專利名稱：登革病毒的前m/m蛋白的表位、合成肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程學(xué)領(lǐng)域，并涉及重組DNA技術(shù)，尤其涉及編碼登革病毒血清型2的前M/M蛋白的合成肽及含有登革病毒血清型2和4的前M/M蛋白表位的嵌合蛋白的生產(chǎn)。
本技術(shù)目的是鑒別與所有登革病毒血清型交叉反應(yīng)的前M/M中和及保護(hù)性表位，以獲得用于人體免疫接種的免疫原。
現(xiàn)有技術(shù)登革病毒屬于黃病毒科，黃病毒屬(Westaway，E.G.et al，1985，黃病毒科，Intervirol.24 p.183)，其是一種具有一正極性單RNA鏈作為遺傳物質(zhì)的包膜病毒，該遺傳物質(zhì)編碼通過細(xì)胞及病毒蛋白酶在共轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)導(dǎo)后加工的多蛋白。
在病毒膜內(nèi)有兩種結(jié)構(gòu)蛋白E(包膜)和M(膜)，還有一些其它結(jié)構(gòu)蛋白形成等軸核衣殼的C(衣殼)。另外已鑒定出至少7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5)。
糖蛋白E及NS1能獨(dú)立地提供抗登革病毒同源血清型的主動(dòng)及被動(dòng)保護(hù)，而相關(guān)表位的高度構(gòu)象復(fù)雜性仍被保持。由此重組真核細(xì)胞系已被主要選出作為這些蛋白質(zhì)的免疫評(píng)價(jià)體系，如痘苗病毒(Bray，M.et.al.1989，用表達(dá)帶或不帶非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的登革-4結(jié)構(gòu)蛋白的重組痘苗病毒免疫的小鼠被保護(hù)不患致命的登革病毒腦炎，J.Virol，63 p2853)及桿狀病毒(Zhang.Y.M.et al.1988，用桿狀病毒重組子表達(dá)的登革結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1免疫小鼠誘導(dǎo)對(duì)登革病毒腦炎的抗性，J.Virol.62 p3027)。
小蛋白M(8kDa)以名為前M(大約22kDa)的糖基化的前體合成，其在感染細(xì)胞釋放病毒之前或之后被晚期內(nèi)切蛋白裂解(Murray，J.M.et al.1993，登革病毒2型蛋白prM和C-prM的加工，J.Gen.Virol.74 p175)。大概由細(xì)胞蛋白酶進(jìn)行的裂解似乎發(fā)生在后高爾基體酸性小泡內(nèi)，被使此小泡低pH去穩(wěn)定的制劑抑制(Randolph，v.B.et al.1990，嗜酸性胺抑制黃病毒prM蛋白的蛋白裂解加工，Virol.174 p450)。前片段在體外只在細(xì)胞外介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)，其在體內(nèi)的去處仍是未知數(shù)(Murray，J.M.et al.1993，登革病毒2型蛋白prM和C-prM的加工，J.Gen.Virol.74 p.175)。據(jù)認(rèn)為在黃病毒胞吐期間，前M/M的功能是避免E的融合膜區(qū)域被環(huán)境的酸性PH活化(Randolph.V.B.et al.1990，嗜酸性胺抑制黃病毒prM蛋白的蛋白裂解加工，Virol 174 p.450)；如果該事件發(fā)生，則病毒的釋放將被阻止。事實(shí)上已確定前M與E在未成熟胞內(nèi)病毒顆粒內(nèi)相互作用(Wengler，G.y Wengler，G.1989，細(xì)胞相關(guān)的西尼羅黃病毒由E+前M蛋白異二聚體包被，該異二聚體在病毒釋放期間由蛋白裂解破壞和重構(gòu)，J.Virol.63 p.2521)，且E的天然構(gòu)象只在前M存在下可獲得(Konishi，E.y Mason，P.W.1993，日本腦炎病毒包膜糖蛋白的正確成熟需要與前膜蛋白共合成，J.Virol.67 p.1672)。另外已經(jīng)釋放的在其膜內(nèi)只有前M的病毒顆粒通常呈現(xiàn)出比完全成熟的病毒顆粒低的感染性(Wengler，G.y Wengler，G.1989，細(xì)胞相關(guān)的西尼羅黃病毒由E+前M蛋白異二聚體包被，該異二聚體在病毒釋放期間由蛋白裂解破壞和重構(gòu)，J.Virol.63 p.2521)，其中盡管存在M及前M，但前者是主要的。
當(dāng)前M及M在重組痘苗病毒中被表達(dá)時(shí)，其提供一主動(dòng)保護(hù)作用，但不是與前片段一起發(fā)生(Brag，M.y Lai，C.-J.1991.登革病毒前膜和膜蛋白激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，Virol.185 p.5057)，另外，前M或M與糖蛋白E組合在相同重組痘苗病毒中提供的保護(hù)水平一般高于那些由每個(gè)蛋白單獨(dú)所達(dá)水平。相似地，在鼠體內(nèi)抗前M/M的某些抗體能被動(dòng)地保護(hù)(Kaufman，B.M.et al，1989.登革病毒prM糖蛋白的單克隆抗體保護(hù)小鼠免受致死性登革感染，Am J.Trop.Med.&Hyg.41 p.576)合成肽的應(yīng)用使得能證實(shí)根據(jù)空間構(gòu)象的抗原性的分子基礎(chǔ)及所涉及抗原的免疫學(xué)性質(zhì)[Arnon，R.y Sda，-M.1985.合成疫苗現(xiàn)狀及未來，Ann.Inst.Pasteur/Immunol 136 D.271-282]。作為抗登革病毒疫苗亞單位的合成肽使得在最終配制品中只包括不引起免疫擴(kuò)增的保護(hù)表位(Halstead，S.B.y O’Ruourke，E.J.1977.登革病毒和單核巨噬細(xì)胞，I.非中和抗體的感染促進(jìn)作用，J.Exp.Med.14 p.201；Halstead，S.B.1979，被動(dòng)傳遞的抗體對(duì)獼猴中登革感染的體內(nèi)促進(jìn)作用，J.Infect.Dis.140 p.527)，或包括四種血清型的保護(hù)性肽。E和NS1的抗原決定簇的鑒定已成功進(jìn)行。但對(duì)同樣重要的前M/M蛋白沒有類似的研究，這也是本文的結(jié)果是這一方向的第一步的原因。
在E.coli中表達(dá)黃病毒蛋白前M、M及E的嘗試還未盡善盡美(Chambers，T.J.et al.1990，黃熱病毒蛋白在感染細(xì)胞中的產(chǎn)生不連續(xù)的多蛋白種類的鑒定及使用區(qū)域特異性多克隆抗血清對(duì)裂解動(dòng)力學(xué)的分析，Virol.177 p.159；Yan，B.-S.et al.1994，截短潛在的膜結(jié)合區(qū)克服了在大腸桿菌中表達(dá)丙型肝炎病毒蛋白E1的困難，J.Virol.Meths 49 p.343)。顯而易見地，這些蛋白質(zhì)在C-末端的疏水區(qū)域是導(dǎo)致低的或不可測(cè)異源表達(dá)水平的原因(Yah，B.-S.et al.1994.截短潛在的膜結(jié)合區(qū)克服了在大腸桿菌中表達(dá)丙型肝炎病毒蛋白E1的困難，J.Virol.Meths.49 p-343)。
那些蛋白質(zhì)(以及NS1)在E.coli中的表達(dá)一般已經(jīng)通過與其它細(xì)菌蛋白如β-半乳糖苷酶(Cane，P.A.y Gould，E.A.1988，通過用細(xì)菌合成的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)片段免疫降低黃熱病小鼠神經(jīng)毒力，J.Gen.Virol.69 p.1241)、TRPE(Megret，F(xiàn).et al.1992.利用重組融合蛋白和單克隆抗體確定登革病毒包膜糖蛋白上的線性和不連續(xù)抗原位點(diǎn)，Virol.187 p.480)及金黃色葡萄球菌的A蛋白(Murray，J.M.etal.1993.登革病毒2型蛋白prM和C-prM的加工，J.Gen.Virol.74p.175)融合而獲得。在這些融合蛋白中，大多數(shù)相關(guān)構(gòu)象表位缺失，這是因?yàn)楸M管產(chǎn)生的抗病毒的抗血清能識(shí)別全病毒，但它們不能中和它也不能抑制其凝血性質(zhì)(Megret，F(xiàn).et al.1992.利用重組融合蛋白和單克隆抗體確定登革病毒包膜糖蛋白上的線性和不連續(xù)抗原位點(diǎn)，Virol.187 p.480)。但最近報(bào)導(dǎo)顯示融合蛋白的可溶性及作為結(jié)果應(yīng)用非變性方法將其純化可保護(hù)大多數(shù)其具有的中和表位(Seif，S.A.et al.1995.在重組大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的日本腦炎病毒E蛋白的C-末端上的中和表位的更精細(xì)定位，Vaccine 13 p.1515)及保護(hù)性表位(Srivastowa.A.K.et al.1995.用在大腸桿菌中制備的登革病毒2型E和NS1融合蛋白免疫的小鼠被保護(hù)不受致死性登革病毒感染Vaccine 13 p.1251)。
