專利名稱：α－甲基－對－酪氨酸抑制虹膜黑素細胞中黑色素的產(chǎn)生的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及阻滯酪氨酸酶合成的試劑的用途，用來防止由藥物治療或代謝失調(diào)誘發(fā)產(chǎn)生的黑色素沉積引起的永久性虹膜色素沉著。
背景技術(shù)：
拉坦前列素(13，14-二氫-17-苯基-18，19，20-三去甲PGF2α異丙基酯)是一種合成的前列腺素類似物(EP-A-0364317)，它以及天然來源的前列腺素、如PGF2α和PGE2，已被顯示在慢性治療過程中誘發(fā)猴虹膜的色素沉著增加(Selen G.，Stjernschantz J.，Resul B.“前列腺素誘發(fā)的靈長目虹膜色素沉著”，《眼科學(xué)調(diào)查》(Surv.Ophthalmol)1997；41，增刊2S125-S128)。應(yīng)答該前列腺素治療的確切機制是未知的，不過，眼睛顏色變暗必然伴發(fā)黑色素合成增加(黑素生成)。而且，在用拉坦前列素治療(Wistrand PJ，Stjernschantz J.，Olsson K.“作為眼睛顏色的函數(shù)，拉坦前列素誘發(fā)的虹膜色素沉著的發(fā)生率和時間過程”，《眼科學(xué)調(diào)查》1997；41，增刊2S129-S138)或用異丙基烏諾前列酮(13，14-二氫-15-酮基-20-乙基PGF2α異丙基酯)治療(Yamamoto T.，Kitazawa Y.“局部異丙基烏諾前列酮治療后形成的虹膜顏色改變”，《青光眼雜志》(J.Glaucoma)1997；6430-432)的患者中，虹膜顏色變深有時在慢性療法過程中是引人注意的。特別是虹膜異色的患者、也就是眼睛顏色為藍棕色、灰棕色、綠棕色或淡褐色的患者，似乎更易患這種副作用。由于該副作用可能不利于美容，特別是患有單側(cè)青光眼的患者，只對一只眼進行治療，并且由于該副作用是不可逆的和相當(dāng)頻繁的，因此避免其發(fā)生會是有利的，盡管它似乎不會對該患者造成健康上的危害。
黑色素是一種大量天然來源的聚合物，它是從酪氨酸這種氨基酸生成的。在生成黑色素的最初步驟，酪氨酸被羥基化為L-多巴，后者進一步被氧化為多巴醌。催化這兩種反應(yīng)的酶叫作酪氨酸酶。多巴醌是一種不穩(wěn)定化合物，它轉(zhuǎn)化為多巴色素，這是一種生成DHICA(二羥基吲哚羧酸)低聚物所必需的黑色化合物，該低聚物又是最終的聚合反應(yīng)得到真黑色素(黑色或棕色黑色素)所必需的。另外，多巴醌也能與半胱氨酸反應(yīng)，生成含有硫的低聚物，最終生成pheomelanin(微黃色或微紅色黑色素)。重要的是認識到，在黑色素產(chǎn)生過程中的速率限制步驟是由酪氨酸酶催化的反應(yīng)。例如由于酪氨酸酶基因突變而引起的功能性酪氨酸酶的缺乏總是導(dǎo)致白化病，這是因為體內(nèi)沒有色素可供生成。有趣的是，交感神經(jīng)元和腎上腺髓質(zhì)也需要相同的酪氨酸酶來產(chǎn)生去甲腎上腺素、這是一種神經(jīng)遞質(zhì)，和腎上腺素、這是一種激素，這又是因為這些化合物是從酪氨酸經(jīng)過生物合成得到的。因此，阻滯酪氨酸酶的化合物將不僅對黑素原生成有影響，而且對交感神經(jīng)系統(tǒng)也有影響。
發(fā)明概述現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶的抑制劑、特別是α-甲基-對-酪氨酸，抑制由PGF2α和PGE2衍生物、如拉坦前列素和烏諾前列酮給藥誘發(fā)的黑色素產(chǎn)生。
因此，在前列腺素衍生物對青光眼患者給藥前、給藥中或給藥后用所述酪氨酸酶抑制劑治療，抑制虹膜黑素細胞產(chǎn)生黑色素，避免了這些患者的眼睛顏色變異。
發(fā)明的詳細說明用于阻滯酪氨酸酶合成的經(jīng)典試劑是α-甲基-對-酪氨酸，這是一種名為甲基酪氨酸的已知藥物(《美國化學(xué)會會志》77，700，1958)，它是該酶的假底物。于是不生成L-多巴，所以既不能生成黑色素，也不能生成腎上腺素/去甲腎上腺素。該藥物已被用于嗜鉻細胞瘤的緩和治療，這是一種腎上腺髓質(zhì)腫瘤，導(dǎo)致血液中出現(xiàn)高濃度的兒茶酚胺，從而升高血壓。以足夠高濃度使用的α-甲基-對-酪氨酸能夠顯著阻滯腎上腺素/去甲腎上腺素以及黑色素的生物合成。當(dāng)以臨床濃度用于治療嗜鉻細胞瘤時，體內(nèi)的兒茶酚胺濃度明顯降低了(Weiner N.，“抑制腎上腺素能神經(jīng)和阻滯腎上腺素能受體的藥物”，見Goodman GilmanA.，Goodman LS，Rall TW，Murad F.編著的《Goodman和Gilman氏治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)》，Macmillan，紐約，1985，pp 181-214)，在本發(fā)明的體外實驗中，黑色素的產(chǎn)生顯著降低了。實質(zhì)上，任何干擾酪氨酸酶的試劑都將具有同樣的有益作用，阻滯黑色素的產(chǎn)生。
