGGCTGT CGAGTCACCC CCGGCGTTGT GCAGTACCAG TTTACCGCAG2950GTGTGCCTGG ATCCGGCAAG TCCCGCTCTA TTACCCAAGC CGACGTGGAC3000GTTGTCGTGG TCCCGACCCG GGAGTTGCGT AATGCCTGGC GCCGCCGCGG3050CTTCGCTGCT TTCACCCCGC ACACTGCGGC TAGAGTCACC CAGGGGCGCC3100GGGTTGTCAT TGATGAGGCC CCGTCCCTTC CCCCTCATTT GCTGCTGCTC3150CACATGCAGC GGGCCGCCAC CGTCCACCTT CTTGGCGACC CGAATCAGAT3200CCCAGCCATC GATTTTGAGC ACGCCGGGCT CGTTCCCGCC ATCAGGCCCG3250ATTTGGCCCC CACCTCCTGG TGGCATGTTA CCCATCGCTG CCCTGCGGAT3300GTATGTGAGC TAATCCGCGG CGCATACCCT ATGATTCAGA CCACTAGTCG3350GGTCCTCCGG TCGTTGTTCT GGGGTGAGCC CGCCGTTGGG CAGAAGCTAG3400TGTTCACCCA GGCGGCTAAG GCCGCCAACC CCGGTTCAGT GACGGTCCAT3450GAGGCACAGG GCGCTACCTA CACAGAGACT ACCATCATTG CCACGGCAGA3500TGCTCGAGGC CTCATTCAGT CGTCCCGAGC TCATGCCATT GTTGCCTTGA3550CGCGCCACAC TGAGAAGTGC GTCATCATTG ACGCACCAGG CCTGCTTCGC3600GAGGTGGGCA TCTCCGATGC AATCGTTAAT AACTTTTTCC TTGCTGGTGG3650CGAAATTGGC CACCAGCGCC CATCTGTTAT CCCTCGCGGC AATCCTGACG3700CCAATGTTGA CACCTTGGCT GCCTTCCCGC CGTCTTGCCA GATTAGCGCC3750TTCCATCAGT TGGCTGAGGA GCTTGGCCAC AGACCTGCCC CTGTCGCGGC3800TGTTCTACCG CCCTGCCCTG AGCTTGAACA GGGCCTTCTC TACCTGCCCC3850AAGAACTCAC CACCTGTGAT AGTGTCGTAA CATTTGAATT AACAGATATT3900GTGCATTGTC GTATGGCCGC CCCGAGCCAG CGCAAGGCCG TGCTGTCCAC3950GCTCGTGGGC CGTTATGGCC GCCGCACAAA GCTCTACAAT GCCTCCCACT4000CTGATGTTCG CGACTCTCTC GCCCGTTTTA TCCCGGCCAT TGGCCCCGTA4050CAGGTTACAA CCTGTGAATT GTACGAGCTA GTGGAGGCCA TGGTCGAGAA4100GGGCCAGGAC GGCTCCGCCG TCCTTGAGCT CGACCTTTGT AGCCGCGACG4150TGTCCAGGAT CACCTTCTTC CAGAAAGATT GTAATAAAAT CACCACGGGG4200GAGACCATCG CCCATGGTAA AGTGGGCCAG GGCATTTCGG CCTGGAGTAA4250GACCTTCTGT GCCCTTTTCG GCCCCTGGTT CCGTGCTATT GAGAAGGCTA4300TCCTGGCCCT GCTCCCTCAG GGTGTGTTTT ATGGGGATGC CTTTGATGAC4350ACCGTCTTCT CGGCGGCTGT GGCCGCAGCA AAGGCATCCA TGGTGTTCGA4400GAATGACTTT TCTGAGTTTG ATTCCACCCA GAATAATTTT TCCTTGGGCC4450TAGAGTGTGC TATTATGGAG GAGTGTGGGA TGCCGCAGTG GCTCATCCGC4500TTGTACCACC TTATAAGGTC TGCGTGGATT CTGCAGGCCC CGAAGGAGTC4550CCTGCGAGGG TTTTGGAAGA AACACTCCGG TGAGCCCGGC ACCCTTCTGT4600GGAATACTGT CTGGAACATG GCCGTTATCA CCCACTGTTA TGATTTCCGC4650GATCTGCAGG TGGCTGCCTT TAAAGGTGAT GATTCGATAG TGCTTTGCAG4700TGAGTACCGT CAGAGCCCAG GGGCTGCTGT CCTGATTGCT GGCTGTGGCC4750TAAAGTTGAA GGTGGATTTC CGTCCGATTG GTCTGTATGC AGGTGTTGTG4800GTGGCCCCCG GCCTTGGCGC GCTTCCTGAT GTCGTGCGCT TCGCCGGTCG4850GCTTACTGAG AAGAATTGGG GCCCTGGCCC CGAGCGGGCG GAGCAGCTCC4900GCCTCGCTGT GAGTGATTTT CTCCGCAAGC TCACGAATGT AGCTCAGATG4950TGTGTGGATG TTGTCTCTCG TGTTTATGGG GTTTCCCCTG GGCTCGTTCA5000TAACCTGATT GGCATGCTAC AGGCTGTTGC TGATGGCAAG GCTCATTTCA5050CTGAGTCAGT GAAGCCAGTG CTTGACCTGA CAAATTCAAT TCTGTGTCGG5100GTGGAATGAA TAACATGTCT TTTGCTGCGC CCATGGGTTC GCGACCATGC5150GCCCTCGGCC TATTTTGCTG TTGCTCCTCA TGTTTCTGCC TATGCTGCCC5200GCGCCACCGC CCGGTCAGCC GTCTGGCCGC CGTCGTGGGC GGCGCAGCGG5250CGGTTCCGGC GGTGGTTTCT GGGGTGACCG GGTTGATTCT CAGCCCTTCG5300CAATCCCCTA TATTCATCCA ACCAACCCCT TCGCCCCCGA TGTCACCGCT5350GCGGCCGGGG CTGGACCTCG TGTTCGCCAA CCCGCCCGAC CACTCGGCTC5400CGCTTGGCGT GACCAGGCCC AGCGCCCCGC CGCTGCCTCA CGTCGTAGAC5450CTACCACAGC TGGGGCCGCG CCGCTAACCG CGGTCGCTCC GGCCCATGAC5500ACCCCGCCAG TGCCTGATGT TGACTCCCGC GGCGCCATCC TGCGCCGGCA5550GTATAACCTA TCAACATCTC CCCTCACCTC TTCCGTGGCC ACCGGCACAA5600ATTTGGTTCT TTACGCCGCT CCTCTTAGCC CGCTTCTACC CCTCCAGGAC5650GGCACCAATA CTCATATAAT GGCTACAGAA GCTTCTAATT ATGCCCAGTA5700CCGGGTTGCT CGTGCCACAA TTCGCTACCG CCCGCTGGTC