在前M/M情況下，其前功能域有6個(gè)參與3個(gè)二硫鍵的半胱氨酸，及在天冬酰胺69內(nèi)的N-糖基化位點(diǎn)。E和NS1的結(jié)構(gòu)甚至更復(fù)雜，其包含6個(gè)二硫鍵及幾個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。但M的小胞外域明顯沒有那些構(gòu)象復(fù)雜性，因?yàn)槠錄]有半胱氨酸，且其天然構(gòu)型無糖基化。
異源片段在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)較多或較少了解的免疫原性蛋白質(zhì)允許區(qū)域內(nèi)的插入及這些融合物的免疫作用是合成肽應(yīng)用的互補(bǔ)選擇。兩種策略都能確定順序B細(xì)胞及T細(xì)胞表位的存在。這些表位的生物學(xué)重要性能通過實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)以判定在某些疫苗制備物中是否可包括它們。
發(fā)明詳述來自登革2型病毒前M/M蛋白、包括58％氨基酸序列(97/166AA)的5種肽被化學(xué)合成。它們是3-31；45-67；57-92；69-93及103-124，其被依次稱為B19-6；B20-2；B19-5；B20-1；B20-3。
將與載體蛋白綴合或未綴合的肽接種在Balb/c小鼠體內(nèi)。用綴合肽免疫后所得血清經(jīng)降低噬斑數(shù)的體外中和及ELISA測(cè)試。我們還研究了在免疫小鼠體內(nèi)抗登革病毒2型攻擊的主動(dòng)保護(hù)作用。
在用非綴合肽免疫的小鼠體內(nèi)，抗登革2型病毒的抗體應(yīng)答經(jīng)ELISA評(píng)價(jià)，且T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)也同時(shí)評(píng)價(jià)。
還獲得了融合蛋白，且由肽(1-42及92-133)所覆蓋的4個(gè)區(qū)域中的2個(gè)被插入其中，并在E.coli中表達(dá)。用這些融合物的免疫接種將互補(bǔ)用合成肽所得結(jié)果。
在小鼠及人中B細(xì)胞表位的存在被證實(shí)，是由于經(jīng)ELISA肽被免疫的小鼠的抗體及具有登革病毒的臨床及血清診斷的病人血清識(shí)別。肽19-6和20-3能誘導(dǎo)抗四種登革病毒血清型的中和抗體的產(chǎn)生。
病毒特異性增殖應(yīng)答在經(jīng)非綴合肽19-6及19-5免疫的小鼠體內(nèi)證實(shí)。用綴合肽19-6、20-1及19-5免疫的小鼠示出當(dāng)它們經(jīng)登革2型病毒攻擊時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效的保護(hù)水平。
這樣在登革2型病毒前M/M蛋白中順序表位的存在及其在抗這些黃病毒的免疫應(yīng)答中的相關(guān)性被證實(shí)。
實(shí)施例1登革病毒前M/M蛋白的抗原區(qū)及T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)不同理論方法用于預(yù)測(cè)D2病毒前M/M蛋白中的抗原區(qū)。這些區(qū)域是那些可能被所得抗病毒蛋白抗體所識(shí)別及產(chǎn)生識(shí)別初始蛋白的抗體的區(qū)域。一些預(yù)測(cè)T細(xì)胞表位的方法被應(yīng)用。
五種具有可能的B-及T細(xì)胞表位(4個(gè)在前M，1個(gè)在M)的初始肽被發(fā)現(xiàn)，對(duì)這些蛋白質(zhì)的抗原結(jié)構(gòu)的研究及可能具有免疫學(xué)重要性的肽的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的研究基于此發(fā)現(xiàn)。
1.1人抗原性的預(yù)測(cè)用于預(yù)測(cè)抗原性的方法基于氨基酸序列，是由于登革病毒前M/M蛋白的三維結(jié)構(gòu)未經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，且與已知三維結(jié)構(gòu)蛋白在序列水平?jīng)]有明顯類似。
1981年在古巴分離的登革2型病毒A15毒株(Kouri G.et al.1986.古巴的出血性登革病流行史，Bull.P.A.H.O 20 p.24)用于完成本實(shí)施例。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)選擇潛在抗原區(qū)a)根據(jù)不同預(yù)測(cè)方法，基于親水性(Hoop，T.P.y Woods.K.R.1981.從氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白抗原決定簇，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78 p.3824；Parker，J.M.R.et al.1986.從HPLC肽保留數(shù)據(jù)得出的新親水性預(yù)測(cè)的表面殘基與抗原性和X-射線衍生的可及位點(diǎn)的相關(guān)性，Biochemistry 25 p.5425)，柔性(Karplus，P.A.y Schultz，G.E.1985.蛋白質(zhì)中的鏈柔性預(yù)測(cè)，選擇肽抗原的工具，Naturwissenschaften 72p.212)及可及性(Emini，E.A.et al.1985.由病毒特異性合成肽誘導(dǎo)甲型肝炎病毒中和抗體，J.Virol 55 p.836)的高抗原傾向的區(qū)域。
b)根據(jù)使用PHD的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)的具有形成環(huán)及轉(zhuǎn)角的高可能性的區(qū)域(Rost，B.y Sander，C.1993.蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)精度高于70％，J.Mol.Biol 232 p.584；Rost，B.y Sander，C.1994.結(jié)合進(jìn)化信息和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，Proteins 19 p.55；Rost，B.y Sander，C.1994.蛋白質(zhì)家族的溶劑可及性的保守及預(yù)測(cè)，Proteins 20 p.216)。
c)包括或不包括就其它黃病毒而言的插入/抑制的高變異性區(qū)域，及在登革病毒中應(yīng)用或未用的其它黃病毒中糖基化的潛在區(qū)域。
a)抗原性分布1示出當(dāng)賦予前M和M區(qū)段4種與抗原性相關(guān)的氨基酸特性時(shí)所得分布圖。
在前區(qū)域內(nèi)在具有6-9，16-21，28-31，42-47，58-65及82-91殘基的區(qū)域具有高親水性及可及性值。出乎意料的在相應(yīng)于跨膜螺旋的41-76殘基間巨大疏水區(qū)的存在被認(rèn)為未暴露于免疫系統(tǒng)。在M的小胞外域(殘基1-40)，主要親水性/可及性區(qū)域在13-31氨基酸之間，尤其在其起始處(AA13-16)。
b)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)圖2示出根據(jù)PHD程序的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)及前M及M區(qū)段的可及性。預(yù)測(cè)結(jié)果示出許多潛在抗原區(qū)(根據(jù)

圖1的分布圖)傾向于與在蛋白質(zhì)表面的暴露殘基形成環(huán)/β-轉(zhuǎn)角。預(yù)測(cè)在M蛋白41-76位氨基酸之間區(qū)域形成跨膜螺旋，這與此區(qū)域疏水性相吻合，并提示M蛋白的抗原性肽主要在胞外域(1-40)。
c)登革病毒及其它黃病毒前M及M蛋白的序列對(duì)比，變異性及糖基化對(duì)比通常未暴露于溶劑的區(qū)域在同源蛋白質(zhì)家族內(nèi)具有較大保守性，因而較高變異性的區(qū)域具有較高被暴露的概率。
對(duì)于病毒，變異性也是免疫學(xué)壓力一種逃避機(jī)制；當(dāng)然不能排除一些保守區(qū)域也許是抗原性的或在表面可能有保守區(qū)域。
對(duì)4種血清型登革病毒的15個(gè)分離株的前M及M區(qū)的序列分析示出至少69％的殘基是嚴(yán)格保守的。較重要的可變殘基在前M的28-30，55-59，69-72及80-83位，及在M的27-30位。通常這些區(qū)帶與圖1的抗原性分布圖的絕大部分相吻合。
