專利名稱：靶向性細(xì)胞毒性細(xì)胞的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來(lái)說(shuō)涉及微生物學(xué)和免疫治療學(xué)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)涉及抗原-特異性的細(xì)胞毒性細(xì)胞，這些細(xì)胞提供抗體指導(dǎo)的和細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫。
2.相關(guān)技術(shù)簡(jiǎn)述抗體-和細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫利用不同的機(jī)制抑制腫瘤生長(zhǎng)以使宿主免受病毒感染從而保衛(wèi)宿主。抗體免疫在通過(guò)依賴抗體的殺滅細(xì)胞從而使病原體失效上特別起作用(Stires等，1994)。T-細(xì)胞介導(dǎo)的免疫利用兩類T-細(xì)胞的子類的作用輔助T細(xì)胞(其通過(guò)分泌淋巴因子而介導(dǎo)其效應(yīng)以激活其它效應(yīng)細(xì)胞)，及細(xì)胞毒性T細(xì)胞(其通過(guò)觸發(fā)受體-介導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡殺滅靶細(xì)胞(Berke，1994；Young和Liu，1988)。
已確定腫瘤細(xì)胞細(xì)胞表面優(yōu)選表達(dá)的增加數(shù)量的抗原，如致癌蛋白，及細(xì)胞分裂抗原，并且這些在癌治療中可提供選擇性破壞靶細(xì)胞的潛在標(biāo)記(Urban和Schreiber，1992；Pastan和FitzGerald，1991；Boon等，1994)。已研究探討了腫瘤免疫治療的兩種基本方法對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒素和溶細(xì)胞活性的抗體-指導(dǎo)的導(dǎo)向作用(vitetta等，1987；Waldmann，1991；Dohlsten等，1994)，以及增強(qiáng)與腫瘤的細(xì)胞免疫反應(yīng)(Perez等，1985；Gross等，1989；Goverman等，1990；Rosenberg，1991；Eshhar等，1993；Hwu等，1993)。雖然已顯示抗體-指導(dǎo)的免疫治療在體外及體內(nèi)均有效地破壞腫瘤，但其在癌治療中成功利用的主要障礙是抗體或抗體綴合物接近腫瘤塊受到限制(Jain，1989；Shockley等，1992；Reithmuller和Johnson，1992)。在這些情況下，由于接近癌細(xì)胞受到限制，抗體-指導(dǎo)的-免疫治療不能完全摧毀所導(dǎo)向的腫瘤。為了使這種免疫治療獲得成功，必須發(fā)現(xiàn)一種成功地將抗體或抗體-綴合物傳送到腫瘤內(nèi)部的方法。
已花費(fèi)大量的精力來(lái)刺激或修飾T-淋巴細(xì)胞(其通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞因子基因)或抗體/T-細(xì)胞受體以增加細(xì)胞抗-腫瘤的活性(Rosenberg等，1988；Rosenberg等，1990；Kawakami等，1994)。但是使用這種類型的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的主要局限性是難以獲得特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞(Rosenberg等，1988；Rosenberg等，1990；Kawakami等，1994)。除非可獲得特異性細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，否則會(huì)出現(xiàn)非特異性的細(xì)胞毒性并對(duì)受治療者產(chǎn)生不可接受的副作用。
當(dāng)前利用天然毒素來(lái)治療癌和病毒感染十分有限。植物和細(xì)菌產(chǎn)生防御性毒素，它們是能夠殺滅哺乳動(dòng)物細(xì)胞的最有力毒素的一部分；即，一個(gè)或幾個(gè)分子足以殺死哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Yamaizumi等，1978；Chen等，1995)。例如，植物產(chǎn)生蓖麻毒蛋白，相思豆毒蛋白，gelonin和皂草素。細(xì)菌毒素包括假單胞菌屬外毒素A(PEA)與白喉毒素。毒素分子，如PEA，其在胞質(zhì)溶膠中通過(guò)滅活延伸因子-2(EF-2)而阻斷蛋白質(zhì)合成從而殺死細(xì)胞(Pastan和FitzGerald，1992)。遺憾的是，由于該毒素的細(xì)胞毒性影響不限于特定類型的細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞)，因而非特定的細(xì)胞與組織的死亡對(duì)受治療者產(chǎn)生不可接受的副作用或風(fēng)險(xiǎn)，所以這些和其它植物或細(xì)菌的毒素在治療應(yīng)用上十分有限。此外，目前必須全身注射這些毒素，并且其在血液與體內(nèi)被迅速清除掉。對(duì)于許多治療用法，例如在轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的治療中，毒素最好能在系統(tǒng)中仍然保持一段時(shí)間，這樣它們可″清除″其它治療方法沒(méi)有除去的或殺死的靶細(xì)胞。
所進(jìn)行的抗癌和抗病毒疾病的大量研究表明，很明顯需要治療這些致命疾病的新方法。尤其是，能提高對(duì)靶細(xì)胞的毒性特異性的方法將帶來(lái)很多優(yōu)點(diǎn)，所說(shuō)的細(xì)胞尤其是接近受到限制的細(xì)胞(如實(shí)體腫瘤內(nèi)部的細(xì)胞)，并且該方法允許毒素存在于系統(tǒng)中作為″清除劑″并減少毒副作用和風(fēng)險(xiǎn)。
發(fā)明概要本發(fā)明旨在通過(guò)在免疫毒素治療領(lǐng)域中提供驚人的提高作用來(lái)克服這些局限性，其中可利用受治療者自己的細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生和分泌免疫毒素，然后將那些細(xì)胞再注入到受治療者體內(nèi)以作為靶疾病治療中的治療或預(yù)防劑。本發(fā)明提供了幾種與常規(guī)免疫毒素療法相比的改進(jìn)的方法，其中合成制備免疫毒素，然后注射給受治療者。與常規(guī)制備免疫毒素的方法(如毒素與抗體分子的化學(xué)交聯(lián))相比，例如，在本發(fā)明的實(shí)踐中通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)可產(chǎn)生免疫毒素，且可從培養(yǎng)基中通過(guò)過(guò)濾，離心及層析便利地進(jìn)行純化。常規(guī)免疫毒素的另一個(gè)困難是它們?cè)谑苤委熣叩难h(huán)系統(tǒng)中迅速被清除掉，而需要多次施用，這使得很難在血液中保持治療水平而不產(chǎn)生明顯的副作用。相反，在本發(fā)明的實(shí)踐中，只要一次施用產(chǎn)生免疫毒素的細(xì)胞，其即可在受治療者體內(nèi)存活并在一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生免疫毒素(幾個(gè)星期至幾個(gè)月)。
在許多方面，本發(fā)明可被描述為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如細(xì)胞毒性-T-淋巴細(xì)胞，神經(jīng)元或其它表達(dá)和分泌免疫毒素的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。免疫毒素優(yōu)選地由載體(其包含編碼前導(dǎo)序列的核酸序列)編碼，它的表達(dá)在表達(dá)的毒素?fù)p害親本或宿主細(xì)胞之前，可指導(dǎo)免疫毒素以分泌泡的形式分泌到細(xì)胞外。一旦分泌了免疫毒素，細(xì)胞毒性作用主要限于那些表達(dá)免疫毒素抗體組分所識(shí)別的抗原的細(xì)胞，并且親本細(xì)胞(其通常不表達(dá)高水平的抗原)仍然能生存并繼續(xù)表達(dá)免疫毒素。
在本領(lǐng)域中，已知細(xì)胞毒性-T-淋巴細(xì)胞(殺傷細(xì)胞)是細(xì)胞免疫反應(yīng)所涉及的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，這種反應(yīng)具有識(shí)別外源抗原并殺死具有該抗原的細(xì)胞的能力。例如，在本領(lǐng)域中已知免疫毒素是抗體組分和毒素組分的融合物或綴合物，這樣抗體組分或結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別并特異性地結(jié)合在靶細(xì)胞上的抗原上，這樣指導(dǎo)毒素至特定的細(xì)胞類型。如本文所使用的，“表達(dá)和分泌”指本發(fā)明的細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞含有編碼免疫毒素的遺傳物質(zhì)片段，并且通過(guò)宿主細(xì)胞的翻譯機(jī)制(即核糖體)將這些遺傳物質(zhì)翻譯成多肽免疫毒素產(chǎn)物，并且將免疫毒素運(yùn)輸至宿主細(xì)胞外并分泌到胞外基質(zhì)中。在本發(fā)明的實(shí)踐中，編碼免疫毒素的遺傳物質(zhì)可包括DNA載體或RNA載體，或者該物質(zhì)可摻入到宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中。
本發(fā)明免疫毒素被理解為包含抗體組分和毒素組分，本文例證說(shuō)明其從單一啟動(dòng)子共表達(dá)。然而，本發(fā)明的免疫毒素也可以表達(dá)為從不同的啟動(dòng)子表達(dá)的兩個(gè)或多個(gè)mRNA信使，然后其翻譯產(chǎn)物在細(xì)胞中或分泌過(guò)程期間或之后裝配。在某些實(shí)施方案中，免疫毒素的抗體結(jié)構(gòu)域可包含抗-腫瘤抗體的結(jié)構(gòu)域，或者在另一些實(shí)施方案中它包含抗-病毒抗體的結(jié)構(gòu)域，或者在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中它包含T-輔助細(xì)胞的特異性子類的抗-T-輔細(xì)胞抗體的結(jié)構(gòu)域。例如，免疫毒素可以與HER2抗原，Lym-1抗原，生長(zhǎng)因子或激素受體，或已知在腫瘤細(xì)胞中被超量表達(dá)的任何其它抗原發(fā)生免疫反應(yīng)?？?病毒免疫毒素可與HIV抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，諸如gpl20抗原或流感病毒，皰疹病毒，Epstein-Barr病毒或任何已知的病毒抗原。在另一實(shí)施方案中，抗-T輔助細(xì)胞免疫毒素可與T-輔細(xì)胞(其牽涉自身免疫疾病)的特異性子類發(fā)生免疫反應(yīng)。用于本發(fā)明實(shí)踐的優(yōu)選毒素包括(但不限于)假單胞菌屬外毒素，如假單胞菌屬外毒素A，蓖麻毒蛋白A，白喉毒素，或其具有細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性的部分，相思豆毒蛋白，gelonin，皂草素或可獲得編碼基因的任何其它毒素。
在許多方面，本發(fā)明可以包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如表達(dá)和分泌免疫毒素的細(xì)胞毒性-T-淋巴細(xì)胞或神經(jīng)元，其中這些細(xì)胞分散于藥學(xué)上可接受載液中。該溶液適于肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或者適于吸入或本領(lǐng)域已知的其它施用方法?！逅帉W(xué)上可接受″是指當(dāng)施用至動(dòng)物或人時(shí)，組合物不產(chǎn)生過(guò)敏性或類似的副反應(yīng)，并且其包括(但不限于)任何和所有溶劑，介質(zhì)，等滲劑及類似物。本領(lǐng)域熟知將這些基質(zhì)和藥劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)。除了任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑與活化組分不可兼容外，預(yù)期它們可用于治療組合物中。也可將輔助活性組分摻入到組合物中。
在另一方面，本發(fā)明可被描述為被載體轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，及神經(jīng)元，這樣該載體包含有效連接在啟動(dòng)子上的核酸序列，編碼一個(gè)或多個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)及融合蛋白(其包含前導(dǎo)序列和免疫毒素)的核酸序列，以及所有真核基因表達(dá)所必需的基因信號(hào)(如聚腺苷酸化位點(diǎn))。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，前導(dǎo)序列指導(dǎo)載體表達(dá)的免疫毒素轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。因此人們認(rèn)為前導(dǎo)序列在免疫毒素的毒素組分表達(dá)之前即被表達(dá)，優(yōu)選由啟動(dòng)子在第一編碼區(qū)表達(dá)。載體可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的表達(dá)載體(其被插入了前導(dǎo)序列與免疫毒素基因)，也可以是質(zhì)粒，病毒載體如腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，或腺病毒相關(guān)載體，粘粒或本領(lǐng)域已知的其它類型的載體。此外，所述載體可包含與脂質(zhì)體或脂質(zhì)復(fù)合物相締合的裸露DNA或RNA分子，或者可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法，電穿孔法或其它機(jī)械，電氣或化學(xué)方法將所述載體引入至細(xì)胞內(nèi)。上述載體表達(dá)的免疫毒素可與腫瘤相關(guān)抗原(如HER2或Lym-l抗原)或病毒相關(guān)抗原(如HIV抗原或HIVgp120抗原)或T-輔細(xì)胞的子類相關(guān)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)細(xì)胞分散在例如上述藥學(xué)上可接受的載體中時(shí)，宿主動(dòng)物細(xì)胞或淋巴細(xì)胞可包含藥理組合物。
本發(fā)明在許多方面可被描述為殺滅腫瘤細(xì)胞的方法，該方法包括使腫瘤細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞(如細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞及神經(jīng)元)所分泌的免疫毒素相接觸，其中免疫毒素的抗體部分識(shí)別腫瘤細(xì)胞的抗原。優(yōu)選地，腫瘤細(xì)胞超量表達(dá)HER-2或Lym-1相關(guān)抗原，或其它腫瘤相關(guān)抗原，并且腫瘤細(xì)胞是B細(xì)胞淋巴瘤，乳房瘤，卵巢瘤，胃瘤或腦腫瘤的細(xì)胞，或其它已知的與正常細(xì)胞相比超量表達(dá)表面抗原的腫瘤細(xì)胞。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物受治療者中，優(yōu)選為人受治療者，或干脆是人癌患者，將這些動(dòng)物細(xì)胞以藥物組合物的形式施用給受治療者。本發(fā)明在許多方面也可被描述為抑制受治療者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括將表達(dá)抗-腫瘤細(xì)胞免疫毒素的細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞施用至受治療者體內(nèi)。
神經(jīng)元或其它腦細(xì)胞表達(dá)并分泌本文所描述的免疫毒素。該實(shí)施方案的融合蛋白包含肽信號(hào)序列，抗體結(jié)構(gòu)域，及細(xì)胞毒素組分，其中抗體結(jié)構(gòu)域可與腦腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，并且腦細(xì)胞產(chǎn)生與分泌免疫毒素沒(méi)有對(duì)上述宿主腦細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。由于能將表達(dá)自體固有的免疫毒素的神經(jīng)元在外科手術(shù)除去腫瘤后植入到腦內(nèi)(例如為了長(zhǎng)期表達(dá)免疫毒素以消除剩余的腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞)，因此認(rèn)為該實(shí)施方案特別有效。
