專利名稱：骨基質(zhì)明膠載體的去活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于生物醫(yī)學(xué)的材料制備領(lǐng)域，特別適用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的骨基質(zhì)明膠載體。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，簡稱BMP)是一種具有獨(dú)特誘導(dǎo)成骨功能的機(jī)體蛋白因子，在機(jī)體骨組織再生和修復(fù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?，F(xiàn)在已可從牛、馬、豬、羊、兔、鼠和人骨或骨肉瘤中生化提取不同種屬來源的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，或利用生物工程技術(shù)制備基因重組的人的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)。利用其誘導(dǎo)成骨活性，有望實(shí)現(xiàn)人體斷骨的快速再生連接和缺骨的快速再生修復(fù)，在骨科和口腔科臨床具有廣泛的應(yīng)用前景，并具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
為了充分發(fā)揮骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的獨(dú)特的誘導(dǎo)成骨活性并取得良好的臨床治療效果，需要滿足三個條件一、保證骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的天然立體構(gòu)象和雙體結(jié)構(gòu)的完整，使其活性不被破壞；二、使骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)與適當(dāng)?shù)妮d體復(fù)合，為被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的新生成骨細(xì)胞提供附著位點(diǎn)，同時載體還起到緩釋和引導(dǎo)成骨方向和范圍的作用；三、不引起免疫反應(yīng)。
骨基質(zhì)明膠(bone matrix gelatine，簡稱BMG)是從牲骨中提取的，主要成分是膠原蛋白。它成本低廉并具有良好的生物相容性。由于膠原蛋白組成和結(jié)構(gòu)的高度保守，使其種屬差異極小，基本不引起免疫炎癥反應(yīng)，可被人體自然吸收和同化。經(jīng)過去活處理的骨基質(zhì)明膠(BMG)本身無誘導(dǎo)活性，并具有多孔網(wǎng)架的微觀結(jié)構(gòu)，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的極佳的載體材料。
在牲骨中，天然存在的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和其它非膠原蛋白成分與骨基質(zhì)明膠(BMG)相復(fù)合并構(gòu)成了牛骨基質(zhì)。為了制備安全實(shí)用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)載體材料骨基質(zhì)明膠(BMG)，需要去除骨基質(zhì)中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和大量的非膠原蛋白組分。這不僅可以得到無誘導(dǎo)成骨活性的惰性膠原載體，而且通過去除大量高種屬特異性的非膠原蛋白，得到無免疫原性的骨基質(zhì)明膠(BMG)載體。所以去活處理是骨基質(zhì)明膠(BMG)載體的制備中的關(guān)鍵步驟。
現(xiàn)有技術(shù)中主要是將牲骨經(jīng)粉碎并脫脂脫鈣后，用高濃度的強(qiáng)變性劑鹽酸胍將水不溶性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等非膠原性蛋白溶解抽提去除，水洗去胍后凍干，制成去活膠原載體。詳細(xì)過程參見U.S.Patent4975526。
上述現(xiàn)有方法在實(shí)踐中存在的問題主要是由于骨基質(zhì)顆粒大小差異和鹽酸胍抽提效率等因素的影響，為了保證得到無誘導(dǎo)活性的載體，需要長時間的和反復(fù)的抽提，并可能在不同批次間存在差異。未被去除的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)由于雙體結(jié)構(gòu)未被破壞，除去鹽酸胍后仍可能復(fù)性并具有活性；部分與膠原蛋白緊密結(jié)合的非膠原蛋白和被包裹其中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)蛋白始終難于被抽提去除。
本發(fā)明的目的是提出一種能夠破壞活性成分的天然結(jié)構(gòu)，提高抽提去活效率，和保證骨基質(zhì)明膠(BMG)載體的誘導(dǎo)惰性及無免疫原性的去活骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)載體骨基質(zhì)明膠(BMG)的制取方法。