在多于30個(gè)黃病毒分離物中這些區(qū)域的序列的比較示出前M的1-33區(qū)是高變異性的，并帶有傾向于插入/抑制(在8和30位)的可能存在的環(huán)及N-糖基化的一些潛在位點(diǎn)。相反，在前M的33-91區(qū)域是低變異性的；有一些部位在所有黃病毒中都是嚴(yán)格保守的，如形成3個(gè)二硫鍵的6個(gè)半胱氨酸，在40-65區(qū)域的至少5個(gè)酸性殘基，及87-91堿性序列，在此之后在成熟病毒釋放之前或期間內(nèi)發(fā)生蛋白酶裂解(圖3)。
抗原性登革復(fù)合物中保守的殘基Asn-69具有復(fù)合物前M/M蛋白的唯一N-糖基化。但在黃病毒家族，該區(qū)域位于高變異性的可能暴露的環(huán)內(nèi)。同時(shí)，與其它黃病毒內(nèi)潛在N-糖基化位點(diǎn)(如JE，SLE，MVE，YF中AA14及LI，LAN，YF，TBE中AA32)相吻合的登革病毒前M/M殘基是靠近被認(rèn)為是抗原性區(qū)的β-轉(zhuǎn)角。
1.2T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)經(jīng)兩種獨(dú)立方法進(jìn)行預(yù)測(cè)Rothbard及Taylor模式方法(Rothbard，J.B.y Taylor，W.R.1988.T細(xì)胞表位中共有的序列模式，EMBO.J.7.P.93)及有形成α-螺旋結(jié)構(gòu)[AMPHI 7及11]傾向的片段的確定(Margalit，H.et al.1987.從初級(jí)序列預(yù)測(cè)免疫優(yōu)勢(shì)輔助T細(xì)胞抗原位點(diǎn)，J.Immunol.138 p.2213)。結(jié)果示于圖4。
1.3為相關(guān)表位的鑒別而預(yù)計(jì)的肽中性及保護(hù)性肽的確定通常對(duì)更有效疫苗的研制是非常重要的，且來自高抗原性傾向區(qū)域的肽對(duì)其鑒別非常有用，尤其那些線型性質(zhì)的肽。
表1示出一系列包含傾向于具有D2病毒前M/M蛋白的B及T細(xì)胞表位(根據(jù)一些用于此實(shí)施例的預(yù)測(cè)方法)的區(qū)域的肽。如果該預(yù)測(cè)的正確性經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，則每個(gè)區(qū)域的免疫學(xué)重要表位將經(jīng)過設(shè)計(jì)每個(gè)區(qū)域中的肽而準(zhǔn)確排列。
表1.登革病毒前M/M蛋白中的預(yù)計(jì)的抗原性肽

實(shí)施例2.寡肽及寡核苷酸的化學(xué)合成2.1寡肽的合成所有的肽都用Boc-策略以固相在p-甲基二苯甲基胺樹脂(resinMBHA，BACHEM，瑞士)上合成。
保護(hù)性氨基酸經(jīng)BACHEM提供，氨基酸鏈反應(yīng)基團(tuán)的保護(hù)基是Arg(Tos)，ASP(OBzl)，Cys(4-Me-Bzl)，Glu(OBzl)，Lys(2-Cl-Z)，Trp(CHO)，Tyr(Cl2-Bzl)。所用的Asn，Gln及Pro在側(cè)鏈中沒有保護(hù)基。
Boc-氨基酸保護(hù)基的去掉是用在二氯甲烷中的37.5％三氟乙酸進(jìn)行的。二異丙基碳二亞胺(DIC)的原位活化用于每個(gè)殘基的偶聯(lián)反應(yīng)，Asn，Gln除外，這兩個(gè)氨基酸用DIC及在H，N-二甲基甲酰胺中的1-羥基苯并三唑活化。
樹脂的最終脫保護(hù)及肽釋放在特殊設(shè)備中進(jìn)行，所用步驟已知為L(zhǎng)ow-High HF。
在步驟的第一部分(Low HF)，保護(hù)性的樹脂系統(tǒng)用HF(25％)DMS(65％)p-甲酚(10％)在0℃處理120分鐘，在含Trp肽情況下，將該混合物用HF(25％)DMS(60％)EDT(10％)p-甲酚(5％)替換。然后將樹脂-肽用二乙基乙醚、二氯甲烷及2-丙酮洗數(shù)次，并真空干燥。
在步驟的第二部分(High HF)，將樹脂-肽用HF(90％)苯甲醚(10％)，在0℃處理60分鐘。
將粗產(chǎn)物用乙醚洗，然后用30％在水中的乙酸萃取，最后凍干。
將肽在BAKER C-18(4.6×100mm)柱中經(jīng)BP-HPLC，并在JEOL HX-110HF設(shè)備中以FAB作為電離方法經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定加以鑒定。
登革病毒前M/M蛋白中氨基酸序列及其定位示于表1。
2.2寡核苷酸的合成根據(jù)亞磷酰胺方法在Gene Assembler Plus設(shè)備中自動(dòng)合成寡核苷酸。
6種寡核苷酸的序列示于表2。
表2在每個(gè)末端內(nèi)產(chǎn)生的便于后期操作的XbaI及EcoRI位點(diǎn)分別以下劃線及雙下劃線示出，修飾的蛋白質(zhì)讀框由堿基三聯(lián)體表示。

實(shí)施例3肽與載體蛋白偶聯(lián)及免疫方案3.1肽與BSA的偶聯(lián)肽的偶聯(lián)以如下方式進(jìn)行
1.BSA的活化邊搖動(dòng)邊將以5μg/μl在二甲基甲酰胺中的80μl雙功能試劑間-馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)滴加入2.8mg牛白蛋白組分V(BSA)在250μl PBS中的溶解物中。然后將其在室溫保持振蕩30分鐘，并將混合物經(jīng)過PD10柱。
2.肽與活化的BSA偶聯(lián)將1mg肽溶于300μl PBS中的溶解物邊搖動(dòng)邊滴加入活化的BSA溶液中。將其在室溫保持3小時(shí)，并用Lowry方法檢測(cè)濃度。
3.2免疫方案與BSA連接的肽的免疫方案如下將4-6周齡的雄性Balb/c小鼠用50μg肽-BSA綴合物經(jīng)腹膜內(nèi)免疫。另外，進(jìn)行兩種免疫方案，一種用BSA而另一種用PBS。共進(jìn)行4次接種，每次相隔15天。在第一次劑量中使用弗氏完全佐劑，而其它次用弗氏不完全佐劑。在最后一次接種7天后從后眶靜脈取血樣。
將每個(gè)方案所得血清置于-20℃至后期使用。
實(shí)施例4體外蝕斑減少中和試驗(yàn)根據(jù)Morens所述進(jìn)行中和技術(shù)(Morens，D.M.et al.1985.在BHK-21細(xì)胞中經(jīng)半微量方法進(jìn)行的登革病毒的簡(jiǎn)化的蝕斑減少中和測(cè)定BHK懸浮試驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)蝕斑減少中和的比較。J.Clin.Microbiol.22p.250)。
制備抗肽血清和抗BSA對(duì)照物及陰性血清的1/10至1/640的稀釋液。將每個(gè)血清的稀釋液與具有15-20PFU/50μl的病毒(登革2型病毒A15株)稀釋液相接觸。
將混合物在37℃溫育1小時(shí)。將共50μl的每種混合物分成三份加入24孔培養(yǎng)盤中的BHK-21細(xì)胞中，然后在37℃在CO2溫育器中溫育4小時(shí)。接著加入0.5ml含羧甲基纖維素的培養(yǎng)基，并考慮使用的病毒血清型再溫育幾天。在這些天之后，進(jìn)行染色及計(jì)數(shù)由病毒產(chǎn)生的裂解蝕斑。
在每種情況下效價(jià)以可獲得50％蝕斑數(shù)的減少的稀釋度表示。結(jié)果示于表3。
表3抗19-6及20-3的抗肽血清的PRNT

實(shí)施例5 T細(xì)胞表位的鑒定在前M的肽中T細(xì)胞表位的存在可通過對(duì)游離肽(非綴合肽)免疫小鼠體內(nèi)引起的抗肽抗體應(yīng)答的研究加以評(píng)價(jià)。當(dāng)與首次用來實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)答相比，接觸過抗原的動(dòng)物在對(duì)加強(qiáng)劑量抗原的應(yīng)答中證實(shí)產(chǎn)生較高血清抗體。這些結(jié)果證實(shí)在這些肽中存在B細(xì)胞表位，并示出這些序列含有T細(xì)胞表位，其能體內(nèi)刺激Th活性以增進(jìn)抗體應(yīng)答效價(jià)。
脾T淋巴細(xì)胞的病毒特異性增殖應(yīng)答在肽免疫的BALB/C小鼠中被證實(shí)。來自19-6及19-5免疫小鼠的T細(xì)胞當(dāng)其與登革2型病毒培養(yǎng)時(shí)，在體外母細(xì)胞化發(fā)育分析中增殖。但20-2肽不能引起抗病毒的有效增殖應(yīng)答。其可能含有T細(xì)胞隱蔽表位，在肽游離形式中被識(shí)別，但不似在天然感染中優(yōu)勢(shì)免疫表位呈遞及病毒加工的結(jié)果。(圖5)實(shí)施例6 保護(hù)性分析將用1/2500稀釋度(相當(dāng)于100LD50致死量)活的小鼠適應(yīng)登革2型病毒(A15株)經(jīng)顱內(nèi)注射最后一次免疫7天后的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)小鼠觀測(cè)21天以上，觀測(cè)其發(fā)病率及死亡率。用Fisher’s檢驗(yàn)測(cè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。肽免疫的動(dòng)物及對(duì)照動(dòng)物的存活百分率示于圖6，由肽19-5，19-6及20-1引起的保護(hù)水平為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(p＜0.05)。
