專利名稱：可提取物化合物以及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可可提取物和因此得到的化合物例如多酚類，優(yōu)選富含矢車菊苷配質(zhì)的多酚類。本發(fā)明還涉及制備這樣的提取物和化合物的方法以及其用作抗腫瘤劑、抗氧化劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑、環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制劑、NO(一氧化氮)或NO合酶調(diào)制劑，或者作為非甾類抗炎劑、編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑、血小板聚集調(diào)制劑、血液或體液葡萄糖調(diào)制劑、抗菌劑和氧化性DNA損傷的抑制劑。
在本發(fā)明中在每篇文獻(xiàn)出現(xiàn)的地方充分引述這些文獻(xiàn)或者在說明書的結(jié)尾處權(quán)利要求書之前的參考文獻(xiàn)部分引用。這些文獻(xiàn)屬于本發(fā)明的范圍；這里引用的每篇文獻(xiàn)在此引入以供參考。
背景技術(shù)：
多酚類是一組廣泛出現(xiàn)在各種不同植物中的非常不同的化合物(Ferreira等，1992)，其中一些植物進(jìn)入食物鏈。在一些情況下，它們代表一類重要的用于人類飲食的化合物。雖然一些苯酚被認(rèn)為是無營(yíng)養(yǎng)的，但是對(duì)這些化合物的興趣逐漸增高，因?yàn)樗鼈兛赡軐?duì)健康產(chǎn)生有益作用。
例如，已表明櫟精(一種類黃酮)在試驗(yàn)用動(dòng)物體中具有抗癌活性(Deshner等，1991和Kato等，1983)。業(yè)已表明(+)-兒茶酸和(-)-表兒茶酸(黃烷-3-醇類)可以抑制白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性(Chu等，1992)。同樣已表明Nobotainin(一種低聚可水解的鞣酸)具有抗腫瘤活性(Okuda等，1992)。同樣統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，日本的茶葉生產(chǎn)地區(qū)的胃癌死亡率明顯低。業(yè)已報(bào)道過表?xiàng)攦翰杷峥讞斔猁}是一種綠茶中的抑制小鼠皮膚癌的藥理學(xué)活性物質(zhì)(Okua等，1992)。已表明鞣花酸在各種動(dòng)物模型中具有抗癌因子活性(Bukharta等，1992)。最近，Kikkoman公司已獲得原花色素寡聚物作為抗誘變劑用途的專利。實(shí)際上，最近在美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)第202次全國(guó)會(huì)議中已經(jīng)提出食物中酚類化合物的領(lǐng)域和它們?cè)谠囼?yàn)用動(dòng)物模型中對(duì)腫瘤擴(kuò)散的調(diào)制作用(Ho等，1992；Huang等，1992)。
然而，這些報(bào)告均沒有教導(dǎo)或建議可可提取物或因此得到的化合物、制備這樣的提取物和因此得到的化合物的方法，或者可可提取物或因此獲得的化合物作為例如抗腫瘤劑、抗氧化劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑、環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制劑、NO(氧化一氮)或NO合酶調(diào)制劑，或者作為非甾類抗炎劑、編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑、血小板聚集調(diào)制劑、血液或體液葡萄糖調(diào)制劑、抗微生物劑和氧化性DNA損傷的抑制劑的用途。
目標(biāo)和發(fā)明概述因?yàn)槲窗l(fā)酵的可可豆包含大量的多酚類，所以本發(fā)明人認(rèn)為可能通過從可可中提取可可提取物，即可可中的化合物，和篩選該提取物的活性可以使該提取物顯示出類似的活性和用途。國(guó)家癌癥研究所已經(jīng)篩選了各種不同的用于抗癌活性的可可權(quán)屬(Theobroma)和Herrania屬作為他們龐大的天然產(chǎn)物選擇計(jì)劃的一部分。報(bào)道過在一些可可組織的提取物中具有低水平的活性，并且該工作沒有繼續(xù)進(jìn)行。因此，在抗腫瘤或抗癌手段中，不認(rèn)為可可和其提取物是有用的；也就是說，在抗腫瘤或抗癌手段中的教導(dǎo)誤導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員在癌癥治療中不使用可可和其提取物。
因?yàn)橐烟峁┰S多分析步驟研究可可多酚類對(duì)調(diào)料發(fā)展的貢獻(xiàn)(Clapperton等，1992)，所以，與抗腫瘤或抗癌手段中的知識(shí)相反，本發(fā)明人決定采用類似的方法來制備抗癌篩選的樣品。令人驚奇地，與現(xiàn)有技術(shù)中的知識(shí)例如國(guó)家癌癥研究所的篩選相反，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)包含矢車菊苷配質(zhì)的可可多酚提取物作為抗癌劑和抗腫瘤劑具有顯著的效用。
此外，本發(fā)明人證明，含矢車菊苷配質(zhì)的可可提取物和由可可提取物獲得的化合物可以作為抗腫瘤劑、抗氧化劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑、環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制劑、NO(氧化一氮)或NO合酶調(diào)制劑，或者作為非甾類抗炎劑、編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑、血小板聚集調(diào)制劑、血液或體液葡萄糖調(diào)制劑、抗菌劑和氧化性DNA損傷的抑制劑。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備可可提取物和/或因此得到的化合物的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種可可提取物和/或因此得到的化合物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種式An的聚合化合物和其藥物學(xué)上可接受的鹽或衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，其中A是具有結(jié)構(gòu)式

的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在4、6或8位上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及Y=Z=氫；糖任選地在任何位置上例如通過酯鍵被酚部分取代。
本發(fā)明的又一目的是提供一種式An的聚合化合物和其藥物學(xué)上可接受的鹽或衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，其中A是具有結(jié)構(gòu)式

的單體，n是2～18的整數(shù)，例如3～18；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體通過(4→6)或(4→8)鍵合在4位上；在4位上的鍵具有α或β立體化學(xué)；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，并且對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫；4位上的鍵有α或β立體化學(xué)。
糖任選地在任何物質(zhì)上例如通過酯鍵被酚部分取代。
本發(fā)明的另一目的是提供一種抗氧化組合物。
本發(fā)明的又一目的是證明對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶活性的抑制作用。
本發(fā)明的目的還在于提供一種治療腫瘤或癌癥的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種抗癌、抗瘤或抗腫瘤組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種抗微生物組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種NO或NO合酶調(diào)制組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種非甾類抗炎組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種血液或體液葡萄糖調(diào)制組合物。
本發(fā)明的目的還在于提供一種使用抗腫瘤、抗氧化、抗微生物、環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制或NO或NO合酶調(diào)制、非甾類抗炎調(diào)制和/或血液或體液葡萄糖調(diào)制組合物治療患者的方法。
本發(fā)明的附加目的是提供一種抑制氧化性DNA損傷的組合物和方法。
本發(fā)明的又一目的是提供一種血小板聚集調(diào)制的組合物和方法。
本發(fā)明的又一目的是提供一種編程性細(xì)胞死亡調(diào)制的組合物和方法。
本發(fā)明的又一目的是提供一種制備上述任何組合物的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種在上述方法中使用的或用于制備上述組合物的試劑盒已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可可提取物和因此得到的化合物具有抗瘤、抗癌和抗腫瘤活性，或者是一種抗氧化組合物，或者抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶活性，或者是抗微生物劑，或者是一種環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制劑，或者是NO或NO合酶調(diào)制劑，或者是非甾類抗炎劑，是編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑，是血小板聚集調(diào)制劑，或者是血液或體液葡萄糖調(diào)制劑，或者是氧化性DNA損傷的抑制劑。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種基本上純的可可提取物和由此得到的化合物。該提取物或化合物優(yōu)選包括多酚類例如富含可可矢車菊苷配質(zhì)的多酚(類)，例如至少一種可可矢車菊苷配質(zhì)選自(-)表兒茶酸、(+)兒茶酸、矢車菊苷配質(zhì)B-2、矢車菊苷配質(zhì)寡聚物2～18，例如3～18，如2～12或3～12，優(yōu)選2～5或4～12，更優(yōu)選3～12，最優(yōu)選5～12，矢車菊苷配質(zhì)B-5、矢車菊苷配質(zhì)A-2、矢車菊苷配質(zhì)C-1。
本發(fā)明還提供一種由基本上純的可可提取物或由此得到的化合物或合成可可多酚類例如富含矢車菊苷配質(zhì)的多酚類和合適載體例如藥物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)或食品科學(xué)上可接受的載體組成的抗瘤、抗癌和抗腫瘤劑，或者抗氧化劑，或者DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑，或者抗微生物劑，或者環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制劑，或者NO或NO合酶調(diào)制劑，非甾類抗炎劑，編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑，血小板聚集調(diào)制劑，血液或體液葡萄糖調(diào)制劑，或者氧化性DNA損傷的抑制劑的組合物。該提取物和由此得到的化合物優(yōu)選包括可可矢車菊苷配質(zhì)。該可可提取物或由此得到的化合物優(yōu)選是通過如下方法得到，該方法包括將可可豆磨成粉末，使該粉末脫脂，從該粉末中提取活性化合物并純化。
本發(fā)明還包括一種使用抗瘤、抗癌和抗腫瘤劑，或者抗氧化劑，或者DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑，或者抗微生物劑，或者環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制劑，或者NO或NO合酶調(diào)制劑，非甾類抗炎劑，編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑，血小板聚集調(diào)制劑，血液或體液葡萄糖調(diào)制劑，或者氧化性DNA損傷的抑制劑治療需要治療的患者的方法，該方法包括給患者施用一種由有效量的基本上純的可可提取物或由此得到的化合物或合成可可多酚或矢車菊苷配質(zhì)和一種載體，例如藥物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)或食品科學(xué)上可接受的載體。可可提取物或由此得到的化合物可以是可可矢車菊苷配質(zhì)；優(yōu)選是通過將可可豆磨成粉末，使該粉末脫脂，并從該粉末中提取活性化合物并純化而獲得的。
此外，本發(fā)明提供一種使用抗瘤、抗癌和抗腫瘤劑，或者抗氧化劑，或者DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑，或者抗微生物劑，或者環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制劑，或者NO或NO合酶調(diào)制劑，非甾類抗炎劑，編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑，血小板聚集調(diào)制劑，血液或體液葡萄糖調(diào)制劑，或者氧化性DNA損傷的抑制劑治療需要治療的患者的試劑盒，其包括基本上純的可可提取物或由此得到的化合物或合成可可多酚或矢車菊苷配質(zhì)和一種合適于與提取物或由此得到的化合物或合成多酚或矢車菊苷配質(zhì)混合的載體，例如藥物學(xué)、獸醫(yī)學(xué)或食品科學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明提供一種在附圖38A～38P和39A～39AA中所示的化合物；目前優(yōu)選4→6和4→6的連鎖。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含本發(fā)明化合物的食品防腐和制備組合物，以及通過在食品中添加該組合物來制備或防腐食品的方法。
以及，本發(fā)明還包括含本發(fā)明化合物和合適載體或稀釋劑的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑，以及通過施用該組合物來治療需要治療的患者的方法。
概括地，鑒于上述包括可可提取物的實(shí)施方案，本發(fā)明也包括這樣的實(shí)施方案，其中使用本發(fā)明的化合物代替或作為可可提取物。因此，本發(fā)明包括試劑盒、方法和類似于那些上述與可可提取物和本發(fā)明化合物有關(guān)的組合物的組合物。
下面的詳細(xì)說明公開了這些和其它目的和實(shí)施方案或?qū)⑹顾鼈兏宄?br> 附圖簡(jiǎn)述參照附圖將更好地理解下面的詳細(xì)說明，在附圖中附

圖1表示粗可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分的代表性凝膠滲透層析譜；附圖2A是表示從未發(fā)酵的可可中提取的可可矢車菊苷配質(zhì)分離的代表性反相HPLC層析圖(洗脫圖)；附圖2B表示從未發(fā)酵的可可中提取的可可矢車菊苷配質(zhì)的代表性正相HPLC分離；附圖3表示幾個(gè)代表性的矢車菊苷配質(zhì)結(jié)構(gòu)；附圖4A～4E表示在抗癌或抗腫瘤活性的篩選中采用的5個(gè)級(jí)分的代表性HPLC層析圖；附圖5和6A～6D表示可可提取物和癌細(xì)胞ACHN(附圖5)和PC-3(附圖6A～6D)之間的劑量-反應(yīng)關(guān)系(殘存級(jí)分/劑量，微克/毫升)；M&M2 F4/92、M&MA+E U12P1、M&MB+E Y192P1、M&MC+E U12P2、M&MD+E U12P2；附圖7A～7H表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A、B、C、D、E、A+B、A+E和A+D與PC-3細(xì)胞系之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(殘存級(jí)分/劑量，微克/毫升)；MM-1A 0212P3、MM-1 B 0162P1、MM-1 C0122P3、MM-1 D 0122P3、MM-1 E 0292P8、MM-1 A/B 0292P6、MM-1 A/E 0292P6、MM-1 A/D 0292P6；附圖8A～8H表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A、B、C、D、E、A+B、B+E和D+E與KB鼻咽/Hela系之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(殘存級(jí)分/劑量，微克/毫升)；MM-1A 092K3、MM-1 B 0212K5、MM-1 C0162K3、MM-1 D 0212K5、MM-1 E 0292K5、MM-1 A/B 0292K3、MM-1 B/E 0292K4、MM-1 D/E 0292K5；附圖9A～9H表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A、B、C、D、E、B+D、A+E和D+E與HCT-116細(xì)胞系之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(殘存級(jí)分/劑量，微克/毫升)；MM-1 C 0192H5、D 0192H5、E 0192H5、MM-1 B&D 0262H2、A/E 0262H3、MM-1 D＆E 0260H1；附圖10A～10H表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A、B、C、D、E、B+D、C+D和A+E與ACHN腎細(xì)胞系之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(殘存級(jí)分/劑量，微克/毫升)；MM-1A 092A5、MM-1 B 092A5、MM-1 C0192A7、MM-1 D 0912A7、M&M1 E 0912A7、MM-1 B&D0302A6、MM-1 C&D 0302A6、MM-1 A&E 0262A6；附圖11A～11H表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A、B、C、D、E、A+E、B+E和C+E與A-549肺細(xì)胞系之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(級(jí)分存活/劑量，微克/毫升)；MM-1A 019258、MM-1 B 09256、MM-1 C019259、MM-1 D 091258、MM-1 E 091258、A/E 026254、MM-1B&E 030255、MM-1 C&E N6255；附圖12A～12H表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A、B、C、D、E、B+C、C+D和D+E與SK-5黑色瘤細(xì)胞系之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(殘存級(jí)分/劑量，微克/毫升)；MM-1A 0121S4、MM-1 B 0121S4、MM-1C 0121S4、MM-1 D 0121S4、MM-1 E N32S1、MM-1 B&C N32S2、MM-1 C&D N32S3、MM-1 D&E N32S3；附圖13A～13H表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A、B、C、D、E、B+C、C+E和D+E與MCF-7乳腺細(xì)胞系之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(級(jí)分存活/劑量，微克/毫升)；MM-1A N22M4、MM-1 B N22M4、MM-1C N22M4、MM-1 D N22M3、MM-1 E 0302M2、MM-1 B/C0302M4、MM-1 C&E N22M3、MM-1 D&E N22M3；附圖14表示可可矢車菊苷配質(zhì)(特別是級(jí)分D)與CCRF-CEM T-細(xì)胞白血病細(xì)胞系之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(細(xì)胞/mL/生長(zhǎng)天數(shù)；空心圓圈是對(duì)照物，實(shí)心圓圈是125μg的級(jí)分D，空心倒三角是250μg的級(jí)分D，實(shí)心倒三角是500μg的級(jí)分D)；附圖15A表示XTT和抗使用級(jí)分D+E處理的MCF-7 p168肺癌細(xì)胞的結(jié)晶紫細(xì)胞毒性鑒定的對(duì)比(空心圓圈是XYY，實(shí)心圓圈是結(jié)晶紫)；附圖15B表示從使用各種水平的來自UIT-1可可基因型的粗多酚處理的MDA MB231肺癌細(xì)胞系得到的典型劑量反應(yīng)曲線(吸光度(540納米)/天數(shù)；空心圓圈是對(duì)照物，實(shí)心圓圈是載體，空心倒三角是250μg/mL，實(shí)心倒三角是100μg/mL，空心正方形是10μg/mL；吸光度2.0是板讀數(shù)器的最大值，并且不一定表示細(xì)胞數(shù)目)；附圖15C表示從使用各種水平的來自UIT-1可可基因型的粗多酚處理的PC-3前列腺癌細(xì)胞系得到的典型劑量反應(yīng)曲線(吸光度(540納米)/天數(shù)；空心圓圈是對(duì)照物，實(shí)心圓圈是載體，空心倒三角是250μg/mL，實(shí)心倒三角是100μg/mL，空心正方形是10μg/mL)；
附圖15D表示從使用各種水平的來自UIT-1可可基因型的粗多酚處理的MCF-7 p168乳腺癌細(xì)胞系得到的典型劑量反應(yīng)曲線(吸光度(540納米)/天數(shù)；空心圓圈是對(duì)照物，實(shí)心圓圈是載體，空心倒三角是250μg/mL，實(shí)心倒三角是100μg/mL，空心正方形是10μg/mL，實(shí)心正方形是1μg/mL；吸光度2.0是板讀數(shù)器的最大值，并且不一定表示細(xì)胞數(shù)目)；附圖15E表示從使用各種水平的來自UIT-1可可基因型的粗多酚處理的海拉子宮癌細(xì)胞系得到的典型劑量反應(yīng)曲線(吸光度(540納米)/天數(shù)；空心圓圈是對(duì)照物，實(shí)心圓圈是載體，空心倒三角是250μg/mL，實(shí)心倒三角是100μg/mL，空心正方形是10μg/mL；吸光度2.0是板讀數(shù)器的最大值，并且不一定表示細(xì)胞數(shù)目)；附圖15F表示抗使用不同可可多酚級(jí)分處理的Hela子宮癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用(吸光度(540納米)/天數(shù)；空心圓圈是100μg/mL級(jí)分A-E，實(shí)心圓圈是100μg/mL級(jí)分A-C，空心倒三角是100μg/mL級(jí)分D&E；吸光度2.0是板讀數(shù)器的最大值，并且不一定表示細(xì)胞數(shù)目)；附圖15G表示抗使用不同可可多酚級(jí)分處理的SKBR-3乳腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用(吸光度(540納米)/天數(shù)；空心圓圈是級(jí)分A-E，實(shí)心圓圈是級(jí)分A-C，空心倒三角是級(jí)分D&E)；附圖15H表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分D+E和Hela之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(吸光度(540納米)/天數(shù)；空心圓圈是對(duì)照物，實(shí)心圓圈是100μg/mL，空心倒三角是75μg/mL，實(shí)心倒三角是50μg/mL，空心正方形是25μg/mL，實(shí)心正方形是10μg/mL；吸光度2.0是板讀數(shù)器的最大值，并且不表示細(xì)胞數(shù)目)；附圖15I表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分D+E和SKBR-3細(xì)胞之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(吸光度(540納米)/天數(shù)；空心圓圈是對(duì)照物，實(shí)心圓圈是100μg/mL，空心倒三角是75μg/mL，實(shí)心倒三角是50μg/mL，空心正方形是25μg/mL，實(shí)心正方形是10μg/mL)；附圖15J表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分D+E和使用軟瓊脂克隆鑒定的Hela之間的典型劑量反應(yīng)關(guān)系(柱狀圖表；菌落數(shù)目/對(duì)照物，1、10、50和100μg/mL)；附圖15K表明當(dāng)使用從8種不同的可可基因型中獲得的粗多酚提取物處理Hela時(shí)對(duì)Hela生長(zhǎng)的抑制(％控制率/濃度，μg/mL；空心圓圈是C-1，實(shí)心圓圈是C-2，空心倒三角是C-3，實(shí)心倒三角C-4，空心正方形是C-5，實(shí)心正方形是C-6，空心三角是C-7，實(shí)心三角C-8；C-1=UF-12園藝學(xué)品種=Trinitario，并且是UF-12(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可堿的)；C-2=NA-33園藝學(xué)品種=Forastero，并且是NA-33(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可堿的)；C-3=EEG-48園藝學(xué)品種=Forastero，并且是EEG-48(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可堿的)；C-4=未知的園藝學(xué)品種=Forastero，并且是未知的(西非)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可堿的)；C-5=UF-613園藝學(xué)品種=Trinitario，并且是UF-613(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可堿的)；C-6=ICS-100園藝學(xué)品種=Trinitario(尼加拉瓜Criollo祖先)，并且是ICS-100(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可堿的)；C-7=ICS-139園藝學(xué)品種=Trinitario(尼加拉瓜Criollo祖先)，并且是ICS-139(巴西)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可堿的)；C-8=UIT-1園藝學(xué)品種=Trinitario，并且是UIT-1(馬來西亞)可可多酚的粗提取物(除去咖啡因/除去可可堿的)；)；附圖15L表示當(dāng)使用從發(fā)酵可可豆和干可可豆獲得的粗多酚提取物處理時(shí)對(duì)Hela生長(zhǎng)的抑制(完整的發(fā)酵步驟和太陽干燥；％對(duì)照物/濃度，μg/mL；空心圓圈是零天的級(jí)分，實(shí)心圓圈是1天的級(jí)分，空心倒三角是2天的級(jí)分，實(shí)心倒三角是3天的級(jí)分，空心正方形是4天的級(jí)分和實(shí)心正方形是9天的級(jí)分)；附圖15M表示酶氧化的可可矢車菊苷配質(zhì)抗Hela的作用(多酚氧化酶處理的粗可可多酚的劑量反應(yīng)；％對(duì)照物/濃度，μg/mL；實(shí)心正方形是粗UIT-1(具有咖啡因和可可堿)，空心圓圈是粗UIT(無咖啡因和可可堿)和實(shí)心圓圈是粗UIT-1(多酚氧化酶催化的))；附圖15N表示復(fù)合可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分D和E的代表性的半制備規(guī)模的反相HPLC分離；附圖15O表示粗可可多酚提取物的代表性正相半制備規(guī)模HPLC分離；附圖16表示與合成抗氧化劑BHA和BHT相比可可矢車菊苷配質(zhì)提取物和級(jí)分的典型Rancimat氧化曲線(任意單位/時(shí)間；點(diǎn)劃線和十字(+)是BHA和BHT；*是D-E；×是粗的；空心正方形是A-C；和空心菱形是對(duì)照物)；附圖17表示一種顯示通過可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ催化的動(dòng)質(zhì)體DNA去鏈狀排列抑制的典型瓊脂糖凝膠(泳道1包括0.5μg的標(biāo)記(M)單體長(zhǎng)度的動(dòng)質(zhì)體DNA環(huán)；泳道2和20包括在存在4％DMSO但無任何可可矢車菊苷配質(zhì)存在時(shí)與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ一起保溫的動(dòng)質(zhì)體DNA。(對(duì)照物-C)；泳道3和4包括在0.5h和5.0μg/mL可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A存在下與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ一起保溫的動(dòng)質(zhì)體DNA；泳道5和6包括在0.5和5.0μg/mL可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分B存在下與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ一起保溫的動(dòng)質(zhì)體DNA；泳道7、8、9、13、14和15是在0.05、0.5和5.0μg/mL可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分D存在下與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ一起保溫的動(dòng)質(zhì)體DNA的復(fù)制物；泳道10、11、12、16、17和18在0.05、0.5和5.0μg/mL可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分D存在下與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ一起保溫的動(dòng)質(zhì)體DNA的復(fù)制物；泳道19是在5.0μg/mL可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分E存在下與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ一起保溫的動(dòng)質(zhì)體DNA的復(fù)制物；)附圖18表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分D抗DNA修復(fù)感受態(tài)和缺損細(xì)胞系的劑量反應(yīng)關(guān)系(殘存級(jí)分/μg/mL；左側(cè)xrs-6 DNA缺損修補(bǔ)細(xì)胞系，MM-1 D D282X1；右側(cè)BRI感受態(tài)DNA修補(bǔ)細(xì)胞系，MM-1 DD282B1)；附圖19表示當(dāng)使用可可級(jí)分D+E處理時(shí)與MCF-7 p168親代細(xì)胞系相比抗阿霉素MCF-7細(xì)胞的劑量反應(yīng)曲線(％控制率/濃度，μg/mL；開環(huán)是MCF-7 p168；實(shí)心圓圈是MCF-7 ADR)；附圖20A和B表示使用100μg/mL和25μg/mL水平的通過正相半制備型HPLC制備的十二種級(jí)分處理時(shí)Hela和SKBR-3的劑量反應(yīng)效果(柱狀圖表，％控制率/對(duì)照物和級(jí)分1-12)；附圖21表示由可可提取物制備的粗的、富集的和純化的五聚物的正相HPLC分離；附圖22A、B和C分別表示富含矢車菊苷配質(zhì)的五聚物、級(jí)分A-C和級(jí)分D-E的MALDI-TOF/MS；附圖23A表示通過改進(jìn)的半制備型HPLC純化的低聚矢車菊苷配質(zhì)的洗脫圖；
附圖23B表示通過改進(jìn)的半制備型HPLC純化的三聚物矢車菊苷配質(zhì)的洗脫圖；附圖24A-D各表示所有的基于表兒茶酸結(jié)構(gòu)的(4-8)鍵合的五聚物的能量最低結(jié)構(gòu)；附圖25A表示在用芐硫醇進(jìn)行硫解作用時(shí)表兒茶酸的相對(duì)熒光性；附圖25B表示在用芐硫醇進(jìn)行硫解作用時(shí)兒茶酸的相對(duì)熒光性；附圖25C表示在用芐硫醇進(jìn)行硫解作用時(shí)二聚物(B2和B5)的相對(duì)熒光性；附圖26A表示在硫解作用時(shí)二聚物的相對(duì)熒光性；附圖26B表示在二聚物硫解和隨后脫硫時(shí)B5二聚物的相對(duì)熒光性；附圖27A表示在使用五聚物處理MDA MB 231裸鼠模型期間相對(duì)腫瘤體積；附圖27B表示使用五聚物處理的MDA MB 231裸鼠模型的相對(duì)存活率曲線；附圖28表示來自可可提取物的矢車菊苷配質(zhì)的丙酮萃取物的無鹵素分析分離的洗脫圖；附圖29表示用于矢車菊苷配質(zhì)的正相HPLC分離的固定相的孔徑尺寸的作用；附圖30A表示在可可豆發(fā)酵期間底物的利用；附圖30B表示發(fā)酵期間代謝物的生成；附圖30C表示在可可豆發(fā)酵期間板讀數(shù)；附圖30D表示在可可豆的發(fā)酵溶液中各組分的相對(duì)濃度；附圖31表示NO相關(guān)的脫羥腎上腺素-預(yù)收縮鼠主動(dòng)脈的乙酰膽堿誘導(dǎo)松弛；附圖32表示來自各種試驗(yàn)混合物的血糖耐受性圖；附圖33A-B表示吲哚美辛對(duì)COX-1和COX-2活性的影響；附圖34A-B表示聚合程度和IC50/COX-1/COX-2之間的相關(guān)性(μM)；附圖35表示化合物對(duì)COX-1和COX-2活性的影響之間的相關(guān)性(μM)；附圖36A-V表示含矢車菊苷配質(zhì)和COX-1/COX-2的樣品的IC50值(μM)；
附圖37表示用于從可可中分離矢車菊苷配質(zhì)的提純流程圖；附圖38A-38P表示五聚物的優(yōu)選結(jié)構(gòu)；附圖39A-AA表示五聚物的立體異構(gòu)體庫；附圖40A-B表示矢車菊苷配質(zhì)的正相HPLC分離的70分鐘的梯度，分別通過UV和熒光測(cè)定；附圖41A-B表示矢車菊苷配質(zhì)的正相HPLC分離的30分鐘的梯度，分別通過UV和熒光測(cè)定；附圖42表示矢車菊苷配質(zhì)的制備型正相HPLC分離；附圖43A-G分別表示矢車菊苷配質(zhì)二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的CD(圓二色性)圖譜附圖44A表示表兒茶酸的結(jié)構(gòu)和1H/13C NMR數(shù)據(jù)；附圖44B-F表示表兒茶酸的APT、COSY、XHCORR、1H和13CNMR圖譜；附圖45A表示兒茶酸的結(jié)構(gòu)和1H/13C NMR數(shù)據(jù)；附圖45B-E表示兒茶酸的1H、APT、XHCORR和COSY NMR圖譜；附圖46A表示B2二聚物的結(jié)構(gòu)和1H/13C NMR數(shù)據(jù)；附圖46B-G表示B2二聚物的13C、APT、1H、HMQC、COSY和HOHAHA NMR圖譜；附圖47A表示B5二聚物的結(jié)構(gòu)和1H/13C NMR數(shù)據(jù)；附圖47B-G表示B5二聚物的1H、13C、APT、COSY、HMQC和HOHAHA NMR圖譜；附圖48A-D表示表兒茶酸/兒茶酸三聚物的1H、COSY、HMQC和HOHAHA NMR圖譜；附圖49A-D表示表兒茶酸三聚物的1H、COSY、HMQC和HOHAHA NMR圖譜；附圖50A和B表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A和C分別對(duì)血壓的影響；在施用級(jí)分A之后在1分鐘內(nèi)血壓水平降低21.43％，并在15分鐘之后重新恢復(fù)正常，而在施用級(jí)分C之后在1分鐘內(nèi)血壓水平降低50.5％，并在5分鐘之后重新恢復(fù)正常；附圖51表示可可矢車菊苷配質(zhì)對(duì)麻醉豚鼠的動(dòng)脈血壓的影響；
附圖52表示L-NMMA對(duì)通過可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分C產(chǎn)生的麻醉豚鼠動(dòng)脈血壓變化的影響；附圖53表示緩激肽對(duì)通過HUVEC產(chǎn)生的NO生成量的影響；附圖54表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分對(duì)通過HUVEC產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞NO生成量的影響；附圖55表示可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分對(duì)巨噬細(xì)胞NO生成量的影響；附圖56表示可可矢車菊苷配質(zhì)對(duì)LPS誘導(dǎo)和γ干擾素誘發(fā)的巨噬細(xì)胞的影響；附圖57表示可可矢車菊苷配質(zhì)寡聚物的膠束電動(dòng)毛細(xì)管層析分離；附圖58A-F表示配合到三聚物上的Cu+2-、Zn+2-、Fe+2-、Fe+3-、Ca+2-和Mg+2-離子的MALDI-TOF質(zhì)譜；附圖59表示可可矢車菊苷配質(zhì)寡聚物的MALDI-TOF質(zhì)譜(四聚物至十聚物)；附圖60表示可可矢車菊苷配質(zhì)寡聚物和產(chǎn)生白血病病毒的貓F(tuán)eA類淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系的劑量反應(yīng)關(guān)系；附圖61表示可可矢車菊苷配質(zhì)寡聚物和貓CRFK正常腎細(xì)胞系的劑量反應(yīng)關(guān)系；附圖62表示可可矢車菊苷配質(zhì)寡聚物和犬MDCK正常腎細(xì)胞系的劑量反應(yīng)關(guān)系；附圖63表示可可矢車菊苷配質(zhì)寡聚物和犬GH正常腎細(xì)胞系之間的劑量反應(yīng)關(guān)系；附圖64表示六聚物水解的時(shí)間-溫度作用；和附圖65表示三聚物形式時(shí)的時(shí)間-溫度作用；發(fā)明詳述本發(fā)明的化合物正如上面所討論的一樣，現(xiàn)在已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，可可提取物或由其衍生的化合物表現(xiàn)出抗瘤、抗癌和抗腫瘤活性，抗氧化活性，抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶和氧化性DNA損傷，以及具有抗微生物、環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶、NO或NO合酶、編程性細(xì)胞死亡、血小板聚集和血液或體液葡萄糖調(diào)制活性，以及作為非甾類抗炎劑的效能。
該提取物、化合物或由此衍生的化合物的混合物通常是這樣制備的，即將可可豆粉碎成粉末，使該粉末脫脂，并從該粉末中提取活性化合物并提純。該粉末可以通過凍干可可豆和果肉，除去凍干可可豆的果肉和外殼并碾磨去殼的可可豆。活性化合物的提取可以通過溶劑萃取技術(shù)進(jìn)行?？梢岳缤ㄟ^凝膠滲透層析或通過制備型高效液相層析(HPLC)技術(shù)或通過這些技術(shù)的組合來純化包括活性化合物的提取物例如以獲得大體上純的提取物。
關(guān)于從可可衍生的本發(fā)明化合物的分離和純化，不用說將可以采用任何種類的可可樹屬、Herrania或它們的種間或種內(nèi)的雜種。在這方面，參考文獻(xiàn)是Schultes的《Herrania的概要》(“Synopsis ofHerrania”)，《阿諾德植物園雜志》(“Journal of the ArnoldArboretum”)第ⅩⅩⅩⅨ期，第217～278頁，以及圖片Ⅰ～ⅩⅦ(1985),Cuatrecasas《可可和其同源物，屬間可可樹屬的分類修訂本》(“Cocoa and Its Allies,A Taxonomic Revision of the GenusTheobroma”)《美國(guó)國(guó)家博物館的?？?“Bullletin of the UnitedStates National Museum”)第35期，第6部分，第379～613頁，以及圖片1～11(Smithsonian Institution 1964)，以及Addison等《亞馬遜河存在的屬間可可樹屬的觀察》(“Observations on the Species ofthe Genus Theobroma Which Occurs in the Amazon”)《Bol.Tech.Inst.Agronomico de Nortes》,25(3)(1951)。
此外，實(shí)施例25列出以前未報(bào)道過的在可可樹屬和Herrania和它們的種間和種內(nèi)混合種中發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明的化合物的濃度；同樣實(shí)施例25也描述了調(diào)節(jié)通過控制可可發(fā)酵條件而從可可獲得的本發(fā)明化合物含量的方法。
在基本上純的矢車菊苷配質(zhì)的分離中使用的提純方法的示意圖列于附圖37中。提純流程圖的步驟1和2描述在實(shí)施例1和2中；步驟3和4描述在實(shí)施例3、13和23中；步驟5描述在實(shí)施例4和14中；步驟6描述在實(shí)施例4、14和16中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解和想象到對(duì)附圖37中概述的提純流程圖進(jìn)行改進(jìn)以獲得活性化合物而不會(huì)偏離本發(fā)明的宗旨和范圍，并且無需進(jìn)行過分的試驗(yàn)。
具有活性的提取物、化合物和由此衍生的化合物的混合物，不希望被任何特殊的理論所限制，已經(jīng)被認(rèn)為是可可多酚，例如矢車菊苷配質(zhì)。這些可可矢車菊苷配質(zhì)具有顯著的抗瘤、抗癌和抗腫瘤活性；抗氧化活性；抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶和氧化性DNA損傷；具有抗微生物的活性；具有調(diào)制環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶、NO或NO合酶、編程性細(xì)胞死亡、血小板聚集和血液或體液葡萄糖的能力，以及作為非甾類抗炎劑的效能。
本發(fā)明提供一種式