這樣的試劑是例如羥基醌和可與銅離子反應(yīng)的物質(zhì)，因為銅是酪氨酸酶必需的輔因子，以及該酶的各種假底物。所以，如果這些試劑是分別給出或者是以混合物方式給出的，該混合物中同時含有拉坦前列素、異丙基烏諾前列酮或任意其他誘發(fā)黑素原生成的前列腺素，那么就能夠防止、至少能夠顯著阻礙虹膜中的色素生成。
α-甲基-對-酪氨酸的這種活性已被下列實驗證實材料和方法細胞培養(yǎng)物從成年供眼者分離眼色素層的黑素細胞，進行培養(yǎng)。切除虹膜，置于皿中，使后表面向上。在37℃的0.25％胰蛋白酶溶液(Gibco，USA)中浸漬2小時后，從基質(zhì)分離虹膜色素上皮。將剩余的虹膜基質(zhì)置于4℃的0.25％胰蛋白酶溶液中18小時，隨后在37℃下培養(yǎng)1小時。收集被分離的細胞。將胰蛋白酶溶液用膠原酶溶液(400U/ml，在F-12培養(yǎng)基中，Sigma，USA)代替，在37℃下培養(yǎng)。每小時替換膠原酶溶液，收集細胞，離心，再次懸浮，并鋪平板，進行3小時。
在Falcon培養(yǎng)皿(Becton Dickinson，USA)中，用FIC培養(yǎng)基培養(yǎng)已分離的眼色素層黑素細胞，F(xiàn)IC培養(yǎng)基由F-12培養(yǎng)基組成，其中補充了10％胎牛血清、2mM谷酰胺(均來自Gibco)、10ng/ml霍亂毒素、0.1mM異丁基甲基黃嘌呤、50μg/ml慶大霉素(均來自Sigma)、和20ng/ml基本成纖維細胞生長因子(Promega，USA)。培養(yǎng)皿在濕潤的5％CO2大氣中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)基一周更換三次。必要時加入3至7天的遺傳霉素(Sigma，USA)(100μg/ml)，這是一種細胞毒素試劑。
用于本項研究的8個細胞系的眼色素層黑素細胞是從具有不同虹膜顏色(棕色和棕藍色)的供體中分離的。
黑色素測量用胰蛋白酶-EDTA溶液分離經(jīng)過培養(yǎng)的眼色素層黑素細胞，在血細胞計數(shù)器中計數(shù)，將細胞懸液離心，將沉淀溶于1N NaOH。在475nm下測量光密度，藉此測定黑色素的濃度，并與利用合成黑色素(Sigma)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較。黑色素含量以ng/細胞表示。
黑色素產(chǎn)生量的計算利用下式，在每次產(chǎn)生的開始和結(jié)束時測定黑色素的含量和細胞數(shù)，藉此計算黑色素的產(chǎn)生量CP＝CtP-C0/1.3D(P-1)其中C0和Ct分別代表在時間為0和時間為t時每個細胞中的黑色素含量；P是時間t過程中的群體增加，D是眼色素層黑素細胞的加倍時間；CP是時間t過程中每天每個細胞的黑色素產(chǎn)生量。
酪氨酸酶活性利用Pomerantz法并作適應(yīng)性改進，在九個細胞系中評價酪氨酸酶的活性，該方法是以3H2O的測量為基礎(chǔ)的，3H2O由酶催化的酪氨酸的羥基化反應(yīng)釋放出來的。
結(jié)果當(dāng)以最高摩爾濃度加入拉坦前列素時，從5個棕色虹膜的細胞系和3個棕藍色虹膜的細胞系培養(yǎng)得到的虹膜黑素細胞中的黑色素含量顯示出增加了。對黑色素的產(chǎn)生量和酪氨酸酶的活性也發(fā)現(xiàn)了同樣結(jié)果(表1和2)。
加入α-甲基-對-酪氨酸(10-5M)后，在含有10-7至10-5M拉坦前列素的從棕色虹膜和棕藍色虹膜培養(yǎng)得到的黑素細胞中都發(fā)現(xiàn)，黑色素的含量和產(chǎn)生量以及酪氨酸酶的活性都顯著降低了(表1和2)。
這些結(jié)果顯示，α-甲基-對-酪氨酸抑制了虹膜黑素細胞產(chǎn)生黑色素。
本發(fā)明也涉及藥物組合物，該藥物組合物含有具有抗青光眼活性的PGF2α或PGE2衍生物和作為聯(lián)合制劑的酪氨酸酶抑制劑，同時、單獨或連續(xù)地用在青光眼療法中。特別是本發(fā)明涉及藥物產(chǎn)品，該產(chǎn)品含有拉坦前列素作為抗青光眼的試劑、和α-甲基-對-酪氨酸作為聯(lián)合制劑，同時、單獨或連續(xù)地用在青光眼療法中。