實(shí)施例7 間接ELISA檢測(cè)抗肽抗體人血清將肽19-6，20-1，20-2，20-3以10μg/ml在包被緩沖液中的濃度固定于培養(yǎng)板中，然后在4℃溫育過夜。加入用PBS-Tween稀釋200倍的血清。最后加入人/過氧化物酶全抗免疫球蛋白綴合物，接著加入底物(鄰苯二胺，H2O2，0.05M磷酸鹽檸檬酸緩沖液，PH5)。在ELISA讀數(shù)器中在492nm進(jìn)行讀數(shù)，并測(cè)定每種肽的截?cái)嘀怠?br> 所用血清來自經(jīng)用抗登革全抗體的血凝抑制技術(shù)(Clarke，D.H.yCasals，J.1958，節(jié)肢動(dòng)物攜帶的病毒的血凝及血凝抑制技術(shù)，Am.T.Trop Med.Hyg.7，p.561)及抑制作用的ELISA(Vazquez，S.，F(xiàn)emandez，R.1989，Utilizacion de un metodo de ELISA de Inhibicion enel diagnostico serologico de dengue，Rev.Cub.Med.Trop.41(1)p18-26)經(jīng)血清學(xué)診斷為登革病毒臨床感染的患者。
該研究包括在古巴1981年，巴拿馬1994年及哥斯達(dá)黎加1994年發(fā)生的流行的118例患者血清。登革2型病毒從這些病例中分離出，另外血清型1和4在哥斯達(dá)黎加分離出；它們根據(jù)在首次及二次感染情況下抑制血凝抗體的效價(jià)來分類。
46.6％的血清對(duì)所用的4種肽是陽性的。獲得對(duì)肽B19-6，20-1，20-2及20-3的陽性率分別為56.8％，79.6％，77.1％及83.1％。
經(jīng)樣本/截?cái)嘀档墓饷芏认禂?shù)計(jì)算的每種肽的反應(yīng)性平均指數(shù)是1.07，1.52，1.57及1.49。
小鼠血清如上所述使用間接ELISA，但使用與過氧化物酶綴合的抗小鼠Ig?？闺难逯兴每贵w效價(jià)通常為1/10000以上。
實(shí)施例8前M/M片段在腦膜炎奈瑟氏球菌P64k蛋白質(zhì)中的插入在此實(shí)施例中，登革2型病毒(A15株)及登革4型(814669株)的前M/M蛋白的表達(dá)片段(Zhao，B.et al.1986.全長(zhǎng)登革4型病毒DNA序列的克隆編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因的分析，Virol.155 p.77)插入在我們已預(yù)先鑒定的腦膜炎奈瑟氏球菌蛋白質(zhì)P64k中(Silva，R.et al.1992.編碼腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白的核苷酸序列及所述蛋白在疫苗制備物中的應(yīng)用，歐洲專利0 474 313，1997)，其已被證實(shí)在一些動(dòng)物模型中具有高免疫原性。此外，P64k在E.coli中的表達(dá)水平達(dá)到細(xì)菌總蛋白30％以上。
二聚體性質(zhì)的P64k蛋白(64kDa)在每個(gè)亞單位中有兩個(gè)功能區(qū)一個(gè)具有結(jié)合脂肪酸活性(1-100)，另一個(gè)具有硫辛酰胺脫氫酶活性(117-594)。二者均經(jīng)X射線晶體學(xué)被鑒定為相對(duì)獨(dú)立的構(gòu)象區(qū)(Li de La Sierra，I.et al.1994.來自腦膜炎奈瑟氏球菌的重組外膜蛋白的晶體學(xué)及初步X-射線研究，J.Mol.Biol.235 P.1154；Li dela Sierra，I.et al.1997.來自腦膜炎奈瑟氏球菌的表面抗原的硫辛酰胺脫氫酶區(qū)域的分子結(jié)構(gòu)，J.Mol.Biol 269 p.129)。
選擇前者(在45位氨基酸內(nèi))進(jìn)行前M/M的1-42及92-133片段的插入，這是由于此小區(qū)域更暴露且似乎不參與二聚體形成。這提示針對(duì)天然P64k，如果插入位點(diǎn)在117-594位區(qū)域，嵌合蛋白的球狀結(jié)構(gòu)變化較小，另外，其直接參與二聚體的形成。
將編碼氨基酸44-53(TLETDKATMD)的區(qū)域，其包括與用于融合蛋白生產(chǎn)的P64k基因的結(jié)合脂肪酸區(qū)域，初步改變?yōu)門LDLEMD。進(jìn)行該修飾以避免P64k被原發(fā)肝硬化患者血清識(shí)別，這種患者具有抗在線粒體脫氫硫辛酰胺乙酰基轉(zhuǎn)移酶中存在的同源表位的自身抗體(Tuaillon，N.et al.1992.由原發(fā)肝硬化中抗M2自身抗體特異識(shí)別的二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶的硫辛酰合成十八肽，J.Immunol.148 p.445)。
以下闡述了產(chǎn)生兩個(gè)克隆的策略將Pre-2，M-2及M-4片段經(jīng)PCR擴(kuò)增，分別使用寡核苷酸1和2，3和4及5和6組合(見表2)，并用pD-5質(zhì)粒做模板。此pD-5質(zhì)粒包括一克隆入pBluescript載體(Stratagene)中的登革2型病毒(A15株)前M/M基因的拷貝。將在每種情況下所得DNA條帶(120bp)用XbaI(Pre-2及M-2)或XbaI/EcoR I(M-4)消化，并將其克隆入在克隆入載體pM-92中的P64k基因的135-145位人工產(chǎn)生的相應(yīng)位點(diǎn)。此外，在已提及的XbaI及EcoR I位點(diǎn)中含有M-2和M-4條帶的嵌合克隆經(jīng)三重連接反應(yīng)產(chǎn)生。具有正確方向插入子的重組克隆經(jīng)限制性分析及DNA測(cè)序加以鑒定。
將由Pre-2(pD31)，M-2(pD30)，M-2/M-4(pD33)及M-4(pD34)的克隆產(chǎn)生的融合蛋白在E.coli MM294(Fˉend Al hsdR17(rk-mk+)sup E44 thi-1 relAl？RfbDl？SpoTl？)菌株中在色氨酸操縱子的啟動(dòng)子(ptrp)控制下表達(dá)。所有都獲得預(yù)期大小，并且表達(dá)水平在細(xì)菌總蛋白質(zhì)的30％以上，但PD31蛋白質(zhì)顯示高度不穩(wěn)定性(圖7)。所有融合蛋白在ELISA(數(shù)據(jù)未顯示)及Western印跡(圖8)中均被抗P64k的一些鼠單克隆抗體識(shí)別，其中檢測(cè)到在全細(xì)胞提取物中明顯的降解。這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列示于序列表。
用經(jīng)非變性手段半純化的PD33及PD34融合蛋白免疫小鼠在ELISA中具有抗其的高效價(jià)(高達(dá)1/100000)，并同時(shí)獲得在ELISA中抗合成肽的效價(jià)高達(dá)1/4000的抗體。
附圖描述圖1登革病毒前M(A)和M(B)蛋白的親水性，可及性及柔性分布圖。
圖2前M(A)及M(蛋白質(zhì))的二級(jí)結(jié)構(gòu)及可及性預(yù)測(cè)。AA氨基酸。PHD sec二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(E＝β，H＝螺旋，L＝環(huán))。P-3 acc可及性預(yù)測(cè)(e＝暴露，b＝未暴露)。Sub sec(Sub acc)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(可及性)靈驗(yàn)性為82.4％(70％)的殘基。
圖3前M及M蛋白的變異性分布圖。變異性考慮3套黃病毒序列而被計(jì)算出。Dengue15個(gè)登革分離物的序列。MTV由蚊子轉(zhuǎn)遞的黃病毒包括登革病毒、Kunji，西尼羅病毒，墨累山谷腦炎病毒及圣路易斯腦炎病毒。黃病毒30個(gè)以上不同黃病毒分離物的序列(MTV+黃熱病毒，Langat，跳躍病病毒及蜱傳腦炎病毒)。
圖4前M(A)及M(B)蛋白質(zhì)T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)AMPHI7(11)7(11)個(gè)殘基的兩親區(qū)段預(yù)測(cè)，陽性殘基是兩親性區(qū)段潛在抗原性的中心氨基酸。RT4(5)4(5)個(gè)殘基抗原性分布圖預(yù)測(cè)，陽性殘基是那些符合分布圖的殘基。
圖5肽免疫小鼠19-6，19-5及20-2的脾T細(xì)胞對(duì)登革2型病毒抗原的增殖應(yīng)答(在10，20及40μg/ml濃度)。
圖6肽免疫的和對(duì)照動(dòng)物中的存活百分率。由肽19-5，19-6及20-1誘導(dǎo)的保護(hù)水平是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。