在許多方面，本發(fā)明也可被描述為殺滅病毒感染的細(xì)胞的方法，其包括使該細(xì)胞與細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的免疫毒素相接觸，其中免疫毒素的抗體部分識(shí)別病毒感染的細(xì)胞表達(dá)的抗原。在該實(shí)施方案的實(shí)踐中，將細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞以藥物溶液施用給被病毒感染的動(dòng)物受治療者或人受治療者。在一些方面，本發(fā)明可被描述為抑制受治療者HIV感染的方法，其包括施用藥物溶液至受治療者體內(nèi)，其中所說(shuō)的溶液包含表達(dá)和分泌抗-HIV免疫毒素的細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞。
在許多方面，本發(fā)明也可被描述為殺滅在自身免疫疾病中所牽涉的T-輔細(xì)胞的特定物種的方法，并且免疫毒素的抗體部分識(shí)別特定類型T-輔細(xì)胞表達(dá)的抗原。例如，T-輔細(xì)胞的特定子類在這些病情下(如風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎或全身狼瘡紅斑癥)得到超活化。本發(fā)明由于只將病癥所涉及的細(xì)胞作為靶位而無(wú)傷于其余的免疫系統(tǒng)，因此它比抑制整個(gè)免疫系統(tǒng)的療法更具優(yōu)越性。例如，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況下的另一優(yōu)點(diǎn)是免疫毒素產(chǎn)生細(xì)胞可直接注射到病理位點(diǎn)，如關(guān)節(jié)內(nèi)。在該實(shí)施方案的實(shí)踐中，可將細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞或產(chǎn)生免疫毒素的細(xì)胞以藥物組合物形式施用至動(dòng)物受治療者體內(nèi)，最優(yōu)選為人受治療者(其患有涉及T-輔細(xì)胞特定子類的自身免疫疾病)。
本發(fā)明也在許多方面被描述為制備重組免疫毒素的方法，其中該方法包含獲得經(jīng)表達(dá)載體(其編碼前導(dǎo)序列和免疫毒素)轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的步驟。通過(guò)將表達(dá)載體導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，或用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，可使細(xì)胞表達(dá)免疫毒素，并將其分泌至培養(yǎng)基中。在該方法的實(shí)踐中，免疫毒素前導(dǎo)序列的構(gòu)建體可由本領(lǐng)域已知的各種啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)，包括CMV啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(若需求)。若細(xì)胞在表達(dá)免疫毒素有效的條件下培養(yǎng)時(shí)，前導(dǎo)序列可指導(dǎo)表達(dá)的免疫毒素進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中或分泌泡內(nèi)。產(chǎn)生免疫毒素的方法還包括從培養(yǎng)基中分離免疫毒素的步驟。這種方法比化學(xué)合成免疫毒素法或細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)表達(dá)免疫毒素法更具各種優(yōu)點(diǎn)。例如，在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中可獲得大量的免疫毒素并且可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法從培養(yǎng)基中容易地分離出免疫毒素。此外，在細(xì)菌中表達(dá)哺乳動(dòng)物的基因經(jīng)常導(dǎo)致不能溶解的包涵體，其中的蛋白質(zhì)不能正確折疊并可能是失活的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可從培養(yǎng)基中容易地分離出活化的免疫毒素?？砂b這些分離的免疫毒素進(jìn)行商業(yè)出售，并且可用于體外應(yīng)用，或研究，或輸入療法(其中所有細(xì)胞均非所需)。
附圖簡(jiǎn)述下列附圖構(gòu)成了本發(fā)明敘述的一部分，并進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的特定方面。參考一或多個(gè)這些附圖并結(jié)合本文具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述將會(huì)更好地理解本發(fā)明。


圖1.抗-HER2/毒素表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖。表達(dá)載體(pCMV-sFv23e-PE40)含有具有前導(dǎo)信號(hào)序列并融合了PEA(ATCC)的PE40序列(結(jié)構(gòu)域II和III)的抗-HER2 sFv23e基因(Batra等，1992；Kasprzyk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993)，它們都在CMV啟動(dòng)子的控制之下。在重組體逆轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體(LNCX-sFve23/PE40)中，sFve23/PE40基因由內(nèi)部的CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，新霉素抗性(neo)基因由LTR驅(qū)動(dòng)。
圖2.所分泌的sFv23e-PE40融合毒素的ADP-核糖基化活性。如以前所述(Collier和Kandel，1971；Chen等，1995)，收獲MOLT-sFv23e-PE40和MOLT-對(duì)照的培養(yǎng)基并進(jìn)行ADP-核糖基化試驗(yàn)。如以前所述(Collier和Kandel，1971)，用尿素使純化的PEA蛋白質(zhì)變性，然后進(jìn)行ADP-核糖基化試驗(yàn)。在減去背景水平后，用重復(fù)測(cè)定進(jìn)行所示樣品的平均閃爍計(jì)數(shù)。陰影柱表明所示濃度下的PEA活性。空白柱表明Molt-4對(duì)照培養(yǎng)基；MOLT-sFv23e-PE40(sFv23e-PE40-1)的培養(yǎng)基；MOLT-sFv23e-PE40的培養(yǎng)基(sFv23e-PE40-2)(其通過(guò)Amicon濾器得以濃縮)。
圖3A.將超量表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞(SKOV-3，N-87)及低表達(dá)HER2(或沒(méi)達(dá)到檢測(cè)水平)的對(duì)照細(xì)胞系(MCF-7和NIH3T3)接種在96孔的平板(1×105/ml)上。培養(yǎng)24小時(shí)后，添加0.3ml Molt-sFv23e-PE40(1和2個(gè)克隆)或Molt-對(duì)照細(xì)胞(5×105/ml)至平板的每孔中，并繼續(xù)共培養(yǎng)62小時(shí)。然后通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色(Chen等，1995)除去共培養(yǎng)中的死細(xì)胞，通過(guò)腫瘤細(xì)胞減去Molt-對(duì)照細(xì)胞在共培養(yǎng)中死亡細(xì)胞的百分比(3％)，然后再顯示所選的細(xì)胞的殺滅百分比。
圖3B.添加指定濃度的親本23e抗體至Molt-sFv23e-PE40和SKOV3腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)物中(1個(gè)克隆)，所呈現(xiàn)的細(xì)胞毒性抑制作用的百分比。
圖4A.將腫瘤細(xì)胞(N87)(5×106)皮下注射進(jìn)無(wú)胸腺/Nu小鼠的側(cè)部，并讓其生長(zhǎng)16天。計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量后，用PBS洗滌Molt-sFv23e-PE40或Molt-對(duì)照細(xì)胞并再次懸浮在培養(yǎng)基中。將具有腫瘤異常移植物的小鼠隨機(jī)分成兩組第1天對(duì)處理組(7只小鼠)施用Molt-sFv23e-PE40(0.2ml1×107)，對(duì)照組(5只小鼠)施用Molt-對(duì)照細(xì)胞(0.2ml 1×107)，然后每周注射一次直到第六周。每隔三至五天卡鉗測(cè)量腫瘤直徑，并由下式計(jì)算腫瘤體積腫瘤體積＝(寬度)2×長(zhǎng)度/2(Osborne等，1985)。已顯示了處理組(實(shí)線連接，方形)，及對(duì)照組(點(diǎn)線連接，實(shí)心菱形)的平均腫瘤體積。如Manova檢驗(yàn)所評(píng)估的，處理和對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線的區(qū)別為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著(P＝0.009)。
圖4B.顯示如圖4A所述的處理組(實(shí)心菱形)和對(duì)照組(實(shí)心方形))的存活率。
圖5.抗-gp120/毒素表達(dá)載體的示意圖。為了產(chǎn)生HIV-1-特異殺傷細(xì)胞，利用中和人類單克隆的抗體(105)(其可識(shí)別被HIV-1感染的細(xì)胞表面上表達(dá)的HIV-1 gp120的CD4-結(jié)合位點(diǎn))。將編碼PEA的結(jié)構(gòu)域II(用于穿過(guò)膜雙分子層的轉(zhuǎn)運(yùn))和結(jié)構(gòu)域III(用于EF-2的腺苷二磷酸(ADP)-核糖基化)的基因(PE40)融合到F105的k鏈基因上。所產(chǎn)生的雙順?lè)醋虞d體(pCMV-Fab105-PE40)含有在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下的Fd鏈(VH+CHI)，及內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)以及K-PE40嵌合基因(其之前為前導(dǎo)信號(hào)序列)。在LNCX-Fab105-PE40重組逆轉(zhuǎn)錄病毒穿梭載體中，F(xiàn)ab105/PE40嵌合基因由內(nèi)部CMV啟動(dòng)子表達(dá)，Neo基因由LTR表達(dá)。該構(gòu)建體是通過(guò)限制酶消化而鑒定的，并通過(guò)DNA序列分析得以確認(rèn)。
圖6A.所分泌的Fab105-PE40融合蛋白的抗原結(jié)合活性(由ELISA檢測(cè))。在Jurkat-Fab105-PE40的基質(zhì)中檢測(cè)到HIV-1 gp120的陽(yáng)性結(jié)合活性，而在Jurkat-對(duì)照基質(zhì)中沒(méi)有檢測(cè)到任何明顯結(jié)合活性。實(shí)心柱是Jurkat-Fab105-PE40(Fab105-PE40)的培養(yǎng)基；Jurkat-對(duì)照(Jurkat)培養(yǎng)基?？招闹鶚?biāo)明濃度的純化F105抗體(O.8-0.1μg/ml)與HIV-1 gp120的陽(yáng)性結(jié)合活性。
圖6 B.所分泌的Fab105-PE40的ADP-核糖基化活性(DPM)。將Jurkat-Fab105和Jurkat-對(duì)照細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行ADP-核糖基化試驗(yàn)。實(shí)心柱是Jurkat-Fab105-PE40(Fab 105-PE40-1)的培養(yǎng)基；Jurkat-Fab105-PE40(Fab105-PE40-2)培養(yǎng)基(通過(guò)Amlcon過(guò)濾使其濃縮)；Jurkat-對(duì)照(Jurkat)的培養(yǎng)基?？招闹置诘腇ab105-PE40的ADP-核糖基化活性(通過(guò)表明濃度的純化PEA(每反應(yīng)5-40ng)所測(cè)量的值)。
圖7A.在體外通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞對(duì)HIV-1感染細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性。用實(shí)驗(yàn)室毒株HIV-1病毒(IIIB)和兩種主要受治療者分離物(INME和TPO)感染親本Jurkat細(xì)胞，每隔三至四天測(cè)量反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性，直到RT活性達(dá)到平臺(tái)。然后將HIV-1-感染的Jurkat細(xì)胞放置在12孔Costar-Transwell濾器組織培養(yǎng)平板的頂部腔室中，并將Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-對(duì)照細(xì)胞以比率1∶1(HIV-感染的細(xì)胞Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-對(duì)照細(xì)胞)(空心柱)和比率1∶10(實(shí)心柱)放置在底部腔室中。頂端腔室中的HIV-1-感染細(xì)胞經(jīng)過(guò)72小時(shí)的共培養(yǎng)，然后計(jì)算存活的細(xì)胞數(shù)量，通過(guò)比較與Jurkat-對(duì)照共培養(yǎng)的感染細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)量，來(lái)闡述與Jurkat-Fab105-PE40共培養(yǎng)的感染細(xì)胞的殺滅細(xì)胞百分比以表明其存活細(xì)胞數(shù)量情況。
圖7B.轉(zhuǎn)導(dǎo)的LAK細(xì)胞的選擇性細(xì)胞殺滅。通過(guò)在培養(yǎng)基(其補(bǔ)充了riL-2和PHA)培育外周血液淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生人LAK細(xì)胞。通過(guò)將LAK細(xì)胞與轉(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞系(PA317)共培養(yǎng)24小時(shí)，可將Fab105-PE40基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到LAK細(xì)胞中，接著擴(kuò)大培養(yǎng)幾天。將所轉(zhuǎn)導(dǎo)的LAK細(xì)胞與來(lái)自實(shí)驗(yàn)室毒株HIV-1(IIIB)的HIV-感染細(xì)胞，以及兩個(gè)主要病系株(INME和TPO)共培養(yǎng)72小時(shí)，如上述表示細(xì)胞殺滅百分比。空心柱比率1∶1(HIV-感染細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)或擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的LAK細(xì)胞)。實(shí)心柱比率1∶10(HIV-感染細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)或擬轉(zhuǎn)導(dǎo)的LAK細(xì)胞)。
圖7C.抑制HIV-1感染的動(dòng)力學(xué)。將被主要HIV-1分離物(WEAU)感染的親本Jurkat細(xì)胞與Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-對(duì)照細(xì)胞以1∶1，1∶5和1∶10的比率進(jìn)行共培養(yǎng)。培養(yǎng)后每三至四天監(jiān)測(cè)共培養(yǎng)物中的RT活性。
說(shuō)明性實(shí)施方案的描述本發(fā)明提供了一種新型細(xì)胞毒性細(xì)胞，其集合了抗體的特異性，毒素的強(qiáng)毒性，及淋巴細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞特性，如歸巢和組織穿入作用，這樣均給抗體-指導(dǎo)的和細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫治療提供了優(yōu)點(diǎn)。細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞不僅識(shí)別靶，而且可產(chǎn)生有效的分子以主要的不依賴組織相容性(MHC)的方式殺死靶細(xì)胞。此外，所描述的細(xì)胞不因產(chǎn)生免疫毒素而具有副作用。驚人地是，細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞不僅能存活而且似乎不以任何方式被削弱。