根據(jù)本發(fā)明的目的，我們所采用去活處理骨基質(zhì)明膠(BMG)載體的方法是利用還原劑破壞其分子內(nèi)和分子的二硫鍵，破壞其天然活性的空間構(gòu)象，使雙體結(jié)構(gòu)還原成單體結(jié)構(gòu)，使其失去誘導(dǎo)活性并與膠原蛋白去復(fù)合，而且還利于被抽提除去。本發(fā)明的骨基質(zhì)明膠載體骨基質(zhì)明膠(BMG)的去活方法是將新鮮的牲骨股骨去骺端，剔除肌內(nèi)，筋膜和骨髓后進(jìn)行脫脂脫水處理，其特征在于脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進(jìn)行后，并于4℃再進(jìn)行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥保存，再將所獲脫鈣骨基質(zhì)DBM經(jīng)2molCaCL2,0.5mol乙二胺四乙酸鈉(EDTA)pH 8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用還原劑與變性劑溶液，按5-10倍體積與DBM混合并于室溫下抽提24-48小時。抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理8-12小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質(zhì)明膠(BMG)粉粒置于4℃保存。在上述本發(fā)明去活方法中二次抽提溶液還原劑是指0.05-0.2mol二硫蘇糖醇(DTT)溶液或0.7mol β-巰基乙醇(BME)溶液中的任意一種。而與還原劑混合的變性劑是指4-6mol鹽酸胍/0.5mol CaCl2pH7.0溶液或者說6-8mol尿素/0.5mol CaCl2pH7.0溶液中的任一一種。
采用本發(fā)明的骨基質(zhì)明膠載體去活方法經(jīng)實(shí)驗(yàn)具有以下特點(diǎn)將制備過程分為DBM粗制和骨基質(zhì)明膠(BMG)精制兩部分并分別保存所制取得材料，有利于實(shí)現(xiàn)質(zhì)量可控的載體材料的批量制備。
通過CaCL2、EDTA、55℃溫水順序抽提，可大約去掉20％的可溶性非膠原蛋白。
通過高濃度鹽酸胍或尿素的變性作用，將水不溶性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和其它非膠原蛋白的分子內(nèi)和分子間氫鍵破壞，破壞其蛋白空間構(gòu)象；通過DTT和BME的還原作用，破壞骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等非膠原蛋白的分子內(nèi)和分子間二硫鍵，使多聚體和雙體解離為單體，破壞蛋白的活性結(jié)構(gòu)。利用變性劑和還原劑的協(xié)同作用，使緊密地包聚在骨基質(zhì)高度交聯(lián)結(jié)構(gòu)中的不溶性蛋白易于被溶解抽提，并不再具有維持其生理活性的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，提高了抽提去活效率。
通過熱酸處理使與膠原蛋白有化學(xué)鍵合的蛋白解離下來，而對膠原蛋白纖維只有少量的降解作用。
經(jīng)上述制備和去活處理的骨基質(zhì)明膠骨基質(zhì)明膠(BMG)不再具有潛在的誘導(dǎo)成骨活性和免疫原性，而具有微觀多孔網(wǎng)架結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，是一種易與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)復(fù)合的可降解的安全的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)載體。
實(shí)施例冶金部鋼鐵研究總院生物材料與工程中心于1994年8月至11月間在河北省大廠縣收集新鮮牛股骨按照上述方法經(jīng)過清理、破碎、清洗、脫脂脫水、研磨粉碎、篩分、脫鈣、清洗、脫脂脫水、干燥保存等步驟制備了約20千克的牛骨脫鈣骨基質(zhì)(DBM)。于1995年初至1998年中在中心實(shí)驗(yàn)室用(DBM)材料制備骨基質(zhì)明膠(BMG)，并通過動物實(shí)驗(yàn)檢測載體的安全性和效果，取得滿意的結(jié)果。形成上述制備方法。按照上述方法分別制備了4批共800克牛骨骨基質(zhì)明膠(BMG)載體，經(jīng)過小鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)，組織切片觀察，均未發(fā)現(xiàn)有誘導(dǎo)成骨活性和免疫炎癥反應(yīng)，生物安全性良好。
以下為實(shí)施例的具體實(shí)施方案。
實(shí)施例1；本實(shí)施例是采用10Kg的新鮮牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后進(jìn)行脫脂、脫水處理，其脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進(jìn)行后并于4℃再進(jìn)行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥保存，再將所獲脫鈣骨基質(zhì)(DBM)經(jīng)2mol CaCL2,0.5mol乙二胺四乙酸鈉(EDTA)pH8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用含有0.07mol-硫蘇糖醇(DTT)的4mol鹽酸胍/0.5mol CaCl2pH7.0溶液按7倍體積與脫鈣骨基質(zhì)(DBM)混合并于室溫下抽提30小時，抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理8小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質(zhì)明膠粉粒置于4℃保存。