圖7用融合蛋白及P64k蛋白(pM-92質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的MM294E.coli菌株的10％SDS-PAGE。泳道1-未轉(zhuǎn)化的MM294菌株，2-pM-92/MM294，3-pD-30/MM294，4-pD-31/MM294，5-pD-33/MM294，6-pD-34/MM294。
圖8應(yīng)用融合蛋白及P64k蛋白(pM-92質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的MM294E.coli菌株的ACM114的Western印跡。泳道1-未轉(zhuǎn)化的MM294菌株，2-pM-92/MM294，3-pD-30/MM294，4-pD-31/MM294，5-pD-33/MM294，6-pD-34/MM294。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱遺傳和生物技術(shù)工程中心(B)街道Ave.31 entre 158 y 190，Playa(C)城市哈瓦那(E)國(guó)家古巴(F)郵政編碼(ZIP)10600(G)電話53 7 218466(H)傳真53 7 218070/336008(A)名稱佩德羅庫(kù)利熱帶醫(yī)學(xué)研究所(B)街道Autopista Novia del Mediodia Km 6，La Lisa(C)城市哈瓦那(E)國(guó)家古巴(F)郵政編碼(ZIP)11100(G)電話53 7 220633(H)傳真53 7 335061(ii)發(fā)明名稱登革病毒的前M/M蛋白表位，合成肽及其應(yīng)用(iii)序列數(shù)9(iv)計(jì)算機(jī)閱讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(v)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朇U 13/97(B)申請(qǐng)日1997年1月15日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)是(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體登革病毒(B)毒株登革-2(C)具體分離物A-15(xi)序列描述SEQ ID NO1Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Met Arg Gln Glu1 5 10 15Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Gly Asp Gly Val20 25(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)是(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體登革病毒(B)毒株登革-2(C)具體分離物A-15(xi)序列描述SEQ ID NO2Cys Glu Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu1 5 10 15Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)是(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體登革病毒(B)毒株登革-2
(C)具體分離物A-15(xi)序列描述SEQ ID NO3Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser1 510 15Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg20 25 30Glu Lys Arg Ser35(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)是(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體登革病毒(B)毒株登革-2(C)具體分離物A-15(xi)序列描述SEQ ID NO4Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Gly1 5 10 15Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val20 25(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)是(iv)反義否(v)片段類型內(nèi)部(vi)原始來源(A)生物體登革病毒(B)毒株登革-2(C)具體分離物A-15(xi)序列描述SEQ ID NO5Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys1 5 10 15His Ala Gln Arg Ile Glu20(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度635個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)是(iv)反義否(vi)原始來源(A)生物體融合蛋白(vii)現(xiàn)有來源(B)克隆PD31(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn1 5 10 15Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val20 25 30Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp Phe His Leu Thr Thr Arg35 40 45Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser50 55 60Leu Leu Phe Lys Thr Gly Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala65 70 75 80Met Asp Leu Gly Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val85 90 95Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly100 105 110Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala115 120 125Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro130 135 140Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp145 150 155 160Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala165 170 175Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr180 185 190Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu195 200 205Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn210 215 220Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala225 230 235 240Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met245 250 255Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu260 265 270Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu275 280 285Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys290 295 300Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu305 310 315 320Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val325 330 335Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met340 345 350Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met355 360 365Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp370 375 380Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys385 