的化合物，其中n是2～18的整數(shù)，例如3～12，這樣存在第一單體單元A和多個(gè)其它單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；4位是α或β立體化學(xué)；X、Y和Z代表單體單元之間鍵和的位置，但條件是對(duì)于第一單體單元來說，在此鍵合的其它單體單元在4位上以及Y=Z=氫，以及條件是，當(dāng)不是用于鍵和單體單元時(shí)，X、Y和Z是氫，或Z、Y是糖和X是氫，或X是α或β糖和Z、Y是氫，或它們的組合。該化合物中的n可以是5～12，當(dāng)然優(yōu)選n是5的化合物。糖可以選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。任何或所有的R、X、Y和Z的糖可以任選地通過酯鍵被酚部分取代。
因此，本發(fā)明提供式

的化合物，其中n是2～18的整數(shù)，例如3～12，有利地是5～12，優(yōu)選n是5，這樣存在第一單體單元A，

和多個(gè)A的其它單體單元。
R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；4位是α或β立體化學(xué)；X、Y和Z代表單體單元之間鍵和的位置，但條件是對(duì)于第一單體單元來說，在此鍵合的其它單體單元在4位上以及Y=Z=氫，以及條件是，當(dāng)不是用于鍵和單體單元時(shí)，X、Y和Z是氫，或Z、Y是糖和X是氫，或X是α或β糖和Z、Y是氫，或它們的組合。
所述的糖可以任選地通過酯鍵被酚部分取代。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種式An的聚合化合物以及其藥物學(xué)上可接受的鹽或衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，其中A是具有結(jié)構(gòu)式

的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和至少一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在4、6或8位上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)；X、Y和Z選自由單體單元A、氫和糖組成的該組中，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元(也就是說鄰近末端單體單元的單體單元的鍵合)在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地在任何位置上例如通過酯鍵被酚部分取代。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，n可以是3～18,2～18,3～12，例如5～12；并且有利地，n是5。該糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。任何或所有的R、X、Y和Z的糖可以任選地通過酯鍵被酚部分取代。酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
附加地，本發(fā)明提供一種式An的聚合化合物和其藥物學(xué)上可接受的鹽或衍生物(包括氧化產(chǎn)物)，其中A是具有結(jié)構(gòu)式