本發(fā)明也被描述為能表達(dá)和分泌免疫毒素的細(xì)胞毒性細(xì)胞，其中所說(shuō)的免疫毒素包含前導(dǎo)序列信號(hào)序列和免疫學(xué)活性抗體結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞毒素，其中所說(shuō)的結(jié)構(gòu)域可識(shí)別靶細(xì)胞特異的抗原。本發(fā)明的細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫毒素對(duì)靶細(xì)胞與組織具有高特異性，這樣沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非靶細(xì)胞或組織的任何非特異性的毒性相互作用。細(xì)胞能產(chǎn)生免疫毒素分子至一段較長(zhǎng)的時(shí)間，多達(dá)三個(gè)月或更長(zhǎng)。
本發(fā)明的分泌免疫毒素的細(xì)胞的另一方面是為了患者的安全，該細(xì)胞可用陰性選擇標(biāo)記來(lái)標(biāo)記。通過(guò)將標(biāo)記基因摻入到用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的重組載體中，如兩個(gè)串聯(lián)拷貝的單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)(其提供在鳥嘌磷存在下的陰性選擇(Ishibashi等，1993)))，可選擇地消滅所轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(如果必要)。這使得萬(wàn)一有不利副作用，臨床醫(yī)師也可選擇性地消滅分泌免疫毒素的細(xì)胞。
這種新型細(xì)胞毒性的細(xì)胞(其能產(chǎn)生和分泌新靶毒素蛋白)是根據(jù)毒素的蛋白質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞殺滅機(jī)理來(lái)設(shè)計(jì)的。毒素分子(如假單胞菌屬外毒素(PEA))可阻止細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，并通過(guò)在胞質(zhì)溶膠中使延伸因子-2(EF-2)失活從而殺死細(xì)胞(Vitetta等，1987；Waldmann，1991；Dohlsten等，1994；Yamaizuni等，1978；Hwang等，1987；Siegall等，1989；Pastan等，1992)，這表明毒素分子定位于了胞質(zhì)溶膠以便殺死細(xì)胞。本發(fā)明利用該性質(zhì)，通過(guò)遺傳修飾細(xì)胞以利用前導(dǎo)信號(hào)序列產(chǎn)生和分泌靶毒素(Walter和Lingappa，1986)。然后，新合成的靶毒素轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔中然后分泌到細(xì)胞外。由于在胞質(zhì)溶膠中ER與分泌泡的膜脂雙層阻止了所合成的融合毒素與EF-2相互作用，因此表達(dá)毒素的細(xì)胞應(yīng)該仍然能存活。分泌的靶毒素在進(jìn)入并釋放到胞質(zhì)溶膠后選擇地結(jié)合和消滅靶細(xì)胞(Vitetta等，1987；Waldmann，1991；Dohlsten等，1994；Yamaizumi等，1978；Hwang等，1987；Siegall等，1989；Pastan等，1992)。然而，分泌的毒素不能殺死表達(dá)毒素的細(xì)胞，由于該細(xì)胞缺乏細(xì)胞表面上的靶抗原。遺傳修飾的細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞具有有力的和選擇性的細(xì)胞毒性，表明該方法能廣泛應(yīng)用于病毒感染，癌和自身免疫疾病的治療。
本發(fā)明的方法可用于治療病毒感染的治療應(yīng)用，尤其是HIV-1感染，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞可在淋巴組織和器官以及HIV-1感染的主要庫(kù)中歸巢并分泌抗-HIV/毒素(Pantaleo等，1993；Embretson等，1993)。這樣，局部所產(chǎn)生的較高水平的靶毒素與全身施用抗體/毒素蛋白質(zhì)(Chaudhary等，1988)相比能更有效地中和無(wú)細(xì)胞的毒粒，并消滅HIV-感染的細(xì)胞。因?yàn)榭贵w確定了在腫瘤細(xì)胞表面上選擇地表達(dá)的抗原數(shù)量增多(Pastan和FitzGerald，1992；Walter和Lingappa，1986；Waldmann，1991)，所以本發(fā)明的方法也可以用來(lái)選擇性地摧毀其它靶，如腫瘤。例如，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞毒性細(xì)胞所分泌的靶毒素可識(shí)別和消滅乳房癌細(xì)胞。
本發(fā)明的某些實(shí)施方案可用于自身免疫疾病和反應(yīng)的治療，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。這種類型的疾病經(jīng)常因T-輔細(xì)胞的特定子類的超活化而惡化。本發(fā)明提供了通過(guò)指導(dǎo)免疫毒素只對(duì)那些細(xì)胞起作用的特異性抑制有毒T-細(xì)胞的方法。因?yàn)榘忻庖叨舅貙⒉挥绊懯苤委熣咂渌拿庖邞?yīng)答機(jī)制部分(包括其它不與該抗體發(fā)生交叉-反應(yīng)T輔助細(xì)胞的子類)，所以該方法比治療自身免疫疾病的抑制整個(gè)免疫系統(tǒng)的療法具有優(yōu)勢(shì)。在該實(shí)施方案的實(shí)踐中，可從受治療者體內(nèi)分離T-輔細(xì)胞的毒性物種，并且利用本領(lǐng)域已知的制備抗體的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使其產(chǎn)生識(shí)別T-輔細(xì)胞子類的特異抗原的抗體。然后如本文所述利用該抗體產(chǎn)生免疫毒素載體，并用該載體來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞(如分泌對(duì)T輔助細(xì)胞的免疫毒素)。為了更好地定靶于疾病位點(diǎn)，所轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞可直接輸注在炎癥位置，如關(guān)節(jié)?？傊@類新型抗原特異性細(xì)胞毒性的細(xì)胞和融合蛋白(其具有抗體指導(dǎo)的和細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫治療特性)可廣泛應(yīng)用于治療病毒感染，癌和自身免疫疾病和反應(yīng)。
如本文所示，發(fā)現(xiàn)所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞毒性細(xì)胞在體外和體內(nèi)均對(duì)靶癌細(xì)胞具有有力的和選擇性的細(xì)胞毒性。除了集合了抗體的特異性及毒素分子的毒性和淋巴細(xì)胞的效應(yīng)-細(xì)胞-性質(zhì)之外，這些細(xì)胞還顯示在體內(nèi)具特異性抗-腫瘤的活性而沒(méi)有明顯非特異毒性。由于TILs再注入后可在體外迅速增生并擴(kuò)散再循環(huán)然后定位在腫瘤位點(diǎn)上(Perez等，1985；Gross等，1990；Goverman等，1990；Rosenberg，1991；Eshhar等，1993；Hwu等，1993；Rosenberg等，1988；Rosenberg等，1990；Kawakami等，1994；Bolhuis等，1991；Topalian等，1989；Barth等，1990)，本發(fā)明的一個(gè)方面是腫瘤滲透淋巴細(xì)胞(TILs)或其它淋巴細(xì)胞的利用。所轉(zhuǎn)導(dǎo)的TILs的歸巢腫瘤特點(diǎn)使得它們不僅可充當(dāng)向腫瘤組織傳送抗體/毒素的載體，還可在腫瘤組織內(nèi)充當(dāng)靶毒素生產(chǎn)者。尤其適合于那種幾乎不可能檢測(cè)到但可被這些靶的毒性細(xì)胞選擇性消滅(當(dāng)再輸入到受治療者體內(nèi)，以作免疫監(jiān)視時(shí))的腫瘤微轉(zhuǎn)移塊。免疫毒素免疫毒素技術(shù)是相當(dāng)先進(jìn)的技術(shù)，其為抗體研究領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。免疫毒素是具有與另一藥劑相連接的抗體組分的試劑，尤其是與細(xì)胞毒性或以其它方式抗細(xì)胞的藥劑(其能殺死或抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)或細(xì)胞分裂)相連接。典型的抗細(xì)胞劑包括化療劑和放射性同位素及細(xì)胞毒素。化療劑的例子是激素如類固醇；代謝拮抗物如胞嘧啶戊糖苷，氟尿嘧啶，氨甲蝶呤或氨基蝶呤；anthracycline；絲裂霉素C；長(zhǎng)春花生物堿；脫乙酰甲基秋水仙鹼；依托泊苷；光神霉素；或抗腫瘤烷化劑，如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。
優(yōu)選的免疫毒素通常包括來(lái)源于植物，霉菌或細(xì)菌的毒素，如鏈毒素，核糖體失活蛋白質(zhì)，α-次黃嘌呤，曲霉素，局限曲霉素，核糖核酸酶諸如胎盤的核糖核酸酶，血管生成素，白喉毒素或假單胞菌屬外毒素，皂草素，gelonin，或相思豆毒蛋白(所論及的僅僅是一些例子)。細(xì)胞毒素與抗體在淋巴細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞中遺傳上共表達(dá)是本發(fā)明的一個(gè)重要部分。因此，優(yōu)選利用的毒素是那些已知編碼基因，并可通過(guò)分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其插入到表達(dá)載體中的毒素。本文實(shí)踐中所述的任何這種毒素包括在所要求的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
例如，現(xiàn)在已克隆并表達(dá)了一種生物活性蓖麻毒蛋白A鏈(o′Hare等，1987；Lamb等，1985；Halling等，1985)，因此可將蓖麻毒蛋白A，或更小的或其它方式的變體肽(其仍具有適當(dāng)?shù)亩舅鼗钚?用于本發(fā)明的實(shí)踐中。此外，現(xiàn)在已克隆蓖麻毒蛋白A鏈的事實(shí)使得可應(yīng)用定點(diǎn)誘變，通過(guò)這些誘變易于制備，并篩選A鏈的衍生肽，并且獲得與本發(fā)明有關(guān)的另外的有用組分。單克隆抗體的制備在本領(lǐng)域大家熟知制備和鑒定抗體的方法(參見，例如，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1988；本文一并參考)。
通常按照制備多克隆抗體的相同線路開始產(chǎn)生單克隆抗體(MAb)。簡(jiǎn)言之，依據(jù)本發(fā)明，多克隆抗體是通過(guò)用免疫原性組合物(如特異性T-輔細(xì)胞的物種)免疫動(dòng)物(根據(jù)所使用的抗原組合物和方案，或進(jìn)行預(yù)先免疫耐受化或不進(jìn)行)，并從該免疫動(dòng)物中收集抗血清。各式各樣的動(dòng)物物種均可用于產(chǎn)生抗血清。用于產(chǎn)生抗血清的典型動(dòng)物是兔，小鼠，大鼠，倉(cāng)鼠，豚鼠或小羊。由于兔的血液量比較大，因此優(yōu)選兔來(lái)制備多克隆抗體。
如本領(lǐng)域所熟知的，給定的組合物的免疫原性可以變化。因此經(jīng)常需要促進(jìn)宿主的免疫系統(tǒng)，其可通過(guò)使載體偶連肽或多肽免疫原來(lái)達(dá)到目的。典型和優(yōu)選的載體是鎖眼帽貝血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它清蛋白如卵清蛋白，小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白可用作為載體。本領(lǐng)域熟知用以使載體蛋白質(zhì)連結(jié)多肽的方法，其包括戊二醛，m-馬來(lái)酰苯甲酰基-N-羥基琥珀酸胺酯，碳二亞胺和二-重氮化聯(lián)苯胺。
如本領(lǐng)域所熟知的，特定免疫原組合物的免疫原性可利用免疫應(yīng)答的非特異刺激物(稱為佐劑)得以提高。典型和優(yōu)選的佐劑包括完全費(fèi)氏佐劑(包含殺死的結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答的非特異刺激質(zhì))，不完全費(fèi)氏佐劑和氫氧化鋁佐劑。
用于制備多克隆抗體的免疫原組合物的量取決于免疫原的性質(zhì)及用于免疫的動(dòng)物。各種途徑可用來(lái)施用免疫原(皮下，肌內(nèi)，真皮內(nèi)，靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi))。通過(guò)免疫后在不同時(shí)間取免疫動(dòng)物的血液可監(jiān)控多克隆抗體的產(chǎn)生。也可再進(jìn)行一次助推器注射。重復(fù)促進(jìn)和滴度檢驗(yàn)的過(guò)程直到達(dá)到合適的滴度。當(dāng)達(dá)到所需的免疫原性水平時(shí)，可使免疫動(dòng)物流血，分離血清并存儲(chǔ)和/或?qū)?dòng)物用來(lái)產(chǎn)生MAb。
利用大家熟知的技術(shù)易于制備MAb，如美國(guó)專利4,196,265(本文一并參考)，所述技術(shù)。典型地，該技術(shù)涉及用所選擇的免疫原組合物對(duì)合適的動(dòng)物種進(jìn)行免疫處理，例如，純化的或部分純化的T-輔細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，多肽或肽或任何其它所需的抗原組合物。以刺激產(chǎn)生抗體細(xì)胞的有效方式施用組合物免疫。嚙齒動(dòng)物如小鼠和大鼠是優(yōu)選動(dòng)物，然而，也可利用兔子或綿羊細(xì)胞。利用大鼠具有一定的優(yōu)點(diǎn)(Goding，1986，pp.60-61)，但是優(yōu)選小鼠，BALB/c小鼠更優(yōu)選，這是常規(guī)利用的并且通常給出高百分比的穩(wěn)定融合蛋白。
免疫后，可選擇具有產(chǎn)生抗體能力的體細(xì)胞(尤其是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞))用于MAb生產(chǎn)方案。這些細(xì)胞可從活組織脾，扁桃體或淋巴結(jié)以及外周血液樣品中獲得。優(yōu)選脾細(xì)胞和外周血液細(xì)胞，因?yàn)榍罢呤钱a(chǎn)生抗體的細(xì)胞(其在分裂成漿細(xì)胞階段)的豐富來(lái)源，而后者因?yàn)橥庵苎喝菀撰@得。通常，將一組動(dòng)物進(jìn)行免疫處理，移走具有最高抗體滴度的動(dòng)物脾，并通過(guò)用注射器使脾勻化獲得淋巴細(xì)胞。典型地，一只免疫小鼠的脾含有大約5×107-2×108個(gè)淋巴細(xì)胞。
然后使來(lái)自免疫動(dòng)物的產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞與無(wú)限增殖的骨髓細(xì)胞(其通常是與所說(shuō)免疫動(dòng)物相同物種的一種)相融合。適宜用于產(chǎn)生雜交瘤融合方法(優(yōu)選為非-抗體-產(chǎn)生性的)的骨髓瘤細(xì)胞系具有高融合效率及酶缺陷性，這種酶缺陷性使得它不能在一定選擇性基質(zhì)(其只支持所需融合細(xì)胞(雜交瘤)的生長(zhǎng))中生長(zhǎng)。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可利用許多骨髓瘤細(xì)胞中的任何一種(Goding，pp.65-66，1986；Campbell，pp.75-83，1984)。引用)。例如，其中免疫動(dòng)物是小鼠時(shí)，可利用P3-X63/Ag8，X63/Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，F(xiàn)O，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0 Bul；對(duì)于大鼠，可利用R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR983F和4B210；U-266，GM1500-GRG2，LICR-LON-HMy2和UC729-6均可用于與人細(xì)胞融合的有關(guān)事項(xiàng)中。
優(yōu)選的鼠骨髓瘤細(xì)胞是NS-1骨髓瘤細(xì)胞系(也稱P3-NS-1-Ag4-1)，其可通過(guò)細(xì)胞系保藏號(hào)GM3573從NIGMS人基因突變體細(xì)胞保藏處獲得。另一個(gè)可利用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系是抗8-氮鳥嘌呤的小鼠骨髓瘤SP2/0非生產(chǎn)者細(xì)胞系。
通常用于制備產(chǎn)生抗體的脾或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜種的方法包括在一種或多種藥劑(化學(xué)劑或電方法)(其能促進(jìn)細(xì)胞膜的融合)的存在下，將體細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以2∶1的比例相混合，但比例可在約20∶1至約1∶1的范圍內(nèi)變化。利用仙臺(tái)病毒的融合方法見Kohier和Milstein的描述(1975，1976)，利用聚乙烯乙二醇(PEG)(如37％(v/v)PEG)的方法見Gefter等的描述(1977)。也適于利用電刺激引起融合(Goding pp.71-74，1986)。