390 395 400Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu405 410 415Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val420 425 430Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala435 440 445Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met450 455 460Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln465 470 475 480Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu485 490 495Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly500 505 510Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu513 520 525Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp530 535 540Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr545 550 555 560Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile565 570 575Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile580 585 590Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His595 600 605Pro Thr Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly610 615 620Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys625 630 635(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度635個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)是(iv)反義否(vi)原始來源(A)生物體融合蛋白(vii)現(xiàn)有來源(B)克隆PD30(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn1 5 10 15Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val20 25 30Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Ser Val Ala Leu Val Pro35 40 45His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser50 55 60Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg65 70 75 80His Pro Gly Phe Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val85 90 95Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly100 105 110Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala115 120 125Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro130 135 140Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp145 150 155 160Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala165 170 175Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr180 185 190Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu195 200 205Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn210 215 220Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala225 230 235 240Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met245 250 255Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu260 265 270Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu275 280 285Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys290 295 300Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu305 310 315 320Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val325 330 335Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met340 345 350Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met355 360 365Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp370 375 380Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys385 390 395 400Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu405 410 415Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val420 425 430Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala435 440 445Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met450 455 460Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln465 470 475 480Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu485 490 495Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly500 505 510Val Ala Tyr Thr Ser Pro Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu515 520 525Ser Ala Lys Ala Ser Gly Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp530 535 540Ala Ala Ser Gly Arg Ala Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr545 550 555 560Lys Leu Ile Phe Asp Ala Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile565 570 575Val Gly Pro Asn Gly Gly Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile580 585 590Glu Met Gly Cys Asp Ala Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His595 600 605Pro Thr Leu Gly Glu Ser Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly610 615 620Thr Cys Thr Asp Leu Pro Pro Gln Lys Lys Lys625 630 