的單體，n是2～18的整數(shù)，例如3～18，有利地是3～12，例如5～12，優(yōu)選n是5；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫；在4位上的鍵具有α或β立體化學(xué)；糖任選地在任何位置上例如通過酯鍵被酚部分取代。
關(guān)于敘述的“至少一個(gè)末端單體單元A”，當(dāng)然應(yīng)該理解為本發(fā)明的化合物具有二個(gè)末端單體單元，以及這二個(gè)末端單體單元可以是相同的或不同的。此外，應(yīng)該明白所敘述的“至少一個(gè)末端單體單元A”包括其中該末端單體單元被稱為“第一單體單元”的實(shí)施方案，而所敘述的“第一單體單元”涉及其上附加了其它單體單元以獲得式An聚合化合物的單體。此外，對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上并且任選地Y=Z=氫。
至于所敘述的術(shù)語“它們的混合物”，應(yīng)該理解為同時(shí)可以使用一種或多種本發(fā)明的化合物，也就是說給需要治療的患者施用包括一種或多種本發(fā)明化合物的制劑。
本發(fā)明的化合物或它們的混合物顯示出上面提及的可可提取物的用途；并且在整個(gè)公開文本中，術(shù)語“可可提取物”可以被本發(fā)明的化合物或其混合物所代替，這樣可以理解為本發(fā)明的化合物和其混合物是可可提取物。
這里使用的術(shù)語“寡聚物”是指上面出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)式的任何化合物或其混合物，其中n是2～18。當(dāng)n是2時(shí)，該寡聚物被稱為“二聚物”；當(dāng)n是3時(shí)，該寡聚物被稱為“三聚物”；當(dāng)n是4時(shí)，該寡聚物被稱為“四聚物”；當(dāng)n是5時(shí)，該寡聚物被稱為“五聚物”；并且可以使用類似的術(shù)語代表n高達(dá)并包括18的寡聚物，這樣當(dāng)n是18時(shí)，該寡聚物被稱作“十八聚物”。
本發(fā)明的化合物或其混合物例如可以從天然來源如任何的可可樹屬、Herrania或它們的種間或種內(nèi)雜種中分離；或者本發(fā)明的化合物或其混合物可以被純化，也就是說本發(fā)明的化合物或其混合物基本上是純的；例如純化至表觀均一性。提純是一相對(duì)概念，并且許多實(shí)施例證明例如通過本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員列舉的方法分離本發(fā)明化合物或其混合物以及純化它們可以獲得基本上純的本發(fā)明化合物或它們的混合物，或者純化它們至表觀均一性(即通過分離純化，特征層析峰)?？紤]到實(shí)施例(例如實(shí)施例37)，基本上純的化合物或化合物的混合物的純度至少是約40％，例如至少是約50％，有利地是至少約60％，例如至少約70％，更有利地至少約75％～80％，優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選大于90％，例如至少是90～95％，或甚至更純，例如純度大于95％，如95～98％。
此外，包括在這里使用的寡聚物的單體單元的實(shí)例分別是(+)-兒茶酸和(-)-表兒茶酸、簡(jiǎn)寫為C和EC。相鄰單體之間的鍵合是從4位到6位或從4位到8位；單體的4位和相鄰單體單元的6位和8位之間的這種鍵合在這樣被稱為(4→6)或(4→8)。在單體的4位和其相鄰單體的6位和8位之間存在4種可能的立體化學(xué)鍵；單體之間的立體化學(xué)鍵合在這里被稱為(4α→6)或(4β→6)或(4α→8)或(4β→8)。當(dāng)C被鍵合到另一個(gè)C或EC時(shí)，這里該鍵合被稱為(4α→6)或(4α→8)。當(dāng)EC被鍵合到另一個(gè)C或EC時(shí)，該鍵合在這里被稱為(4β→6)或(4β→8)。
釋放上述活性的化合物的實(shí)例包括二聚物，EC-(4β→8)-EC和EC-(4β→6)-EC，其中優(yōu)選EC-(4β→8)-EC；三聚物[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，其中優(yōu)選[EC-(4β→8)]2EC；四聚物[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，其中[EC-(4β→8)]3-EC是優(yōu)選的；和五聚物[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，其中五聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；[EC-(4β→8)]4-EC是優(yōu)選的。
此外，釋放上述活性的化合物還包括六聚物～十二聚物，其實(shí)例如下六聚物，其中一個(gè)單體(C或EC)具有與另一個(gè)單體鍵合的鍵(4β→8)或(4β→6)，該鍵用于將EC鍵合到另一個(gè)EC或C上，以及具有與另一個(gè)單體鍵合的用于將C鍵合到另一個(gè)C或EC上的鍵(4α→8)或(4α→6)；隨后通過(4β→8)鍵鍵合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，其中六聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在優(yōu)選的實(shí)施方案中六聚物是[EC-(4β→8)]5-EC；七聚物，其中二個(gè)單體(C和/或EC)的任何組合具有與另一個(gè)單體鍵合的鍵(4β→8)或(4β→6)，該鍵用于將EC鍵合到另一個(gè)EC或C上，以及具有與另一個(gè)單體鍵合的用于將C鍵合到另一個(gè)C或EC上的鍵(4α→8)或(4α→6)；隨后通過(4β→8)鍵鍵合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，其中七聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在優(yōu)選的實(shí)施方案中七聚物是[EC-(4β→8)]6-EC；八聚物，其中三個(gè)單體(C和/或EC)的任何組合具有與另一個(gè)單體鍵合的鍵(4β→8)或(4β→6)，該鍵用于將EC鍵合到另一個(gè)EC或C上，以及具有與另一個(gè)單體鍵合的用于將C鍵合到另一個(gè)C或EC上的鍵(4α→8)或(4α→6)；隨后通過(4β→8)鍵鍵合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，其中八聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在優(yōu)選的實(shí)施方案中八聚物是[EC-(4β→8)]7-EC；九聚物，其中四個(gè)單體(C和/或EC)的任何組合具有與另一個(gè)單體鍵合的鍵(4β→8)或(4β→6)，該鍵用于將EC鍵合到另一個(gè)EC或C上，以及具有與另一個(gè)單體鍵合的用于將C鍵合到另一個(gè)C或EC上的鍵(4α→8)或(4α→6)；隨后通過(4β→8)鍵鍵合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，其中九聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在優(yōu)選的實(shí)施方案中九聚物是[EC-(4β→8)]8-EC；十聚物，其中五個(gè)單體(C和/或EC)的任何組合具有與另一個(gè)單體鍵合的鍵(4β→8)或(4β→6)，該鍵用于將EC鍵合到另一個(gè)EC或C上，以及具有與另一個(gè)單體鍵合的用于將C鍵合到另一個(gè)C或EC上的鍵(4α→8)或(4α→6)；隨后通過(4β→8)鍵鍵合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C，其中十聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在優(yōu)選的實(shí)施方案中十聚物是[EC-(4β→8)]9-EC；十一聚物，其中六個(gè)單體(C和/或EC)的任何組合具有與另一個(gè)單體鍵合的鍵(4β→8)或(4β→6)，該鍵用于將EC鍵合到另一個(gè)EC或C上，以及具有與另一個(gè)單體鍵合的用于將C鍵合到另一個(gè)C或EC上的鍵(4α→8)或(4α→6)；隨后通過(4β→8)鍵鍵合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]10-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-C，其中十一聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在優(yōu)選的實(shí)施方案中十一聚物是[EC-(4β→8)]10-EC；和十二聚物，其中七個(gè)單體(C和/或EC)的任何組合具有與另一個(gè)單體鍵合的鍵(4β→8)或(4β→6)，該鍵用于將EC鍵合到另一個(gè)EC或C上，以及具有與另一個(gè)單體鍵合的用于將C鍵合到另一個(gè)C或EC上的鍵(4α→8)或(4α→6)；隨后通過(4β→8)鍵鍵合到上述五聚物化合物上，例如[EC-(4β→8)]11-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-C，其中十二聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的；在優(yōu)選的實(shí)施方案中十二聚物是[EC-(4β→8)]11-EC。
從該詳細(xì)描述將明白上述列舉是示范性的并作為本發(fā)明化合物的幾個(gè)非限制性實(shí)例的解釋，其決不是窮舉地列出本發(fā)明包括的本發(fā)明化合物。
實(shí)施例3A、3B、4、14、23、24、30和34描述分離本發(fā)明化合物的方法。實(shí)施例13、14A～D和16描述純化本發(fā)明化合物的方法。實(shí)施例5、15、18、19、20和29描述鑒別本發(fā)明化合物的方法。附圖38A～P和39A～AA圖示代表本發(fā)明五聚物的立體化學(xué)構(gòu)型庫。實(shí)施例17描述制作本發(fā)明化合物的分子模型的方法。實(shí)施例36提供可可中存在較高寡聚物(其中n是13～18)的證據(jù)。
此外，因?yàn)楸景l(fā)明描述了關(guān)于優(yōu)選包括可可矢車菊苷配質(zhì)的可可提取物這方面，所以有機(jī)化學(xué)的專業(yè)人員從該公開文本將理解和預(yù)見獲得和/或制備該活性化合物的合成路徑(例如，參見實(shí)施例11)。相應(yīng)地，本發(fā)明包括合成可可多酚或矢車菊苷配質(zhì)或它們的衍生物和/或它們的合成前體等，其中該前體包括但不限于苷、棓酸鹽、酯等。也就是說，本發(fā)明的化合物可以通過從可可或從可可樹屬或Herrania中的任何屬以及從合成路途中分離來制備；本發(fā)明化合物的衍生物和合成前體例如苷、棓酸鹽、酯等也包括在本發(fā)明的范圍中。衍生物同樣包括其中糖或棓酸鹽部分在Y或Z位的末端單體上或者取代的糖或棓酸鹽部分在Y或Z的末端單體上的上述結(jié)構(gòu)式的化合物。
例如，實(shí)施例8，方法C描述使用可可酶氧化地改性本發(fā)明化合物或其組合物以獲得改進(jìn)的抗某種癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性(參見附圖15M)。本發(fā)明包括例如使用多酚氧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶混合物、和/或酶例如水解酶、酯酶、還原酶、轉(zhuǎn)移酶等和它們的混合物酶改性本發(fā)明化合物的能力，同時(shí)考慮動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)因素(參見實(shí)施例41，注意水解作用)。
關(guān)于本發(fā)明化合物的合成，在該公開文本和現(xiàn)有技術(shù)中的知識(shí)的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員將能夠預(yù)見其它的合成途徑，而無需過分的試驗(yàn)，例如，在聚合化合物的細(xì)心的反合成分析以及單體的基礎(chǔ)上。例如給定本發(fā)明化合物的特性，專業(yè)人員可以使用各種各樣的選擇性保護(hù)/去保護(hù)的方法、與有機(jī)金屬加成物偶合的方法、酚偶合和光化學(xué)方法，例如在會(huì)聚、線性或仿生方法中，或者這些方法的的組合，以及精通合成有機(jī)化學(xué)的專業(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)一起作為制備本發(fā)明化合物得到附加合成方法，而無需過分的試驗(yàn)。在這方面，參考文獻(xiàn)是W.Carruthers，《一些有機(jī)合成的現(xiàn)代方法》(“Some Modern Methods of OrganicSynthesis”)第3版，Cambridge University Press,1986，和J.March,《高級(jí)有機(jī)化學(xué)》(“Advanced Organic Chemistry”)第3版，JohnWiley & Sons,1985,Van Rensburg等，Chem.Comm.,24:2705～2706(1996,12,21),Ballenegger等，(Zyma SA)歐洲專利0096 007B1和在下面的參考文獻(xiàn)部分中的文件，所有的這些在這里引入以供參考。
本發(fā)明化合物的用途關(guān)于本發(fā)明的化合物，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物有不同的活性，因此，本發(fā)明的化合物可以廣泛地用于治療各種疾病，下面對(duì)此進(jìn)行討論。
COX/LOX-相關(guān)用途動(dòng)脈粥樣硬化，最流行的心血管疾病，是心臟患病、中風(fēng)和血管循環(huán)問題的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化是一種復(fù)雜的的疾病，其包括許多細(xì)胞類型、生化現(xiàn)象和分子因素。該疾病、其疾病狀況和疾病發(fā)展這幾個(gè)方面是通過低密度脂蛋白(LDL)氧化反應(yīng)、環(huán)加氧酶(COX)/脂氧化酶(LOX)生物化學(xué)和一氧化氮(NO)生物化學(xué)的依存結(jié)果識(shí)別的。
臨床研究已經(jīng)斷然地確定LDL的血漿濃度的升高與動(dòng)脈粥樣硬化的加重有關(guān)。聚集在動(dòng)脈粥樣病灶中的膽固醇主要從血漿脂蛋白包括LDL中產(chǎn)生。LDL的氧化反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣化形成的開始是關(guān)鍵的事件，并且與超氧陰離子自由基(O2·-)的產(chǎn)量增大有關(guān)。通過O2·-或其它活性種類(例如·OH、ONOO·-、脂質(zhì)過氧化自由基、銅離子和鐵基蛋白質(zhì))進(jìn)行的LDL的氧化反應(yīng)降低LDL的親和性以便通過受體介導(dǎo)的胞吞作用吸收在細(xì)胞中。然后氧化改性的LDLs快速被巨噬細(xì)胞吸收，該巨噬細(xì)胞接著轉(zhuǎn)變?yōu)榉浅ｎ愃朴谠谠缙趧?dòng)脈粥樣病灶中發(fā)現(xiàn)的“泡沫細(xì)胞”的細(xì)胞。
氧化的脂蛋白同樣可以通過在LDL顆粒中脂質(zhì)氫過氧化物的形成來促進(jìn)血管損傷。該事件引起不飽和的LDL脂質(zhì)的自由基鏈氧化反應(yīng)，因此產(chǎn)生更多的用于巨噬細(xì)胞摻入的氧化的LDL。
由這些方法裝滿氧化LDL的泡沫細(xì)胞的集中聚集導(dǎo)致早期“脂條”病灶，其最終發(fā)展為更高級(jí)的復(fù)雜的導(dǎo)致冠狀病的動(dòng)脈粥樣硬化病灶。
正如Jean MarX在《科學(xué)》(“Science”)第265期(1994,7,15)第320頁中概括討論的一樣，在美國(guó)每年大約330,000名患者接受冠狀和/或外周血管成形術(shù)，該血管成形術(shù)是一種打開被危險(xiǎn)的動(dòng)脈粥樣斑塊(動(dòng)脈粥樣硬化)堵塞的血管例如冠狀血管并因此恢復(fù)正常血液流動(dòng)的方法。對(duì)于大多數(shù)患者來說，該手術(shù)均在計(jì)劃中。然而，這些患者的幾乎33％(據(jù)一些報(bào)道可能更高)出現(xiàn)再次狹窄，其中被治療的血管再次快速被堵塞。與進(jìn)行血管成形術(shù)之前相比，這些患者情況不是更好，有時(shí)更壞。血管壁中平滑肌細(xì)胞(SMCs)的過度增生促進(jìn)再次狹窄。在病灶中氧化LDL的快速聚集可能有助于動(dòng)脈粥樣硬化形成機(jī)理有關(guān)的過程如再次狹窄。Zhou等《初次巨細(xì)胞病毒感染和冠狀A(yù)therectomy之后再次狹窄的危險(xiǎn)性之間的關(guān)系》(“Association Between PriorCytomegalovirus Infection And The Risk Of Restenosis After CoronaryAtherectomy”)1996,8,29,New England Journal of Medicine,335:624-630，以及在這里引用的文件，所有的這些在此引入以供參考。相應(yīng)地，本發(fā)明與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)的用途可以適用于再次狹窄。
在通過本發(fā)明化合物抑制環(huán)加氧酶方面，已知環(huán)加氧酶是前列腺素和其它涉及許多生理過程的花生四烯酸代謝物(例如類花生酸)生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶。COX-1是一種在許多組織，包括血小板，中表達(dá)的組成型酶，而COX-2，酶的第二種同種型，是可通過各種細(xì)胞因子、荷爾蒙和腫瘤促進(jìn)劑誘導(dǎo)的。COX1產(chǎn)生血栓烷A2，其與血小板的聚集有關(guān)，而血小板聚集反過來涉及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。其抑制是心血管疾病預(yù)防效果的基礎(chǔ)。
COX-1和COX-2的活性是通過阿斯匹林和其它的非甾類抗炎藥(NSAIDs)來抑制的，并且NSAIDs對(duì)胃的副作用被認(rèn)為與COX-1的抑制有關(guān)。加之，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有規(guī)律地服用NSAIDs的患者與未施用這類藥物的人相比感染結(jié)腸直腸癌的危險(xiǎn)性是40～50％；并且在86％的結(jié)腸直腸腺癌患者中，COX-2 mRNA水平顯著提高。
表達(dá)細(xì)胞系的COX-2的一個(gè)顯著性能是更強(qiáng)地表達(dá)參與編程性細(xì)胞死亡即細(xì)胞程序死亡調(diào)制的基因。幾個(gè)NSAIDs已經(jīng)暗示細(xì)胞死亡增加和在雞胚成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡。
細(xì)胞脂氧化酶同樣涉及通過不飽和脂質(zhì)進(jìn)行的LDL的氧化改性。脂質(zhì)過氧化自由基有助于不飽和LDL脂質(zhì)的自由基鏈的進(jìn)一步氧化，以生產(chǎn)更多的用于巨噬細(xì)胞并入的氧化LDL。
已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明化合物在治療與COX/LOX有關(guān)的疾病中的用途。在實(shí)施例28中，COX是通過濃度類似于已知NSAID，吲哚美辛，的單獨(dú)的本發(fā)明化合物來抑制的。
為了抑制COX，本發(fā)明化合物是其中n是2～18的寡聚物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物是其中n是2～10的寡聚物，更優(yōu)選地，本發(fā)明化合物是其中n是2～5的寡聚物。
釋放關(guān)于上述COX/LOX的抑制活性的化合物的實(shí)施例包括上面討論的二聚物、三聚物、四聚物和五聚物。
因此，由于本發(fā)明化合物對(duì)COX-2產(chǎn)生顯著的抑制能力，以及對(duì)推定的COX-2表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞系的毒害細(xì)胞作用，所以本發(fā)明化合物具有作為導(dǎo)致癌的多步發(fā)展的抑制劑的編程性細(xì)胞死亡的活性，以及作為具有預(yù)防活性廣譜的NSAID類藥物中一員的活性(例如，參見實(shí)施例8，附圖9D～9H)。
另外，前列腺素，COX催化的花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2的次末端產(chǎn)物，與發(fā)炎、疼痛、發(fā)熱、胎兒發(fā)育、分娩和血小板聚集有關(guān)。因此，本發(fā)明化合物對(duì)與NSAIDs相同的條件是有效的，例如抗心血管疾病并且中風(fēng)等(實(shí)際上，減少血栓烷A2產(chǎn)生的血小板COX-1的抑制是阿斯匹林對(duì)心血管疾病產(chǎn)生預(yù)防效果的基礎(chǔ))。
炎癥是活組織對(duì)損傷的響應(yīng)。它包括一系列復(fù)雜的酶活化、介質(zhì)釋放、體液的外滲、細(xì)胞遷移、組織的破壞和修補(bǔ)。炎癥是通過釋放花生四烯酸(COX和LOX的底物)的磷脂酶A2激活的。COX將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為在從急性水腫到慢性關(guān)節(jié)炎的發(fā)炎條件中發(fā)現(xiàn)的主要類花生酸的前列腺素PGE2。通過NSAID對(duì)其抑制是治療的主要手段。
關(guān)節(jié)炎是風(fēng)濕病的一種，風(fēng)濕病包括各種各樣的疾病和病理過程，這些病大多數(shù)損害關(guān)節(jié)組織。通過這些疾病損害的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)是包括滑膜、軟骨、骨頭、腱、韌帶和間質(zhì)組織的結(jié)締組織。暫時(shí)結(jié)締組織綜合癥包括扭傷和拉傷、腱炎和腱鞘畸形。最嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎形式是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)和系統(tǒng)性紅斑性狼瘡。
除風(fēng)濕病外，其它疾病的特征也在于炎癥。齒齦炎和牙根骨膜炎遵循類似于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理圖片。炎性腸疾病是指腸的自發(fā)性慢性炎癥病情、潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病。脊椎炎涉及脊椎關(guān)節(jié)的慢性炎癥。這里與肥胖癥有關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率同樣高。
因此，本發(fā)明化合物潰瘍用于治療涉及發(fā)炎、疼痛、發(fā)熱、胎兒發(fā)展、分娩和血小板聚集有關(guān)的病情。
通過本發(fā)明化合物對(duì)COX的抑制同樣將抑制前列腺素即PGD2、PGE2的形成。因此，本發(fā)明化合物潰瘍用于治療與前列腺素PGD2、PGE2有關(guān)的病情。
與NO有關(guān)的用途已知一氧化氮可用于抑制主要與動(dòng)脈粥樣化形成過程有關(guān)的血小板聚集、單核細(xì)胞粘著和趨化性以及血管平滑肌組織的增生。支持這種觀點(diǎn)的證據(jù)是，由于NO與氧氣游離基反應(yīng)，在動(dòng)脈粥樣組織中NO減少。由于這些反應(yīng)造成的NO的減少導(dǎo)致大量的血小板和炎性細(xì)胞粘著在血管壁上，進(jìn)一步損害NO的松弛機(jī)理。在這種情況下，NO的減少促進(jìn)動(dòng)脈粥樣化過程，導(dǎo)致病情加劇。
高血壓是心血管疾病包括中風(fēng)、心臟發(fā)作、心力衰竭、不規(guī)則心搏和腎衰竭的主導(dǎo)原因。高血壓是一種血管中的血壓高于其流過身體時(shí)正常血壓的狀態(tài)。當(dāng)在一段持續(xù)時(shí)間內(nèi)收縮壓超過150毫米汞柱或舒張壓超過90毫米汞柱時(shí)，對(duì)身體造成危害。例如過高的收縮壓可以破壞任何地方的血管。當(dāng)它出現(xiàn)在大腦中時(shí)，導(dǎo)致中風(fēng)。它也可以引起血管增厚和狹窄，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。血壓升高同樣迫使心臟肌肉增大，因?yàn)楫?dāng)排出血液時(shí)，它要加倍運(yùn)轉(zhuǎn)以克服升高的靜(舒張)壓。這種增大最終產(chǎn)生不規(guī)則心搏和心力衰竭。高血壓被稱為“無聲殺手”，因?yàn)樗划a(chǎn)生任何癥狀并且僅在量血壓時(shí)被發(fā)現(xiàn)。
血液的調(diào)節(jié)是一復(fù)雜事件，這里一種機(jī)理涉及組成型Ca+2/一氧化氮合酶的鈣調(diào)蛋白依賴形式的表達(dá)(縮寫為eNOS)。通過這種酶產(chǎn)生的NO使血管中的肌肉松弛(舒張)，這種松弛降低血壓。當(dāng)不能得到通過eNOS產(chǎn)生的NO的正常水平時(shí)，或者因?yàn)橐种苿┳柚股苫蛘咴诓±砬闆r下，例如動(dòng)脈粥樣硬化，血管肌肉不能舒張至合適的程度。所產(chǎn)生的血管收縮提高血壓，并可能對(duì)高血壓的一些形式負(fù)責(zé)任。
血管內(nèi)皮細(xì)胞包括eNOS。通過eNOS合成的NO以相反的方向擴(kuò)散，并且當(dāng)它到達(dá)底層的血管平滑肌時(shí)，NO粘附在鳥苷酸環(huán)化酶的血紅素基上，引起cGMP提高。cGMP的提高造成細(xì)胞內(nèi)游離Ca+2的降低。環(huán)GMP可以活化蛋白激酶，該蛋白激酶使Ca+2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白磷酸化，從而使Ca+2隱蔽在肌肉細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)中。因?yàn)榧∪馐湛s需要Ca+2，所以，由于Ca+2的濃度降低，收縮力下降。肌肉的松弛使血管舒張，這種舒張降低血壓。因此eNOS的抑制引起血壓升高。
當(dāng)不能產(chǎn)生正常水平的NO時(shí)，或者因?yàn)橐种苿┳柚股苫蛘咴诓±砬闆r下，例如動(dòng)脈粥樣硬化，血管肌肉不能舒張至合適的程度。所產(chǎn)生的血管收縮提高血壓，并可能對(duì)高血壓的一些形式負(fù)責(zé)任。非常有興趣發(fā)現(xiàn)一種治療方法以提高高血壓患者中的eNOS活性，但是對(duì)具體的治療方法沒有任何報(bào)道。能釋放NO的藥劑，例如硝化甘油或二硝酸異山梨酯仍然是血管舒張治療的主要手段。
雖然本發(fā)明化合物抑制LDL的氧化，但是這些化合物的更綜合的作用是它們通過NO對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生的多元化作用。通過本發(fā)明化合物對(duì)NO的調(diào)制產(chǎn)生許多有益效果，包括高血壓調(diào)節(jié)、降低NO影響的高膽固醇血癥、抑制血小板聚集和單核細(xì)胞粘著，所有這些均與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展有關(guān)。
NO在免疫系統(tǒng)中的作用不同于其在血管中的功能。巨噬細(xì)胞包括一種被稱為iNOS的NOS類型，其是誘導(dǎo)型的，而不是組成型的。iNOS基因的轉(zhuǎn)錄受許多被稱為生物因子的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物的正控制或負(fù)控制。最重要的誘導(dǎo)物是γ干擾素、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素2和脂多糖(LPS)，其中脂多糖是革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的一種組分。刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生足夠的NO以抑制核糖核酸酶還原酶，該酶用于將核苷酸轉(zhuǎn)化為DNA合成所需的脫氧核苷酸。DNA合成的抑制是一種重要的方法，其中巨噬細(xì)胞和其它具有iNOS的組織可以抑制快速分裂的腫瘤細(xì)胞或感染性細(xì)菌的生長(zhǎng)。
關(guān)于NO和感染性細(xì)菌的作用，微生物在反映身體接觸和損害、習(xí)性、職業(yè)、個(gè)體環(huán)境以及通過非正常儲(chǔ)存、處理和污染導(dǎo)致的食物傳染疾病的感染過程中起重要作用。
本發(fā)明化合物、它們的混合物和包含它們的組合物在治療與調(diào)節(jié)NO濃度有關(guān)的情況是有效的。實(shí)施例9描述本發(fā)明化合物抗氧化活性(作為自由基的抑制劑)。假定NO是自由基，本發(fā)明化合物是強(qiáng)氧化劑，那么可推測(cè)以體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)方式施用本發(fā)明化合物將造成NO水平降低。NO的任何降低將導(dǎo)致高血壓效果，而不是低血壓效果。與所期望的相反，在體外實(shí)驗(yàn)中本發(fā)明化合物使NO增加，而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生低血壓效果(實(shí)施例31和32)。這些結(jié)果不是預(yù)計(jì)的并完全是出乎意料的。
實(shí)施例27描述在口服含本發(fā)明化合物和葡萄糖的溶液之后不久紅細(xì)胞增多癥(erythmia)(臉潮紅)，因此暗示血管舒張作用。
實(shí)施例31描述在體內(nèi)動(dòng)物模型中通過本發(fā)明化合物得到的低血壓效果，其證明本發(fā)明在治療高血壓方面是有效的。在該實(shí)施例中，本發(fā)明化合物、其混合物和包括它們的組合物包括其中n是2～18，優(yōu)選2～10的寡聚物。
實(shí)施例32描述在體外模型中本發(fā)明化合物對(duì)NO生成的調(diào)節(jié)。在該實(shí)施例中，本發(fā)明化合物、其混合物和含它們的組合物包括其中n是2～18，優(yōu)選2～10的寡聚物。
此外，實(shí)施例35提供通過MALDI/TOF/MS發(fā)現(xiàn)的所形成的Cu+2-、Fe+2-、Fe+3-寡聚物的配合物的證據(jù)。這些結(jié)果表明本發(fā)明化合物可以與銅和/或鐵離子配合以降低它們對(duì)LDL氧化的作用。
此外，本發(fā)明化合物在感染治療和食物酸敗的預(yù)防中具有有效的抗微生物活性。實(shí)施例22和30描述本發(fā)明化合物對(duì)下面所列的幾種有代表性的具有臨床和食物意義的微生物的抗微生物活性。微生物類型 臨床/食物意義幽門螺桿菌革蘭氏陰性胃炎、潰瘍、胃癌芽孢桿菌屬革蘭氏陽性食物中毒、傷口感染、牛乳腺炎、敗血病沙門氏菌屬革蘭氏陰性食物中毒、腹瀉金黃色葡萄球菌革蘭氏陽性癤子、癰、傷口感染、敗血病、乳房膿腫大腸桿菌 革蘭氏陰性嬰兒腹瀉、尿道感染假單胞菌屬革蘭氏陰性尿道感染、傷口感染、“游泳耳”釀酒酵母 酵母菌食物酸敗巴氏醋桿菌革蘭氏陰性食物酸敗實(shí)施例33描述本發(fā)明化合物對(duì)巨噬細(xì)胞NO形成的作用。在該實(shí)施例中，結(jié)果證明本發(fā)明化合物誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞NO形成，這二者不依賴和依賴于脂多糖(LPS)或細(xì)胞因子的刺激。形成NO的巨噬細(xì)胞潰瘍抑制感染的細(xì)菌的生長(zhǎng)。
釋放抗微生物活性的本發(fā)明化合物是其中n是2～18的寡聚物，優(yōu)選其中n是2、4、5、6、8和10的寡聚物。
釋放與上述NO有關(guān)的抗微生物活性的化合物的實(shí)施例包括上面討論的二聚物、四聚物、五聚物、六聚物、十聚物和十二聚物。
抗癌用途癌癥被劃分為三組癌(carcinomas)、肉瘤和淋巴瘤。癌是一種在皮膚、各種器官的襯料(linings)、腺和組織中產(chǎn)生的惡性腫瘤。肉瘤是在骨頭、肌肉或結(jié)締組織中產(chǎn)生的惡性腫瘤。第三組包括白血病和淋巴瘤，因?yàn)檫@二者均是在形成血液的器官中出現(xiàn)。癌癥的主要類型是前列腺、乳腺、肺、結(jié)腸直腸、膀胱、非何杰金氏淋巴、子宮、皮膚黑素瘤、腎、白血病、卵巢和胰腺。
癌癥的形成由通過許多因子例如遺傳基因因子、電離輻射、污染、氡和損害DNA的自由基造成的DNA細(xì)胞的改變而引起的。攜帶突變的細(xì)胞在細(xì)胞分裂的有序過程中產(chǎn)生缺陷。這些細(xì)胞不能承受編程性細(xì)胞死亡(細(xì)胞程序死亡)并繼續(xù)分裂，這種分裂或者標(biāo)志著惡性腫瘤的開始，或者允許在一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生更多的突變，從而導(dǎo)致惡性腫瘤。
對(duì)于各種不同的癌癥存在三個(gè)主要的共同特征。它們是(1)無限增生的能力；(2)腫瘤對(duì)植物組織的侵入性；(3)轉(zhuǎn)移過程。
一定類型的癌癥是以獨(dú)特的方式轉(zhuǎn)移。例如甲狀腺、肺、乳腺和前列腺癌通常轉(zhuǎn)移到骨頭。肺癌通常擴(kuò)散到腦和腎上腺，結(jié)腸直腸癌經(jīng)常轉(zhuǎn)移到肝臟。白血病在發(fā)作時(shí)被認(rèn)為是一種全身性疾病，在貫穿全身的骨髓中發(fā)現(xiàn)該疾病。
已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明化合物在治療上述討論的各種不同的癌癥中是有效的。實(shí)施例6、7、8和15描述釋放抗癌活性的本發(fā)明化合物對(duì)人Hela(宮頸)、前列腺、乳腺、腎、T-細(xì)胞白血病、結(jié)腸癌細(xì)胞系的作用。實(shí)施例12(附圖20)表明使用基本上通過HPLC純化的低聚(二聚物～十二聚物)的矢車菊苷配質(zhì)治療的Heal和SKBR-3乳腺癌細(xì)胞系的劑量反應(yīng)效應(yīng)?？惯@些癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性取決于五聚物至十二聚物矢車菊苷配質(zhì)，而較低的寡聚物未表現(xiàn)出效果。
因?yàn)椴幌Ｍ苋魏卫碚摰南拗?，所以這里出現(xiàn)解釋上述效果的最小結(jié)構(gòu)基元。實(shí)施例37同樣表明較高寡聚物(五聚物至十二聚物)抗貓類淋巴母細(xì)胞系的相同細(xì)胞毒性效果。同樣在較高寡聚物(附圖58-61)抗正常犬和貓細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性。
在實(shí)施例8(附圖9D-H)中，表明本發(fā)明化合物可以釋放抗表達(dá)人結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT1l6)的推定COX-2的細(xì)胞毒性。
實(shí)施例9描述本發(fā)明化合物的抗氧化活性。本發(fā)明化合物抑制DNA鏈斷裂、DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)和核苷酸的自由基氧化以降低和/或防止突變的發(fā)生率。
實(shí)施例10描述本發(fā)明化合物作為拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑，其是化療劑例如阿霉素的靶。
實(shí)施例21描述在裸鼠模型(鼠的平均重量是約25克)中基本上純的五聚物的體內(nèi)效果，該五聚物釋放抗人乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231/LCC6)的抗腫瘤活性。由于出乎意料的動(dòng)物毒性，以較高劑量(5毫克)的五聚物重復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)不是完全成功的。目前認(rèn)為該毒性可能與本發(fā)明化合物的血管舒張效應(yīng)有關(guān)。
實(shí)施例33描述本發(fā)明化合物對(duì)巨噬細(xì)胞NO形成的作用。產(chǎn)生NO的巨噬細(xì)胞可以抑制快速分裂的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
此外，本發(fā)明包括本發(fā)明化合物通過編程性細(xì)胞死亡導(dǎo)致細(xì)胞增生抑制的用途。
用于抗癌活性的本發(fā)明化合物是其中n是2～18，例如3～18，如3～12的寡聚物，優(yōu)選其中n是5～12，更優(yōu)選其中n是5的寡聚物。
釋放關(guān)于上述癌癥的抑制活性的化合物包括上述討論的五聚物至十二聚物。
制劑和方法因此，總的來說，本發(fā)明化合物、其混合物和包含它們的組合物已表現(xiàn)出一系列抗動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、癌癥、血壓調(diào)節(jié)和/或高血壓、炎性疾病、感染物和食物酸敗幾個(gè)方面的活性。
因此，本發(fā)明化合物、其混合物和含它們的組合物是COX抑制劑，其通過抑制血栓烷A2形成和因此降低血栓形成的危險(xiǎn)性來影響血小板聚集。另外，COX的抑制導(dǎo)致更少的血小板和炎性細(xì)胞粘著在血管壁上，從而為改善NO的松弛機(jī)理創(chuàng)造條件。這些結(jié)果與以類似于一種已知NSAID，吲哚美辛，的濃度抑制COX相結(jié)合表現(xiàn)出抗凝效能。
此外，本發(fā)明化合物、其混合物和含它們的組合物是抗氧化劑，其通過降低超氧化物自由基負(fù)離子和脂氧化酶媒介脂質(zhì)過氧化自由基的水平來抑制LDL的氧化。在該階段LDL氧化的抑制降低巨噬細(xì)胞的活性并且延緩泡沫細(xì)胞的形成，從而進(jìn)一步中斷動(dòng)脈粥樣硬化過程。同樣LDL氧化的抑制也可以延緩再狹窄的過程。因此，本發(fā)明化合物或其混合物或含它們的組合物可以被用于預(yù)防和/治療動(dòng)脈粥樣硬化和/或再狹窄。并且，因此在血管成形術(shù)或類似手術(shù)之前或之后可以施用本發(fā)明化合物來預(yù)防或治療易于再狹窄患者的再狹窄。
為了治療或預(yù)防再狹窄和/或動(dòng)脈粥樣硬化，根據(jù)該公開文本和本領(lǐng)域中的常識(shí)，例如在初次出現(xiàn)再狹窄和/或動(dòng)脈粥樣硬化病癥或癥狀時(shí)，在即將進(jìn)行血管形成術(shù)之前、同時(shí)或之后，或者在血管形成術(shù)之后按照內(nèi)科專業(yè)人員的要求盡早地將一種本發(fā)明化合物或它們的混合物或含一種或多種本發(fā)明化合物的組合物按照內(nèi)科專業(yè)人員所希望的單獨(dú)或與其它治療一起施用，而無需任何過分的試驗(yàn)；可以在一個(gè)療程例如一個(gè)月、二個(gè)月、半年、一年或者在一些其它的內(nèi)科專業(yè)人員認(rèn)為需要的時(shí)間段的療程中連續(xù)地施用本發(fā)明化合物或其混合物或含它們的組合物，而無需任何其它過分的試驗(yàn)。
此外，本發(fā)明化合物，其混合物和含它們的組合物已經(jīng)顯示出可以在體內(nèi)產(chǎn)生低血壓效果和在體外誘導(dǎo)NO。實(shí)際上，這些結(jié)果可以應(yīng)用在治療高血壓和在涉及高膽固醇血癥的NO水平顯著降低的臨床情況中。
本發(fā)明化合物、其混合物和含它們的組合物的制劑可以按照制藥、食品科學(xué)、醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)領(lǐng)域的專業(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法以立即或緩釋活性化合物的液體、懸浮液、片劑、膠囊、注射液或栓劑的形式制備。
載體可以是聚合的延遲釋放體系。在控制釋放的組合物制劑中合成聚合物是特別有用的。其早期的例子是將甲基丙烯酸甲酯聚合成直徑小于1微米的球體以形成所謂的納米級(jí)顆粒，參見Kreuter,J.,《醫(yī)學(xué)和藥學(xué)中的微膠囊和納米級(jí)顆?！?“Microcapsules and Napoparticles inMedicine and Pharmacologv”),M.Donbrow(ED).CRC Press,125-148頁。
通常選擇用于藥劑和最近用于抗原的載體是聚(d,1-丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)。這是一種長(zhǎng)期以來在易受腐蝕藥用縫合線、骨平板(boneplates)和其它臨時(shí)性假器官中使用的可生物降解的聚酯，它們?cè)谄渲袥]有顯示出任何毒性。已經(jīng)可以將各種各樣的藥劑配制成PLGA微膠囊。正如Eldridge,J.H.等《微生物學(xué)和免疫學(xué)的當(dāng)代課題》(“CurrentTopics in Microbiology and Immunology”)1989,146:59-66中綜述的一樣，關(guān)于PLGA用于控制的適應(yīng)性已經(jīng)積累了很多數(shù)據(jù)。在口服時(shí)，直徑為1～10微米的PLGA微球中的俘獲物(entrapment)發(fā)揮作用。PLGA的微囊包封方法采用油包水乳液的相分離方法。本發(fā)明化合物或它們的混合物是作為作為一種水溶液制備的，PLGA溶解在合適的有機(jī)溶劑例如二氯甲烷和乙酸乙酯中。這二種不能混合的溶液通過高速攪拌被共乳化。然后加入一種該聚合物的非溶劑，造成該聚合物沉淀在含水液滴的周圍，形成初期微膠囊。收集該微膠囊，用一種試劑(聚乙烯醇(PVA)、明膠、藻酸鹽、甲基纖維素)穩(wěn)定該微膠囊，并通過真空干燥或者溶劑萃取除去溶劑。
此外，關(guān)于緩釋制劑的制備，參考文獻(xiàn)是U.S.5,024,843、5,091,190、5,082,668、4,612,008和4,327,725，這些文獻(xiàn)在此引用以供參考。
此外，所關(guān)心的可可基因型的選擇方法和鑒定被用于制備單位標(biāo)準(zhǔn)(SOI)和非SOI的巧克力產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以作為將活性成分輸送給需要治療上述病情的患者的載體以及作為以守恒水平輸送本發(fā)明化合物的工具。
在這方面，參考文獻(xiàn)是1996年9月6日申請(qǐng)的共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)08/709,406，該文獻(xiàn)在此引入以供參考。USSN08/709,406涉及一種由可可豆制備具有水平守恒的多酚的可可油和/或可可固體的方法，其中采用一種組合獨(dú)特的不需要分離的可可豆焙燒或磨漿設(shè)備的加工步驟，以便任選地在不暴露于強(qiáng)烈的熱處理下在一段持續(xù)時(shí)間內(nèi)加工可可豆和/或使用脂肪的溶劑萃取方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，與在傳統(tǒng)可可加工方法中發(fā)現(xiàn)的多酚相比可以提高多酚的守恒性，這樣在未加工可可豆中發(fā)現(xiàn)的多酚的最初含量與在加工之后獲得的多酚含量的比例小于或等于2。
本發(fā)明的組合物包括一種或多種上述提及的在具有藥物學(xué)上可接受的載體或賦形劑的劑型中的化合物。本發(fā)明化合物具有抗瘤、抗癌和抗腫瘤活性，抗氧化活性，抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶，抑制氧化性DNA損傷，誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞NO形成，具有抗微生物、環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶、NO或NO合酶、編程性細(xì)胞死亡、血小板聚集和血液或體內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)活性，以及作為非甾類抗炎劑的效能。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括由本發(fā)明化合物和其混合物以及除藥物學(xué)上可接受載體或賦形劑外至少一種附加的抗瘤劑、降壓劑、抗炎劑、抗微生物劑、抗氧化劑和血細(xì)胞生成劑組成的組合物。
在考慮這里所列數(shù)據(jù)、給藥途徑、單個(gè)寡聚物的濃度和毒性(例如LD50)下，按劑量或通過內(nèi)科、營(yíng)養(yǎng)學(xué)或獸醫(yī)領(lǐng)域中的專業(yè)人員熟知的技術(shù)，可以將這樣的組合物施用給需要這種服用法的患者，這些數(shù)據(jù)是這樣的一些因素例如年齡、性別、體重、單個(gè)受試者或患者的遺傳學(xué)和狀況。
該組合物可以與其它抗瘤、抗癌、抗腫瘤劑、抗氧化劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑、氧化性DNA損傷的抑制劑或環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶抑制劑、編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑、血小板聚集調(diào)制劑、血液或體內(nèi)葡萄糖調(diào)制劑或NO或NO合酶調(diào)制劑，非甾類抗炎劑和/或與能夠降低或減輕抗瘤、抗癌、抗腫瘤劑、抗氧化劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑、氧化性DNA損傷的抑制劑或環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶抑制劑、編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑、血小板聚集調(diào)制劑、血液或體內(nèi)葡萄糖調(diào)制劑或NO或NO合酶調(diào)制劑、非甾類抗炎劑的不良作用的試劑一起共同服用或順序地服用，同時(shí)還要考慮這些因素如年齡、性別、體重、單個(gè)受試者或患者的遺傳學(xué)和狀況以及施用途徑。
用于人或獸類的本發(fā)明組合物的實(shí)例包括用于口服的可食組合物，例如固體或液體劑型，例如膠囊、片劑、丸劑等，以及可咀嚼的固體或飲用劑型，本發(fā)明特別適合于這種劑型，因?yàn)楸景l(fā)明來自可食用源(例如可可或巧克力味的固體或液體組合物)；適合于針注射、口服、鼻、肛門、陰道等給藥的液體制劑，例如懸浮液、糖漿或酏劑(包括可可或巧克力味的組合物)；適合于腸胃外、皮下、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥(例如可注射的給藥方式)的制劑例如無菌的懸浮液或乳液。然而，在組合物中的活性成分可以與蛋白質(zhì)配合，這樣當(dāng)在血液中給藥時(shí)，由于血蛋白質(zhì)的沉淀可能出現(xiàn)凝結(jié)；本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)該考慮到這點(diǎn)。在這樣的組合物中，活性可可提取物可以與合適的載體、稀釋劑或賦形劑例如消毒水、生理鹽水、葡萄糖、DMSO、乙醇等混合。本發(fā)明的活性可可提取物可以以凍干的形式提供，然后重新用于例如等滲壓水溶液、鹽水、葡萄糖或DMSO緩沖液中。在某一鹽水溶液中，發(fā)現(xiàn)了一些沉淀；可以采用這種發(fā)現(xiàn)作為分離本發(fā)明化合物的手段，例如通過“鹽析”方法。
實(shí)施例38描述在藥物、補(bǔ)充物和食品領(lǐng)域中使用的片劑劑型的本發(fā)明化合物制劑。另外，實(shí)施例39描述用于相同領(lǐng)域的膠囊劑型的本發(fā)明化合物制劑。此外，實(shí)施例40描述含本發(fā)明化合物或根據(jù)待審查的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)08/709,406(其在此引入以供參考)中描述的方法獲得的可可固體的標(biāo)準(zhǔn)鑒定(SOI)和非SOI巧克力的劑型。
試劑盒此外，本發(fā)明還包括一種試劑盒，其中具有活性可可提取物。該試劑盒可以包括含合適載體、稀釋劑或賦形劑的獨(dú)立的容器。該試劑盒還可以包括一種附加的抗瘤、抗癌、抗腫瘤劑、抗氧化劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑、氧化性DNA損傷的抑制劑或環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶抑制劑、編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑、血小板聚集調(diào)制劑、血液或體內(nèi)葡萄糖調(diào)制劑或NO或NO合酶調(diào)制劑，非甾類抗炎劑和/或與能夠降低或減輕抗瘤、抗癌、抗腫瘤劑、抗氧化劑、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ酶抑制劑、氧化性DNA損傷的抑制劑或環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶抑制劑、編程性細(xì)胞死亡調(diào)制劑、血小板聚集調(diào)制劑、血液或體內(nèi)葡萄糖調(diào)制劑或NO或NO合酶調(diào)制劑、非甾類抗炎劑的不良作用的試劑。該附加的試劑可以在一個(gè)單獨(dú)的容器中或與活性可可提取物混合。此外，試劑盒可以包括混合或組合成分的工具和/或給藥方法。
基因的鑒定本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括用借助于本發(fā)明化合物或這些化合物的混合物而緊密細(xì)胞接觸的結(jié)果來表達(dá)的基因的調(diào)制。這樣，本發(fā)明包括鑒定通過本發(fā)明化合物或其混合物誘導(dǎo)的或抑制的與幾種疾病有關(guān)的基因的鑒定，這些疾病包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、癌癥、心血管疾病和炎癥。更精確地說，在通過本發(fā)明混合物或其混合物接觸之前和之后鑒定和描述在這些疾病狀態(tài)中表達(dá)不同(相對(duì)于它們?cè)凇罢！睙o病狀態(tài)下的表達(dá))的基因。
正如在上面討論中提及的一樣，這些疾病和疾病狀態(tài)部分是以自由基的相互作用和生物分子的多樣性為基礎(chǔ)的。這些疾病有關(guān)的中心課題是許多自由基反應(yīng)涉及反應(yīng)性氧物質(zhì)，其反過來誘導(dǎo)與疾病發(fā)展有關(guān)的生理狀態(tài)。例如，反應(yīng)性氧物質(zhì)已經(jīng)涉及到轉(zhuǎn)錄因子例如核因子(NF)-κB的調(diào)節(jié)。(NF)-κB的靶基因包括一系列與協(xié)同炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因。這些基因包括編碼腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-I、(IL)-6和(IL)-8、誘導(dǎo)NOS、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類抗原和其它的基因。同樣，反過來，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性的基因可以通過氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)。在自由基清除劑和自由基產(chǎn)生體系之間的氧化壓力是不平衡的。這些情況的一些已知的實(shí)施例(Winyard和Blake,1977)包括gaddl 53(由生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)的基因)，其產(chǎn)物已顯示出與NF-IL6結(jié)合并形成不能與DNA結(jié)合的異源二聚體。NF-IL6正調(diào)節(jié)一些基因的表達(dá)，包括編碼白細(xì)胞介素6和8的那些。氧化壓力可誘導(dǎo)基因的另一個(gè)實(shí)例為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子p53在生長(zhǎng)抑制中的作用的gadd45。p53編碼可終止細(xì)胞分裂并誘導(dǎo)異常細(xì)胞(如癌細(xì)胞)進(jìn)行編程性細(xì)胞死亡的p53蛋白。
給出本發(fā)明化合物或化合物的混合物在部分基于自由基機(jī)理的多種疾病的治療中的應(yīng)用的出人意料，非顯而易見和新用途的全貌。本發(fā)明進(jìn)一步包括通過使用基因表達(dá)測(cè)定來確定本發(fā)明化合物在特定疾病或疾病狀態(tài)的動(dòng)物體外和成體內(nèi)模型中，對(duì)基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的暫時(shí)性作用的方法。這些分析包括，但不局限于差示，cDNA文庫的測(cè)序，基因表達(dá)的系列分析(SAGE)，通過與高密度寡核苷酸種類雜交的表達(dá)監(jiān)測(cè)和基于該方法或它們的組合的各種逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)(Lockhart等，1996)。
包含在本發(fā)明中的本發(fā)明化合物或化合物的混合物的綜合生理作用，結(jié)合遺傳評(píng)價(jià)方法使得能發(fā)現(xiàn)無論是已知或新的，被誘導(dǎo)的或被抑制的基因和基因產(chǎn)物。例如本發(fā)明包括使用RT-PCR在體外和體內(nèi)誘導(dǎo)和/或抑制淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞因子(如IL-1,IL-2,IL-6,IL-8,IL-12和TNF-α)。類似地，本發(fā)明包括應(yīng)用差示來確定選擇基因的誘導(dǎo)和/或抑制；用于在刺激和/或氧化劑刺激的條件下(如TNF-α或H2O2條件)下的心血管領(lǐng)域(如超氧化物歧化酶，血紅素氧化酶，COXI和2，及其它氧化劑防御基因)。對(duì)于癌癥領(lǐng)域，本發(fā)明包括應(yīng)用分化顯示來確定在對(duì)照和氧化劑應(yīng)激細(xì)胞中基因或基因產(chǎn)物，如CuZn-超氧化物酶歧化酶，Mn-超氧化物歧化酶，過氧化氫酶等的誘導(dǎo)和/或抑制。
僅通過舉例說明的方式給出下面非限制性實(shí)施例，并不被認(rèn)為是限制本發(fā)明，在不背離其實(shí)質(zhì)或范圍的情況下，許多明顯的變化均是可能的。實(shí)施例實(shí)施例1可可來源和制備方法從世界三大主要可可生產(chǎn)地獲得代表三種已確定的可可園藝學(xué)品種的一些可可樹(Theobroma cocao)的屬典型種。本研究中所采用的那些屬典型種的表示于表1中。將收獲的可可豆莢打開，取出帶果肉的豆用于冷凍干燥。從冷凍干燥物中人工取出果肉，并將豆如下進(jìn)行分析。首先人工將未發(fā)酵，冷凍干燥的可可豆去皮，并用TEKMAR Mill研磨成很細(xì)的粉狀物。接著使用重蒸餾的己烷作為溶劑，通過Soxhlet提取，將產(chǎn)生的物質(zhì)脫脂過夜。室溫下，用真空將殘留溶劑從脫脂物中除去。表1可可(Theobroma cacao)來源物質(zhì)的描述