融合方法通常以低頻產(chǎn)生的存活雜種，約1×10-6至1×10-8。然而，通過(guò)在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)將存活的融合雜種與親本未融合的細(xì)胞(尤其是繼續(xù)無(wú)限分裂的未融合的骨髓瘤細(xì)胞)區(qū)分開，因此這不成問(wèn)題。選擇培養(yǎng)基通常含有阻止組織培養(yǎng)基中從頭合成核苷酸的藥劑。典型和優(yōu)選的藥劑是氨基蝶呤，氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤均阻止嘌呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅僅阻止嘌呤合成。若利用氨基蝶呤或氨甲蝶呤，則給基質(zhì)補(bǔ)充次黃嘌呤和胸苷以作為核苷酸來(lái)源(HAT基質(zhì))。若利用重氮絲氨酸，則給基質(zhì)補(bǔ)充次黃嘌呤。
優(yōu)選的選擇培養(yǎng)基是HAT。僅僅能啟動(dòng)核苷酸補(bǔ)救途徑的細(xì)胞才能在HAT基質(zhì)中生存。骨髓瘤細(xì)胞缺損補(bǔ)救途徑的關(guān)鍵酶，例如，次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，因此它們不能生存。B細(xì)胞可以啟動(dòng)該途徑，但它們?cè)谂囵B(yǎng)中生活范圍有限，通常大約兩周之內(nèi)死去。因此，在選擇培養(yǎng)基中唯一存活的細(xì)胞是那些由骨髓瘤和B細(xì)胞所形成的雜種。
該培養(yǎng)提供一群雜交瘤，從中可選擇特定的雜交瘤。典型地，通過(guò)在微量滴定板用單克隆稀釋液培養(yǎng)細(xì)胞，接著檢驗(yàn)每個(gè)克隆上清液的所需反應(yīng)性(大約兩至三周后)來(lái)選擇雜交瘤。這種檢驗(yàn)分析應(yīng)該靈敏，簡(jiǎn)單和迅速，如放射免疫測(cè)定，酶免疫測(cè)定，細(xì)胞毒性試驗(yàn)，噬斑試驗(yàn)，點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)，等。
然后連續(xù)稀釋所選擇的雜交瘤并克隆到產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系的個(gè)體中，這些克隆可無(wú)限繁殖并提供MAb。以兩種基本方法可使該細(xì)胞系用于產(chǎn)生MAb?？蓪㈦s交瘤的樣品注射到(經(jīng)常為腹腔內(nèi)注射)常用來(lái)提供最初融合的體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的一類組織兼容性動(dòng)物體內(nèi)。所注射的動(dòng)物產(chǎn)生分泌特異單克隆抗體(其由融合的雜交細(xì)胞而產(chǎn)生)的腫瘤。穿刺放液處理動(dòng)物的體液(如血清或流動(dòng)的腹水)則可提供高濃度的MAb。也可體外培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞系，這時(shí)Mab自然分泌到培養(yǎng)基(從中易于獲得高濃度的Mab)中。利用過(guò)濾，離心和各種層析方法如HPLC或親和性層析，可對(duì)任何方法所產(chǎn)生的Mab進(jìn)行進(jìn)一步純化(如果需要)。免疫測(cè)定用于本發(fā)明實(shí)踐的免疫測(cè)定包括(但不限于)美國(guó)專利4,367,110(雙單克隆抗體夾心化驗(yàn))美國(guó)專利4,452,901(Wester印跡)所描述的。其它測(cè)定法包括在體內(nèi)和體外的配體標(biāo)記免疫沉淀法和免疫細(xì)胞化學(xué)法。
免疫測(cè)定，最簡(jiǎn)單和直接地說(shuō)就是結(jié)合分析。優(yōu)選的免疫測(cè)定是各種類型的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，以及其它本領(lǐng)域已知的固體支持物的免疫測(cè)定。最優(yōu)選的見Doellgast等(1993，1994)和美國(guó)專利4,668,621所描述的。利用組織段和放射免疫測(cè)定(RIA)的免疫組織化學(xué)測(cè)定法也特別有用。然而，更好的是這些檢測(cè)不限于這些技術(shù)，也可利用Western印跡，斑點(diǎn)印跡，F(xiàn)AGS分析，等。
在一個(gè)典型的ELISA中，本發(fā)明的抗體(即將用于免疫毒素的產(chǎn)生的那些抗體)固定化在挑選的具有蛋白質(zhì)親和性的表面上，如聚苯乙烯微滴定板的小孔。然后，往孔中添加可能含有靶抗原的生物樣品(其可以自身連接可檢測(cè)的標(biāo)記)。在結(jié)合后，進(jìn)行洗滌以除去非特異結(jié)合的免疫復(fù)合物，并檢測(cè)結(jié)合抗原的量。
此外，借助于二級(jí)結(jié)合配體(其對(duì)初級(jí)抗體具有結(jié)合親和性)可檢測(cè)第一次添加的組分(其成為初級(jí)免疫復(fù)合物內(nèi)的結(jié)合物)。在這些情況下，二級(jí)結(jié)合配體可與檢測(cè)標(biāo)記相連接。二級(jí)結(jié)合配體經(jīng)常本身就是抗體，可稱為″次級(jí)″抗體。在有效的條件下，將初級(jí)免疫復(fù)合物與標(biāo)記的次級(jí)結(jié)合配體或抗體相接觸至一段足以形成次級(jí)免疫復(fù)合物的時(shí)間。然后通常進(jìn)行洗滌以除去非特異結(jié)合的標(biāo)記的次級(jí)抗體或配體，然后檢測(cè)在次級(jí)免疫復(fù)合物中所余下的標(biāo)記。這種類型的ELISA是簡(jiǎn)單的″夾心ELISA″。
其它方法包括用兩步操作來(lái)檢測(cè)初級(jí)免疫復(fù)合物。二級(jí)結(jié)合配體如抗體(其對(duì)初級(jí)抗體具有結(jié)合親和性)可用來(lái)形成次級(jí)免疫復(fù)合物，如上述。在洗滌后，再一次在有效的條件下將次級(jí)免疫復(fù)合物與三級(jí)結(jié)合配體或抗體(其對(duì)二級(jí)抗體具有結(jié)合親和性)相接觸至一段足以形成免疫復(fù)合物(三級(jí)免疫復(fù)合物)的時(shí)間。三級(jí)配體或抗體可與檢測(cè)標(biāo)記相連接，這使得可檢測(cè)所形成的三級(jí)免疫復(fù)合物。如果需要，該系統(tǒng)可使信號(hào)擴(kuò)增。
在另一個(gè)典型的ELISA中，懷疑包含靶抗原的樣品固定化在小孔表面上，然后與本發(fā)明的抗體或免疫毒素相接觸。結(jié)合后，進(jìn)行洗滌除去非特異結(jié)合的免疫復(fù)合物，并檢測(cè)結(jié)合抗原。若初始抗體與可檢測(cè)標(biāo)記相連接，則可直接檢測(cè)免疫復(fù)合物。再一次利用二級(jí)抗體(其對(duì)一級(jí)免疫毒素抗體具有結(jié)合親和性)檢測(cè)免疫復(fù)合物，并且該二級(jí)抗體與可檢測(cè)標(biāo)記相連接。
另一種ELISA(其中蛋白質(zhì)或肽被固定化)包括利用檢測(cè)中的抗體競(jìng)爭(zhēng)。在這種ELISA中，將標(biāo)記的抗體添加至小孔中，使其結(jié)合，并且借助它們的標(biāo)記來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在用涂布壁的孔中進(jìn)行溫育之前或期間使樣品與標(biāo)記抗體相混合，從而檢測(cè)未知樣品中的靶抗原的量。樣品中靶抗原的存在使得減少了免疫毒素抗體與孔結(jié)合的量，這樣減少了最終的信號(hào)。
不管使用何種形式，ELISA具有一定的共同特性，如涂布，溫育或結(jié)合，洗滌以除去非特異性結(jié)合的物種，以及檢測(cè)結(jié)合免疫復(fù)合物。這些見下述在抗原或抗體涂布平板時(shí)，人們通常以抗原或抗體的溶液溫育(或過(guò)夜或規(guī)定的幾小時(shí))平板的小孔。然后洗滌平板的小孔以除去未完全吸附的材料。然后利用非特異性蛋白質(zhì)(其對(duì)于所檢驗(yàn)的抗血清是抗原中性的)涂布任何小孔的余下的有效表面。這些蛋白質(zhì)包括牛血清白蛋白(BSA)，酪蛋白以及奶粉溶液。涂布可阻斷固定化表面的非特異吸附位點(diǎn)，并且這樣減少由抗血清非特異結(jié)合在表面上所造成的背景影響。
在ELISA中，通常利用次級(jí)或三級(jí)檢測(cè)方法而非直接的方法。這樣，在蛋白質(zhì)或抗體結(jié)合到小孔(其涂上一層非反應(yīng)性物質(zhì)以減少背景影響)上后，進(jìn)行洗滌以除去未結(jié)合的材料，并在利于形成免疫復(fù)合物(抗原/抗體)方式的條件下，使固定化表面與被檢驗(yàn)的對(duì)照抗原和/或生物樣品相接觸。然后免疫復(fù)合物的檢測(cè)需要標(biāo)記的次級(jí)結(jié)合配體或抗體，或與標(biāo)記的三級(jí)抗體或三級(jí)結(jié)合配體協(xié)力作用的次級(jí)結(jié)合配體或抗體。
“在利于形成免疫復(fù)合物(抗原/抗體)方式的條件下”包括用溶液如BSA，牛微克球蛋白(BGG)和磷酸緩沖鹽水(PBS)/Tween稀釋抗原與抗體。這些添加劑有助于減少非特異的背景影響。″合適的″條件是指在使得可以有效結(jié)合的溫度下溫育至足以充分結(jié)合的時(shí)間。典型的溫育步驟約1-2-4小時(shí)，溫度優(yōu)選為25℃-27℃的順序，或在約4℃下過(guò)夜。
在所有ELISA的溫育步驟之后，洗滌該接觸表面以除去非復(fù)合的物質(zhì)。優(yōu)選的洗滌方法包括用溶液如PBS/Tween，或硼酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌。檢驗(yàn)樣品與原來(lái)的結(jié)合物質(zhì)所形成的特異性免疫復(fù)合物后，接著進(jìn)行洗滌，甚至能檢測(cè)微量免疫復(fù)合物的存在。
為了提供檢測(cè)方法，二級(jí)或三級(jí)抗體將與檢測(cè)標(biāo)記相連接。優(yōu)選酶，其通過(guò)用適當(dāng)?shù)娘@色底物進(jìn)行溫育可產(chǎn)生顏色。這樣，例如，需要在利于形成進(jìn)一步的免疫復(fù)合物的條件下，使一級(jí)或二級(jí)免疫復(fù)合物與綴合了脲酶，葡萄糖氧化酶，堿性磷酸酶或氫過(guò)氧化物酶的抗體相接觸并溫育至一段時(shí)間(如室溫下在含PBS的溶液如PBS-Tween中溫育2小時(shí))。
在用標(biāo)記抗體溫育之后，隨后進(jìn)行洗滌以除去未結(jié)合的物質(zhì)，定量分析標(biāo)記的量，如在過(guò)氧化物酶作為酶標(biāo)記的情況下通過(guò)用顯色底物如尿素和溴甲酚紫或2，2′-吖嗪-二-(3-乙基-苯二氫噻唑-6-硫酸[ABTS]和H2O2。然后通過(guò)測(cè)量顏色產(chǎn)生的程度進(jìn)行定量分析，例如，利用可視頻譜分光光度計(jì)。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，控制編碼蛋白質(zhì)的基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子與增強(qiáng)子由若干的遺傳元件組成。細(xì)胞機(jī)制能夠收集并整合每個(gè)元件所傳達(dá)的調(diào)節(jié)信息，這使得不同基因進(jìn)化不同的且經(jīng)常為復(fù)合物模式的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
本文所說(shuō)的術(shù)語(yǔ)啟動(dòng)子是指一組轉(zhuǎn)錄控制模塊，它們聚集在RNA聚合酶II的起始位點(diǎn)周圍。許多關(guān)于啟動(dòng)子如何組織的思想都來(lái)自對(duì)幾個(gè)病毒啟動(dòng)子的分析，其包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單位。這些研究(最近工作更加驗(yàn)證了)表明啟動(dòng)子由不連續(xù)的功能模塊組成，每個(gè)大約由7-20bp DNA組成，并包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活蛋白質(zhì)的識(shí)別位點(diǎn)。每個(gè)啟動(dòng)子中至少一個(gè)組件具有RNA合成的起始位點(diǎn)位置的作用。最好的已知例子是TATA盒，但是一些啟動(dòng)子缺乏TATA盒，如哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子以及SV40晚期基因的啟動(dòng)子，重疊在細(xì)胞起始位點(diǎn)的不連續(xù)元件利于固定起始處。
另外的啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始頻率。典型地，這些位于起始位點(diǎn)的上游區(qū)30-110bp，雖然近來(lái)表明一些啟動(dòng)子也含有起始位點(diǎn)下游區(qū)的功能元件。元件之間的間距是可變的，這樣若元件倒轉(zhuǎn)或相互之間相對(duì)移動(dòng)，啟動(dòng)子功能仍得以維持。在tk啟動(dòng)子中，元件之間的間距最多可增至50bp遠(yuǎn)而活性未降低。取決于啟動(dòng)子，每個(gè)元件可協(xié)同作用或獨(dú)立作用以激活轉(zhuǎn)錄。
最初發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子是增強(qiáng)位于同一DNA分子的遠(yuǎn)距離位置的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄遺傳元件。原核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的經(jīng)典研究幾乎沒(méi)有這種遠(yuǎn)距離作用的先例。后來(lái)的工作表明具有增強(qiáng)子活性的DNA區(qū)可組織得象啟動(dòng)子一樣。即，它們由許多單個(gè)元件組成，每個(gè)元件結(jié)合了一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄蛋白。增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的基本區(qū)別是操作上的差異。作為一個(gè)整體的增強(qiáng)子區(qū)必須能在遠(yuǎn)距離刺激轉(zhuǎn)錄；而這對(duì)啟動(dòng)子區(qū)或其組分是不必要的。另一方面，啟動(dòng)子必須有一個(gè)或多個(gè)元件，其能在特殊位點(diǎn)以一定的方向指導(dǎo)RNA合成的起始，而增強(qiáng)子缺乏這些特性。除了這些操作差異，增強(qiáng)子和啟動(dòng)子是十分類似的實(shí)體。它們具有在細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄的相同的一般性功能。它們經(jīng)常重疊并鄰接，而且似乎具有十分類似模結(jié)構(gòu)。綜合來(lái)說(shuō)，這些事項(xiàng)暗示增強(qiáng)子和啟動(dòng)子是同源的實(shí)體，并且結(jié)合至這些序列上的轉(zhuǎn)錄激活物蛋白可以以基本相同的方式與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)制相互作用。
下列是可用來(lái)與免疫毒素構(gòu)建體相組合的病毒啟動(dòng)子，細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子以及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。此外，在基因治療方案中也可利用任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合(AS PER真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù)EPDB)來(lái)驅(qū)動(dòng)免疫毒素融合基因的表達(dá)。
表1
啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的利用在本領(lǐng)域中人們認(rèn)為，要使編碼序列置于啟動(dòng)子的控制下，則需將蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄閱讀框的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，端放置在所選擇啟動(dòng)子的″下游″約1至約50個(gè)核苷酸處。此外，若進(jìn)行真核表達(dá)，其通常需要結(jié)合成包含協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)和適當(dāng)?shù)木巯佘账峄稽c(diǎn)(如5′-AATAAA-3′)的轉(zhuǎn)錄單位(如果這些不包含在原來(lái)的克隆節(jié)段內(nèi)的話)。典型地，聚A附加位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄終止位置之前的蛋白質(zhì)終止位點(diǎn)″下游″約30至2000核苷酸處。重組載體對(duì)于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用，表達(dá)載體的控制功能經(jīng)常由病毒物質(zhì)提供。例如，一般利用的啟動(dòng)子來(lái)自巨細(xì)胞病毒(CMV)，多形腫瘤，腺病毒2，以及最常見的猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子特別有用，因?yàn)橐讖牟《局蝎@得其含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的片段(Fiers等，1978)。如果其包含從HindIII位點(diǎn)至BglI位點(diǎn)(其位于病毒的復(fù)制起點(diǎn)處)約250bp的序列，也可利用較小或較大的SV40片段。此外，可以(也是經(jīng)常需要的)利用通常與所需基因序列相聯(lián)合的啟動(dòng)子或控制序列，只要這些控制序列與宿主細(xì)胞系統(tǒng)可兼容。
復(fù)制起點(diǎn)可通過(guò)載體構(gòu)建來(lái)提供，以便包含外源起點(diǎn)(如來(lái)自CMV，SV40或其它病毒(例如多形腫瘤，腺，VSV，BPV)來(lái)源的)，或由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制來(lái)提供。如果載體整合在宿主細(xì)胞染色體上，后者經(jīng)常足夠。表達(dá)載體的構(gòu)建使編碼PEA 253-613(ATCC)氨基酸的DNA片段在閱讀框中與抗-HIV-1gp120人單克隆抗體F105的K基因相融合。先構(gòu)建包含F(xiàn)d-IRES-K-F105的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體(Chen等，1994)，并用來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體pCMV-Fab105-PE40(圖.5)。所形成的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體(pCMV-Fab105-PE40)含有CMV啟動(dòng)子控制下的FdF105基因/內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列/k105-PE40融合基因。用限制酶消化來(lái)鑒定該表達(dá)載體，并由DNA序列分析進(jìn)行確認(rèn)。
在該表達(dá)載體中，在CMV啟動(dòng)子控制下轉(zhuǎn)錄單條mRNA，從單條mRNA分別翻譯出兩種基因產(chǎn)物。第一個(gè)Fd105基因的翻譯以帽依賴性方式的，第二個(gè)K-PE40融合基因以非帽依賴帽性方式在IRES的控制下進(jìn)行翻譯。載體構(gòu)建的詳情如下。利用IRES構(gòu)建Fab105的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體利用兩個(gè)獨(dú)立CMV啟動(dòng)子，可在Fab105表達(dá)載體中共表達(dá)Fab105片段的重鏈和輕鏈(Chen等，1994)。進(jìn)一步修飾具有兩個(gè)獨(dú)立CMV啟動(dòng)子序列的Fab105表達(dá)盒的共表達(dá)載體，以使其包括一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列。在逆轉(zhuǎn)錄病毒和其它載體中已利用來(lái)源于EMCV的IRES使兩個(gè)或多個(gè)基因得到有效的共表達(dá)。在這種類型的表達(dá)載體中，單一mRNA在上游啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從單條mRNA分別翻譯出兩種基因產(chǎn)物。第一個(gè)基因的翻譯以帽依賴性方式，第二個(gè)基因以非帽依賴性方式在IRES的控制進(jìn)行翻譯。
如下由利用兩個(gè)相同CMV啟動(dòng)子的表達(dá)載體來(lái)構(gòu)建利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列的雙順?lè)醋覨ab105表達(dá)載體利用引物(具有附加NheI克隆位點(diǎn)的5′-TTTGCTAGCGGTATTATCATCGTG-3′引物(SEQ ID NO1)；具有附加NotI位點(diǎn)的5′-TTTGCGGCCGCGAATTAAT TCCGGTTA-3′引物(SEQ IDNO2))，由pCITE-2a質(zhì)粒(Novogen，Madison，WI)PCRTM擴(kuò)增來(lái)源于腦心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列。用瓊脂糖膠純化IRES DNA片段，約515bp，然后用NheI/NotI切割。
為了將單個(gè)NheI克隆位點(diǎn)引入到具有IRES的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體中，由來(lái)自雜交瘤的cDNA PCRTM擴(kuò)增人單克隆中和抗體2.1H(其抗HIV-1 gp120的CD4-結(jié)合位點(diǎn))的輕入鏈片段，并測(cè)序(Bagley等，分子免疫學(xué)，311149-1160，1994)。然后用NheI/Xbal切割2.1H的輕鏈片段并進(jìn)行凝膠純化。通過(guò)連接三個(gè)片段，將NheI/Xbal切割的2.1H輕鏈和NotI/NheI切割的IRES DNA片段克隆到NotI/Xbal切割的pCMV-Fab105內(nèi)。通過(guò)DNA測(cè)序鑒定并確認(rèn)所產(chǎn)生的構(gòu)建體pCMV-FI105-IRES-2.1H，其含有F105的Fd，IRES，以及巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下的2.1H輕鏈序列。然后用NheI和Xbal消化pCMV-Fd105-IRES-2.1H質(zhì)粒，并從瓊脂糖膠中回收載體DNA片段。利用引物5′-GGTTGCTAGCATGGAAACCCCAGCGCAG-3′(SEQ ID NO3)5’-AAAATCTAGATTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3′(SEQ ID NO4)，由pCMV-Fab105進(jìn)行PCRTM擴(kuò)增F105的k鏈DNA片段。用NheI和Xbal消化所擴(kuò)增的k鏈片段，約760bp，并進(jìn)行瓊脂糖膠純化。然后將NheI/Xbal切割的pCMV-Fd105-IRES-2.1H與-K DNA片段連接在一起，并轉(zhuǎn)導(dǎo)到宿主大腸桿菌中。用酶消化鑒定所產(chǎn)生的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體pCMV-Fab105-I(其含有CMV啟動(dòng)子控制下的Fd/IRES/K基因)，并用于進(jìn)一步的研究。Fab105-PE40融合蛋白的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體的構(gòu)建從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的PEA基因含有三個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域I，細(xì)胞-識(shí)別域；結(jié)構(gòu)域II，轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域(氨基酸(aa)殘基253-404)；以及結(jié)構(gòu)域III，催化結(jié)構(gòu)域(405-613的aa)(Pastan和FitzGerald，科學(xué)2541173-1177，1942)。從質(zhì)粒pJH8(ATCC)上切割下包含編碼PEA的253-613氨基酸的序列的BglII-EcoRI片段，并克隆到pSP72載體(Stratagene)(pSP-PE40)。為了將NotI位點(diǎn)整合到該片段上，利用對(duì)應(yīng)PEA氨基酸253-258的具有附加NotI位點(diǎn)的引物5′-TTGCGGCCGCGAAAGGCGG CAGCCTGGCCGCG-3′(SEQ ID NO5)以及對(duì)應(yīng)氨基酸330-324的反向引物5′-GCGGATCGCTTCGCCCAGGT-3′(SEQ ID NO6)來(lái)擴(kuò)增氨基酸253-330，然后用NotI/SalI切割所擴(kuò)增的DNA。從pSP-PE40載體上切割下包含PEA氨基酸308-613序列的Sal I/XbaI-DNA片段，并純化。然后通過(guò)三片段連接，將氨基酸253/308的NotI/SalI片段和編碼氨基酸308/613的SalI/Xbal DNA片段克隆到pCMV-sFv23e-S的NotI/Xbal位點(diǎn)上。從pCMV-sFv23e/PE40切割下包含PE40(結(jié)構(gòu)域II和III)序列的NotI/Xbal DNA片段，由pCMV-Fab105-I載體PCRTM擴(kuò)增k鏈基因以摻入NheI/NotI位點(diǎn)。通過(guò)NheI/NotI-切割的k鏈/NotI/Xbal切割的PE40/NheI/Xbal切割的pCMV-Fab105-I的三片段連接，構(gòu)建所形成的Fab105-PE40雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體。通過(guò)限制酶消化鑒定載體，并由DNA測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)。放射標(biāo)記和免疫沉淀為了瞬時(shí)表達(dá)，利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Chen和Compans，1991)用20μg質(zhì)粒DNA pCMV-Fab105-PE40或載體pRc/CMV轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)染60-72小時(shí)后用200μCi35S-半胱氨酸放射性標(biāo)記一段時(shí)間。用200μCi35S-半胱氨酸放射性標(biāo)記所轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞(5×106)一段時(shí)間。將培養(yǎng)基和細(xì)胞溶胞產(chǎn)物與抗PEA和人類IgG的混合物進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。在還原條件下，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以分析樣品(Chen和Compans，1991)，并利用磷光造影(Phosphorimager)(Molecular Dynamic)進(jìn)行觀察。細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和PCRTM擴(kuò)增通過(guò)電穿孔法用pCMV-Fab105-PE40轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞(CD4+人T-淋巴細(xì)胞)，并且在包含G418(800μg/ml)的培養(yǎng)基中選擇兩至三周(Chen等，1994)。如所述(Maniatis等，1986)，從細(xì)胞中提取基因組DNA。下列低核苷酸用于PCRTM反應(yīng)A對(duì)5′-TTATTGCTAGC GTCGACCTTCGCGATGTACGGGCCAG-3′(SEQ ID NO7)和5′-GGTACCGAATTCTCTAGAACAAGATTTGGGCTC-3′(SEQ ID NO8)B對(duì)5′-GGTAGGCCTCAGGTGCAGCTGCAGGAG-3′(SEQ ID NO9)和5′-TTTGCTAGCGGTATTATCATCGTG-3′(SEQ ID NO10)C對(duì)5′-TTTGCGGCCGCGAATTAATTCCGGTTA-3′(SEQ ID NO)和5′-TTTAAGATCTCCACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3′(SEQ ID NO12)D對(duì)5′-TTGAATTCGGAGGTGGCCGGAAGTCACCCTGGCGCGGAGTTC(SEQ ID NO13)和5′-TTTATCGATTCTAGATTACGGCGGTTTGCCGGGCTG-3′(SEQ ID NO14)。在瓊脂糖凝膠上分析PCRTM產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和ADP-核糖基化測(cè)定如其它地方所描述(Chen等，1994，本文一并參考)在HIV-1 gp120-涂布的平板中完成ELISA。簡(jiǎn)言之，HIV-1 gp120涂布的平板用來(lái)自Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-對(duì)照的培養(yǎng)基進(jìn)行溫育，其后進(jìn)行抗人IgG(西格瑪)反應(yīng)。
如圖7A所示，所分泌的Fab105-PE40具有特異性結(jié)合HIV-1 gp120的活性。為了進(jìn)一步確定結(jié)合活性，利用其它抗體進(jìn)行ELISA。用10μg重組HIV-1 gp120涂布Elisa微量滴定板(美國(guó)生物技術(shù)公司)。用含1％BSA的TBST緩沖液封閉平板。添加Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-對(duì)照的培養(yǎng)基至平板上。然后將溶于TBST中的山羊抗人免疫球蛋白(西格瑪)或抗PEA(GIBCO BRL)的稀釋液(1∶1,000)添加至小孔中，接著加入抗山羊IgG-過(guò)氧化物酶綴合物(西格瑪)的TBST-1％BSA溶液(稀釋度為1∶1,000)。利用抗人IgG或抗PEA檢測(cè)到在Jurkat-Fab105-PE40培養(yǎng)基中的陽(yáng)性結(jié)合活性；而在Jurkat對(duì)照培養(yǎng)基中未檢測(cè)到任何明顯的結(jié)合活性。細(xì)胞培養(yǎng)和HIV-1感染為了檢查細(xì)胞毒性細(xì)胞的殺細(xì)胞活性，在12孔平板中放置直徑12mm、孔徑0.40μM的Costar-Transwell濾膜(其可分離細(xì)胞，但不分離大分子)(Costar公司，劍橋，MA)，并用于共培養(yǎng)測(cè)定。用實(shí)驗(yàn)室毒株HIV-1病毒(IIIB)或兩種主要的患者的分離物(INME和IPO)(其能感染Jurkat細(xì)胞，可從UAB(伯明翰，AL)的Drs.F.Gao和G.Shaw處獲得)感染親本Jurkat細(xì)胞。每三至四天測(cè)量反轉(zhuǎn)錄酶直到RT達(dá)到其平臺(tái)。然后以不同的比率將HIV-1-感染的Jurkat細(xì)胞放置在頂腔室中，將Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat對(duì)照細(xì)胞放置在底腔室中。每日計(jì)數(shù)在頂端腔室中的HTV-1-感染細(xì)胞的存活細(xì)胞數(shù)量。通過(guò)比較與Jurkat對(duì)照共培養(yǎng)的存活感染細(xì)胞的量，用與Jurkat-Fab105-PE40共培養(yǎng)的存活感染細(xì)胞的百分比來(lái)表示殺滅活性。為了檢查轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞對(duì)HIV-1 RT產(chǎn)生的效應(yīng)，利用主要HIV-1分離物(WEAU)感染親本Jurkat細(xì)胞。感染6天后，在受感染的Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)高水平的RT活性。然后用PBS洗滌這些感染的細(xì)胞，并以5×105/ml的細(xì)胞密度懸浮在RPMI-1640基質(zhì)/10％牛血清中。然后將受感染的Jurkat細(xì)胞以幾種不同的比率與Jurkat-Fab105-PE40及Jurkat對(duì)照相混合。如以前所述(Poiesz等，1980)進(jìn)行RT試驗(yàn)。構(gòu)建靶特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞通過(guò)將抗-HER2/毒素表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到人淋巴細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生腫瘤特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞。由于在胞質(zhì)溶膠中ER與分泌泡的膜脂雙層結(jié)構(gòu)阻止了EF-2與新近合成的融合毒素的相互作用，因此該基因修飾的細(xì)胞仍然能存活并表達(dá)和分泌靶抗體/毒素。然后在內(nèi)化并且釋放至靶腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中后，所分泌的抗體-毒素融合蛋白即能識(shí)別并消滅靶細(xì)胞。然而，靶毒素蛋白不殺死在細(xì)胞表面上缺乏靶抗原的所轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)毒素的細(xì)胞。這樣，這一新類型的具有抗體指導(dǎo)的和細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性特性的細(xì)胞毒性細(xì)胞將廣泛應(yīng)用于癌和其它疾病治療上。