635(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度677個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)是(iv)反義否(vi)原始來源(A)生物體融合蛋白(vii)現(xiàn)有來源(B)克隆PD34(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn1 5 10 15Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val20 25 30Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Asp Phe His Leu Thr Thr Arg35 40 45Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys Ser50 55 60Leu Leu Phe Lys Thr Gly Asp Gly Val Asn Met Cys Thr Leu Met Ala65 70 75 80Met Asp Leu Gly Ser Val Ala Leu Val Pro His Val Gly Met Gly Leu85 90 95Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His100 105 110Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly Phe Leu Glu115 120 125Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val Val Lys Glu Val Lys Val130 135 140Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly Leu Ile Val Val Val Glu145 150 155 160Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Pro165 170 175Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gln Ala Ala Gln180 185 190Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp Val Val Val Leu Gly Gly195 200 205Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala Ala Ala Asp Glu Gly Leu210 215 220Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr Leu Gly Gly Val Cys Leu225 230 235 240Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu Leu His Asn Ala Ala Val245 250 255Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Pro Glu260265 270Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala Tyr Lys Asp Gly Val Val275 280 285Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met Ala Lys Ser Arg Lys Val290 295 300Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu Asp Pro His His Leu Glu305 310 315 320Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu Gln Ala Ala Pro Thr Gly325 330 335Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys Ile Ile Ala Ala Gly Ser340 345 350Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu Asp Pro Arg Ile Ile Asp355 360 365Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val Pro Gly Lys Leu Leu Ile370 375 380Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met Gly Thr Val Tyr Ser Thr385 390 395 400Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met Met Asp Gly Leu Met Gln405 410 415Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp Gln Lys Gln Asn Glu Tyr420 425 430Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys Thr Val Ala Val Glu Pro435 440 445Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu Gly Ala Asn Ala Pro Lys450 455 460Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val Ala Ala Gly Arg Ala Pro465 470 475 480Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala Gly Val Ala Val Thr Asp485 490 495Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met Arg Thr Asn Val Pro His500 505 510Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln Pro Met Leu Ala His Lys515 520 525Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu Asn Cys Ala Gly His Lys530 535 540Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly Val Ala Tyr Thr Ser Pro545 550 555 560Glu Val Ala Trp Val Gly Glu Thr Glu Leu Ser Ala Lys Ala Ser Gly565 570 575Arg Lys Ile Thr Lys Ala Asn Phe Pro Trp Ala Ala Ser Gly Arg Ala580 585 590Ile Ala Asn Gly Cys Asp Lys Pro Phe Thr Lys Leu Ile Phe Asp Ala595 600 605Glu Thr Gly Arg Ile Ile Gly Gly Gly Ile Val Gly Pro Asn Gly Gly610 615 620Asp Met Ile Gly Glu Val Cys Leu Ala Ile Glu Met Gly Cys Asp Ala625 630 635 640Ala Asp Ile Gly Lys Thr Ile His Pro His Pro Thr Leu Gly Glu Ser645 650 655Ile Gly Met Ala Ala Glu Val Ala Leu Gly Thr Cys Thr Asp Leu Pro660 665 670Pro Gln Lys Lys Lys675(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度635個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)是(iv)反義否(vi)原始來源(A)生物體融合蛋白(vii)現(xiàn)有來源(B)克隆PD33(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Ala Leu Val Glu Leu Lys Val Pro Asp Ile Gly Gly His Glu Asn1 5 10 15Val Asp Ile Ile Ala Val Glu Val Asn Val Gly Asp Thr Ile Ala Val20 25 30Asp Asp Thr Leu Ile Thr Leu Asp Leu Glu Ser Val Ala Leu Thr Pro35 40 45His