實(shí)施例2矢車菊苷配質(zhì)提取方法A．方法1使用由Jalal和Collin(1977)描述的方法的改進(jìn)，從實(shí)施例1的脫脂，未發(fā)酵，冷凍干燥的可可豆中提取矢車菊苷配質(zhì)。使用2×400mL70％丙酮/去離子水，接著用400mL 70％甲醇/去離子水從一批50g脫脂的可可物中提取矢車菊苷配質(zhì)。收集提取物，通過在45℃下，用置于部分真空的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去溶劑。將產(chǎn)生的水相用去離子水稀釋至1L，并用400mL CHCl3萃取兩次。棄去溶劑相。接著將水相用500mL乙酸乙酯萃取4次。通過10℃下，在Sorvall RC 28S離心機(jī)上以2,000×g離心30分鐘破碎所有產(chǎn)生的乳狀液。向混合的乙酸乙酯萃取物中加入100-200mL去離子水，通過45℃下，用置于部分真空的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去溶劑。將產(chǎn)生的水相凍于液N2中，接著在LABCONCO冷凍干燥系統(tǒng)中冷凍干燥。從不同可可屬典型種獲得的粗矢車菊苷配質(zhì)的產(chǎn)率列于表2中。
表2粗矢車菊苷配質(zhì)的產(chǎn)率

B．方法2另外，用70％丙酮水溶液從實(shí)施例1的脫脂，未發(fā)酵，冷凍干燥的可可豆中提取矢車菊苷配質(zhì)，將10g脫脂物與100mL溶劑一起攪拌5-10分鐘。4℃下，以3000×g將淤漿離心15分鐘，并將上清通過玻璃棉。部分真空下，讓濾液進(jìn)行蒸餾，將產(chǎn)生的水相凍于液N2中，接著在LABCONCO冷凍干燥系統(tǒng)中冷凍干燥。粗矢車菊苷配質(zhì)的產(chǎn)率為15-20％。
不愿被任何特定理論所局限，認(rèn)為粗產(chǎn)率的不同反映了不同屬典型種，地理來源，園藝學(xué)品種和制備方法之間的差異。實(shí)施例3可可矢車菊苷配質(zhì)的部分純化A．凝膠滲透層析通過在Sephadex LH-20(28×2.5cm)上的液體層析部分純化從實(shí)施例2獲得的矢車菊苷配質(zhì)。用從去離子水至甲醇的分級(jí)梯度來輔助分離。起始的梯度組合物從15％甲醇的去離子水溶液開始，其后是每30分鐘逐步使用25％甲醇的去離子溶液，35％甲醇的去離子水溶液，70％甲醇的去離子水溶液和最終100％甲醇。將黃嘌呤生物堿(咖啡堿和可可堿)洗脫之后的流出物收集作為單一級(jí)分。該級(jí)分產(chǎn)生被進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)分級(jí)以產(chǎn)生稱為MM2A-MM2E的5個(gè)亞級(jí)分(Subfraction)的無黃嘌呤生物堿的亞級(jí)分。通過在45℃下，用置于部分真空的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)從各個(gè)亞級(jí)分中除去溶劑。將產(chǎn)生的水相凍于液N2中，并在LABCONCO冷凍干燥系統(tǒng)中冷凍干燥過夜。顯示分級(jí)分離的代表性凝膠滲透層析示于圖1中。用這種方法細(xì)分級(jí)分離了約100mg物質(zhì)。
層析條件柱；28×2.5cm Sephadex LH-20，流動(dòng)相甲醇/水分級(jí)梯度，15∶85,25∶75,35∶65,70∶30,100∶0，以1/2小時(shí)間隔進(jìn)行，流速；1.5mL/分鐘，檢測(cè)器；UV在λ1=254nm和λ2=365nm，記錄速度0.5mm/分鐘，柱負(fù)荷；120mg。B．半制備高效液相色譜(HPLC)方法1反相分離通過半制備HPLC部分純化從實(shí)施例2和/或3A獲得的矢車菊苷配質(zhì)。安裝有可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，帶有1mL注射口的Rheodyne 7010注射閥的Hewlett Packard 1050 HPLC系統(tǒng)被裝備有Pharmacia FRAC-100級(jí)分收集器。在與Phenomenex 10μODS UltracarbTM(60×10mm)保護(hù)柱相連的Phenomenex UltracarbTM10μODS柱(250×22.5mm)上進(jìn)行分離。流動(dòng)相結(jié)合物A=水；B=甲醇，以下面的線性梯度條件使用[時(shí)間，％A]；(0,85),(60,50),(90,0)和(110,0),流速為5mL/分鐘。在254nm用紫外檢測(cè)化合物。
用于分離存在于級(jí)分D+E的矢車菊苷配質(zhì)的代表性半制備HPLC的量示于圖15N中。在規(guī)定的時(shí)間間隔或通過人工級(jí)分收集來收集各個(gè)峰或選擇的層析區(qū)域以用于進(jìn)一步的純化和后面的評(píng)價(jià)。注射填充量為25-100mg物質(zhì)。方法2．正相分離通過半制備HPLC部分純化從實(shí)施例2和/或3A獲得的矢車菊苷配質(zhì)提取物。帶有設(shè)置在254nm的Millipore-Waters型480 LC檢測(cè)器的Hewlett Packard 1050 HPLC系統(tǒng)安裝有設(shè)置在峰形的PharmaciaFrac-100級(jí)分收集器。在與Supelco 5μm Supelguard LC-Si保護(hù)柱(20×4.6mm)相連的Supelco 5μm Supelcosil LC-Si柱(250×10mm)上進(jìn)行分離。用下面條件下的線性梯度洗脫矢車菊苷配質(zhì)(時(shí)間0％A,％B)；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,10,86),(70,10,86)，接著是10分鐘的重新平衡。流動(dòng)相組合物為A=二氯甲烷；B=甲醇；和C=乙酸∶水(1∶1)。采用3mL/分鐘的流速。在254nm下用紫外檢測(cè)各成分，并在Kipp和Zonan BD41記錄儀上記錄。注射體積為100-250μl將10mg矢車菊苷配質(zhì)提取物溶解在0.25mL 70％丙酮水溶液中的溶液。代表性半制備HPLC的量示于圖15中。在規(guī)定的時(shí)間間隔或通過人工收集級(jí)分來收集各峰或選擇的層析區(qū)以用于進(jìn)一步的純化和后面的評(píng)價(jià)。HPLC條件250×10mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)半制備柱20×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)保護(hù)柱檢測(cè)器Waters LC分光光度計(jì)類型480@254nm流速3mL/分鐘，柱溫室溫注射250μL 70％丙酮提取物

獲得的級(jí)分如下

>實(shí)施例4矢車菊苷配質(zhì)的分析性HPLC分析方法1反相分離將從實(shí)施例3獲得的矢車菊苷配質(zhì)給0.45μ濾器過濾，并用裝備了Diode Array檢測(cè)器和HP類型1046A程度可控?zé)晒鈾z測(cè)器的HewlettPackard 1090三元HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。45℃下，在Hewlett-Packard5μ Hypersil ODS柱(200×2.1mm)上進(jìn)行分離。將黃烷醇(flavanols)和矢車菊苷配質(zhì)用60％B至A的線性梯度洗脫，接著用B以0.3mL/分鐘的流速洗滌柱。流動(dòng)相組合物為B=0.5％乙酸的甲醇溶液和A=0.5％乙酸的毫微純水溶液。在A和B流動(dòng)相中的乙酸水平可被增加至2％。用其中λex=276nm和λem=316nm的熒光及在280nm處用紫外檢測(cè)各成分。根據(jù)參考標(biāo)準(zhǔn)溶液確定(+)兒茶酸和(-)表兒茶酸的濃度。通過使用(-)表兒茶酸的應(yīng)管因子計(jì)算矢車菊苷配質(zhì)的水平。對(duì)于一種可可屬典型種，顯示各種成分分離的代表性HPLC層析示于圖2A中。從另一種可可屬典型種獲得類似的HPLC分布圖。HPLC條件柱200×2.1mm Hewlett Packard Hypersil ODS(5μ)保護(hù)柱20×2.1mm Hewlett Packward HypersilODS(5μ)檢測(cè)器Diode Array@280nm熒光λex=276nm；λem=316nm流速0.3mL/分鐘柱溫45℃

方法2正相分離將從實(shí)施例2和/或3獲得的矢車菊苷配質(zhì)提取物經(jīng)0.45μ濾器過濾，并用裝備有HP型1046A程序可控?zé)晒鈾z測(cè)器和二極管系統(tǒng)檢測(cè)器的Hewlett Packward 1090系列Ⅱ HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。37℃下，在與Supelco Supelguard LC-Si 5μ保護(hù)柱(20×4.6mm)相連的5μ Phenomenex Lichrosphere_硅100柱(250×3.2mm)上進(jìn)行分離。在下面條件下，用線性梯度洗脫矢車菊苷配質(zhì)(時(shí)間，％A,％B)；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50)(65,10,86),(70,10,86)，接著進(jìn)行8分鐘的重新平衡。流動(dòng)相組合物為A=二氯甲烷，B=甲醇，和C=乙酸∶水，體積比為1∶1。采用0.5mL/分鐘的流速。用其中λex=276nm和λem=316nm的熒光或通過在280nm下的紫外線檢測(cè)各成分。對(duì)于一個(gè)屬典型種，顯示各種矢車菊苷配質(zhì)的分離的代表性HPLC層析示于圖28中。從另一個(gè)可可屬典型種獲得類似的HPLC分布圖。HPLC條件250×3.2mm Phenomenex Lichrosphere_Silica 100柱(5μ)20×4.6mmSupelco Supelguard LC-Si(5μ)保護(hù)柱檢測(cè)器PhotodiodeArray@280nm熒光λex=276nm；λem=316nm流速0.5mL/分鐘柱溫37℃

實(shí)施例5矢車菊苷配質(zhì)的鑒定通過在Sephadex LH-20(28×2.5cm)柱上的液相層析，接著通過使用10μ Bondapak C18(100×8mm)柱的半制備HPLC或通過使用5μ Supelcosil LC-Si(250×10mm)柱的半制備HPLC純化矢車菊苷配質(zhì)。
使用正和負(fù)離子型的液相二級(jí)離子質(zhì)譜(LSIMS)法，在VG ZAB-T高分解MS系統(tǒng)中通過快速原子轟擊-質(zhì)譜法(FAB-MS)分析部分純化的分離物。30 KV下，銫離子槍被用作電離源，“MagicBullet Matrix”(1∶1二硫蘇糖醇/二硫赤蘚糖醇)被用作質(zhì)子供體。
用LSIMS對(duì)這些級(jí)分的分析研究表明了如下表所示的多種黃烷-3-醇寡聚體的存在。
表3來自可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分的LSIMS(正離子)數(shù)據(jù)。

主要質(zhì)量段的離子與以前報(bào)導(dǎo)的對(duì)矢車菊苷配質(zhì)的正和負(fù)離子FAB-MS分析的工作一致(Self等，1986和Porter等，1991)。對(duì)應(yīng)于m/z 577(M+H)+的離子和其在m/z 599(M+Na)+的鈉加合物表明在分離物中雙重連接的矢車菊苷配質(zhì)二聚體的存在。非常感興趣地注意到較高的寡聚體與其被質(zhì)子化的分子離子(M+H)+更有可能形成鈉加合物(M+Na)+?；谟蒖evilla等(1991),Self等(1986)和Porter等(1991)報(bào)導(dǎo)的工作，推測(cè)性地鑒定了矢車菊苷配質(zhì)異構(gòu)體B-2,B-5和C-1。在部分純化的級(jí)分中，通過FAB-MS證實(shí)了高至八聚體和十聚體的矢車菊苷配質(zhì)。另外，高至十二聚體的矢車菊苷配質(zhì)的證據(jù)從正相HPLC分析中觀察到(參見圖2B)。表4列出了基于反相HPLC分析的在無黃嘌呤生物堿的分離物中發(fā)現(xiàn)的矢車菊苷配質(zhì)的相對(duì)濃度。表5列出了基于正相HPLC分析的矢車菊苷配質(zhì)的相對(duì)濃度。表4在無黃嘌呤生物堿的分離物中的矢車菊苷配質(zhì)的相對(duì)濃度。