CCCAACGCTG5750TTGGTGGCTA CGCTATCTCC ATTTCGTTCT GGCCACAGAC CACCACCACC5800CCGACGTCCG TTGACATGAA TTCAATAACC TCGACGGATG TCCGTATTTT5850AGTCCAGCCC GGCATAGCCT CCGAGCTTGT TATTCCAAGT GAGCGCCTAC5900ACTATCGCAA CCAAGGTTGG CGCTCTGTTG AGACCTCCGG GGTGGCGGAG5950GAGGAGGCCA CCTCTGGTCT TGTCATGCTC TGCATACATG GCTCACCTGT6000AAATTCTTAT ACTAATACAC CCTATACCGG TGCCCTCGGG CTGTTGGACT6050TTGCCCTCGA ACTTGAGTTC CGCAACCTCA CCCCCGGTAA TACCAATACG6100CGGGTCTCGC GTTACTCCAG CACTGCCCGT CACCGCCTTC GTCGCGGTGC6150AGATGGGACT GCCGAGCTCA CCACCACGGC TGCTACTCGC TTCATGAAGG6200ACCTCTATTT TACTAGTACT AATGGTGTTG GTGAGATCGG CCGCGGGATA6250GCGCTTACCC TGTTTAACCT TGCTGACACC CTGCTTGGCG GTCTACCGAC6300AGAATTGATT TCGTCGGCTG GTGGCCAGCT GTTCTACTCT CGCCCCGTCG6350TCTCAGCCAA TGGCGAGCCG ACTGTTAAGC TGTATACATC TGTGGAGAAT6400GCTCAGCAGG ATAAGGGTAT TGCAATCCCG CATGACATCG ACCTCGGGGA6450ATCCCGTGTA GTTATTCAGG ATTATGACAA CCAACATGAG CAGGACCGAC6500CGACACCTTC CCCAGCCCCA TCGCGTCCTT TTTCTGTCCT CCGAGCTAAC6550ATGTGCTTT GGCTTTCTCT CACCGCTGCC GAGTATGACC AGTCCACTTA6600CGGCTCTTCG ACCGGCCCAG TCTATGTCTC TGACTCTGTG ACCTTGGTTA6650ATGTTGCGAC CGGCGCGCAG GCCGTTGCCC GGTCACTCGA CTGGACCAAG6700GTCACACTTG ATGGTCGCCC CCTTTCCACC ATCCAGCAGT ATTCAAAGAC6750CTTCTTTGTC CTGCCGCTCC GCGGTAAGCT CTCCTTTTGG GAGGCAGGAA6800CTACTAAAGC CGGGTACCCT TATAATTATA ACACCACTGC TAGTGACCAA6850CTGCTCGTTG AGAATGCCGC TGGGCATCGG GTTGCTATTT CCACCTACAC6900TACTAGCCTG GGTGCTGGCC CCGTCTCTAT TTCCGCGGTT GCTGTTTTAG6950CCCCCCACTC TGTGCTAGCA TTGCTTGAGG ATACCATGGA CTACCCTGCC7000CGCGCCCATA CTTTCGATGA CTTCTGCCCG GAGTGCCGCC CCCTTGGCCT7050CCAGGGTTGT GCTTTTCAGT CTACTGTCGC TGAGCTTCAG CGCCTTAAGA7100TGAAGGTGGG TAAAACTCGG GAGTTATAGT TTATTTGCTT GTGCCCCCCT7150TCTTTCTGTT GCTTATTT 7168(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi) 序列描述SEQ ID NO5ACATTTGAAT TCACAGACAT TGTGC25(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度26堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO6ACACAGATCT GAGCTACATT CGTGAG 26(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度26堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO7AAAGGGATCC ATGGTGTTTG AGAATG 26(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi) 序列描述SEQ ID NO8ACTCACTGCA GAGCACTATC GAATC25(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO9CGGTAAACTG GTACTGCACA AC 22(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO10AAGTCCCGCT CTATTACCCA AG 22(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO11
ACCCACGGGT GTTGGTTTTT 21(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO12TTCTTGGGGC AGGTAGAGAA G21(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度26堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO13TTATTGAATT CATGTCAACG GACGTC 26(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO14AATAATTCAT GCCGTCGCTC C21(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO15AAGCTCAGGA AGGTACAACT C21(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO16AAATCGATGG CTGGGATCTG ATTC 24(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO17GAGGCATTGT AGAGCTTTGT G21(2)SEQ ID NO18的信息
(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO18GATGTTGCAC GGACAGCAAA TC 22(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO19ATCTCCGATG CAATCGTTAA TAAC 24(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO20TAATCCATTC TGTGGCGAGA G21(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征