通過(guò)將抗-HIVgp120/毒素表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到人淋巴細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生HIV-特異性的細(xì)胞毒性細(xì)胞。該遺傳修飾的細(xì)胞表達(dá)并分泌靶抗體/毒素，其能識(shí)別并特異性地殺死靶HIV-1-感染的細(xì)胞。該抗原特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞具有靶毒素生產(chǎn)者及載體的作用，這樣就結(jié)合了抗體指導(dǎo)的和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫治療的各優(yōu)點(diǎn)。靶特異性淋巴細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成速率為了確定在表達(dá)抗體/毒素蛋白質(zhì)的細(xì)胞中其細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成是否受到阻礙，分別檢查Jurkat-Fab105-PE40，Jurkat對(duì)照細(xì)胞，MOLT-SFv23e-PE40，以及MOLT對(duì)照的3H-亮氨酸的摻入速率。用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat對(duì)照(0.5×106)，然后懸浮在含有10％FBS的1ml RPMI 1640基質(zhì)中。添加3H-亮氨酸(ICN藥物，公司，1mCi/ml)至培養(yǎng)基中，使其終濃度為4μCi/ml，并在37℃下溫育1小時(shí)，接著用PBS洗滌三次以除去未摻入的3H-亮氨酸。沉淀后用三氯乙酸(TCA)洗滌，將小球再懸浮在4ml閃爍液體中(ScintiVerse ED，F(xiàn)isher)，并用閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)(LS Beekman)。發(fā)現(xiàn)Jurkat-Fab105-PE40和Jurkat-對(duì)照細(xì)胞的3H-亮氨酸的摻入速率為可比較的水平。靶特異性淋巴細(xì)胞的胸苷摻入速率通過(guò)測(cè)量胸苷摻入情況檢測(cè)DNA合成速率。用RPMI-1640洗滌Jurkat-F105-PE40，Jurkat對(duì)照細(xì)胞，MOLT-F105-PE40或MOLT對(duì)照細(xì)胞，并以0.5×106ml的密度再懸浮在RPMI-1640/10％FBS中。然后在有或沒(méi)有PHA(載體實(shí)驗(yàn)室)下添加細(xì)胞(終濃度為0.8μg/ml)1小時(shí)。然后分別添加10μCi的(甲基-3H)-胸苷(ICN藥物，公司，1mCi/ml)至每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中，并在37℃下溫育12小時(shí)。用100μl 0.5％SDS洗滌細(xì)胞三次，并將其溶解。然后將所溶解的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物添加至4ml閃爍液體中，并用閃爍計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。Jurkat-F105-PE40或Jurkat對(duì)照的3H-胸苷摻入速率沒(méi)有任何顯著性差異。此外，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除法檢測(cè)到兩個(gè)細(xì)胞系均為超過(guò)95％的存活率。還發(fā)現(xiàn)Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat對(duì)照細(xì)胞有一條類似的增殖曲線。Jurkat-Fab105-PE40細(xì)胞在四個(gè)多月觀察期內(nèi)仍然保持存活并正常增殖。
下列實(shí)施例旨在說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將看到下述實(shí)施例所揭示的技術(shù)代表了本發(fā)明發(fā)明人所發(fā)明的技術(shù)在本發(fā)明的實(shí)踐中很好地起作用，這樣可認(rèn)為它們構(gòu)成了其實(shí)踐的優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該(按照本文)能認(rèn)識(shí)到在所述具體實(shí)施方案中可作許多改變且仍然得到同樣或類似的結(jié)果，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
實(shí)施例1抗腫瘤細(xì)胞毒性細(xì)胞下列實(shí)施例說(shuō)明了特異于HER-2的細(xì)胞毒性細(xì)胞的構(gòu)建和利用，其中所說(shuō)的HER-2是表皮生長(zhǎng)因子家族的跨膜蛋白質(zhì)，其在各種人類腫瘤中得以超量表達(dá)，如乳房，卵巢，胃以及其它癌(King等，1985；Slamon等，1989；Wen等，1992；Hynes，1993；Muss等，1994)。發(fā)現(xiàn)抗HER2單鏈抗體(sFv)(其包含連接在來(lái)自單克隆抗體23e的輕鏈可變區(qū)上的重鏈可變區(qū))對(duì)HER-2的胞外結(jié)構(gòu)域具有高親合性結(jié)合活性，并在結(jié)合后能有效地進(jìn)入其內(nèi)部(Batra等，1992；Kasprzyk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993)。在本研究中，將具有前導(dǎo)信號(hào)序列的sFv23e基因在閱讀框中與切斷的基因(PE40)相融合，該切斷的基因在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下編碼PEA的結(jié)構(gòu)域II(轉(zhuǎn)移)和III(催化)(氨基酸253-613)(Rosenberg等，1988；Rosenberg等，1990；Kawakami等，1994；Gray等，1984；Allured等，1986)。該載體(pCMV-sFv23e-PE40)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并分泌抗-HER2sFv-PE40融合毒素。
合成具有附加信號(hào)前導(dǎo)序列(包括HindIII克隆位點(diǎn))的用于擴(kuò)增sFv23e基因的正向引物5′-TTAAGCTTATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCGACGTCCAGCTGACC-3′(F-1)(SEQ ID NO15)，并利用具有附加NotI克隆位點(diǎn)的反向引物5′-TTTGCGGCCGCGGAGACGGTGACCGTGGT-3′(SEQ ID NO16)來(lái)擴(kuò)增具有附加前導(dǎo)信號(hào)序列的sFv23e基因。然后將具有前導(dǎo)序列片段的sFv23e基因克隆進(jìn)質(zhì)粒pRc/CMV(Invitrogen)的HindIII/NotI位點(diǎn)內(nèi)，則所產(chǎn)生的載體為pCMV-sFv23e-S。從質(zhì)粒pJH8(ATCC)中切割下含有編碼PEA氨基酸(aa)253-613序列的BglII-EcoRI片段，并克隆到pSP72載體中(Stratagene)(pSP-PE40)。為了將NotI位點(diǎn)結(jié)合在片段上，利用對(duì)應(yīng)253-263氨基酸并具附加NotI位點(diǎn)的引物(5′-CCCGCGGCCGCGCCGTCGCCGAGGAACTC-3′(F-2)(SEQ IDNO17)和對(duì)應(yīng)氨基酸330-322的反向引物(5′-GCGGATCGCTTCGCCCAGGT-3′(SEQ ID NO18)來(lái)擴(kuò)增編碼氨基酸253-322的DNA片段，然后用NotI/SalI切割所擴(kuò)增的DNA。從pSP-PE40載體切割下編碼氨基酸322-613的Sal/XbaDNA片段并進(jìn)行純化。然后通過(guò)三片段連接，將氨基酸253/322的NotI/SalI片段和氨基酸322/613的SalI/Xbal片段克隆到pCMV-sFv23e-S的NotI/XbaI位點(diǎn)內(nèi)。通過(guò)限制酶消化確定所產(chǎn)生的構(gòu)建體，并由DNA序列分析進(jìn)行確認(rèn)。
為了檢驗(yàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞是否能產(chǎn)生抗體/毒素融合蛋白，用pCMV-sFv23e-PE40 DNA轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，并通過(guò)免疫熒光染色進(jìn)行分析。當(dāng)該細(xì)胞與抗-sFv23e(Batra等，1992；Kasprzyk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993)抗體或抗-PEA(Gibco-BRL)抗體一起溫育，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞質(zhì)中(尤其是核周高爾基區(qū))發(fā)現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性染色現(xiàn)象時(shí)，表明轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物COS細(xì)胞高水平地表達(dá)抗-HERSsFv/PE40融合蛋白。該染色模式類似于一種典型的分泌蛋白模式(Chen等，1994)。熒光陽(yáng)性細(xì)胞顯示了正常形態(tài)學(xué)，并且轉(zhuǎn)染的細(xì)胞超過(guò)98％均能存活(這類似于對(duì)照細(xì)胞)。在僅被載體轉(zhuǎn)染并用抗-sFv23e抗體和-PEA抗體的混合物染色的對(duì)照細(xì)胞中沒(méi)有觀察到任何明顯的染色。
用放射性標(biāo)記和免疫沉淀分析進(jìn)一步檢查融合蛋白的表達(dá)情況。用pCMV-sFv23e-PE40 DNA或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，60小時(shí)后，用35S-光氨酸放射性標(biāo)記轉(zhuǎn)染細(xì)胞4小時(shí)(Chen和Compans，1991)。從被抗-sFv23e抗體或抗-PEA抗體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的培養(yǎng)基中免疫沉淀出抗體-毒素融合蛋白，約70kd，隨后進(jìn)行SDS-PAGE分析。對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)帶。這些結(jié)果確認(rèn)了哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體/毒素融合蛋白。
將pCMV-sFv23e-PE40轉(zhuǎn)導(dǎo)到人T-淋巴細(xì)胞(Molt-4細(xì)胞)內(nèi)可產(chǎn)生特異于HER-2的細(xì)胞毒性細(xì)胞，然后進(jìn)行G418選擇(Chen等，1994)。人淋巴細(xì)胞表達(dá)低水平(幾乎不可檢測(cè))的HER-2蛋白質(zhì)(Potter等，1989；Press等，1990)。挑選抗G418的細(xì)胞，并亞克隆，進(jìn)一步分析它們的生物特性與蛋白質(zhì)表達(dá)情況。脈沖追蹤放射性標(biāo)記研究顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生并分泌了融合蛋白。
用基因組PCRTM分析來(lái)檢測(cè)是否摻入了表達(dá)載體基因。從MOLT-sFv23e-PE40和MOLT對(duì)照細(xì)胞中分離出基因組DNA(Maniatis等，1986)，并進(jìn)行PCRTM擴(kuò)增。由轉(zhuǎn)導(dǎo)的MOLT-sFv23e-PE40細(xì)胞(而非對(duì)照細(xì)胞)的基因組DNA特異擴(kuò)增PEA DNA片段的sFv23e DNA片段(約770bp)，結(jié)構(gòu)域II(約450bp)或結(jié)構(gòu)域III(約610bp)。此外，在MOLT-sFv23e-PE40的培養(yǎng)基中檢測(cè)到明顯的ADP-核糖基化活性，但是在對(duì)照細(xì)胞的基質(zhì)中僅檢測(cè)到背景水平的ADP-核糖基化活性，這表明分泌的融合蛋白具有毒素酶促活性。當(dāng)與純化的PEA(Gibco-BRL)的活性相比較時(shí)，MOLT-sFv23e-PE40(24小時(shí)/1×106細(xì)胞/ml)產(chǎn)生了超過(guò)0.5μg的PEA蛋白質(zhì)。
檢查MOLT-sFv23e-PE40的幾種生物特性。首先，檢查MOLT-sFv23e-PE40和MOLT對(duì)照細(xì)胞的增殖速率和存活力，并沒(méi)有任何明顯的區(qū)別。其次，通過(guò)3H-胸苷摻入法(有或沒(méi)有PHA(0.8μg/ml)的刺激)測(cè)量，發(fā)現(xiàn)MOLT-sFv23e-PE40和MOLT對(duì)照細(xì)胞的DNA合成速率相似。第三，通過(guò)3H-亮氨酸摻入法測(cè)量，發(fā)現(xiàn)MOLT-sFv23e-PE40和MOLT對(duì)照細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成速率幾乎相同。這樣，所轉(zhuǎn)導(dǎo)的MOLT-sFv23e-PE40細(xì)胞保持了它們的基本生物學(xué)功能。
為了確定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞是否對(duì)靶腫瘤細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒性，進(jìn)行了共培養(yǎng)研究。將表達(dá)不同水平的HER2細(xì)胞系與MOLT-sFv23e-PE40和MOLT對(duì)照淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)62小時(shí)。在與MOLT-sFv23e-PE40共培養(yǎng)的超量表達(dá)HER-2的腫瘤細(xì)胞(SKOV-3和N-87)中觀察到明顯的細(xì)胞殺滅力(Batra等，1992；Kasprzyk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993；Kraus等，1987)，而與MOLT-sFv23e-PE40共培養(yǎng)的低水平表達(dá)HER-2的腫瘤細(xì)胞(MCF-7和NIW3T3)中僅有少量的細(xì)胞被殺死(Di Fiore等，1987)(圖.3A)。MOLT對(duì)照細(xì)胞對(duì)高水平或低水平表達(dá)HER-2的腫瘤細(xì)胞均沒(méi)有任何明顯作用。因此，選擇性地抑制與MOLT-sFv23e-PE40共培養(yǎng)的超量表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。親本23e抗體也顯示其以一定濃度(其大小取決于方法)抑制細(xì)胞毒性(圖.3B)?？傊?，這些結(jié)果表明所轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞對(duì)靶癌細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒性。
通過(guò)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染，可產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞，MOLT-sFv23e-PE40和對(duì)照淋巴細(xì)胞，隨后進(jìn)行G418選擇(Chen等，1994)。如所描述的(Maniatis，1986)，從該細(xì)胞系中提取基因組DNA。以下列出了用于PCRTM反應(yīng)的低核苷酸A對(duì)F-1和5′-TTTAAGATCTACAGGAGACGGTGACCGTGG-3′(SEQ ID NO19)B對(duì)F-2和5′-TTGCGGCCGCGAAAGGCGGCAGCCTGGCCGCG-3’(SEQ ID NO5)C對(duì)5′-GGTACCGAATTCTCTAGAGGCGACGTCAGCTTCAGC-3′(SEQ ID NO20)和5′-TTAATTGCGGCCGCTTACTTCAGGTCCTCGCG-3′(SEQ ID NO21).