表5矢車菊苷配質(zhì)在丙酮水溶液提取物中的相對(duì)濃度

圖3表明一些矢車菊苷配質(zhì)的結(jié)構(gòu)，圖4A-4E表明在下面篩選抗癌或抗腫瘤活性中采用的五個(gè)級(jí)分的代表性HPLC層析。用于圖4A-4E的HPLC的條件如下
HPLC條件裝備有HP型1046A程序可控?zé)晒鈾z測(cè)器的HewlettPackard 1090三元HPLC系統(tǒng)。
柱Hewlett Packard 5μHypersil ODS(200×2.1mm)，線性梯度為60％B至A，流速為0.3mL/分鐘，B=0.5％乙酸的甲醇溶液；A=0.5％乙酸的去離子水溶液。λex=280nm；λem=316nm。
圖15 O表明在篩選抗腫瘤或抗癌活性中采用的另外12種級(jí)分的代表性半制備HPLC層析(HPLC條件如上所述)。實(shí)施例6可可提取物(矢車菊苷配質(zhì))的抗癌，抗瘤或抗腫瘤活性最初由Mosmann(1983)開發(fā)的MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴鎓)-微量滴定板四唑鎓細(xì)胞毒性分析被用來篩選來自實(shí)施例5的試驗(yàn)樣品。以10mg/mL濃度將試驗(yàn)樣品，標(biāo)準(zhǔn)樣(順式鉑氨和苯丁酸氮芥)及MTT試劑溶解在100％DMSO(二甲亞砜)中。從貯液制備系列稀釋液。在為試驗(yàn)樣品的情況下，在0.5％DMSO中制備從0.01至100μg/mL變化的稀釋液。
從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得所有人腫癌細(xì)胞系。在含10％胎牛血清，100單位/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素和240單位/mL制霉菌素的α-MEM中讓細(xì)胞生長(zhǎng)成單層。37℃下，將細(xì)胞保存在濕潤(rùn)的5％CO2氣氛中。
在胰蛋白酶消化后，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)至50×105細(xì)胞/mL的濃度(根據(jù)癌細(xì)胞系而變化)。將200μl細(xì)胞懸浮液平板接種至96孔微量滴定板的4行孔中。在讓細(xì)胞貼壁四小時(shí)后，將2μl包含試驗(yàn)樣品溶液的DMSO加入到四行孔中。采用試驗(yàn)樣品稀釋的大小順序的尋找初始劑量應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)被用來確定待考查的劑量范圍。接著在BIO RAD MP 450平板計(jì)數(shù)器中測(cè)定在540nm的各孔吸光率。將四行試驗(yàn)樣品處理的孔的平均吸光率與對(duì)照比較，結(jié)果以對(duì)照吸光率加上/減去標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)來表示。MTT還原為紫色甲_產(chǎn)物以線性方式與孔中存活細(xì)胞的數(shù)目相關(guān)。因此，通過測(cè)定還原產(chǎn)物的吸光率，可獲得在給定劑量的試驗(yàn)樣品時(shí)，存活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。對(duì)照孔中包含最終濃度為1％DMSO。
用這種方法首先試驗(yàn)兩個(gè)樣品。樣品MM1代表非常粗的可可矢車菊苷配質(zhì)的分離物，并包含可鑒定量的咖啡因和可可堿。樣品MM2代表用凝膠滲透層析部分純化的可可矢車菊苷配質(zhì)分離物。在MM2中不存在咖啡因和可可堿。使用前面描述的方法篩選兩個(gè)樣品抗下列癌細(xì)胞系的活性HCT 116結(jié)腸癌ACHN腎腺癌SK-5黑素瘤A 498腎腺癌MCF-7乳腺癌PC-3前列腺癌CAPAN-2胰腺癌在任何觀察的腫瘤細(xì)胞系中，用MM1觀察到很少活性或沒有活性。發(fā)現(xiàn)MM2具有抗HCT-116,PC-3和ACHN腫瘤細(xì)胞系的活性。然而，發(fā)現(xiàn)MM1和MM2與MTT相干擾，以致它模糊了反映存活細(xì)胞數(shù)目減少的吸光率的降低。由于化學(xué)反應(yīng)看來在孔中沿平板的周圍更加迅速地發(fā)生，因此這種干擾還由于大量錯(cuò)誤障礙物所導(dǎo)致。這些作用的一個(gè)典型實(shí)例示于圖5中。在為高濃度的試驗(yàn)材料時(shí)，將期望觀察到存活細(xì)胞的大量減少，而非顯示高的存活水平。然而，顯微鏡檢查表明盡管發(fā)生MTT干擾，但仍產(chǎn)生細(xì)胞毒性效果。例如，以這種方式獲得了MM2對(duì)ACHN細(xì)胞的效果的0.5μg/mL的IC50值。
在本發(fā)明人看來，這些初步結(jié)果需要修改分析方法以排除MTT的干擾。如下完成它。在37℃下，將平板在濕潤(rùn)，5％CO2氣氛中保溫18小時(shí)后，小心地將培養(yǎng)基吸出并以新鮮α-MEM培養(yǎng)基代替。在分析的第三天再將該培養(yǎng)基從各孔中吸出，并代之以100μl新配制的McCoy′s培養(yǎng)基。接著向各平板的孔中加入11μl 5mg/mL MTT的PBS(磷酸鹽緩沖液)貯液。37℃下，在濕潤(rùn)，5％CO2氣氛中保溫4小時(shí)后，向平板各孔中加入100μl 0.04N鹽酸異丙醇溶液，接著充分混合以由任何活細(xì)胞產(chǎn)生的甲_。另外，決定細(xì)分級(jí)分離矢車菊苷配質(zhì)以確立導(dǎo)致活性的特定成分。
前述細(xì)分級(jí)分離方法被用來制備用于進(jìn)一步篩選的樣品。制備代表圖1所示區(qū)域和圖4A-4E所示成分分布的五個(gè)級(jí)分。將樣品編號(hào)為MM2A-MM2E以反映這些分析特征并表示不存在咖啡因和可可堿。
針對(duì)HCT-116,PC-3和ACHN腫瘤細(xì)胞系分別篩選各級(jí)分。結(jié)果表明該活性并不集中在任何一個(gè)特定的級(jí)分。由于在“活性”天然產(chǎn)物分離物中的成分可協(xié)同作用，因此這種結(jié)果被認(rèn)為是常有的。在為可可矢車菊苷配質(zhì)分離物(MM2)的情況下，多于二十種的可檢測(cè)成分組成了分離物。被認(rèn)為有可能該活性與存在于不同級(jí)分中的各成分的混合有關(guān)，而非該活性與各個(gè)成分有關(guān)。
基于此結(jié)果，決定混合級(jí)分并重復(fù)抗相同腫瘤細(xì)胞系的分析。一些級(jí)分混合產(chǎn)生了抗PC-3腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性效果。具體地，獲得了各自對(duì)于MM2A和MM2E混合的40μg/mL的IC50值，和對(duì)于MM2C和MM2E混合的20μg/mL的IC50值。還報(bào)導(dǎo)了抗HCT-16和ACHN細(xì)胞系的活性，但如前，MTT指示劑的干擾排除了明確的觀察結(jié)果。在HCT-116和ACHN系重復(fù)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以改進(jìn)數(shù)據(jù)。然而，由于細(xì)菌污染和試驗(yàn)樣品標(biāo)樣的消耗，這些結(jié)果不穩(wěn)定。圖6A-6D表明在可可提取物的混合物與PC-3腫瘤細(xì)胞之間的劑量應(yīng)答關(guān)系。
然而，從這個(gè)數(shù)據(jù)中清楚可見可可提取物，尤其是可可多酚或矢車菊苷配質(zhì)具有顯著的抗腫瘤；抗癌或抗瘤活性，尤其是對(duì)人PC-3(前列腺)，HCT-116(結(jié)腸)和ACHN(腎)腫瘤細(xì)胞系。此外，那些結(jié)果表明特定矢車菊苷配質(zhì)可能是抗PC-3細(xì)胞系活性的主要原因。實(shí)施例7可可提取物(矢車菊苷配質(zhì))的抗癌，抗腫瘤或抗瘤活性為了證實(shí)上面的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)一步研究級(jí)分混合物，進(jìn)行另外綜合性篩選。
所有制備的物質(zhì)和方法與上面描述的那些相同，除開將每個(gè)試驗(yàn)劑量標(biāo)準(zhǔn)4次重復(fù)增加到每個(gè)劑量8或12次重復(fù)。為了這個(gè)研究，篩選五個(gè)可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分的每一種及其混合物的抗下面腫瘤細(xì)胞系活性PC-3前列腺KB鼻咽/HelaHCT-116結(jié)腸ACHN腎MCF-7乳腺SK-5黑素瘤A-549肺CCRF-CEM T-細(xì)胞白血病各個(gè)篩選由分析不同劑量水平(0.01-100μg/mL)的級(jí)分A,B,C,D和E(參見圖4A-4E和其討論，見上文)抗各種細(xì)胞系的活性組成?；旌衔锖Y選由混合等劑量水平的級(jí)分A+B,A+C,A+D,A+E,B+C,B+D,B+E,C+D,C+E和D+E的抗各種細(xì)胞系的活性組成。分別討論這些分析的結(jié)果，接著進(jìn)行全面總結(jié)。A．PC-3前列腺細(xì)胞系圖7A-7H表明在可可矢車菊配質(zhì)級(jí)分和PC-3細(xì)胞系之間的典型劑量應(yīng)答關(guān)系。圖7D和7E證明級(jí)分D和E在75μg/mL的IC50值時(shí)具有活性。當(dāng)級(jí)分D或E存在時(shí)，從其它矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分的混合物的劑量反應(yīng)曲線獲得的IC50值在60-80μg/mL之間變化。各IC50值示于表6中。B．KB鼻咽/Hela細(xì)胞系圖8A-8H表明可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分和KB鼻咽/Hela細(xì)胞系之間的典型的劑量應(yīng)答關(guān)系。圖8D和8E證明級(jí)分D和E在IC50值為75μg/mL時(shí)具有活性。圖8F-8H描述了從級(jí)分混合物研究獲得的代表性結(jié)果。在這種情況下，矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分混合物A+B沒有作用，而級(jí)分混合物B+E和D+E在IC50值為60μg/ml時(shí)具有活性。當(dāng)存在級(jí)分D或E時(shí)，從來自其它級(jí)分混合物的其它劑量反應(yīng)曲線獲得的IC50值在60-80μg/mL之間變化。各IC50值示于表6中。這些結(jié)果本質(zhì)上與針對(duì)PC-3細(xì)胞系獲得的那些相同。C．HCT-116結(jié)腸細(xì)胞系圖9A-9H表明在可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分和HCT-116結(jié)腸細(xì)胞系之間的典型的劑量應(yīng)答關(guān)系。圖9D和9E證明級(jí)分E在IC50值為約400μg/mL具有活性。該值通過外推現(xiàn)有曲線而獲得。注意到級(jí)分D的劑量反應(yīng)曲線的斜率也表明活性。然而，由于該曲線的斜率太低不得獲得可靠值，因此無IC50值從該曲線獲得。圖9F-9H描述了從級(jí)分混合物研究獲得的代表性結(jié)果。在這種情況下，矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分混合物B+D沒有顯示明顯的活性，而級(jí)分混合物A+E和D+E分別在IC50值為500μg/mL和85μg/mL具有活性。當(dāng)級(jí)分E存在時(shí)，從其它級(jí)分混合物的劑量反應(yīng)曲線獲得的IC50值平均為約250μg/mL。外推IC50值列于表6中。D．ACHN腎細(xì)胞系圖10A-10H表明可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分和ACHN腎細(xì)胞系之間的典型的劑量應(yīng)答關(guān)系。圖10A-10E說明各級(jí)分對(duì)該細(xì)胞系不具活性。圖10F-10H描述從級(jí)分混合物研究中獲得的代表性結(jié)果。在這種情況下，矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分混合物B+C不具活性，而級(jí)分混合物A+E產(chǎn)生外推的IC50值為約500μg/mL。類似于C+D混合物的劑量反應(yīng)曲線被認(rèn)為不具活性，因?yàn)樗鼈兊男甭侍?。其它?jí)分混合物的外推IC50值列于表6中。E．A-549肺細(xì)胞系圖11A-11H表明在可可矢車菊苷配質(zhì)和A-549肺細(xì)胞系之間的典型的劑量應(yīng)答關(guān)系。在用于該分析的劑量下，從任何各種級(jí)分或級(jí)分的混合物沒有活性可被檢測(cè)出。然而，矢車菊苷配質(zhì)對(duì)該細(xì)胞系可能具有用途。F．SK-5黑素瘤細(xì)胞系圖12A-12H表明在可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分和SK-5黑色瘤細(xì)胞系之間的典型的劑量應(yīng)答關(guān)系。在用于該分析中的劑量下，從任何各種級(jí)分或級(jí)分的混合物中沒有活性可被檢測(cè)出。然而，矢車菊苷配質(zhì)對(duì)該細(xì)胞系可能具有用途。G．MCF-7乳腺細(xì)胞系圖13A-13H表明在可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分和MCF-7乳腺細(xì)胞系之間的典型的劑量應(yīng)答關(guān)系。在用于該分析中的劑量下，從任何各種級(jí)分或級(jí)分的混合物中沒有活性可被檢測(cè)出。然而，矢車菊苷配質(zhì)對(duì)該細(xì)胞系可能具有用途。H．CCRF-CEM T-細(xì)胞白血病細(xì)胞系最初獲得抗CCRF-CEM T-細(xì)胞白血病細(xì)胞系的典型的劑量反應(yīng)曲線。然而，不同級(jí)分濃度下針對(duì)時(shí)間的對(duì)細(xì)胞數(shù)目的顯微鏡計(jì)數(shù)表明500μg級(jí)分A,B和D在4天期間內(nèi)完成80％生長(zhǎng)的降落。代表性劑量應(yīng)答關(guān)系示于圖14中。I．總結(jié)從這些分析中獲得的對(duì)于所有細(xì)胞系，除開CCRF-CEM T-細(xì)胞白血病的IC50值集中列于表6中。因?yàn)椴捎貌煌姆治龇椒?，從表中有目的地省去T-細(xì)胞白血病的數(shù)據(jù)。對(duì)這些結(jié)果的一般性總結(jié)表明最大活性與級(jí)分D和E相關(guān)。這些級(jí)分對(duì)PC-3(前列腺)和KB(鼻咽/Hela)細(xì)胞系最具活性。雖然僅在如此高的劑量下，這些級(jí)分也顯示抗HCT-116(結(jié)腸)和ACHN(腎)細(xì)胞系的活性。未檢測(cè)出抗MCF-7(乳腺)，SK-5(黑素瘤)和A-549(肺)細(xì)胞系的活性。然而，對(duì)于這些細(xì)胞系，矢車菊苷配質(zhì)可能具有用途。還顯示出抗CCRF-CEM(T-細(xì)胞白血病)細(xì)胞系的活性。還應(yīng)注意到級(jí)分D和E為組成最復(fù)雜的混合物。然而，從這些數(shù)據(jù)清楚可見可可提取物，尤其是可可矢車菊苷配質(zhì)具有顯著的抗腫瘤，抗癌或抗瘤活性。表6可可矢車菊苷配質(zhì)對(duì)各種細(xì)胞系的IC50值(IC50值，μg/mL

從劑量反應(yīng)曲線外推大于100μg/mL的值實(shí)施例8可可提取物(矢車菊苷配質(zhì))的抗癌，抗腫瘤或抗瘤活性一些另外的體外分析方法被用來補(bǔ)充和擴(kuò)展示于表6和7的結(jié)果。方法A．結(jié)晶紫染色分析所有人腫瘤細(xì)胞系均從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。在含10％胎牛血清而不含抗生素的IMEM中讓細(xì)胞生長(zhǎng)至單層。37℃下，將細(xì)胞保存在濕潤(rùn)，5％CO2氣氛中。
胰蛋白酶消化后，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)至濃度為1,000-2,000細(xì)胞/100mL。通過將細(xì)胞(1,000-2,000細(xì)胞/孔)平板接種在96孔微量滴定板中來確定細(xì)胞增殖。在每孔加入100μl細(xì)胞后，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)。在24小時(shí)末，以不同濃度加入各種可可級(jí)分以獲得劑量應(yīng)答結(jié)果。將可可級(jí)分溶解在2倍濃度的培養(yǎng)基中，在三孔中加入100μl各種溶液。在連續(xù)的幾天中，將平板用50μl結(jié)晶紫(2.5g結(jié)晶紫溶解在125mL甲醇，375mL水中)染色15分鐘。除去染料，將平板輕輕浸至冷水中以除去過量染料。將洗滌重復(fù)二次或多次，并讓平板干燥。通過向各孔中加入100μl 0.1M檸檬酸鈉/50％乙醇來溶解剩余的染料。溶解后，在540nm下(在410nm下的參考濾器)，在ELISA平板計(jì)數(shù)器上定量細(xì)胞數(shù)。用吸光率作為Y軸，生長(zhǎng)天數(shù)作為X軸作圖來自ELISA計(jì)數(shù)器的結(jié)果。方法B．軟瓊脂克隆分析根據(jù)由Nawata等(1981)描述的方法，在軟瓊脂上克隆細(xì)胞。在含0.8％瓊脂和各種濃度的可可級(jí)分的培養(yǎng)基中制備單細(xì)胞懸液。將懸液以等分樣品分至被含1.0％瓊脂的培養(yǎng)基覆蓋的35mm平皿中。10天保溫后，在Ominicron 3600 Image Analysis System中確定直徑大于60μm的菌落的數(shù)量。將菌落數(shù)量作為Y-軸，可可級(jí)分的濃度作為X-軸將結(jié)果作圖。方法C．XTT微量培養(yǎng)四唑鎓分析由Scudiero等(1988)描述的XTT分析方法被用來篩選各種可可級(jí)分。除開下面的修改，XTT分析本質(zhì)上與使用MTT方法(實(shí)施例6)描述的相同。以1mg/mL不含血清的培養(yǎng)基制備XTT((2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺酰苯基)-5-((苯基氨基)羰基)-2H-四唑鎓氫氧化物)，并預(yù)保溫至37℃。以5mM PBS制備PMS。將XTT和PMS混合在一起；向各孔中加入10μl PMS/mL XTT和50μlPMS-XTT。37℃，保溫4小時(shí)后，在機(jī)械搖床上將平板混合30分鐘并在450-600nm處測(cè)量吸光率。用吸光率作為Y-軸，生長(zhǎng)天數(shù)或濃度作為X-軸將結(jié)果作圖。
對(duì)于方法A和C，還將對(duì)照百分?jǐn)?shù)作為Y-軸，生長(zhǎng)天數(shù)或濃度作為X-軸將結(jié)果作圖。
用可可級(jí)分D和E(實(shí)施例3B)進(jìn)行抗乳腺癌細(xì)胞系的MCF-7p168的XTT和結(jié)晶紫分析法的比較以確定何種分析是最靈敏的。如圖15A中所示，兩種分析對(duì)于濃度＞75μg/mL顯示出相同的劑量-應(yīng)答效果。在低于此值的濃度時(shí)，結(jié)晶紫分析比XTT分析結(jié)果顯示出更高的標(biāo)準(zhǔn)偏差。然而，由于結(jié)晶紫分析易于使用，因此除開另有說明，所有后面的分析均用此方法進(jìn)行。
提供結(jié)晶紫分析結(jié)果(圖15B-15E)以分別證實(shí)粗多酚提取物(實(shí)施例2)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA MB231，前列腺癌細(xì)胞系PC-3，乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 p163和頸癌細(xì)胞系Hela的作用。在所有情況下，在5-7天期間，250μg/mL的劑量完全抑制所有癌細(xì)胞生長(zhǎng)。由于100μg/mL劑量也抑制生長(zhǎng)，因此Hela細(xì)胞系看來對(duì)提取物更為敏感。還分析了來自實(shí)施例3B的可可級(jí)分抗Hela和其它乳腺癌細(xì)胞系SKBR-3。結(jié)果(圖15F和15G)表明級(jí)分D和E具有最高活性。如圖15H和15I所示，從兩種癌細(xì)胞系獲得了約40μg/mL D和E的IC50值。
在確定試驗(yàn)化合物抑制不依賴貼壁生長(zhǎng)的能力的軟瓊脂克隆分析中還試驗(yàn)了可可級(jí)分D和E。如圖15J所示，100μg/mL的濃度完全抑制了Hela細(xì)胞的菌落形成。
還分析了從代表三種可可園藝學(xué)品種的8種不同可可的屬典型種獲得的粗多酚提取物抗Hela細(xì)胞系。如圖15K所示，所有可可變異種顯示相似的劑量應(yīng)答作用。UIT-1變種顯示最大的抗Hela細(xì)胞系活性。這些結(jié)果證實(shí)所有可可的屬典型種擁有不依賴于地理來源，園藝學(xué)品種和屬典型種的產(chǎn)生抗至少一種人癌細(xì)胞系活性的多酚級(jí)分。
每日基礎(chǔ)上從一噸規(guī)模巴西可可豆的傳統(tǒng)的5天發(fā)酵，接著進(jìn)行4天太陽干燥階段而制備的粗多酚提取物進(jìn)行另一系列分析。示于圖15L中的結(jié)果未顯示出這些早期加工階段的顯著效果，這表明在多酚的組合物中變化很小。然而，已知(Lehrian和Patterson,1983)在發(fā)酵階段多酚氧化酶(PPO)將氧化多酚。為了確定酶促氧化多酚將對(duì)活性具有何種影響，進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)。通過用丙酮，以1mg粉比10mL丙酮的比例萃取磨得很細(xì)，未發(fā)酵，冷凍干燥的脫脂巴西可可豆來制備粗PPO。將漿液以3,000rpm離心15分鐘。將其重復(fù)三次，每次棄去上清，將第四次萃取物倒入Buchner過濾漏斗。讓丙酮粉末空氣干燥，接著根據(jù)由McLord和Kilara(1983)描述的方法進(jìn)行分析。向粗多酚溶液中(100mg/10mL檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液，0.02M,pH 5.5)中加入100mg丙酮粉末(4,000單位活性/mg蛋白)并用讓氣泡流通過漿液來攪拌30分鐘。將樣品以5,000×g離心15分鐘，用20mL乙酸乙酯將上清萃取3次?；旌弦宜嵋阴ポ腿∥?，部分真空下蒸餾干燥并加入5mL水，接著冷凍干燥。然后針對(duì)Hela細(xì)胞對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分析并將劑量應(yīng)答與未經(jīng)酶促處理的粗多酚提取物進(jìn)行比較。結(jié)果(圖15M)表明酶促氧化提取物的劑量反應(yīng)曲線中的明顯的偏離，這表明氧化產(chǎn)物比它們的天然形式更具抑制性。實(shí)施例9含矢車菊苷配質(zhì)的可可提取物的抗氧化劑活性文獻(xiàn)中的證據(jù)提出了天然產(chǎn)生的抗氧化劑(維生素C,E和β-胡蘿卜素)的消耗與包括癌癥的疾病的低發(fā)病率之間的關(guān)系(DesigningFoods,1993；Caragay,1992)。通常認(rèn)為這些抗氧化劑影響某些參與一些類型的腫瘤啟動(dòng)的氧化和自由基過程。另外，已表明為抗癌劑的一些植物多酚化合物本質(zhì)上也具有抗氧化劑活性(Ho等，1992；Huang等，1992)。
為了確定含矢車菊苷配質(zhì)的可可提取物是否具有抗氧化劑性質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)Rancimat方法。實(shí)施例1,2和3中描述的方法被用來制備被進(jìn)一步處理以從凝膠滲透層析中產(chǎn)生兩個(gè)級(jí)分的可可提取物。這兩個(gè)級(jí)分實(shí)際上為混合的級(jí)分A-C，及D和E(見圖1)，其中它們的抗氧化劑性質(zhì)被與合成抗氧化劑BHA和BHT進(jìn)行了比較。
去皮后從未烘烤的花生中擠出花生油。以兩個(gè)水平～100ppm和～20ppm，將各個(gè)試驗(yàn)化合物摻入油中，實(shí)際水平示于表7中。將50μl甲醇溶解的抗氧化劑加入各樣品中以輔助抗氧化劑的分散。用50μl不含抗氧化劑的甲醇制備對(duì)照樣品。
在100℃和20cc/分鐘空氣下，使用Rancimat穩(wěn)定性試驗(yàn)將樣品的氧化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)兩次。選擇實(shí)驗(yàn)參數(shù)以匹配使用活性氧法(AOM)或Swift穩(wěn)定性試驗(yàn)(Van Oosten等，1981)的那些。典型的Rancimat顯示于圖16中。結(jié)果以達(dá)到100meq過氧化物水平所需的小時(shí)數(shù)表示報(bào)導(dǎo)在表8中。表7抗氧化劑的濃度