(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO21AAGTGTGACC TTGGTCCAGT C21(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度23堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO22TTGCTCGTGC CACAATTCGC TAC 23(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO23CATTTCACTG AGTCAGTGAA G21(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸
(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO24TAATTATAAC ACCACTGCTA G21(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO25GATTGCAATA CCCTTATCCT G21(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度23堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO26ATTAAACCTG TATAGGGCAG AAC 23(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi) 序列描述SEQ ID NO27AAGTTCGATA GCCAGATTTG C21(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO28TCATGTTGGT TGTCATAATC C21(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO29GATGACGCAC TTCTCAGTGT G21(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO30
AGAACAACGA ACGGAGAAC 19(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO31AGATCCCAGC CATCGACTTT G21(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO32TAGTAGTGTA GGTGGAAATA G21(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO33GTGTGGTTAT TCAGGATTAT G21(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO34ACTCTGTGAC CTTGGTTAAT G21(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) 線性(xi) 序列描述SEQ ID NO35AACTCAAGTT CGAGGGCAAA G21(2) SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO36CGCTTACCCT GTTTAACCTT G21(2)SEQ ID NO37的信息
(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO37ATCCCCTATA TTCATCCAAC CAAC 24(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO38CTCCTCATGT TTCTGCCTAT G21(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO39GCCAGAACGA AATGGAGATA GC 22(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征
(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO40CTCAGACATA AAACCTAAGT C21(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO41TGCCCTATAC AGGTTTAATC G21(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO42ACCGGCATAT ACCAGGTGC 19(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)
(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO43ACATGGCTCA CTCGTAAATT C21(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO44AACATTAGAC GCGTTAACGA G21(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO45CTCTTTTGAT GCCAGTCAGA G21(2)SEQ ID NO46的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO46ACCTACCCGG ATGGCTCTAA GG 22(2)SEQ ID NO47的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO47TATGGGAATT CGTGCCGTCC TGAAG25(2)SEQ ID NO48的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO48AGTGGGAGCA GTATACCAGC G21(2)SEQ ID NO49的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi) 序列描述SEQ ID NO49CTGCTATTGA GCAGGCTGCT C21(2)SEQ ID NO50的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO50GGGCCATTAG TCTCTAAAAC C21(2)SEQ ID NO51的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO51GAGGTTTTCT GGAATCATC 19(2)SEQ ID NO52的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度15堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO52