在瓊脂糖凝膠上分析PCRTM擴(kuò)增的DNA片段。
實(shí)施例2抗腫瘤細(xì)胞毒性細(xì)胞的體外活性進(jìn)一步在裸鼠模型中檢測(cè)實(shí)施例1所描述的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的抗腫瘤活性。利用人胃癌細(xì)胞系N87，這種細(xì)胞超量表達(dá)HER-2蛋白質(zhì)，并且在裸鼠中作為皮下腫瘤得以充分生長(zhǎng)(Batra等，1992；Kaspryzk等，1992；Bird等，1988；Marasco等，1993)。檢查采用的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的浸潤(rùn)能力。通過(guò)尾部注射給具有異體移植N87癌的昏迷裸鼠施用MOLT-sFv23e-PE40細(xì)胞。48小時(shí)后，處死小鼠，制備腫瘤組織的冷凍切片并用抗PEA抗體染色，接著用抗山羊IgG綴合物(西格瑪)進(jìn)行染色。在注射了MOLT-sFv23e-PE40的小鼠的腫瘤組織外周血管區(qū)觀察到明顯的熒光染色現(xiàn)象，而在Molt對(duì)照細(xì)胞所注射的動(dòng)物中無(wú)此現(xiàn)象。顯微鏡下沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)正常組織(肝，肺，腎和心臟)明顯的細(xì)胞毒性。然后檢測(cè)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)與動(dòng)物存活的作用。每周對(duì)具有異體移植N87腫瘤的小鼠靜脈注射Molt-sFv23e-PE40或Molt對(duì)照細(xì)胞(0.5至1.0×107)，共六周。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的施用嚴(yán)重地阻礙了異體移植腫瘤的生長(zhǎng)(圖.4A)。Molt對(duì)照細(xì)胞所注射的小鼠在70天內(nèi)全部死去，但是以Molt-sFv23e-PE40注射的小鼠在觀察期內(nèi)均存活(圖.4B)。這樣，施用轉(zhuǎn)染細(xì)胞能很好地阻止腫瘤生長(zhǎng)，并延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間。
實(shí)施例3重組抗-HIV-1毒素融合蛋白的表達(dá)為了產(chǎn)生HIV-1-特異性的細(xì)胞毒性細(xì)胞，可利用抗HIV-1 gp120(其在HIV-1-感染細(xì)胞的表面上得以表達(dá))(Sodroski等，1986；Lifson等，1986)的CD4-結(jié)合位點(diǎn)的人類中和單克隆抗體(F105)(Marasco等，1993；Thali等，1991；Chen等，1994)。將PEA的編碼結(jié)構(gòu)域II(用于跨雙層膜轉(zhuǎn)運(yùn))和結(jié)構(gòu)域III(用于EF-2的腺苷二磷酸(ADP)-核糖基化)的基因(PE40)(Gray等，1984；Allured等，1986；Siegall等，1989)與F105的k鏈基因相融合(Chen等，1994)。隨后，構(gòu)建一種雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體(pCMV-Fab105-PE40)，其含有Fd鏈(VH+CH1)，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)，及k-PE40嵌合基因(圖.5)。
通過(guò)將抗體/毒素表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)CD4+Jurkat人T-淋巴細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生特異于HIV-1-感染細(xì)胞的細(xì)胞毒性細(xì)胞，接著進(jìn)行G418選擇。選擇抗G418的細(xì)胞，并亞克隆，利用基因組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCRTM)來(lái)檢測(cè)Fab105-PE40基因是否摻入到細(xì)胞內(nèi)。如圖6A所示，由從轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞中分離出的基因組DNA特異性擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子-Fd，F(xiàn)d-IRES，IRES-k鏈，以及毒素結(jié)構(gòu)域III DNA片段。用抗人IgG抗體或抗PEA抗體從Jurkat-Fab105-PE40的培養(yǎng)基中免疫沉淀Fd和k-PE40蛋白質(zhì)，這表明Fd和k-PE40鏈的兩片段共同組合在Fab片段上。這樣，存活的所轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生并分泌抗體-PE40分子至培養(yǎng)基中。
用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢查所分泌的Fab105-PE40的抗原結(jié)合活性。在Jurkat-Fab105-PE40的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)gp120的陽(yáng)性結(jié)合活性，而在Jurkat對(duì)照中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何明顯的結(jié)合活性。與連續(xù)稀釋的純化親本F105抗體的結(jié)合活性相比較(Chen等，1994)，Jurkat-Fab105-PE40(24小時(shí)/1×106細(xì)胞/ml)產(chǎn)生了約0.6-0.7μg/ml的Fab105-PE40分子。利用ADP-核糖基化分析法檢查Fab105-PE40的毒素酶促活性。在Jurkat-Fab105-PE40的培養(yǎng)基中檢測(cè)到明顯的ADP-核糖基化活性，而在對(duì)照細(xì)胞的基質(zhì)中僅檢測(cè)到背景水平的ADP-核糖基化活性。當(dāng)與純化的PEA的ADP-核糖基化活性相比較時(shí)，Jurkat-Fab105-PE40(24小時(shí)/1×106細(xì)胞/ml)產(chǎn)生約0.8μg/ml的PEA蛋白質(zhì)。
檢查Jurkat-Fab105-PE40的幾種生物學(xué)特性。當(dāng)檢查Jurkat-Fab105-PE40和Jurkat對(duì)照細(xì)胞的增殖速率和存活力時(shí)，其區(qū)別幾乎可忽略。此外，通過(guò)3H-胸苷摻入法(有或沒(méi)有PHA(0.8μg/ml)的刺激)測(cè)量，發(fā)現(xiàn)Jurkat-Fab105-PE40與Jurkat對(duì)照的DNA合成速率相類似。當(dāng)用3H-亮氨酸摻入法測(cè)量時(shí)發(fā)現(xiàn)Jurkat-Fab105-PE40與Jurkat對(duì)照細(xì)胞的DNA合成速率幾乎相同。這樣，所轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat-Fab105-PE40細(xì)胞保持了它們的基本生物學(xué)功能。對(duì)HIV-1-感染細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性通過(guò)利用共培養(yǎng)分析檢查對(duì)HIV-1-感染細(xì)胞的細(xì)胞殺滅活性及對(duì)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的作用，來(lái)評(píng)估所轉(zhuǎn)導(dǎo)的Jurkat-Fab 105-PE40細(xì)胞對(duì)HIV-1-感染細(xì)胞的選擇性毒性。為了檢查細(xì)胞毒性細(xì)胞的細(xì)胞殺滅活性，用HIV-1實(shí)驗(yàn)室毒株(IIIB)或分別用兩種主要HIV-1分離物(INME和TPO)感染親本Jurkat T-淋巴細(xì)胞，然后將其以幾個(gè)不同的比率與Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat對(duì)照細(xì)胞在12孔Costar-Transwell濾膜培養(yǎng)平板中進(jìn)行共培養(yǎng)。計(jì)數(shù)頂部腔室中存活的HIV-1-感染的細(xì)胞量，圖7A顯示了非存活細(xì)胞的百分比。在被菌株IIIB或主要HIV-1分離物感染的細(xì)胞與Jurkat-Fab105-PE40的共培養(yǎng)物中觀察到明顯的細(xì)胞殺滅現(xiàn)象，但Jurkat對(duì)照中沒(méi)有。沒(méi)有觀察到任何對(duì)未受感染的親本Jurkat細(xì)胞的副作用。
為了在共培養(yǎng)中進(jìn)一步觀察病毒感染，用HIV-1患者主要分離物(WEAU)感染親本的Jurkat細(xì)胞6天，并用PBS洗滌三次，然后以幾種不同的比率與Jurkat-Fab105-PE40或Jurkat-對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。每三至四天通過(guò)測(cè)量病毒的RT活性監(jiān)控共培養(yǎng)物中的HIV-1感染情況。如圖7B所示，整個(gè)時(shí)期在與Jurkat-Fab105-PE40的共培養(yǎng)物中僅觀察到低水平的RT，而在與Jurkat對(duì)照的共培養(yǎng)物中檢測(cè)到明顯高水平的RT。當(dāng)利用增加的Jurkat-Fab105-PE40與靶HIV-1-感染細(xì)胞的比例時(shí)，觀察到對(duì)HIV-1感染的更強(qiáng)的抑制作用。沒(méi)有檢測(cè)到Jurkat-Fab105-PE40對(duì)共培養(yǎng)的未受到HIV-1感染的Jurkat和其它淋巴細(xì)胞系有任何作用。這樣，Jurkat-Fab105-PE40很有可能通過(guò)Fab 105-PE40融合蛋白的選擇性細(xì)胞毒性與中和活性有效地抑制HIV-感染。
實(shí)施例4
特異于B細(xì)胞譜系的殺傷細(xì)胞的產(chǎn)生前不久，產(chǎn)生了一種獨(dú)特的鼠單克隆抗體，Lym-1，其能識(shí)別正常和惡性B-細(xì)胞的細(xì)胞表面上存在的HLA-Dr抗原的多形變體(Epstein等，1987；Hu等，1995)。該抗體Lym-1與正常的B淋巴細(xì)胞相比較時(shí)，對(duì)淋巴瘤細(xì)胞具有明顯增加的親合力，尤其對(duì)B-細(xì)胞具有非凡的特異性。123I-標(biāo)記的Lym-1放射造影研究例證了淋巴瘤位點(diǎn)的選擇性定位以及檢測(cè)腫瘤位點(diǎn)的能力(Epstein等，1985；1987；DeNardo等，1987；1988a；1988b；Hu等，1989)。組織切片的免疫化學(xué)檢測(cè)及放射造影表明，目前還沒(méi)有任何Lym-1抗體結(jié)合T-細(xì)胞或其它正常細(xì)胞和組織的跡象(Epstein等，1987)?？傊?，顯示了抗體Lym-1對(duì)惡性B-細(xì)胞的特異性，并且其可用于B-譜系惡性腫瘤的靶治療。
為了利用Lym-1抗體特異性的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)嵌合基因可產(chǎn)生特異于B-譜系的白血病/淋巴瘤的殺傷細(xì)胞。所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞識(shí)別和殺死B-譜系的白血病/淋巴瘤細(xì)胞。具體地說(shuō)，克隆Lym-1抗體的抗體可變區(qū)的基因，并裝配到單鏈抗體(sFv)基因上。將sFv-Lym基因在閱讀框內(nèi)融合到PEA的結(jié)構(gòu)域II-III序列內(nèi)，并克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體內(nèi)。
將具有前導(dǎo)信號(hào)肽的sFv-lym/毒素基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)人T-淋巴細(xì)胞內(nèi)，可產(chǎn)生特異的細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞，其能產(chǎn)生并分泌sFv-lym/毒素融合蛋白。由ADP-核糖基化分析和流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析可證明所分泌抗體/毒素分子的B-細(xì)胞結(jié)合活性和毒素催化活性。在體外觀察到所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞毒性細(xì)胞對(duì)B-細(xì)胞白血病/淋巴瘤細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒性。該結(jié)果顯示這種新型的具有一定特異性的細(xì)胞毒性細(xì)胞可廣泛應(yīng)用于B-譜系惡性腫瘤和其它癌的治療?？贵w/毒素融合蛋白的構(gòu)建和表達(dá)從美國(guó)加利弗尼亞San Diego A.Epstein.教授處獲得單克隆抗體Lym-1的cDNA基因(Epstein等，1987)。分別PCRTM擴(kuò)增VH與VL cDNA基因，然后進(jìn)行凝膠純化。然后進(jìn)行延伸PCRTM以將VH與VL裝配到sFv中。所產(chǎn)生的sFv-Lym蛋白質(zhì)由連接了前導(dǎo)信號(hào)多肽序列的抗體Lym-1的輕鏈及重鏈可變區(qū)組成。來(lái)源于ATCC的PEA的基因含有三個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域I，細(xì)胞識(shí)別區(qū)；結(jié)構(gòu)域II，轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域(氨基酸(aa)殘基253-404)；以及結(jié)構(gòu)域III，催化結(jié)構(gòu)域(氨基酸405-613)(Pastan，1992)。
具體地說(shuō)，用抗體Lym-1的可變區(qū)基因作為PCRTM反應(yīng)的模板，如上述(Chen等，1994)。利用具有附加信號(hào)肽前導(dǎo)序列和Hind III克隆位點(diǎn)的VH-Lym正向引物(5′-TTAAGCTTCATATGGAACA TCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCC-3′SEQ ID NO22(F-1))，及具有附加鏈間接頭序列的反向引物5′-GCTCCCACCACCTCCGGAGCCACCGCCACCTGCAGAGACGTGACCCAGAGT-3′，SEQ ID NO23，來(lái)擴(kuò)增具有前導(dǎo)信號(hào)肽序列的VH基因。利用具有附加鏈間接頭序列的VL-Lym正向引物5′-GGTGGCGGTGGCTCCGGAGGTGGTGG6AGCGGTGGCGGCGGATCTGAGCTFCGTGAATGACCCAGTCTCCA-3′SEQ ID NO24，及具有附加NotI克隆位點(diǎn)的反向引物5′-AAAGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGT-3′SEQ ID NO25，(F-2)來(lái)擴(kuò)增具有前導(dǎo)信號(hào)肽序列的VL基因。然后利用引物F-1與F-2通過(guò)延伸PCRTM使PCRTM所擴(kuò)增的VH和VLDNA片段裝配到sFv-Lym中。然后將具有前導(dǎo)序列片段的sFv-Lym克隆進(jìn)入質(zhì)粒pRc/CMV(Invivrogen)的HindIII/NotI位點(diǎn)內(nèi)，所產(chǎn)生的載體命名為pCMV-sFv-Lym。特異于B-譜系白血病/淋巴瘤的細(xì)胞毒性細(xì)胞的產(chǎn)生通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)所融合的抗體/毒素表達(dá)載體，產(chǎn)生特異于B-譜系細(xì)胞的細(xì)胞毒性細(xì)胞?；蜣D(zhuǎn)移和選擇方法如上述(Chen等，1994)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)電穿孔法使抗體/毒素表達(dá)DNA轉(zhuǎn)染人T-淋巴細(xì)胞(如Molt，或SupT)，并在含G418的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。兩至三周后篩選出抗G418的細(xì)胞，并將其亞克隆。為了檢測(cè)重組蛋白質(zhì)表達(dá)情況，如上述，對(duì)所轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行放射標(biāo)記并進(jìn)行免疫沉淀。然后由SDS-PAGE分析樣品，并通過(guò)磷光造影使其可視。
對(duì)所轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行PCRTM分析以確定抗體/毒素基因是否摻入到所轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的基因組內(nèi)。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatias等，1986)，從所轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞中提取基因組脫氧核糖核酸。以下列出了用于PCRTM反應(yīng)的對(duì)應(yīng)sFv-Lym和PEA毒素基因的低核苷酸A對(duì)引物F-1和5′-TTTAAGATCTACAGGAGAC GGTGACCGTGG-3′(SEQ ID NO26)；B對(duì)F-2和5′-TTGCGGCCGCGAAAGGCGGCAGCCTGGCCGCG-3’(SEQ ID NO27)；C對(duì)5′-GGTACCGAATTCTCTAGAGGCGACGTCAGCTTCAGC-3′(SEQ TD NO28)和5′-TTAATTGCGGCCGCTTACTTCAGGTCCTCGCG-3’(SEQ ID NO29)。瓊脂糖膠電泳分析PCRTM產(chǎn)物。已摻入了編碼sFv-lym/毒素DNA的淋巴細(xì)胞基因組將產(chǎn)生具有PCRTM引物對(duì)的三個(gè)特異帶約770bp的sFv-Lym DNA片段，約450bp的PEA結(jié)構(gòu)域II以及約610bp的PEA結(jié)構(gòu)域III。
為了檢查哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抗體/毒素表達(dá)情況，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析。在蓋玻片上培育COS-1細(xì)胞，并利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑將5μg抗體/毒素表達(dá)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)(Chen和Compans，1992)。溫育48小時(shí)后，用抗毒素抗體(Gibco-BRL)固定細(xì)胞并染色，接著用熒光綴合物處理。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中觀察到強(qiáng)陽(yáng)性的熒光染色，而在對(duì)照細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到任何明顯染色。熒光染色定位在整個(gè)胞質(zhì)與核周高爾基區(qū)，這表明是典型的分泌蛋白質(zhì)染色模式。還證明了表達(dá)抗體/毒素蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞保持了它們正常的形態(tài)學(xué)，這表明哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體/毒素分子，并能存活。所分泌的重組抗體/毒素融合蛋白的結(jié)合B-細(xì)胞活性和毒素催化活性為了確定所分泌的抗體/毒素融合蛋白是否保持抗原結(jié)合活性。對(duì)惡性B-細(xì)胞系(如Raji)進(jìn)行流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。將Raji細(xì)胞(1×106)(ATCC)與不同的連續(xù)稀釋的抗體/毒素融合蛋白在4℃下溫育30分鐘，然后在利于進(jìn)一步形成免疫復(fù)合物的條件下(如室溫下在含PBS的溶液(如PBS-Tween)中溫育2小時(shí))與抗鼠IgG抗體綴合物或抗-PEA抗體接著與標(biāo)記的抗體綴合物(西格瑪)溫育一段時(shí)間。T-細(xì)胞系(如Molt-4，SupT)作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性結(jié)果表明由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體/毒素融合蛋白能結(jié)合B-細(xì)胞。
實(shí)施例5由腦細(xì)胞產(chǎn)生靶毒素通過(guò)脂質(zhì)體膠囊化將表達(dá)TGF-PE40融合毒素的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到正常的神經(jīng)元內(nèi)，該神經(jīng)元產(chǎn)生并分泌TGF-PE40融合毒素。在腫瘤異種移植裸鼠模型中，轉(zhuǎn)染一個(gè)月后檢測(cè)到轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元表達(dá)了TGF-PE40融合蛋白。