表8花生油和各種抗氧化劑的氧化穩(wěn)定性

這些結(jié)果證實(shí)了含所有試驗(yàn)添加物的花生油的增加的氧化穩(wěn)定性。通過向樣品中摻入可可的粗乙酸乙酯提取物實(shí)現(xiàn)了氧化穩(wěn)定性的最大的增加。這些結(jié)果證實(shí)含矢車菊苷配質(zhì)的可可提取物具有等于或大于等量的合成BHA和BHT的抗氧化劑能力。因此，本發(fā)明可在BHA或BHT的已知用途方面被用于替代BHT或BHA，例如作為抗氧化劑和/或食品添加劑。并且在此方面，也應(yīng)注意到本發(fā)明來自可食用來源。給出這些結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需過分實(shí)驗(yàn)還可很容易地確定用于該“BHA或BHT”用途中的本發(fā)明的適宜量，如加入到食物中的量。實(shí)施例10拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制研究DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ?yàn)榇呋疍NA鏈斷裂和重新連接，從而控制DNA的拓?fù)錉顟B(tài)的酶(Wang,1985)。除研究拓?fù)洚悩?gòu)酶的細(xì)胞內(nèi)功能外，一個(gè)最引人注目的發(fā)現(xiàn)是確定了拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ作為許多臨床重要的抗腫瘤化合物的初級(jí)細(xì)胞靶(Yamashita等，1990)，其中包括嵌入劑(m-AMSA,Adriamycin_和橢圓玫瑰樹堿)以及非嵌入的表鬼臼毒素。一些證據(jù)的線索表明一些抗腫瘤藥物具有穩(wěn)定DNA-拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ復(fù)合物(“可切割復(fù)合物”)的共同的性質(zhì)，其中該復(fù)合物在暴露于變性試驗(yàn)時(shí)導(dǎo)致DNA切割的誘導(dǎo)(Muller等，1989)。已提出抗腫瘤藥物導(dǎo)致的可切割復(fù)合物的形成產(chǎn)生大量可導(dǎo)致細(xì)胞死亡的DNA加合物。
根據(jù)該具有吸引力的模型，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ可切割復(fù)合物的特定的新誘導(dǎo)物可用作抗癌，抗腫瘤或抗瘤劑。在試圖確定具有靶定DNA活性的細(xì)胞毒性化合物中，篩選可可矢車菊苷配質(zhì)的增加的抗一些DNA-損傷敏感性細(xì)胞系的細(xì)胞毒性活性，并用從淋巴癌獲得的人拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ進(jìn)行酶分析。A．拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的動(dòng)質(zhì)體DNA的去連鎖(decatenation)如Muller等(1989)所描述的，如下進(jìn)行動(dòng)質(zhì)體DNA的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ去連鎖的體外抑制。用Miller等(1981)和Danlks等(1988)的方法的改進(jìn)，從人淋巴癌中制備含拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性的核提取物。34℃下，1單位的純化酶足以在30分鐘內(nèi)將0.25μg動(dòng)質(zhì)體DNA去連鎖。動(dòng)質(zhì)體從短膜蟲屬錐蟲(Crithidia fasciculata)獲得。在含19.5μlH2O,2.5μl 10×緩沖液(1×含50mM tris-HCl的緩沖液，pH8.0,120mM KCl,10mM MgCl2,0.5mM ATP,0.5mM二硫蘇糖醇和30μg BSA/mL),1μl動(dòng)質(zhì)體DNA(0.2μg)和1μl各種濃度的含DMSO的可可矢車菊苷配質(zhì)試驗(yàn)級(jí)分的0.5mL微量離心管中進(jìn)行各個(gè)反應(yīng)。將該混合物充分混合并置于冰上。34℃下，在水浴中保溫30分鐘之前立即加入1單位拓?fù)洚悩?gòu)酶。
保溫后，通過加入5μl終止緩沖液(5％Sarkosyl,0.0025％溴酚蘭，25％甘油)并置于冰上來終止去連鎖分析。在1％瓊脂糖凝膠上，在含溴化乙錠(0.5μg/ml)的TAE緩沖液中將DNA進(jìn)行電泳。310nm波長(zhǎng)下的紫外線照射使DNA顯色。用Polaroid Land/相機(jī)將凝膠照相。
圖17表明這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。完全連鎖的動(dòng)質(zhì)體DNA不遷移至1％瓊脂糖凝膠中。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ?qū)е碌膭?dòng)質(zhì)體DNA的去連鎖產(chǎn)生不遷移至凝膠中的單體DNA帶(單環(huán)，類型Ⅰ和類型Ⅱ)。作為增加的濃度的函數(shù)的單體帶的逐步消失使加入可可矢車菊苷配質(zhì)導(dǎo)致的酶的抑制成為顯然?；谶@些結(jié)果，在為0.5-5.0μg/mL內(nèi)變化的濃度下，可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A,B,D和E顯示出抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ。這些抑制劑濃度非常類似于對(duì)蒽環(huán)型藥和m-AMSA(4′-(9-吖啶基氨基)甲磺酰-間-茴香酰胺)所獲得的。B．藥物敏感細(xì)胞系篩選可可矢車菊苷配質(zhì)的對(duì)一些DNA損傷敏感性細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。一個(gè)細(xì)胞系為由P.Jeggo(Kemp等，1984)開發(fā)的xrs-6 DNA雙鏈斷裂修復(fù)突變體。xrs-6細(xì)胞系的DNA修復(fù)缺陷使得它們對(duì)X-射線，導(dǎo)致DNA雙鏈直接斷裂的化合物，如博來霉素，和對(duì)抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的化合物尤為敏感，并因此如Warter等(1991)所提出的可能間接誘導(dǎo)雙鏈的斷裂。將針對(duì)修復(fù)缺陷細(xì)胞系的細(xì)胞毒性與針對(duì)DNA修復(fù)良好的CHO細(xì)胞系BR1的細(xì)胞毒性進(jìn)行比較。針對(duì)修復(fù)缺陷(xrs-6)細(xì)胞系的增強(qiáng)的細(xì)胞毒性被解釋作為DNA可切割雙鏈斷裂形成的證據(jù)。
DNA修復(fù)良好的CHO細(xì)胞系BR1由Barrows等(1987)開發(fā)，并除開正常CHO DNA修復(fù)酶外還表達(dá)06-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶。CHO雙鏈斷裂修復(fù)缺陷細(xì)胞系(xrs-6)是來自Dr.P.Jeggo和同事(Jeggo等，1989)的贈(zèng)品。如實(shí)施例6所描述，在含血清和抗生素的α-MEM中讓兩種細(xì)胞生成為單層。37℃下，將細(xì)胞保存在濕潤(rùn)，5％CO2氣氛中。在用可可矢車菊苷配質(zhì)處理之前，用胰蛋白酶處理讓生長(zhǎng)為單層的細(xì)胞脫離。使用實(shí)施例6描述的MTT分析方法進(jìn)行分析。
結(jié)果(圖18)表明針對(duì)xrs-6細(xì)胞系沒有增加的細(xì)胞毒性，這說明可可矢車菊苷配質(zhì)以不同于可切割雙鏈斷裂形成的方式抑制劑拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ。即在其與DNA相互作用以形成不可切割復(fù)合物之前先與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ相互作用。
不可切割復(fù)合物形成化合物是相對(duì)新的發(fā)現(xiàn)。蒽環(huán)型藥，鬼臼素生物堿，蒽二酮，吖啶，和橢圓玫瑰樹堿中的成員均可用于臨床抗癌，抗腫瘤或抗瘤用途，且它們產(chǎn)生可切割復(fù)合物(Liu,1989)。最近已鑒定出了看來不產(chǎn)生可切割復(fù)合物的一些新類型的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑。這包括氨萘非林(Hsiang等，1989)，司替霉素(Fesen等，1989),黃酮類(flavanoids)(Yamashita等，1990),saintopin(Yamashita等，1991)，膜酮(Drake等，1989)，萜類(Kawada等，1991),蒽吡唑(Fry等，1985)，雙氧哌嗪(Tanabe等，1991)，和海洋吖啶-dercitin(Burres等，1989)。
由于在形成可切割復(fù)合物之前，可可矢車菊苷配質(zhì)使拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ失活，因此它們單獨(dú)或與其它已知的并從機(jī)理上被定義為拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑一起混合具有化學(xué)治療價(jià)值。另外，可可矢車菊苷配質(zhì)看來還是一類新的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑(Kashiwada等，1993)和因此可比其它已知抑制劑對(duì)細(xì)胞毒性更小，從而增加了它們?cè)诨瘜W(xué)治療中的應(yīng)用。
采用表達(dá)膜結(jié)合糖蛋白(gp 170)以傳遞多種藥物抗性的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(ADR)(Leonessa等，1994)和其親代細(xì)胞系MCF-7分析可可級(jí)分D和E的效果。如圖19所示，在增加劑量水平的級(jí)分D和E時(shí)，親代細(xì)胞系被抑制，而阿霉素(ADR)抗性細(xì)胞系在較高劑量時(shí)受影響較小。這些結(jié)果表明可可級(jí)分D和E對(duì)多藥抗性細(xì)胞系具有影響。實(shí)施例11矢車菊苷配質(zhì)的合成根據(jù)Delcour等(1983)開發(fā)的方法的改進(jìn)進(jìn)行矢車菊苷配質(zhì)的合成。除開在還原條件下，將(+)-兒茶酸與二氫櫟精縮合外，還采用(-)-表兒茶酸的反映在未發(fā)酵可可豆中自然產(chǎn)生的高濃度的(-)表兒茶酸。如實(shí)施例3,4和5中描述的方法分離，純化，分析和鑒定合成產(chǎn)物。在此方法中，制備了二黃酮類，三黃酮類和四黃酮類并用上面描述的針對(duì)可可提取物的方法將其用作分析標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例12正相半制備級(jí)分的分析由于多酚提取物為組成復(fù)雜的組合物，為了進(jìn)一步純化，劑量應(yīng)答分析和全面的結(jié)構(gòu)鑒定，必需確定何種成分具有抗癌細(xì)胞系活性。根據(jù)寡聚體大小，將正相半制備HPLC分離法(實(shí)施例3B)用來分離可可矢車菊苷配質(zhì)。除開初始提取物，制備十二種級(jí)分(圖2B和15 O)并在100μg/mL和25μg/mL劑量下分析抗Hela和SKBR-3癌細(xì)胞系活性以確定何種寡聚體擁有最大活性。如圖20A和B所示，在100μg/mL水平上，級(jí)分4-11(五聚體-十二聚體)明顯抑制劑Hela和SKBr-3癌細(xì)胞系。這些結(jié)果表明這些特定的寡聚體具有抗Hela和SKBR-3細(xì)胞的最大活性，另外，可可級(jí)分D和E的正相HPLC分析表明在前面研究，如實(shí)施例7中采用的該級(jí)分富含這些寡聚體。實(shí)施例13HPLC純化方法方法A．GPC純化通過Sephadex LH 20(72.5×2.5cm)上的液相層析，使用100％甲醇作為洗脫溶劑，以3.5mL/分鐘流速部分純化如實(shí)施例2獲得的矢車菊苷配質(zhì)。在第一個(gè)1.5小時(shí)后，收集洗脫級(jí)分，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮級(jí)分，重新溶于水中并冷凍干燥。這些級(jí)分被稱為五聚體富集級(jí)分。用該方法將約2.00g從實(shí)施例2獲得的提取物進(jìn)行細(xì)分級(jí)分離。結(jié)果示于表9中。
表9獲得的級(jí)分的組成

ND=未檢測(cè)出tr=痕量方法B．正相分離通過在Supelcosil LC-Si,100 _,5μm(250×4.6mm)上的正相層析，以1.0mL/分鐘的流速或另外在Lichrosphere_Silica 100,100 _,5μm(235×3.2mm)，以0.5mL/分鐘的流速將如實(shí)施例2獲得的矢車菊苷配質(zhì)進(jìn)行分離純化。在下面條件下，用分級(jí)梯度來輔助分離(時(shí)間，％A,％B)；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,10,86),(70,10,86)。流動(dòng)相組合物為A=二氯甲烷；B=甲醇；和C=乙酸∶水(1∶1)。用其中λex=276nm和λem=316nm的熒光，以及通過280nm下的紫外線照射來檢測(cè)各成分。注射體積為0.5μl(20mg/mL)從實(shí)施例2獲得的矢車菊苷配質(zhì)。這些結(jié)果示于圖40A和40B中。
另一種方法，用在下面條件下的分級(jí)梯度來輔助分離(時(shí)間，％A,％B)；(0,76,20)；(25,46,50)；(30,10,86)。流動(dòng)相組合物為A=二氯甲烷；B=甲醇；和C=乙酸∶水(1∶1)。結(jié)果示于圖41A和41B。方法C.反相分離通過在Hewlett Packard Hypersil ODS 5μm、(200×2.2mm)，和Hewlett Packard Hypersil ODS 5μm保護(hù)柱(20×2.1mm)的反相層析將如實(shí)施例2獲得的矢車菊苷配質(zhì)進(jìn)行分離純化。在20分鐘內(nèi)，用20％B至A的線性梯度洗脫矢車菊苷配質(zhì)，接著用100％B以0.3mL/分鐘的流速洗滌柱。流動(dòng)相組合物為B=1.0％乙酸的甲醇溶液與A=2.0％乙酸的毫微純水溶液的脫氣混合物。在280nm用紫外線，及λex=276nm和λem=316nm的熒光來檢測(cè)各成分；注射體積為2.0μl(20mg/mL)。實(shí)施例14五聚體富集級(jí)分的HPLC分離方法A．半制備正相HPLC用裝備有設(shè)置在254nm的Millipore-水類型480LC檢測(cè)器的Hewlett Packard 1050 HPLC系統(tǒng)，通過半制備正相HPLC進(jìn)一步純化五聚體富集級(jí)分，其中該系統(tǒng)中裝有設(shè)置在峰型的Pharmacia Frac-100級(jí)分收集器。在與Supelco 5μ Supelguard LC-Si保護(hù)柱(20×4.6mm)相連的Supelco 5μm Supelcosel LC-Si,100 _柱(250×10mm)上進(jìn)行分離。用在下面條件下的線性梯度洗脫矢車菊苷配質(zhì)(時(shí)間，％A,％B)；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,10,86),(70,10,86)，接著進(jìn)行10分鐘重新平衡，流動(dòng)相組合物為A=二氯甲烷；B=甲醇；和C=乙酸∶水(1∶1)。采用3mL/分鐘的流速。254nm下，用紫外線檢測(cè)各成分；并在Kipp & Zonan BD41記錄儀上進(jìn)行記錄。注射體積范圍為100-250μl將10mg矢車菊苷配質(zhì)溶解在0.25mL 70％丙酮水溶液中的溶液。在規(guī)定的時(shí)間間隔上或通過人工級(jí)分收集來收集各峰或選擇的層析區(qū)域以用于進(jìn)一步純化和后面的評(píng)價(jià)。HPLC條件250×100mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)半制備柱20×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)保護(hù)柱檢測(cè)器Waters LC分光光度計(jì)類型480 @ 254nm流速3mL/分鐘柱溫室溫注射250μl五聚體富集級(jí)分梯度CH2Cl2甲醇乙酸∶水(1∶1)0 82 14430 67.6 28.4 460 46 50465 10 86470 10 864方法B．反相分離將實(shí)施例13得到的矢車菊苷配質(zhì)提取物用0.45μ尼龍膜過濾并用帶二級(jí)管陳列檢測(cè)器和HP型1046A程度熒光檢測(cè)器的Hewlett Packard1090三相HPLC系統(tǒng)分析。在Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS柱(200×2.1mm)柱上于45℃進(jìn)行分離。用60％的B對(duì)A線性梯度洗脫矢車菊苷配質(zhì)，隨后以0.3ml/分鐘的流速以B洗柱。移動(dòng)相的組成是脫氣的混合物B=0.5％的溶于甲醇中的乙酸，A=溶于毫微純水中的0.5％的乙酸。A和B移動(dòng)相中乙酸的濃度可增加至2％。于UV 280m檢測(cè)組份的熒光，其中λex=276nm,λem=316nm。參照標(biāo)準(zhǔn)溶液確定(+)-兒茶酸和(-)-表兒茶酸的濃度。用對(duì)(-)表兒茶酸的反應(yīng)系數(shù)評(píng)估矢車菊苷配質(zhì)的水平。方法C．正相分離將如實(shí)施例13獲得的矢車菊苷配質(zhì)提取物經(jīng)0.45μ尼龍濾器過濾并用裝備有二極管系統(tǒng)檢測(cè)器和HP型1046A程序可控?zé)晒鈾z測(cè)器的Hewlett Packard 1090系列Ⅱ HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分析。37℃下，在與Supelco Supelguard LC-Si 5μ保護(hù)柱(20×4.6mm)相連的5μPhenomenex Lichrosphere_Silica 100柱(250×3.2mm)上進(jìn)行分離。因?yàn)橄旅鏃l件的線性梯度洗脫矢車菊苷配質(zhì)(時(shí)間，％A,％B)；(0,82,14),(30,67.6,28.4),(60,46,50),(65,10,86),(70,10,86)，接著進(jìn)行8分鐘的重新平衡，流動(dòng)相組合物為A=二氯甲烷；B=甲醇；和C=乙酸∶水，體積比為1∶1。采用0.5mL/分鐘的流速。用其中λex=276nm,λem=316nm的熒光，或通過280nm下的紫外線檢測(cè)各成分。對(duì)于一個(gè)屬典型種，顯示各種矢車菊苷配質(zhì)分離的代表性HPLC層析示于圖2中。從其它可可屬(Theobroma)，可可屬(Herrania)和/或其種間種內(nèi)特定的雜交種獲得了類似的HPLC分布圖。HPLC條件250×3.2mm Phenomenex Lichrosphere_Silica 100柱(5μ)20×4.6mm Supelco Supelguard LC-Si(5μ)保護(hù)柱檢測(cè)器光二極管系統(tǒng)@280nm熒光λex=276nm；λem=316nm流速0.5mL/分鐘柱溫37℃乙酸梯度CH2Cl2甲醇水(1∶1)0 82 14430 67.6 28.4 46046 5046510 8647010 864方法D．制備正相分離通過Rigaud等(1993)層析雜志654,255-260的方法的改進(jìn)，用制備正相層析進(jìn)一步純化如實(shí)施例13獲得的五聚體富集級(jí)分。
室溫下，用適宜的保護(hù)柱在5μ Supelcosil LC-Si 100 _柱(50×2cm)上進(jìn)行分離。用在下面條件下的線性梯度洗脫矢車菊配質(zhì)(時(shí)間，％A,％B，流速)；(0,92.5,7.5,10),(10,92.5,7.5,40)；(30,91.5,18.5,40)；(145,88,22,40)；(150,24,86,40)；(155,24,86,50)；(180,0,100,50)。使用前，按下面方案混合流動(dòng)相各成分溶劑A的制備(82％CH2Cl2,14％甲醇，2％乙酸，2％水)1．量取80mL水并倒至4L瓶中。
2．量取80mL乙酸并倒至同一4L瓶中。
3．量取560mL甲醇并倒至同一4L瓶中。
4．量取3280mL二氯甲烷并倒至該4L瓶中。
5．蓋上瓶子并混合均勻。
6．用高純度氦將混合物清洗5-10分鐘以脫氣。
將步驟1-6重復(fù)兩次以產(chǎn)生8體積的溶劑A。
溶劑B的制備(96％甲醇，2％乙酸，2％水)。
1．量取80mL水并倒至4L瓶中。
2．量取80mL乙酸并倒至同一4L瓶中。
3．量取3840mL甲醇并將3840甲醇倒至同一4L瓶中。
4．蓋上瓶子并混合均勻。
5．用高純度氦將混合物清洗5-10分鐘以脫氣。
重復(fù)步驟1-5以產(chǎn)生4體積溶劑B。流動(dòng)相組合物為A=二氯甲烷，含2％乙酸和2％水；B=甲醇，含2％乙酸和2％水。柱負(fù)荷為7mL中含0.7g。254nm下，用紫外線檢測(cè)各成分?？煽墒杠嚲哲张滟|(zhì)的典型的制備正相HPLC分離示于圖42中。HPLC條件柱50×2cm 5μ Supelcosil LC-Si run@室溫流動(dòng)相A=含2％乙酸和2％水的二氯甲烷B=含2％乙酸和2％水的甲醇梯度/流速分布圖