GCATAGGTGA GACTG 15(2)SEQ ID NO53的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度18堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO53AGTTACAGCC AGAAAACC18(2)SEQ ID NO54的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQID NO54CCATGGATCC TCGGCCTATT TTGCTGTTGC TCC 33(2)SEQ ID NO55的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度18堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO55AGGCAGACCA CATATGTG18(2)SEQ ID NO56的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO56GGTGCACTCC TGACCAAGCC 20(2)SEQ ID NO57的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO57ATTGGCTGCC ACTTTGTTC 19(2)SEQ ID NO58的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO58ACCCTCATAC GTCACCACAA C21(2)SEQ ID NO59的信息
(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO59GCGGTGGACC ACATTAGGAT TATC 24(2)SEQ ID NO60的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO60CATGATATGT CACCATCTG 19(2)SEQ ID NO61的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度19堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO61GTCATCCATA ACGAGCTGG 19(2)SEQ ID NO62的信息
(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO62AGCGGAATTC GAGGGGCGGC ATAAAGAACC AGG 33(2)SEQ ID NO63的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO63GCGCTGAATT CGGATCACAA GCTCAGAGGC TATGCC36(2)SEQ ID NO64的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO64GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC 30(2)SEQ ID NO65的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度30堿基對(duì)
(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO65TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG 30(2)SEQ ID NO66的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度38堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO66AAATTGGATC CTGTGTCGGG TGGAATGAAT AACATGTC 38(2)SEQ ID NO67的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度37堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO67ATCGGCAGAT CTGATAGAGC GGGGACTTGC CGGATCC 37(2)SEQ ID NO68的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO68TACCCTGCCC GCGCCCATAC TTTTGATG 28(2)SEQ ID NO69的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO69GGCTGAGATC TGGTTCGGGT CGCCAAGAAG GTG 33(2)SEQ ID NO70的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO70TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG 27(2)SEQ ID NO71的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi) 序列描述SEQ ID NO71GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC29(2)SEQ ID NO72的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO72CCGTCGGATC CCAGGGGCTG CTGTCCTG 28(2)SEQ ID NO73的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO73AAAGGAATTC AAGACCAGAG GTAGCCTCCT C 31(2)SEQ ID NO74的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度28堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO74
GTTGATATGA ATTCAATAAC CTCGACGG 28(2)SEQ ID NO75的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度36堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO75TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATGAG36(2)SEQ ID NO76的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度26堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO76TCACTCGTGA ATTCCTATAC TAATAC 26(2)SEQ ID NO77的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度34堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO77TTTGGATCCT CAGGGAGCGC GGAACGCAGA AATG 34(2)SEQ ID NO78的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO78TGATAGAGCG GGACTTGCCG GATCC25(2)SEQ ID NO79的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO79TTGCATTAGG TTAATGAGGA TCTC 24(2)SEQ ID NO80的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO80ACCTGCTTCC TTCAGCCTGC AGAAG25(2)SEQ ID NO81的信息