實(shí)施例2；本實(shí)施例是采用5Kg的新鮮牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后進(jìn)行脫脂、脫水處理，其脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進(jìn)行后并于4℃再進(jìn)行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥保存，再將所獲脫鈣骨基質(zhì)DBM經(jīng)2mol CaCL2,0.5mol EDTA pH8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用含有0.7mol β-巰基乙醇(BME)的6mol鹽酸胍/0.5mol CaCl2pH7.0溶液按9倍體積與脫鈣骨基質(zhì)(DBM)混合并于室溫下抽提40小時，抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理10小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質(zhì)明膠粉粒置于4℃保存。
實(shí)施例3；本實(shí)施例是采用5Kg的新鮮牛骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后進(jìn)行脫脂、脫水處理，其脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進(jìn)行后并于4℃再進(jìn)行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥保存，再將所獲脫鈣骨基質(zhì)DBM經(jīng)2mol CaCL2,0.5mol乙二胺四乙酸鈉(EDTA)pH8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用含有0.15mol硫蘇糖醇(DTT)的8mo1尿素/0.5mo1 CaCl2pH7.0溶液按6倍體積與脫鈣骨基質(zhì)(DBM)混合并于室溫下抽提24小時，抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理11小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質(zhì)明膠粉粒置于4℃保存。
權(quán)利要求
1.一種骨基質(zhì)明膠載體的去活方法，該方法是將新鮮的牲骨股骨去骺端，剔除肌肉、筋膜和骨髓后進(jìn)行脫脂、脫水處理，其特征在于脫脂脫水處理是在1∶1的乙醇、乙醚中進(jìn)行后并于4℃再進(jìn)行破碎研磨，過篩，保留75-425μm尺寸大小的組分，1mol鹽酸脫鈣，水洗至中性后再次脫脂并干燥，保存，再將所獲材料脫鈣骨基質(zhì)DBM經(jīng)2mol CaCL2,0.5mol乙二胺四乙酸鈉(EDTA)pH8.0,55℃溫水順序抽提(5倍體積，攪拌過夜)后，再采用含有還原劑與變性劑溶液，按5-10倍體積與DBM混合并于室溫下抽提24-48小時，抽提后用8mol尿素洗滌，再用pH5.5的酸溶液于60℃下處理8-12小時，用水充分洗滌至中性，冷凍干燥后，將所得去活骨基質(zhì)明膠粉粒置于4℃保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述去活方法，其特征在于還原劑是指0.05-0.2mol二硫蘇糖醇(DTT)溶液或0.7molβ-巰基乙醇(BME)溶液中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述去活方法，其特征在于還原劑的變性劑是指4-6mol鹽酸胍/0.5mol CaCl2pH7.0溶液或者說6-8mol尿素/0.5mol CaCl2pH7.0溶液中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)的材料制備領(lǐng)域。特別適用于生物醫(yī)學(xué)中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的骨基質(zhì)明膠載體。本發(fā)明方法是利用還原劑破壞其分子內(nèi)和分子間的二硫鍵和天然活性的空間構(gòu)象,使雙體結(jié)構(gòu)還原成單體結(jié)構(gòu),失去誘導(dǎo)活性并與膠原蛋白去復(fù)合。該方法的特點(diǎn)是破壞維持蛋白質(zhì)生理活性的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象,提高了抽提去活效率。
文檔編號A61L27/00GK1225819SQ9812567
公開日1999年8月18日 申請日期1998年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月21日
發(fā)明者李曉光, 孫福玉, 沈淙, 王春華, 王勃生, 楊志偉, 姜雪松 申請人:冶金工業(yè)部鋼鐵研究總院