對所考慮的治療用途來說，α-甲基-對-酪氨酸將優(yōu)選地通過局部途徑或口服途徑給藥，每日劑量約為100-500mg。
盡管本說明書特別涉及了對拉坦前列素誘發(fā)產(chǎn)生黑色素的抑制作用，α-甲基-對-酪氨酸也能夠成功地用來抑制由其他不同來源的藥物治療或代謝失調(diào)誘發(fā)產(chǎn)生的色素沉著這一相同的副作用。
表15個細胞系(棕色)-生長階段-黑色素含量(ng/細胞)無α-甲基-對-酪氨酸 α-甲基-對-酪氨酸10-5無拉坦前列素(對照)0.01380.0133拉坦前列素10-8M 0.01410.0135拉坦前列素10-7M 0.01510.0136拉坦前列素10-6M 0.0161* 0.0137拉坦前列素10-5M 0.0149* 0.0131*相對對照而言p＜0.01黑色素產(chǎn)生量(ng/細胞/天)無α-甲基-對-酪氨酸 α-甲基-對-酪氨酸10-5無拉坦前列素(對照)0.0031 0.0033拉坦前列素10-8M 0.0038 0.0035拉坦前列素10-7M 0.0046* 0.0039拉坦前列素10-6M 0.0036 0.0029拉坦前列素10-5M 0.0047* 0.0031*相對對照而言p＜0.01
酪氨酸酶活性(單位)無α-甲基-對-酪氨酸 α-甲基-對-酪氨酸10-5無拉坦前列素(對照) 36.7 33.6拉坦前列素10-8M 36.7 35.5拉坦前列素10-7M 38.3 38.7拉坦前列素10-6M 42.5 34.6拉坦前列素10-5M 63.1*31.5*相對對照而言p＜0.01表23個細胞系(棕藍色)-生長階段-黑色素含量(ng/細胞)無α-甲基-對-酪氨酸 α-甲基-對-酪氨酸10-5無拉坦前列素(對照) 0.0121 0.0122拉坦前列素10-8M 0.0127 0.0119拉坦前列素10-7M 0.0142* 0.0123拉坦前列素10-6M 0.0149* 0.0125拉坦前列素10-5M 0.0151* 0.0128*相對對照而言p＜0.01黑色素產(chǎn)生量(ng/細胞/天)無α-甲基-對-酪氨酸 α-甲基-對-酪氨酸10-5無拉坦前列素(對照) 0.00210.0023拉坦前列素10-8M 0.00380.0025拉坦前列素10-7M 0.0046* 0.0029拉坦前列素10-6M 0.0056* 0.0029拉坦前列素10-5M 0.0067* 0.0031*相對對照而言p＜0.01
酪氨酸酶活性(單位)無α-甲基-對-酪氨酸 α-甲基-對-酪氨酸10-5無拉坦前列素(對照)32.5 32.4拉坦前列素10-8M 33.7 34.6拉坦前列素10-7M 48.1*31.7拉坦前列素10-6M 52.5*34.6拉坦前列素10-5M 62.7*39.5*相對對照而言p＜0.0權(quán)利要求
1.酪氨酸酶抑制劑在藥物制備中的用途，該藥物防止由藥物治療或代謝失調(diào)誘發(fā)的虹膜黑素細胞產(chǎn)生黑色素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中黑色素的產(chǎn)生是由PGF2α或PGE2衍生物誘發(fā)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中該PGF2α或PGE2衍生物是拉坦前列素或烏諾前列酮。
4.根據(jù)任意一項前述權(quán)利要求的用途，其中該酪氨酸酶抑制劑是α-甲基-對-酪氨酸。
5.藥物組合物，含有作為抗青光眼試劑的PGF2α衍生物、和作為聯(lián)合制劑的酪氨酸酶抑制劑，同時、單獨或連續(xù)地用在青光眼的療法中。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥物組合物，含有作為抗青光眼試劑的拉坦前列素、和作為聯(lián)合制劑的α-甲基-對-酪氨酸，同時、單獨或連續(xù)地用在青光眼的療法中。
7.防止虹膜黑素細胞產(chǎn)生黑色素的方法，該方法包括將有效量的酪氨酸酶抑制劑給藥。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中該酪氨酸酶抑制劑是α-甲基-對-酪氨酸。
全文摘要
描述了阻滯酪氨酸酶合成的試劑的用途,用來防止由藥物治療或代謝失調(diào)誘發(fā)產(chǎn)生的黑色素沉積引起的永久性虹膜色素沉著。
文檔編號A61P43/00GK1255064SQ98804999
公開日2000年5月31日 申請日期1998年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月22日
發(fā)明者F·德拉戈 申請人:法瑪西雅和厄普約翰公司