(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO81GCGGTGGATC CGCTCCCAGG CGTCAAAAC29(2)SEQ ID NO82的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO82GGGCGGATCG AATTCGAGAC CCTTCTTGG29(2)SEQ ID NO83的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO83AGGATGGATC CATAAGTTAC CGATCAG 27(2)SEQ ID NO84的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度29堿基對(duì)
(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO84GGCTGGAATT CCTCTGAGGA CGCCCTCAC29(2)SEQ ID NO85的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO85GCCGAAGATC TATCGGACAT AGACCTC 27(2)SEQ ID NO86的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO86CAGACGACGG ATCCCCTTGG ATATAGCCTG 30(2)SEQ ID NO87的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度40堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈
(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO87GGCCGAATTC AGGCAGACCA CATATGTGGT CGATGCCATG40(2)SEQ ID NO88的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度25堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO88GCAGGTGTGC CTGGATCCGG CAAGT25(2)SEQ ID NO89的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO89GTTAGAATTC CGGCCCAGCT GTGGTAGGTC 30(2)SEQ ID NO90的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi) 序列描述SEQ ID NO90CCGTCCGATT GGTCTGTATG CAGG 24(2)SEQ ID NO91的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO91TACCAGTTTA CTGCAGGTGT GC 22(2) SEQ ID NO92的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO92CAAGCCGATG TGGACGTTGT CG 22(2)SEQ ID NO93的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO93
GGCGCTGGGC CTGGTCACGC CAAG 24(2)SEQ ID NO94的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO94GCAGAAACTA GTGTTGACCC AG 22(2)SEQ ID NO95的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度22堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO95TAGGTCTACG ACGTGAGGCA AC 22(2)SEQ ID NO96的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO96TACAATCTTT CAGGAAGAAG G21(2)SEQ ID NO97的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度21堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO97CCCACACTCC TCCATAATAG C21(2)SEQ ID NO98的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度24堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO98GATAGTGCTT TGCAGTGAGT ACCG 24(2)SEQ ID NO99的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO99GTATAACGGA TCCACATCTC CCCTTACCTC 30(2)SEQ ID NO100的信息
(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO100TACAGATCTA TACAACTTAA CAGTCGG 27(2)SEQ ID NO101的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度29堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO101GCGGCAGATC TCACCGACAC CATTAGTAC29(2)SEQ ID NO102的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO102TAACCTGGAT CCTTATGCCG CCCCTCTTAG 30(2)SEQ ID NO103的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度36堿基對(duì)
(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO103GCACAACCTA GGTTACTATA ACTCCCGAGT TTTACC36(2)SEQID NO104的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO104GGGTTCCCTA GGATGCGCCC TCGGCCTATT TTG 33(2)SEQ ID NO105的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO105CGTGGGCCTA GGAGCGGCGG TTCCGGCGGT GGT 33(2)SEQ ID NO106的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B) 類型核酸