實(shí)施例15矢車菊苷配質(zhì)的鑒定使用裝備有Lecroy 9350 500MHz示波器的HP G2025A MALDI-TOF/MS系統(tǒng)，用刮板/質(zhì)譜的基質(zhì)輔助激光解吸的電離時(shí)間(MALDI-TOF/MS)分析如實(shí)施例14，方法D獲得的矢車菊苷配質(zhì)。根據(jù)制造商的說明使用低分子量肽標(biāo)準(zhǔn)(HP部分號(hào)G2051A)或肽標(biāo)準(zhǔn)(HP部分號(hào)G2052A)，用2,5二羥基苯甲酸(DHB)(HP部分號(hào)G2056A)作為相同基質(zhì)來校準(zhǔn)儀器。將1.0mg樣品溶解在500μl70/30甲醇/水，并以1∶1,1∶10或1∶50(樣品∶基質(zhì))的比例將樣品與DHB基質(zhì)混合，真空下在臺(tái)面干燥器中干燥。將檢測(cè)器電壓設(shè)在4.75KV，激光能量設(shè)在1.5與8μJ之間用陽離子方式分析樣品。以多次單一試驗(yàn)的和來收集數(shù)據(jù)并以分子量單位和刮板時(shí)間來表示。代表性MALDI-TOF/MS示于圖22A中。
圖22和C顯示從如實(shí)施例3描述的制備的部分純化的矢車菊苷配質(zhì)獲得的并如實(shí)施例6和7描述的用于體外評(píng)價(jià)的MALDI-TOF/MS譜，其結(jié)果總結(jié)于表6中。這一數(shù)據(jù)說明本文描述的本發(fā)明化合物主要在級(jí)分D-E，而非A-C中被發(fā)現(xiàn)。
如下獲得譜圖如上所述將純化的D-E級(jí)分進(jìn)行MALDI-TOF/MS，除開最初用SEP-PACK_C-18柱體純化級(jí)分。將5mg級(jí)分D-E的1mL毫微純水溶液上樣至預(yù)平衡的SEP-PACK_柱體中。將柱用5mL微毫純水洗滌以消除污染物，并用1mL 20％甲醇洗脫矢車菊苷配質(zhì)。因?yàn)樗鼈冊(cè)趯?shí)施例3中已被用方法3進(jìn)行了純化，因此不需進(jìn)一步純化而直接使用級(jí)分A-C。
這些結(jié)果證實(shí)并擴(kuò)展了早期的結(jié)果(見實(shí)施例5，表3，圖20A和B)并表明本發(fā)明化合物具有作為陽離子多價(jià)螯合物的用途。尤其是，MALDI-TOF/MS結(jié)果總結(jié)性地說明n=5和較高的矢車菊苷配質(zhì)寡聚體(見圖20A和B；和本發(fā)明目的和概述中的公式)強(qiáng)烈地與針對(duì)Hela和SKBR-3癌細(xì)胞系類型的抗腫瘤活性相關(guān)。n=4或更少的寡聚體對(duì)這些模型無效。該五聚體結(jié)構(gòu)明顯具有存在于其中和更高的寡聚體中的提供這種活性的結(jié)構(gòu)單元。另外，觀察到MALDI-TOF/MS數(shù)據(jù)顯示強(qiáng)的Na+,2Na+,K+,2K+,Ca++的M+離子，這證明了其作為陽離子多價(jià)螯合物的用途。實(shí)施例16寡聚體級(jí)分的純化方法A．用半制備反相HPLC進(jìn)行純化將從實(shí)施例14，方法A和B和D獲得的矢車菊苷配質(zhì)進(jìn)一步分離以獲得用于下一步結(jié)構(gòu)鑒定和說明的實(shí)驗(yàn)量的類似寡聚體(如實(shí)施例15,18,19和20)。裝備有可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，具1mL注射孔的Rheodyne7010注射閥的Hewlett Packard 1050 HPLC系統(tǒng)被裝有PharmaciaFRAC-100級(jí)分收集器。在與Phenomenex 10μODS Ultracarb_(60×10mm)保護(hù)柱相連的Phenomenex Ultracarb_10μ ODS柱(250×22.5mm)上進(jìn)行分離。流動(dòng)相組合物為A=水；B=甲醇，在下面線性梯度條件下使用(時(shí)間，％A)；(0,85),(60,50),(90,0)和(110,0)，流速為5mL/分鐘。在規(guī)定的時(shí)間間隔或通過人工級(jí)分收集來收集各峰或選擇的層析區(qū)域用于通過MALDI-TOF/MS和NMR的進(jìn)一步評(píng)價(jià)。注射負(fù)荷變化范圍為25-100mg物質(zhì)。代表性洗脫分布圖示于圖23b。方法B．改進(jìn)的半制備HPLC將從實(shí)施例14，方法A和B和D獲得的矢車菊苷配質(zhì)進(jìn)一步分離以獲得用于下一步結(jié)構(gòu)鑒定和說明的實(shí)驗(yàn)量的類似寡聚體(如實(shí)施例15,18,19和20)。Supelcosil LC-Si 5μ柱(250×10mm)具有Supelcosil LC-Si 5μ(20×2mm)保護(hù)柱。室溫下，以3.0mL/分鐘的流速進(jìn)行分離。流動(dòng)相組合物為A=二氯甲烷；B=甲醇；和C=乙酸∶水(1∶1)；在下面線性梯度條件下使用(時(shí)間，％A,％B)；(0,82,14)；(22,74,21)；(32,74,21)；(60,74,50,4)；(61,82,14)，接著將柱重新平衡7分鐘。注射體積為60μl含12mg富含五聚體的級(jí)分。280nm下用紫外線檢測(cè)成分。代表性洗脫分布圖示于圖23A中。實(shí)施例17五聚體分子模型的建立通過使用Desktop Molecular Modeller,3.0版本，Oxford UniversityPress,1994的分子模型的建立來確定能量最小結(jié)構(gòu)?；诒韮翰杷峤Y(jié)構(gòu)的[EC(4→8)]4-EC(EC=表兒茶酸)五聚體的四個(gè)代表性圖示于圖24A-D中。推測(cè)為螺旋結(jié)構(gòu)。通常，當(dāng)表兒茶酸為第一個(gè)單體時(shí)，則結(jié)合為4→8,β構(gòu)型結(jié)果，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)單體為兒茶酸，則結(jié)合為4→8,α構(gòu)型結(jié)果，并且無論第二個(gè)單體是否為表兒茶酸或兒茶酸(一個(gè)例外是ent-E(4→8)ent-EC)均獲得這些結(jié)果。圖38A-38P顯示優(yōu)選的五聚體，圖39A-39P顯示高至并包括五聚體的立體異構(gòu)體庫，不需過分實(shí)驗(yàn)，從中可制備落在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它化合物。實(shí)施例18矢車菊苷配質(zhì)的NMR鑒定13C NMR光譜被認(rèn)為是一種常用于研究矢車菊苷配質(zhì)的方法，尤其是因?yàn)樗嵬ǔＬ峁┵|(zhì)量良好的圖譜，而質(zhì)子NMR光譜相當(dāng)寬。寡聚體的13C NMR光譜產(chǎn)生有關(guān)A或B環(huán)取代類型，C環(huán)的有關(guān)的立體化學(xué)和一些情況下的黃酮類內(nèi)部連接的位置的信息。盡管如此，1H NMR光譜仍產(chǎn)生有用的信息。
而且，HOHAHA使用脈沖方法將第一個(gè)氫的磁化順序地轉(zhuǎn)移至第二個(gè)以獲得對(duì)應(yīng)于α,β,γ或δ質(zhì)子的交叉峰。COSY是一種2D-Fourier轉(zhuǎn)移NMR方法，其中垂直和水平軸提供1H化學(xué)移動(dòng)和1D光譜；橫切位置提供質(zhì)子之間的相互關(guān)系，從可確定自旋-自旋偶合。HMQC光譜增加了核NMR光譜的敏感性，而非質(zhì)子并且可揭示從第二和第四個(gè)碳至相應(yīng)質(zhì)子的交叉峰。APT為用于確定位于碳位置的氫的數(shù)目的13C方法。位于碳位置的質(zhì)子的偶數(shù)將產(chǎn)生陽性信號(hào)，而位于碳位置的質(zhì)子的奇數(shù)將產(chǎn)生陰性信號(hào)。
因此13CNMR,1H NMR,HOHAHA(同核Hartmann-Hahn)HMQC(異核多量子相干)，COSY(同核相關(guān)光譜學(xué))，APT(附著質(zhì)子試驗(yàn))和XHCORR(HMQC的改進(jìn))光譜學(xué)被用來說明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)。方法A．單體室溫下，用約10mg/mL的樣品濃度在氘化甲醇中獲得所有光譜。使用甲醇作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，在Bruker 500 MHZ NMR上獲得光譜。
圖44A-E代表用來表征表兒茶酸單體的結(jié)構(gòu)的NMR光譜。圖44A表明為平片狀形式的1H和13C的化學(xué)變化。圖44 B-E表明表兒茶酸的1H,APT,XHCORR和COSY譜。
類似地，圖45 A-F代表用來表征兒茶酸單體結(jié)構(gòu)的NMR譜。圖45A表明為平片狀形式的1H和13C的化學(xué)轉(zhuǎn)變。圖44 B-F表明兒茶酸的1H,13C,APT,XHCORR和COSY譜。方法B．二聚休使用丙酮作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，約10mg/mL濃度的樣品，在75％氘化甲醇的D2O溶液中獲得所有光譜。
圖46A-G代表被用來表征B2二聚體結(jié)構(gòu)的光譜。圖46A表明為平片狀形式的1H和13C的化學(xué)轉(zhuǎn)變。術(shù)語T和B代表二聚休的上半部和二聚體的下半部。
圖46B和C分別表明室溫下，在Bruker 500 MHZ NMR上獲得的13C和APT譜。
圖46D-G分別表明-7℃下，在AMZ-360 MHZ NMR上獲得的1H,HMQC,COSY和HOHAHA。使用梯度脈沖獲得COSY譜。
圖47A-G代表被用來表征B5二聚體結(jié)構(gòu)的光譜。圖47A表明為平片狀形式的13C和1H的化學(xué)轉(zhuǎn)變。
圖47B-D分別表明室溫下，在Bruker 500 MHZ NMR上獲得的1H,13C和APT。
圖47E表明室溫下，使用梯度脈沖在AMX-360上獲得的COSY光譜。
圖47F和G表明室溫下，分別在AMX-360 MHZ NMR上獲得的HMQC和HOHAHA。方法C．三聚體-表兒茶酸/兒茶酸-3℃下，在AMX-360 MHZ NMR上，使用丙酮作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，和10mg/mL的適宜樣品濃度在75％氘化丙酮的D2O溶液中獲得所有光譜。
圖48A-D代表被用來表征表兒茶酸/兒茶酸三聚體的結(jié)構(gòu)的光譜。這些圖分別顯示1H,COSY,HMQC和HOHAHA。使用梯度脈沖獲得COSY譜。方法D．三聚體-全是表兒茶酸在AMX-360 MHZ NMR上，使用丙酮作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)和10mg/mL的適宜樣品濃度在70％氘化丙酮的D2O溶液中獲得所有光譜。
圖49 A-D代表被用來表征所有表兒茶酸三聚體的結(jié)構(gòu)的光譜。這些圖分別顯示1H,COSY,HMQC和HOHAHA。使用梯度脈沖獲得COSY光譜。實(shí)施例19矢車菊苷配質(zhì)的硫解在表征矢車菊苷配質(zhì)的努力中，將芐基硫醇(BM)與兒茶酸，表兒茶酸或二聚體B2和B5反應(yīng)。芐基硫醇以及間苯二酚和苯硫酚在醇/乙酸環(huán)境中可用于矢車菊苷配質(zhì)的水解(硫解作用)。將兒茶酸，表兒茶酸或二聚體(B2和B5二聚體的1∶1混合物)(2.5mg)溶于1.5mL乙醇，100μl BM和50μl乙酸中，并將容器(Beckman氨基酸分析容器)抽空，反復(fù)用氮清洗直至最后用氮清洗之后是密封反應(yīng)容器。將反應(yīng)容器置于95℃下的熱裝置中，在30,60,120和240分鐘時(shí)獲得反應(yīng)的等分樣品。分別代表表兒茶酸，兒茶酸和二聚體的各個(gè)等分樣品的相對(duì)熒光示于圖25A-C中。更高寡聚體被類似硫解。實(shí)施例20二聚體的硫解和脫硫作用通過將二聚體(B2或B5；1.0mg)溶解在600μl乙醇，40μl BM和20μl乙酸中，用硫醇將二聚體B2和B5水解。95℃，氮?dú)夥罩?，在Beckman氨基酸分析容器中將混合物加熱4小時(shí)，抽取等分樣品用于反相HPLC分析，并將75μl各種乙醇阮內(nèi)(Raney)鎳和棓酸(10mg/mL)加入2mL小瓶中的剩余反應(yīng)物中。氫氣氛下清洗容器，偶爾搖蕩達(dá)1小時(shí)。將產(chǎn)物經(jīng)0.45μ濾器過濾并用反相HPLC分析。代表性洗脫分布圖示于圖26A和B中。更高寡聚體被類似脫硫。該數(shù)據(jù)表明表兒茶酸或兒茶酸的聚合作用，從而代表制備本發(fā)明化合物的合成途徑。實(shí)施例21在MDA MB 231裸鼠模型中五聚體的體內(nèi)活性MDA-MB-231/LCC6細(xì)胞系。讓細(xì)胞系在改進(jìn)的含10％胎牛血清的基本必需培養(yǎng)基(IMEM)上生長(zhǎng)并37℃下，保持在濕潤(rùn)的，5％CO2氣氛中。
小鼠。從NCI購(gòu)得雌性六至八周齡NCr nu/nu(裸鼠)小鼠并圈養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中且根據(jù)由美國(guó)農(nóng)業(yè)部和美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)鑒定協(xié)會(huì)提出的規(guī)則來飼養(yǎng)。每?jī)商旒懊恐芊Q重患腫瘤的小鼠以確定適宜的藥物劑量。
腫瘤移植。用IMEM將組織培養(yǎng)的MDA-MD-231稀釋至3.3×106細(xì)胞/mL，在小鼠各側(cè)的乳頭2和3之間皮下注射0.15mL(即0.5×106細(xì)胞)。通過乘法計(jì)算腫瘤體積長(zhǎng)度×寬度×高度×0.5。計(jì)算處理組的腫瘤體積的平均值并用學(xué)生實(shí)驗(yàn)來計(jì)算p值。
樣品制備。通過心穿刺獲得血漿樣品并與15-20mM EDTA一起貯存于-70℃以用于血液化學(xué)測(cè)定的目的。在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間未注意到有不同。
前面經(jīng)皮下注射腫瘤細(xì)胞系MDA-MB-231而被500,000細(xì)胞感染的15只裸鼠被隨機(jī)分成每組有5只動(dòng)物的三組，并用下面中的一種經(jīng)腹膜注射來處理(ⅰ)僅含賦形劑(DMSO)的安慰劑；(ⅱ)賦形劑(DMSO)中含2mg如實(shí)施例14方法D中分離的純化的五聚體矢車菊苷配質(zhì)提取物/小鼠；和(ⅲ)在賦形劑(DMSO)中含10mg如實(shí)施例14方法D中分離的純化的五聚體矢車菊苷配質(zhì)提取物/小鼠。
在給藥10mg后，組(ⅲ)小鼠在約48-72小時(shí)之內(nèi)死亡，而組(ⅱ)小鼠顯示正常。組(ⅲ)小鼠的死亡原因不確定；且可不必須歸于給藥本發(fā)明的化合物。然而，10mg被認(rèn)為是毒性的較高限度。
每周重復(fù)對(duì)組(ⅰ)和(ⅱ)的處理，監(jiān)測(cè)每實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)。在處理兩周后，在組(ⅱ)小鼠中未觀察到毒性信號(hào)，并且后來每周以1/2對(duì)數(shù)大小的增量增加對(duì)該組的給藥劑量。下表表示在組(ⅱ)小鼠的處理過程中的給藥劑量
周劑量(mg/小鼠)1 22 23 44 55 56 57 5處理結(jié)果示于圖27A和B及表10中。表10體內(nèi)抗癌結(jié)果



這些結(jié)果表明本發(fā)明的級(jí)分及本發(fā)明的化合物確實(shí)在抗腫瘤組合物中具有用途，且在低和中等劑量時(shí)沒有毒性，在不需過分實(shí)驗(yàn)即可確定的較高劑量時(shí)具有毒性。實(shí)施例22可可提取物的抗微生物活性方法A進(jìn)行研究以評(píng)價(jià)來自可可豆的粗矢車菊苷配質(zhì)提取物的抗在食物酸敗或致病中非常重要的各種微生物的抗微生物活性。在該研究中使用來自實(shí)施例2方法A的可可提取物。用1mL每種細(xì)胞培養(yǎng)物懸液的0.45％鹽溶液(最終群體數(shù)為102-104cfu/mL)接種適宜于各種試驗(yàn)培養(yǎng)物生長(zhǎng)的瓊脂培養(yǎng)基，并倒入培養(yǎng)皿中。用#2木栓穿孔器(5mm直徑)將孔切至硬化的瓊脂中。讓平板置于4℃冰箱中過夜以使提取物擴(kuò)散至瓊脂中，并隨后在對(duì)目的微生物適宜的生長(zhǎng)溫度下保溫。結(jié)果如下抑制的樣品區(qū)(mm)

NI=無抑制作用在使用上述孔擴(kuò)散分析(在方法A中)，用金黃色葡萄球菌作為目的培養(yǎng)物的研究中證明來自可可豆的純化的矢車菊苷配質(zhì)的抗微生物活性。結(jié)果如下可可提取物如實(shí)施例13方法A中的10mg/100μl除去咖啡因的/除去可可堿的丙酮提取物如實(shí)施例14方法D中的10mg/100μl二聚體(99％純度)如實(shí)施例14方法D中的10mg/100μl四聚體(95％純度)如實(shí)施例14方法D中的10mg/100μl六聚體(88％純度)如實(shí)施例14方法D中的10mg/100μl八聚體/九聚體(92％純度)如實(shí)施例14方法D中的10mg/100μl九聚體和更高聚體(87％純度)抑制的樣品區(qū)(mm)0.45％鹽溶液0二聚體 33四聚體 27六聚體 240.45％鹽溶液0八聚體 22九聚體 20除去咖啡因/除去可可堿 26方法B以變化的濃度將如實(shí)施例2方法2的粗矢車菊苷配質(zhì)提取物加入具酚紅(0.08g/L)的TSB(胰胨豆胨培養(yǎng)液)中，將TSB用豬霍亂沙門氏菌或紐波特沙門氏菌(105cfu/mL)接種，并在35℃下保溫18小時(shí)。結(jié)果如下豬霍亂沙門氏菌紐波特沙門氏菌0mg/mL ++50 ++100 ++250 +-500 --750 -其中+=生長(zhǎng)，-=不生長(zhǎng)，從肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)酸由紅變?yōu)辄S的變化而得以證實(shí)。通過從TSB管平板接種至XLD平板上來證實(shí)抑制。
本實(shí)施例證實(shí)本發(fā)明化合物可用于食品制備和保存。
本實(shí)施例進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明化合物可抑制革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌的生長(zhǎng)。從中本發(fā)明化合物可被用于抑制幽門螺桿菌。在導(dǎo)致胃潰瘍和胃腫瘤中已涉及到幽門螺桿菌。因此，本發(fā)明化合物可被用來治療或預(yù)防細(xì)菌起源的這些和其它疾病?？紤]本領(lǐng)域熟知的因素，如疾病，個(gè)體的年齡，體重，性別和通常的健康狀況，不需要過分實(shí)驗(yàn)即可確定適宜的給藥途徑，劑量和制劑。實(shí)施例23提取物的無鹵素分析分離通過流速為1.0mL/分鐘，柱溫為37℃的在100 _ Supelcosil LC-Si上的無鹵素正相色譜部分純化從實(shí)施例2獲得的矢車菊苷配質(zhì)。用下面條件下的線性梯度來輔助分離(時(shí)間，％A,％B)；(0,82,14)；(30,67.6,28.4)；(60,46,50)。流動(dòng)相組合物為A=30/70％二乙基醚/甲苯；B=甲醇；及C=乙酸/水(1∶1)。在280nm處用紫外線檢測(cè)各成分。代表性洗脫分布圖示于圖28。實(shí)施例24用于矢車菊苷配質(zhì)的正相HPLC分離的固定相的孔大小的作用為了改善矢車菊苷配質(zhì)的分離，研究硅固定相的更大的孔大小的使用。在硅-300,5μm,300_(250×2.0mm)或另一種方法，在硅-1000,5μm,1000_(250×2.0mm)上進(jìn)行分離。使用作流動(dòng)相組成的線性梯度為A=二氯甲烷；B=甲醇；及C=乙酸/水(1∶1)。用其中λex=276nm,λem=316nm的熒光，在280nm下用紫外線檢測(cè)器檢測(cè)各成分。流速為1.0mL/分鐘，烘箱溫度為37℃。來自三個(gè)不同柱(100_孔大小，來自實(shí)施例13，方法D)的代表性色譜圖示于圖29。這表明了用于矢車菊苷配質(zhì)分離的有效的孔大小。實(shí)施例25借助于進(jìn)行發(fā)酵獲得所需矢車菊苷配質(zhì)與可可發(fā)酵相關(guān)的一系列微生物菌株的代表選自M&M/Mars可可培養(yǎng)物群。采用下面的分離物醋化醋桿菌ATCC 15973乳酸桿菌(BH 42)Candida cruzii(BA 15)啤酒糖酵母(BA 13)蠟狀芽孢桿菌(BE 35)球形芽孢桿菌(ME 12)將各菌株從貯用培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中。26℃下，將酵母和醋化醋桿菌保溫72小時(shí)，37℃下，將芽孢桿菌和乳酸桿菌保溫48小時(shí)。使用前用5mL磷酸緩沖液收集斜面培養(yǎng)物。
從新鮮莢果收獲可可豆，除去果肉和殼。將豆用過氧化氫(35％)消毒20秒，接著用過氧化氫酶處理直至停止起泡。將豆用無菌水漂洗兩次并重復(fù)該過程。將豆分至兩個(gè)玻璃缸中并根據(jù)下表中詳述的方法處理

將小試規(guī)模的發(fā)酵進(jìn)行兩次。如下所示保溫所有處理物第一天26℃第二天26℃-50℃第三天50℃第四天45℃第五天40℃在研究期間，通過平板計(jì)數(shù)以評(píng)價(jià)微生物菌群及HPLC分析發(fā)酵培養(yǎng)基的微生物代謝物的產(chǎn)生來監(jiān)測(cè)樣品發(fā)酵。處理后，在層流罩超靜臺(tái)下將豆干燥至水活性為0.64，并在66℃烘烤15分鐘。制備樣品以用于矢車菊苷配質(zhì)分析。將每次處理的三顆豆研磨并用己烷脫脂，接著用丙酮∶水∶乙酸(70∶29.5∶0.5％)提取。將丙酮溶液提取物過濾至小瓶中，并用如實(shí)施例13，方法B中的正丁HPLC定量多酚水平。將剩余的豆研磨并試驗(yàn)。樣品桌面發(fā)酵法的培養(yǎng)和分析分布圖示于圖30A-C。經(jīng)過各種發(fā)酵處理的可可豆的矢車菊苷配質(zhì)分布圖示于圖30D。
本實(shí)施例證實(shí)本發(fā)明不需局限于任何特定的可可屬典型種，并且通過發(fā)酵，由特定的可可屬(Theobroma)或可可屬(Herrania)種或其種間或種內(nèi)種的特異性雜交種產(chǎn)生的矢車菊苷配質(zhì)的水平可被調(diào)節(jié)，例如增加。
下表顯示在為可可屬(Theobroma)和其種間或種內(nèi)種的特異性雜交種的代表的種中測(cè)得的矢車菊苷配質(zhì)水平。如實(shí)施例1和2(方法1和2)制備樣品，并如實(shí)施例13，方法B進(jìn)行分析。該數(shù)據(jù)說明包含本發(fā)明化合物的提取物在可可(Theobroma)和可可(Herrania)的種，以及其種內(nèi)和種間種的特異性雜交性中被發(fā)現(xiàn)。
在脫脂粉末中可可和Herrania種的矢車菊苷配質(zhì)水平ppm(μg/g)

ND=未檢測(cè)樣品指定CPATU tr=痕量(＜50μg/g)*樣品指定ERJON實(shí)施例26矢車菊苷配質(zhì)對(duì)NO的作用方法A本研究的目的是建立矢車菊苷配質(zhì)(如實(shí)施例14，方法D)與NO之間的關(guān)系，其中NO被已知誘導(dǎo)大腦血管擴(kuò)張。評(píng)價(jià)濃度范圍為100μg/mL-0.1μg/mL的單體和較高寡聚體對(duì)來自HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)的硝酸鹽(NO的分解代謝物)的產(chǎn)生的影響。在存在或不存在各種矢車菊苷配質(zhì)時(shí)研究HUVEC(來自Clnetics)24或48小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，收集上清并用量熱分析確定硝酸鹽的含量。在各單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，在存在或不存在矢車菊苷配質(zhì)時(shí)，將HUVEC與乙酰膽堿一起保溫24-48小時(shí)，其中乙酰膽堿被已知誘導(dǎo)NO產(chǎn)生。在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，收集上清并用量熱分析確定硝酸鹽的含量。通過加入為NO合成酶特異性阻斷劑的硝基精氨酸或(1)-N-甲基精氨酸來確認(rèn)NO的作用。方法B．苯福林誘導(dǎo)的收縮的大鼠動(dòng)脈的血管松馳100μg/mL-0.1μg/mL各種矢車菊苷配質(zhì)對(duì)大鼠動(dòng)脈的作用是研究苯福林誘導(dǎo)的收縮的大鼠動(dòng)脈血管松馳的目的。在存在或不存在矢車菊苷配質(zhì)(如實(shí)施例14，方法D)時(shí)保溫分離的大鼠動(dòng)脈，并用肉眼觀察來評(píng)價(jià)肌張力的改變。確定大鼠動(dòng)脈的收縮或舒張。接著，使用其它器官，在加入腎上腺素時(shí)誘導(dǎo)分離的大鼠動(dòng)脈的預(yù)收縮。一旦收縮穩(wěn)定，加入矢車菊苷配質(zhì)并確定大鼠動(dòng)脈的收縮或舒張。通過加入硝基精氨酸或(1)-N-甲基精氨酸確認(rèn)NO的作用。如苯福林預(yù)收縮大鼠主動(dòng)脈所完成的，乙酰膽堿誘導(dǎo)的NO的釋放示于圖31中。方法C．大鼠低血壓的誘導(dǎo)本方法針對(duì)各種矢車菊苷配質(zhì)(如實(shí)施例14，方法D)對(duì)血壓的作用。給大鼠裝上血壓計(jì)以監(jiān)測(cè)收縮和舒張血壓。靜脈內(nèi)注射各種矢車菊苷配質(zhì)(劑量范圍=100～0.1μg/kg)，確定血壓的改變。此外，確定各種矢車菊苷配質(zhì)對(duì)由腎上腺素引起的血壓改變的影響。通過加入硝基精氨酸或(1)-N-甲基精氨酸確認(rèn)NO的作用。
這些研究與下一個(gè)實(shí)施例一起說明可用于調(diào)節(jié)血管擴(kuò)張，并且可進(jìn)一步用于調(diào)節(jié)血壓或改善冠狀動(dòng)脈狀況，和周期性偏頭痛狀況。實(shí)施例27可可多酚對(duì)飽感的影響使用血液葡萄糖水平作為體內(nèi)發(fā)生用于調(diào)節(jié)食欲和飽感的信號(hào)事件的指示劑，選用年齡為48歲的健康男性成年志愿者進(jìn)行一系列簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)以確定可可多酚是否調(diào)節(jié)葡萄糖水平。根據(jù)由Clapperton等(1992)描述的方法從巴西可可豆部分純化可可多酚。該物質(zhì)不包含咖啡困或可可堿。在喝入10流體盎司含和不含75mg可可多酚的Dexicola 75(無咖啡因)葡萄糖耐量試驗(yàn)飲料(Curtin Matheson 091-421)后，在定時(shí)的基礎(chǔ)上分析加快的血液葡萄糖水平。該多酚水平代表試驗(yàn)飲料的總葡萄糖的0.1％并反映出將以標(biāo)準(zhǔn)100g巧克力棒形式存在的大約量。使用Accu-Chek Ⅲ血液葡萄糖監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(Boehringer Mannheim公司)測(cè)定血液葡萄糖水平。在喝入試驗(yàn)飲料，以及在以下面規(guī)定的時(shí)間間隔喝入試驗(yàn)飲料之后測(cè)定血液葡萄糖水平15,30,45,60,75,90,120和180分鐘。在開始各葡萄糖耐量試驗(yàn)之前，測(cè)定高和低葡萄糖水平對(duì)照。將各葡萄糖耐量試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行兩次。對(duì)包含溶解在10流體盎司蒸餾水(無葡萄糖)中的75mg可可多酚的對(duì)照試驗(yàn)溶液也進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
下面表11列出了由本研究中進(jìn)行的各葡萄糖耐量試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)和對(duì)照值。圖32代表具有在三小時(shí)時(shí)間過程中獲得的血液葡萄糖水平的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。很容易看出在喝入包含可可多酚的試驗(yàn)混合物之后獲得的血糖水平有顯著增加。兩個(gè)主要葡萄糖耐量分布圖之間的差別不能由在喝入僅有可可多酚的溶液后獲得的分布圖來解決。向葡萄糖試驗(yàn)飲料中加入可可多酚顯著提高了葡萄糖耐量分布圖。盡管其典型的葡萄糖耐量分布圖被認(rèn)為是正常的(Davidson,I.等，編者Todd-借助于實(shí)驗(yàn)室方法的Sandford臨床診斷第14版；W.B.Saunders Co.；費(fèi)城，PA 1969 Ch.10,pp.550-9)，但血液葡萄糖水平的這種升高是在被認(rèn)為是中等糖尿病的范圍中。這提示由于本發(fā)明的化合物，另外的葡萄糖的差異被從糖原貯存部位釋放至血液中。因此，本發(fā)明可用來在存在糖時(shí)調(diào)節(jié)血液葡萄糖水平。
表11．葡萄糖耐量試驗(yàn)數(shù)據(jù)和對(duì)照結(jié)果