Ser Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Ala Glu Thr Trp Met Ser Ser50 55 60Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Val Glu Ser Trp Ile Leu Arg65 70 75 80Asn Pro Arg Phe Leu Glu Met Asp Val Pro Ala Glu Val Ala Gly Val85 90 95Val Lys Glu Val Lys Val Lys Val Gly Asp Lys Ile Ser Glu Gly Gly100 105 110Leu Ile Val Val Val Glu Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ala Pro Lys Ala115 120 125Glu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Glu Ala Pro Lys Ala Ala Ala Pro130 135 140Ala Pro Gln Ala Ala Gln Phe Gly Gly Ser Ala Asp Ala Glu Tyr Asp145 150 155 160Val Val Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Tyr Ser Ala Ala Phe Ala165 170 175Ala Ala Asp Glu Gly Leu Lys Val Ala Ile Val Glu Arg Tyr Lys Thr180 185 190Leu Gly Gly Val Cys Leu Asn Val Gly Cys Ile Pro Ser Lys Ala Leu195 200 205Leu His Asn Ala Ala Val Ile Asp Glu Val Arg His Leu Ala Ala Asn210 215 220Gly Ile Lys Tyr Pro Glu Pro Glu Leu Asp Ile Asp Met Leu Arg Ala225 230 235 240Tyr Lys Asp Gly Val Val Ser Arg Leu Thr Gly Gly Leu Ala Gly Met245 250 255Ala Lys Ser Arg Lys Val Asp Val Ile Gln Gly Asp Gly Gln Phe Leu260 265 270Asp Pro His His Leu Glu Val Ser Leu Thr Ala Gly Asp Ala Tyr Glu275 280 285Gln Ala Ala Pro Thr Gly Glu Lys Lys Ile Val Ala Phe Lys Asn Cys290 295 300Ile Ile Ala Ala Gly Ser Arg Val Thr Lys Leu Pro Phe Ile Pro Glu305 310 315 320Asp Pro Arg Ile Ile Asp Ser Ser Gly Ala Leu Ala Leu Lys Glu Val325 330 335Pro Gly Lys Leu Leu Ile Ile Gly Gly Gly Ile Ile Gly Leu Glu Met340 345 350Gly Thr Val Tyr Ser Thr Leu Gly Ser Arg Leu Asp Val Val Glu Met355 360 365Met Asp Gly Leu Met Gln Gly Ala Asp Arg Asp Leu Val Lys Val Trp370 375 380Gln Lys Gln Asn Glu Tyr Arg Phe Asp Asn Ile Met Val Asn Thr Lys385 390 395 400Thr Val Ala Val Glu Pro Lys Glu Asp Gly Val Tyr Val Thr Phe Glu405 410 415Gly Ala Asn Ala Pro Lys Glu Pro Gln Arg Tyr Asp Ala Val Leu Val420 425 430Ala Ala Gly Arg Ala Pro Asn Gly Lys Leu Ile Ser Ala Glu Lys Ala435 440 445Gly Val Ala Val Thr Asp Arg Gly Phe Ile Glu Val Asp Lys Gln Met450 455 460Arg Thr Asn Val Pro His Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Ile Val Gly Gln465 470 475 480Pro Met Leu Ala His Lys Ala Val His Glu Gly His Val Ala Ala Glu485 490 495Asn Cys Ala Gly His Lys Ala Tyr Phe Asp Ala Arg Val Ile Pro Gly500 505 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1.屬于登革病毒前M/M蛋白的合成肽或模擬化合物，特征在于包括3-31，57-92，69-93及103-124位氨基酸區(qū)域，且包括至少一種與任何登革病毒血清型交叉反應(yīng)的表位。
2.如權(quán)利要求1的包括3-31，57-92，69-93及103-124位氨基酸區(qū)域的屬于登革病毒前M/M蛋白的合成肽，特征在于是序列表中分別以肽19-6，19-5，20-1及20-3表示的肽。
3.抗黃病毒的診斷試驗(yàn)或藥物配制品，特征在于包括如權(quán)利要求1或2所述的肽或其一部分，與或不與蛋白質(zhì)或其它載體綴合，不依賴于所使用的佐劑或賦形劑。
4.黃病毒特異性抗體或其部分，特征在于其識(shí)別如權(quán)利要求1或2提及的序列。
5.抗黃病毒疫苗或治療制備物，或診斷性試驗(yàn)，特征在于包括權(quán)利要求4所述抗體或其部分。
6.特征在于包含登革2和4型病毒前M/M蛋白表位的遺傳構(gòu)建物，包含與載體蛋白融合的1-42和92-134位氨基酸區(qū)域。
7.如權(quán)利要求6的遺傳構(gòu)建物，特征在于其與腦膜炎奈瑟氏球菌P64k蛋白融合，在序列表中描述為PD31(Pre-2)，PD30(M-2)，PD34(M-4)及PD33(M-2/M-4)。
8.如權(quán)利要求6或7的遺傳構(gòu)建物，特征在于含有至少一個(gè)黃病毒前M/M蛋白表位。
9.診斷性試驗(yàn)或藥物配制品，特征在于含有至少一個(gè)如權(quán)利要求6、7或8的遺傳構(gòu)建物的產(chǎn)物或其部分。
10.抗體或其部分，特征在于可識(shí)別權(quán)利要求6或7提及的序列。
11.抗黃病毒的藥物配制品或診斷試驗(yàn)，特征在于含有權(quán)利要求10所述的抗體或其部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及5種登革2型病毒前M/M蛋白的合成肽,相應(yīng)于3－31,45－67,57－92,69—93及103－124位氨基酸序列。在小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)了抗肽免疫應(yīng)答。也獲得了包括前M/M蛋白區(qū)域的重組融合蛋白。證實(shí)在前M/M蛋白的肽中存在人及小鼠體內(nèi)B細(xì)胞表位。肽3－31和103—124激發(fā)抗四種登革病毒血清型的中和抗體。病毒特異性增殖應(yīng)答在用非綴合肽3－31及57－92免疫的小鼠體內(nèi)證實(shí)。用綴合肽3－31,57－92及69－93免疫的小鼠當(dāng)其被登革2型病毒攻擊時(shí)處于被保護(hù)狀態(tài)。因此,登革2型病毒前M/M蛋白質(zhì)中順序表位的存在,及其在抗黃病毒的免疫應(yīng)答中的關(guān)聯(lián)被證實(shí)。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1249781SQ98803203
公開日2000年4月5日 申請(qǐng)日期1998年1月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年1月15日
發(fā)明者蘇珊娜·巴斯克斯·拉穆多, 瓜達(dá)盧佩·古茲曼·蒂拉多, 赫拉爾多·恩里克·紀(jì)廉·涅托, 奧蘭多·路易斯·帕爾多·拉索, 格萊·奇內(nèi)亞·圣地亞哥, 安娜·比阿特麗斯·佩雷斯·迪亞斯, 馬里齊亞·普波·安圖內(nèi)斯, 羅斯瑪麗·羅德里格斯·羅切, 奧斯瓦爾多·雷耶斯·阿科斯塔, 伊爾達(dá)·埃莉薩·加拉伊·佩雷斯, 加夫列爾·帕德龍·帕洛馬雷斯, 邁林·阿爾瓦雷斯·薇拉, 路易斯·莫里爾·迪亞斯, 奧邁達(dá)·佩雷斯·因蘇塔, 何塞·路易斯·佩萊格里諾·馬丁內(nèi)斯·德拉科特拉 申請(qǐng)人:遺傳和生物技術(shù)工程中心, 佩德羅庫(kù)利熱帶醫(yī)學(xué)研究所