(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO106GCTTGGCCTA GGCAGGCCCA GCGCCCCGCC GCT 33(2)SEQ ID NO107的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO107CCGCCACCTA GGGATGTTGA CTCCCGCGGC GCC 33(2)SEQ ID NO108的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度27堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(xi) 序列描述SEQ ID NO108TTCGGATCCA TGGCGGTCGC TCCGGCC 27(2)SEQ ID NO109的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度33堿基對(duì)(B) 類型核酸(C) 鏈型單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(xi) 序列描述SEQ ID NO109TCAAGCTTAT CATCATAGCA CAGAGTGGGG GGC 33(2)SEQ ID NO110的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度20氨基酸殘基(B) 類型氨基酸(C) 鏈型未知(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(xi) 序列描述SEQ ID NO110Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro5 10 15Val Pro Asp Val Asp20(2)SEQ ID NO111的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度20氨基酸殘基(B) 類型氨基酸(C) 鏈型未知(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(xi) 序列描述SEQ ID NO111Ala Ala Pro Leu Thr Ala Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro5 10 15Val Pro Asp Val Asp20
權(quán)利要求
1.一種DNA分子,其序列主要由編碼戊肝病毒開放讀碼框2蛋白第112至607位氨基酸的核苷酸構(gòu)成。
2.一種DNA分子,其序列主要由編碼戊肝病毒開放讀碼框2蛋白第112至578位氨基酸的核苷酸構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子,所述分子主要由編碼SEQ ID NO.2中第112至607位氨基酸的核苷酸構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子,所述分子的序列誘變成在第578位編碼異亮氨酸。
5.一種重組蛋白,主要由戊肝病毒開放讀碼框2蛋白第112至607位氨基酸構(gòu)成。
6.一種重組蛋白,主要由戊肝病毒開放讀碼框2蛋白第112至578位氨基酸構(gòu)成。
7.一種重組表達(dá)載體,包含權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的DNA分子。
8.產(chǎn)生重組戊肝病毒蛋白的方法,包括在適合所述蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求7所述表達(dá)載體的生物宿主。
9.一種用權(quán)利要求7所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的生物宿主。
10.檢測(cè)生物樣品中有否抗戊肝病毒抗體的方法,所述方法包括樣品接觸如權(quán)利要求5或6所述的蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,所述的生物樣品選自全血、血漿、血清、腦脊液、組織、尿液和胸液。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中檢測(cè)的是IgG或IgM抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中的重組HEV蛋白與固相支持物結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中用帶標(biāo)記抗體檢測(cè)免疫復(fù)合物。
15.用于權(quán)利要求10所述方法的試劑盒,它包括權(quán)利要求5或6所述的重組HEV蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒,還包括帶標(biāo)記的第二抗體。
17.一種藥物組合物,包含權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)和合適的賦形劑、稀釋劑或載體。
18.一種藥物組合物,包含權(quán)利要求6所述的蛋白質(zhì)和合適的賦形劑、稀釋劑或載體。
19.預(yù)防戊肝的方法,包括給予哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求17所述藥物組合物,所述有效量能夠刺激產(chǎn)生保護(hù)性抗體。
20.用于免疫哺乳動(dòng)物以抗戊肝感染的疫苗,包含權(quán)利要求5所述重組蛋白和藥學(xué)上認(rèn)可的載體。
21.檢測(cè)戊肝病毒的方法,包括將生物樣品與抗權(quán)利要求5或6所述蛋白的抗體接觸,與所述戊肝病毒形成免疫復(fù)合物。
22.抗HEV抗體,具有與權(quán)利要求5或6所述蛋白的特異性結(jié)合親和性。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的抗體,所述抗體是單克隆抗體。
24.用于哺乳動(dòng)物預(yù)防戊肝的試劑盒,它包括權(quán)利要求5所述的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及在真核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)戊肝巴基斯坦毒株(SAR-55)開放讀碼框2(ORF-2)蛋白質(zhì)。表達(dá)出的蛋白可以作為抗原用于診斷性免疫測(cè)試和/或作為免疫原或疫苗來抗戊肝感染。
文檔編號(hào)A61K39/29GK1260000SQ98806035
公開日2000年7月12日 申請(qǐng)日期1998年4月9日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月11日
發(fā)明者S·U·埃默森, R·H·珀塞爾, S·A·察廖夫, R·A·魯濱遜 申請(qǐng)人:美國(guó)政府健康及人類服務(wù)部
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1