將TGF-PE40質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到組織培養(yǎng)基中和腫瘤異種移植裸鼠模型中的腦腫瘤細(xì)胞內(nèi)。人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞表達(dá)TGF-PE40，這導(dǎo)致擴(kuò)展的細(xì)胞毒性使周圍的腫瘤細(xì)胞死亡，即所轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠殺死許多周圍的腫瘤細(xì)胞。這樣，可局部利用靶毒素來(lái)產(chǎn)生并增強(qiáng)選擇性細(xì)胞殺滅能力，這對(duì)癌和自身免疫疾病的治療具有廣泛意義，尤其是腦癌的治療。例如，從腦除去腫瘤后，對(duì)受治療者施用該質(zhì)粒/脂質(zhì)體至腦內(nèi)。然后所產(chǎn)生的免疫毒素能尋找并消滅外科手術(shù)后殘余的腫瘤細(xì)胞，這些腫瘤細(xì)胞在它們生長(zhǎng)成另一個(gè)腫瘤之前不能被其它方式檢測(cè)到。因此，本發(fā)明為腦治療提供了一種非常有效的治療法。
實(shí)施例6與自身免疫疾病或反應(yīng)相聯(lián)系的物種特異性殺傷細(xì)胞T-輔細(xì)胞的產(chǎn)生為了轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細(xì)胞(這樣它們可產(chǎn)生能識(shí)別與T-輔細(xì)胞子類特異性相關(guān)的抗原的免疫毒素，其中所說(shuō)的T-輔細(xì)胞與自身免疫疾病或反應(yīng)(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)有相關(guān)聯(lián)，從患者分離出血液樣品，大約200cc/每樣品。從血液樣品中分離出淋巴細(xì)胞，并在適當(dāng)?shù)臈l件下按照J(rèn)anda等，臨床微生物學(xué)手冊(cè)(第5版，美國(guó)微生物學(xué)學(xué)會(huì)，華盛頓，DC，19章，P137)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方案(本文一并參考)進(jìn)行培養(yǎng)；以這種方法，約兩周之后從培養(yǎng)物中分離到約1011個(gè)淋巴細(xì)胞。
如上述轉(zhuǎn)導(dǎo)所分離并培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞，這樣它們將產(chǎn)生并分泌對(duì)所需物種的T輔助細(xì)胞具有免疫活性的細(xì)胞毒素。然后將這些淋巴細(xì)胞以藥學(xué)上可接受的載體再輸入，或注射到宿主受治療者體內(nèi)，這樣輸送了約109個(gè)淋巴細(xì)胞。間隔2周至6個(gè)月(或需要)再次施用該劑量?？勺兓┯盟x擇的位點(diǎn)以適合治療情況。例如，在關(guān)節(jié)炎癥風(fēng)溫性關(guān)節(jié)炎的情況下，優(yōu)選對(duì)關(guān)節(jié)施用藥劑。皮下，肌內(nèi)，真皮內(nèi)或其它位點(diǎn)都可以作為施用位點(diǎn)。
* * *按照本發(fā)明的教導(dǎo)，不須過(guò)度地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)就可以制造并實(shí)施本文所公開的和所要求的所有組合物和方法。雖然以優(yōu)選實(shí)施方案的方式描述了本發(fā)明的組合物與方法，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚本文所述的組合物和/或方法均可變化并且方法的步驟或步驟中的順序均可改變，而不背離本發(fā)明的概念、精神及范圍。更具體地說(shuō)，很明顯化學(xué)和生理學(xué)兩者上相關(guān)聯(lián)的某些試劑可替代本文所述的試劑，并得到相同或類似的結(jié)果。所有本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯知道的類似的替代和修改都被認(rèn)為在附加權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神，范圍以及概念之內(nèi)。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱Wake Forest大學(xué)(B)街道醫(yī)學(xué)中心大道(C)城市winston-Salem(D)州北卡羅來(lái)納(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵區(qū)代碼(ZIP)27157-1023(G)電話(512)418 3000(H)傳真(512)474-7577(ii)發(fā)明名稱靶向性細(xì)胞毒性細(xì)胞(iii)序列數(shù)29(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0版本#1.30(EPO)(vi)在先申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/740,003(B)申請(qǐng)日1996年10月23日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO1TTTGCTAGCG GTATTATCAT CGTG 24(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO2TTTGCGGCCG CGAATTAATICCGGTTA27(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO3GGTTGCTAGC ATGGAAACCC CAGCGCAG 28(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度31個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO4AAAATCTAGA TTAACACTCT CCCCTGTTGA A 31(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO5TTGCGGCCGC GAAAGGCGGC AGCCTGGCCG CG 32(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO6GCGGATCGCT TCGCCCAGGT 20(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO7TTATTGCTAG CGTCGACCTT CGCGATGTAC GGGCCAG37(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO8GGTACCGAAT TCTCTAGAAC AAGATTTGGG CTC33(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO9GGTAGGCCTC AGGTGCAGCT GCAGGAG 27(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO10TTTGCTAGCG GTATTATCAT CGTG 24(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO11TTTGCGGCCG CGAATTAATT CCGGTTA 27(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO12TTTAAGATCT CCACACTCTC CCCTGTTGAA33(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO13TTGAATTCGG AGGTGGCGGA AGTCACCCTGGCGCGGAGTT C41(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO14TTTATCGATT CTAGATTACG GCGGTTTGCC GGGCTG 36(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度80個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO15TTAAGCTTAT GAAACATCTG TGGTTCTTCCTTCTCCTGGT GGCAGCTCCC AGATGGGTCCTGTCCGACGT CCAGCTGACC 80(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO16TTTGCGGCCG CGGAGACGGT GACCGTGGT 29(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO17CCCGCGGCCG CGCCGTCGCC GAGGAACTC 29(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO18GCGGATCGCT TCGCCCAGGT 20(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO19TTTAAGATCT ACAGGAGACG GTGACCGTGG30(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO20GGTACCGAAT TCTCTAGAGG CGACGTCAGC TTCAGC 36(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO21TTAATTGCGG CCGCTTACTT CAGGTCCTCG CG 32(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度68個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO22TTAAGCTTCA TATGGAACAT CTGTGGTTCT TCCTTCTCCTGGTGGCAGCT CCCAGATGGG TCCTGTCC 68(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列序列特征(A)長(zhǎng)度51個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO23GCTCCCACCA CCTCCGGAGC CACCGCCACCTGCAGAGACG TGACCCAGAG T 51(2)SEQ ID 24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度71個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO24GGTGGCGGTG GCTCCGGAGG TGGTGGGAGCGGTGGCGGCG GATCTGAGCT TCGTGAATGACCCAGTCTCC 71(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO25AAAGCGGCCG CACGTTTGAT CTCCAGCTTG GT 32(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO26TTTAAGATCT ACAGGAGACG GTGACCGTGG30(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO27TTGCGGCCGC GAAAGGCGGC AGCCTGGCCG CG 32(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO28GGTACCGAAT TCTCTAGAGG CGACGTCAGC TTCAGC 36(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(xi)序列描述SEQ ID NO29TTAATTGCGG CCGCTTACTT CAGGTCCTCG CG 3權(quán)利要求
1.一種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，其表達(dá)和分泌免疫毒素。
2.權(quán)利要求1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其還被限定為細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其還被限定為神經(jīng)元。
4.權(quán)利要求1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說(shuō)的免疫毒素包括抗-腫瘤抗體結(jié)構(gòu)域。
5.權(quán)利要求3的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說(shuō)的抗-腫瘤抗體結(jié)構(gòu)域是與HER2抗原免疫反應(yīng)性的。
6.權(quán)利要求3的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說(shuō)的抗體結(jié)構(gòu)域是與Lym-1抗原免疫反應(yīng)性的。
7.權(quán)利要求1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說(shuō)免疫毒素的抗體結(jié)構(gòu)域是與病毒抗原免疫反應(yīng)性的。
8.權(quán)利要求7的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說(shuō)的病毒抗原是HIV抗原。
9.一種權(quán)利要求2的細(xì)胞毒性-T-淋巴細(xì)胞，其中所說(shuō)免疫毒素的抗體結(jié)構(gòu)域是與T-輔細(xì)胞免疫反應(yīng)性的。
10.權(quán)利要求1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說(shuō)的免疫毒素的毒素是下列物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域假單胞菌屬外毒素，白喉毒素，蓖麻毒蛋白A，相思豆毒蛋白，gelonin或皂草素毒素。
11.權(quán)利要求1的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，其中所說(shuō)的免疫毒素包含假單胞菌屬外毒素結(jié)構(gòu)域。
12.權(quán)利要求1的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其分散于藥學(xué)上可接受的載液中。
13.一種由表達(dá)載體轉(zhuǎn)染了的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說(shuō)的載體表達(dá)包含前導(dǎo)序列和免疫毒素的融合蛋白，而且所說(shuō)的前導(dǎo)序列指導(dǎo)所說(shuō)的免疫毒素進(jìn)入所說(shuō)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
14.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所說(shuō)的載體是質(zhì)粒。
15.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所說(shuō)的載體是病毒載體。
16.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所說(shuō)的免疫毒素與腫瘤相關(guān)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。
17.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所說(shuō)的免疫毒素與病毒相關(guān)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。
18.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所說(shuō)的免疫毒素與T-輔細(xì)胞相關(guān)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)。
19.權(quán)利要求17的細(xì)胞，其中所說(shuō)的病毒相關(guān)抗原是HIV相關(guān)抗原。
20.權(quán)利要求19的細(xì)胞，其中所說(shuō)的HIV相關(guān)抗原是gp120抗原。
21.權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中所說(shuō)的腫瘤相關(guān)抗原是HER2抗原。
22.權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中所說(shuō)的相關(guān)腫瘤抗原是Lym-1抗原。
23.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其還被限定為細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞。
24.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其還被限定為神經(jīng)元。
25.一種藥理學(xué)組合物，其包含分散于藥學(xué)上可接受的載體中的權(quán)利要求13的細(xì)胞。
26.一種殺滅癌細(xì)胞的方法，該方法包括使所說(shuō)的癌細(xì)胞與哺乳動(dòng)物分泌的免疫毒素相接觸，其中所說(shuō)免疫毒素的抗體部分識(shí)別所說(shuō)癌細(xì)胞的抗原。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的癌細(xì)胞超量表達(dá)HER-2。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是神經(jīng)元。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的癌細(xì)胞超量表達(dá)Lym-1。
31.權(quán)利要求28的方法，其中所說(shuō)的癌細(xì)胞是乳房，卵巢或胃癌細(xì)胞。
32.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的癌細(xì)胞是腦癌細(xì)胞。
33.權(quán)利要求26的方法，其中所說(shuō)的癌細(xì)胞在動(dòng)物受治療者中，而且所說(shuō)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞以藥物組合物的形式施用到所說(shuō)的受治療者體內(nèi)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所說(shuō)的受治療者是人類癌患者。
35.一種殺滅病毒感染的細(xì)胞的方法，該方法包括使所說(shuō)的細(xì)胞與細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞表達(dá)的免疫毒素相接觸，其中所說(shuō)免疫毒素的抗體部分識(shí)別所說(shuō)的病毒感染的細(xì)胞表達(dá)的抗原。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所說(shuō)的細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞以藥物溶液形式施用到具有病毒感染的細(xì)胞的動(dòng)物受治療者體內(nèi)。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所說(shuō)的受治療者是人。
38.一種抑制受治療者HIV感染的方法，該方法包括將藥物溶液施用至所說(shuō)的受治療者體內(nèi)，其中所說(shuō)的溶液包含細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞(其表達(dá)并分泌抗-HIV免疫毒素。
39.一種抑制受治療者腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，該方法包括將表達(dá)抗-腫瘤細(xì)胞免疫毒素的細(xì)胞毒性-T-細(xì)胞施用至受治療者體內(nèi)。
40.一種制備重組免疫毒素的方法，該方法包括下述步驟獲得被表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其中所說(shuō)的載體表達(dá)包含前導(dǎo)序列和免疫毒素的融合蛋白，而且其中所說(shuō)的前導(dǎo)序列指導(dǎo)該免疫毒素進(jìn)入所說(shuō)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中；和在有效表達(dá)所說(shuō)的免疫毒素的條件下培養(yǎng)所說(shuō)的細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的方法，該方法還包括分離所說(shuō)的免疫毒素的步驟。
全文摘要
本文公開了表達(dá)和分泌免疫毒素的哺乳動(dòng)物細(xì)胞,所說(shuō)的免疫毒素針對(duì)腫瘤、HIV抗原和其他患病的細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和神經(jīng)元。
文檔編號(hào)A61K35/14GK1244772SQ9719906
公開日2000年2月16日 申請(qǐng)日期1997年10月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年10月23日
發(fā)明者陳思毅 申請(qǐng)人:威克福雷大學(xué)