>a=預(yù)期范圍253-373mg/dLb=預(yù)期范圍50-80mg/dL個(gè)體在攝入本發(fā)明化合物后還經(jīng)歷了面潮紅(紅斑)和見光頭痛，這說明調(diào)節(jié)血管舒張。
表12和13中存在的數(shù)據(jù)說明這樣的事實(shí)，即從屬于可可原材料和商品巧克力且本發(fā)明化合物包含在其中的本發(fā)明的提取物可被用作藥物，獸醫(yī)和食品科學(xué)制品及運(yùn)用物的賦形劑。
表13商品巧克力中的矢車菊苷配質(zhì)水平μg/g

ND*=未檢測(cè)出表14在可可原料中的矢車菊苷配質(zhì)水平μg/g

ND*=未檢測(cè)出實(shí)施例28矢車菊苷配質(zhì)對(duì)環(huán)加氧酶1和2的影響通過室溫下，在存在各種濃度的包含單體至十聚體及矢車菊苷配質(zhì)混合物的矢車菊苷配質(zhì)溶液時(shí)，將來自公羊精液小泡和羊胎盤的酶分別與花生四烯酸(5μM)一起保溫10分鐘來評(píng)價(jià)矢車菊苷配質(zhì)對(duì)環(huán)加氧酶1和2(COX1/COX2)活性的影響。使用來自Interchim的PGF2 ELA盒(法國(guó))評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)換。吲哚美辛被用作參考化合物。結(jié)果提供在下表中，其中如實(shí)施例14，方法D中，IC50值以μM的單位來表示(除開S11，它代表從實(shí)施例13，方法A制備的矢車菊苷配質(zhì)混合物，且其中樣品S1-S10依次代表矢車菊苷配質(zhì)寡聚體(單體至十聚體)，且IC50以mg/mL單位來表示)。

(*)除開樣品11為mg/mL，其余以μM表示。
抑制研究的結(jié)果提供在圖33A和B中，其中它顯示吲哚美辛對(duì)COX1和COX2活性的影響。圖34A和B表明矢車菊苷配質(zhì)的聚合度與對(duì)COX1和COX2的IC50之間的相互關(guān)系；圖35表明對(duì)COX1和COX2的IC50值間的相互關(guān)系。并且圖36A-Y表明各樣品(S1-S11)對(duì)COX1和COX2的IC50值。
這些結(jié)果說明本發(fā)明化合物具有鎮(zhèn)痛，抗凝血?jiǎng)翱寡装Y用途。而且，COX2已與結(jié)腸癌有關(guān)。本發(fā)明化合物對(duì)COX2活性的抑制說明一種可能的機(jī)理，通過它本發(fā)明化合物具有針對(duì)結(jié)腸癌的抗腫瘤活性。
COX1和COX2還參與前列腺素的合成。因此，本實(shí)施例的結(jié)果還說明可調(diào)節(jié)腎功能，免疫應(yīng)答，發(fā)燒，疼痛，有裂分裂，偏程性細(xì)胞死亡，前列腺素的合成，潰瘍形成(如胃潰瘍)以及生殖。注意到腎功能的調(diào)節(jié)可影響血壓；再一次意味著本發(fā)明化合物參與調(diào)節(jié)血壓，血管舒張和冠狀血管(如調(diào)節(jié)血管緊張肽，緩激肽)。
參考Seibert等，PNAS USA 91:12013-12017(12,1994),Mitchell等，PNAS USA 90:11693-11697(12,1994),Dewitt等，細(xì)胞83:345-348(113,1995),Langenbach等，細(xì)胞83:483-92(113,1995)和Sujii等，細(xì)胞83:493-501(113,1995),Morham等，細(xì)胞83:473-82(113,1995)。
進(jìn)一步參考實(shí)施例9,26和27。在實(shí)施例9中，顯示了本發(fā)明化合物的抗氧化劑活性。在實(shí)施例26中，證實(shí)了對(duì)NO的影響。且在實(shí)施例27中提供了面部血管舒張的證據(jù)。從本實(shí)施例的結(jié)果，結(jié)合實(shí)施例9，26和27，本發(fā)明化合物可調(diào)節(jié)驅(qū)動(dòng)生理作用的自由基機(jī)理。類似地，本發(fā)明可調(diào)節(jié)從生化上直接針對(duì)白三烯合成的脂肪氧化酶介導(dǎo)的自由基類型的反應(yīng)，從而影響后來的生理活動(dòng)(如炎癥，免疫應(yīng)答，冠狀血管狀況，致癌機(jī)理，發(fā)燒，疼痛，潰瘍)。
因此，除開具有鎮(zhèn)痛性質(zhì)外，當(dāng)與其它止痛藥一起服用時(shí)，本發(fā)明化合物還可具有協(xié)同作用。同樣，除開具有抗腫瘤性質(zhì)外，當(dāng)與其它抗腫瘤劑一起服用時(shí)，本發(fā)明化合物還可具有協(xié)同作用。實(shí)施例29圓二色性/矢車菊苷配質(zhì)的研究進(jìn)行CD研究努力解釋如在實(shí)施例14方法D中的純化的矢車菊苷配質(zhì)的結(jié)構(gòu)。使用CD光譜軟件AVIV 60DS V4.1f，在25℃下收集光譜。
在300nm-185nm，以1.50nm帶寬，每次1.00nm掃描樣品。代表性CD光譜示于圖43A-G，它們顯示二聚體至八聚體的CD光譜。
這些結(jié)果說明了本發(fā)明化合物的螺旋結(jié)構(gòu)。實(shí)施例30可可矢車菊苷配質(zhì)對(duì)幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用進(jìn)行研究以評(píng)價(jià)矢車菊苷配質(zhì)寡聚體對(duì)幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌的抗微生物活性。如實(shí)施例13，方法A所描述地制備五聚體富集物并如實(shí)施例14，方法C所描述地進(jìn)行分析，其中89％為五聚體，11％為更高的寡聚體(n為6-12)。如實(shí)施例14，方法D所描述地制備純化的五聚體(96.3％)。
幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得。對(duì)于幽門螺桿菌，將管形瓶用0.5mL胰凍豆胨培養(yǎng)液重新水合，并將懸液轉(zhuǎn)移至含5％去纖維形成的羊血的新鮮TSA斜面上。37℃下，在厭氣瓶中(5-10％二氧化碳；CampyPakPlus,BBL),在微需氧條件下將斜面保溫3-5天。當(dāng)在斜面底部的培養(yǎng)液層中形成良好的生長(zhǎng)時(shí)，將培養(yǎng)液用來接種含羊血的另外的TSA斜面。由于存活率隨連續(xù)傳代培養(yǎng)而降低，因此，匯集從斜面收集的培養(yǎng)液并貯存于-80℃。直接使用來自凍冷管形瓶的用于分析的培養(yǎng)物。將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)在TSA斜面上并在使用前24小時(shí)時(shí)轉(zhuǎn)移至新鮮斜面上。
制備各種培養(yǎng)物的細(xì)胞懸液(幽門螺桿菌，108-109cfu/mL；金黃色葡萄球菌106-107cfu/mL)，并將0.5mL涂布到含5％羊血的TSA平板上。將標(biāo)準(zhǔn)分析盤(Difco)浸入過濾滅菌的五聚體的一系列稀釋物中(23mg/mL至無菌水)。將試驗(yàn)盤和空白對(duì)照盤(無菌水)放在被接種的平板上。含80μg甲硝唑(對(duì)幽門螺桿菌物有抑制性)或30μg萬萬古霉素(對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制性)(BBL Sensidiscs)的對(duì)照盤也放在平板的適宜部位。在微有氧條件下保溫幽門螺桿菌接種的平板。將金黃色葡萄球菌進(jìn)行有氧保溫。生長(zhǎng)后測(cè)定抑制區(qū)。
表14．五聚體對(duì)幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌的生物分析

NI=沒有抑制實(shí)施例31豚鼠中的NO依賴性低血壓研究五種可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分對(duì)豚鼠血壓的影響。簡(jiǎn)而言之，注射40mg/kg戊巴比妥鈉麻醉豚鼠(約400g體重；雄性和雌性)。頸動(dòng)脈插管以監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓。經(jīng)頸靜脈靜脈注射五種可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分(劑量范圍為0.1mg/kg-100mg/kg)。在多道記錄儀上記錄血壓的變化。在這些實(shí)驗(yàn)中，通過在給藥可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分之前10分鐘給藥L-N-甲基精氨酸(1mg/kg)來確定NO的作用。
根據(jù)被本文引作參考的美國(guó)專利5,554,645中描述的方法制備和分析可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分。組分A代表由單體-四聚體組成的制備HPLC級(jí)分。HPLC分析揭示出下面的組成單體 47.2％二聚體23.7三聚體18.7四聚體10.3級(jí)分B代表由五聚體-十聚體組成的制備HPLC級(jí)分。HPLC分析揭示出下面的組成五聚體64.3％六聚體21.4七聚體7.4八聚體1.9九聚體0.9十聚體0.2級(jí)分C代表用于制備級(jí)分A和B(上面)的富集的可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分。HPLC分析揭示出下面的組成單體34.3％二聚體 17.6三聚體 16.2四聚體 12.6五聚體 8.5六聚體 5.2七聚體 3.1八聚體 1.4九聚體 0.7十聚體 0.3級(jí)分D代表由牛奶巧克力制備的矢車菊苷配質(zhì)提取物。HPLC分析揭示出類似于在表12中對(duì)于牌號(hào)8所列的組成。另外，存在10％的咖啡因和6.3％的可可堿。級(jí)分E代表由用堿化水溶液制備的黑巧克力而制得的矢車菊苷配質(zhì)提取物。HPLC分析揭示出類似于在表12中對(duì)于牌號(hào)12所列的組成。另外，存在16.0％的咖啡因和5.8％的可可堿。
在三個(gè)單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，研究了給藥10mg/kg可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分對(duì)麻醉的豚鼠的動(dòng)脈血壓的影響。靜脈注射時(shí)，矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A和E導(dǎo)致血壓降低約20％。這種降低僅僅在一定程度上不同于從溶劑(DMSO)對(duì)照(15±5％,n=5)所獲得的。相反，矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分B,C和D(10mg/kg)誘導(dǎo)血壓顯著降低，對(duì)于級(jí)分C高達(dá)50-60％。在這些實(shí)驗(yàn)中，低血壓效果的順序如下C＞B＞D＞＞A=E。
在注射矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分后產(chǎn)生的血壓的典型記錄對(duì)于級(jí)分提供在圖50A，對(duì)于級(jí)分C在圖50B。圖51說明這些級(jí)分對(duì)血壓的比較效果。
使用L-N-甲基精氨酸(LNMMA)分析NO對(duì)由給藥級(jí)分C誘導(dǎo)的豚鼠低血壓的可能的作用。該藥劑通過抑制NO合成酶而抑制NO的形成。在注射可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分之前10分鐘以1mg/kg的劑量給藥L-NMMA。如圖52中所示，用L-NMMA處理動(dòng)物完全阻斷了由矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分C引發(fā)的低血壓。的確，在用該抑制劑處理之后，由級(jí)分C產(chǎn)生的血壓的變化類似于僅使用溶劑觀察到的那些。實(shí)施例32可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的NO的產(chǎn)生的影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)從Clonetics獲得，并根據(jù)生產(chǎn)商的說明進(jìn)行培養(yǎng)物的培養(yǎng)。將HUVEC細(xì)胞以5,000細(xì)胞/cm2接種在12孔平板中(Falcon)。在相同條件下的第三代之后，讓它們達(dá)到鋪滿。用包含規(guī)定濃度的緩激肽(25,50和100nM)或如實(shí)施例31所描述的可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A-E(100μg/mL)的新鮮培養(yǎng)基更新上清。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收集無細(xì)胞上清并在如下所描述地評(píng)價(jià)NO含量之前冷凍貯藏。在選擇的實(shí)驗(yàn)中，加入NO合成酶(NOS)拮抗劑Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,10μM)以評(píng)價(jià)在所觀察的NO產(chǎn)生中的NOS的參與。
通過用Griess反應(yīng)測(cè)定培養(yǎng)物上清中的亞硝酸鹽濃度來測(cè)定HUVEC NO的產(chǎn)生。Griess試劑為1％磺胺，0.1％N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽。簡(jiǎn)而言之，反復(fù)四次從各種上清取出50μl等分樣品并與150μl Griess試劑一起保溫。540nm下，在多重掃描儀(multiscan)(Labsystems Multiskans MCC/340)中測(cè)定吸光度。采用規(guī)定濃度的亞硝酸鈉以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將無細(xì)胞培養(yǎng)基(空白)的吸光度從用包含細(xì)胞的上清獲得的值中減去。
圖53說明緩激肽對(duì)HUVEC的NO產(chǎn)生的影響，其中觀察到劑量依賴性NO的釋放。抑制劑L-NAME完全抑制緩激肽誘導(dǎo)的NO的釋放。
圖54說明可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分對(duì)HUVEC細(xì)胞的NO產(chǎn)生的影響。級(jí)分B,C和D誘導(dǎo)HUVEC的中等但是顯著量的NO的產(chǎn)生。如通過亞硝酸鹽的產(chǎn)生所評(píng)價(jià)的，級(jí)分C是誘導(dǎo)NO形成的最有效的級(jí)分，而級(jí)分E幾乎是無效的。在存在L-NAME時(shí)，級(jí)分C對(duì)NO產(chǎn)生的影響被極劇降低。有趣的是，級(jí)分B,C和D比級(jí)分A和E包含更大量的矢車菊苷配質(zhì)寡聚體。級(jí)分D和E之間明顯的不同是E從其中采用堿化可可溶液作為巧克力制劑的黑巧克力制備而來。堿化導(dǎo)致迅速減少這些化合物水平的堿催化的矢車菊苷配質(zhì)的聚合作用。在這些類型的巧克力中發(fā)現(xiàn)的矢車菊苷配質(zhì)水平的分析比較示于表12中，其中牌號(hào)12為用堿化可可溶液制備的黑巧克力，牌號(hào)11為典型的牛奶巧克力。因此，從牛奶巧克力獲得的抽取物包含高比例的能誘導(dǎo)NO的矢車菊苷配質(zhì)寡聚體。向級(jí)分C樣品中加入NO抑制劑L-NMMA明顯導(dǎo)致NO的抑制。從矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分獲得的結(jié)果與用緩激肽誘導(dǎo)的NO實(shí)驗(yàn)獲得的那些一致(參見圖53)。
如在HUVEC結(jié)果的情況下，可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分C在豚鼠中產(chǎn)生主要的低血壓效果，而級(jí)分A和E最不有效。而且，高分子量矢車菊苷寡聚體的存在與NO產(chǎn)生的調(diào)節(jié)有關(guān)。實(shí)施例33可可矢車菊苷配質(zhì)對(duì)巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響室溫下，新鮮的加入肝素的人血(70mL)中被加入等體積的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。使用3mL聚蔗糖-3,5-二乙酰胺基-2,4,6-三碘苯甲酸鈉對(duì)10mL血液-PBS溶液的比例將聚蔗糖-3,5-二乙酰胺基-2,4,6-三碘苯甲酸鈉溶液層壓在血液-PBS混合物下，18-20℃下，以2,000rpm將試管離心30分鐘。棄去包含血漿和血小板的上層。將單核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中并在Hanks平衡的鹽溶液中將細(xì)胞洗滌兩次。將單核細(xì)胞重新懸浮在補(bǔ)充有10％胎牛血清的完全RPMI 1640中，計(jì)數(shù)并用臺(tái)盼藍(lán)排阻法測(cè)定存活率。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在補(bǔ)充有20％胎牛血清的完全RPMI 1640中至最終濃度為1×106細(xì)胞/mL。將細(xì)胞懸浮液的等分樣品平板接種至96孔培養(yǎng)平板中，用補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI 1640漂洗3次，棄去非貼壁細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)。
在存在或不存在實(shí)施例31中描述的五種矢車菊苷配質(zhì)時(shí)，將這些細(xì)胞保溫48小時(shí)。在保溫期末期，收集培養(yǎng)基，離心并將無細(xì)胞上清冷凍貯藏以用于亞硝酸鹽分析測(cè)定。
通過用Greiss反應(yīng)測(cè)定亞硝酸鹽濃度來確定巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生。Greiss試劑為1％磺胺，0.1％N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽。簡(jiǎn)而言之，重復(fù)四次從上清取出50μl等分樣品并與150μl Greiss試劑一起保溫。540nm下，在多重掃描儀(Labsystems Multiskans MCC/340)中測(cè)定吸光度。采用規(guī)定濃度的亞硝酸鈉以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將無細(xì)胞培養(yǎng)基(空白)的吸光度從用包含細(xì)胞的上清獲得的值中減去。
在一個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，在存在5U/mL γ-干擾素時(shí)，將巨噬細(xì)胞接觸抗原12小時(shí)，接著在存在或不存在100μg/mL五種矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分時(shí)，用10μg/mL LPS再刺激36小時(shí)。
圖55說明僅100μg/mL的矢車菊苷配質(zhì)C可誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的NO的產(chǎn)生。未能檢測(cè)這些細(xì)胞的基礎(chǔ)NO產(chǎn)生，在以100μg/mL采用的任何可可矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分中未能檢測(cè)到亞硝酸鹽。圖56說明矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分A和D增加接觸過γ-干擾素抗原的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的LPS-誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生。由于在不存在矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分時(shí)培養(yǎng)的LPS-刺激的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞僅產(chǎn)生4μmol/105細(xì)胞/48小時(shí)，因此矢車菊苷配質(zhì)級(jí)分C在一定程度上是有效的。僅僅γ-干擾素在誘導(dǎo)NO中是無效的。
總之，這些結(jié)果證明以特定濃度使用的本發(fā)明化合物的混合物能誘導(dǎo)獨(dú)立和依賴于LPS或細(xì)胞因子刺激的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)生。
從前面來看，顯然提取物和可可多酚，尤其是本發(fā)明化合物以及本發(fā)明的組合物，方法和試劑盒具有明顯和許多用途。
通過本文體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)很清楚地證明了抗腫瘤用途，并且表明本發(fā)明化合物可被用來代替或與常規(guī)抗腫瘤劑一起結(jié)合使用。
本發(fā)明具有如BHT和BHA的抗氧劑活性，以及氧化穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明可被用來代替或在BHA和BHT的已知用途中與BHT或BHA結(jié)合使用，例如抗氧化劑，如抗氧化劑，食品添加劑。
本發(fā)明還可被采用來代替或在其目前已知的用途中與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ-抑制劑一起結(jié)合使用。
本發(fā)明化合物可被用于食品防腐或制備，以及預(yù)防或治療細(xì)菌起源的疾病。簡(jiǎn)單地說本發(fā)明化合物可被用作抗微生物劑。
本發(fā)明化合物還可被用作環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶，NO或NO-合酶，或血液或體內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)劑，從而可用于治療或預(yù)防或調(diào)節(jié)疼痛，發(fā)燒，炎癥性冠狀動(dòng)脈疾病，潰瘍，致癌機(jī)理，血管擴(kuò)張，以及鎮(zhèn)痛，抗凝血抗炎癥以及免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。
而且，本發(fā)明包括化合物或提取物作藥物制劑的賦形劑的用途。因此，具有許多由本發(fā)明預(yù)見的組合物和方法。例如，抗氧化劑或防腐組合物，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ-抑制組合物，用于保存食物或任何所需物質(zhì)例如免于氧化的方法，以及用于抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的方法。組合物可包含本發(fā)明化合物。方法可包括將食物，物質(zhì)或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ與各組合物或與本發(fā)明化合物接觸。從前面清楚可見本發(fā)明其它組合物，方法和具體實(shí)例。
在這方面，已提到本發(fā)明來自可食用來源，且體外活性可以證明至少一些體內(nèi)活性；從本文的體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)出發(fā)，不需過分實(shí)驗(yàn)即可獲得劑量，給藥途徑和制劑。實(shí)施例34．可可矢車菊苷配質(zhì)的膠束電動(dòng)毛細(xì)管層析使用膠囊電動(dòng)毛細(xì)管層析(MECC)分離矢車菊苷配質(zhì)寡聚體開發(fā)出了一種快速法。該方法是由Delgado等，1994報(bào)導(dǎo)的方法的改進(jìn)。MECC法僅需要12分鐘即可實(shí)現(xiàn)用70分鐘正相HPLC分析獲得的相同的分離。圖57代表由實(shí)施例2獲得的可可矢車菊苷配質(zhì)的MECC分離。
MECC條件用實(shí)施例2中描述的方法制備可可矢車菊苷配質(zhì)提取物并以1mg/mL的濃度溶解在由200mM硼酸，50mM十二烷基硫酸鈉(電泳法)及NaOH組成的MECC緩沖液中以將pH調(diào)至8.5。
將樣品通過0.45μm濾器，在下面條件下，使用Hewlett PackardHP-3D CZE系統(tǒng)進(jìn)行電泳入口緩沖液如上所述的Run緩沖液出口緩沖液如上所述的Run緩沖液毛細(xì)管50cm×75μm內(nèi)徑未涂覆的熔融硅檢測(cè)200nm，用二極管系統(tǒng)檢測(cè)器注射50m巴持續(xù)3秒(150m巴秒)電壓6瓦電流系統(tǒng)限制(＜300μA)溫度25℃毛細(xì)管條件每次試驗(yàn)之前及之后用試驗(yàn)緩沖液沖洗5分鐘。
通過模仿改變溫度，壓力及電壓參數(shù)，以及包括試驗(yàn)緩沖液中的有機(jī)調(diào)節(jié)劑及手性選擇劑可改進(jìn)該方法。實(shí)施例35．MALDI-與金屬鹽溶液混合的矢車菊苷配質(zhì)寡聚體的TOF/MS分析在與各種金屬鹽溶液混合的三聚體中進(jìn)行一系列MALDI-TOF/MS分析以確定寡聚體的陽離子加合物是否可被檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)的重要性是提供矢車菊苷配質(zhì)寡聚體通過多價(jià)螯合或運(yùn)輸對(duì)生理過程和疾病非常重要的陽離子在體外和體內(nèi)發(fā)揮生理作用的證據(jù)。
采用的方法如實(shí)施例15中所述。簡(jiǎn)而言之，將2μl 10mM的硫酸鋅二水合物，氯化鈣，硫酸鎂，氯化亞鐵六水合物，硫酸亞鐵七水合物以及硫酸銅溶液分別與4μl如實(shí)施例14所述純化至表觀均一的三聚體(10mg/mL)混合，并加入44μl DHB。
結(jié)果(圖58A-F)表明銅和鐵(鐵和亞鐵)的[金屬-三聚體+H]+離子，其m/z值等于理論計(jì)算質(zhì)量的±1amu標(biāo)準(zhǔn)偏差值。鈣和鎂的[金屬-三聚體+H]+的質(zhì)量不能明確地從鈉和鉀的[金屬-三聚體+H]+的質(zhì)量中消除，其m/z值在±1amu標(biāo)準(zhǔn)偏差值中。未能檢測(cè)到[Zn+2-三聚體+H]+離子。由于一些陽離子為多價(jià)的，因此多金屬-寡聚體配體種類和/或金屬-多寡聚體種類的可能性是可能的。然而，篩選為其預(yù)計(jì)質(zhì)量的這些加合物證明是不成功的。
考慮一些因素，如氧化狀態(tài)以及討論的離子在元素周期表中的相對(duì)位置，上面所示的對(duì)于銅，鐵，鈣，鎂和鋅的結(jié)果可被用作用于后面分析其它金屬離子和本發(fā)明化合物之間的反應(yīng)的常規(guī)技術(shù)。實(shí)施例36．高分子量矢車菊苷配質(zhì)寡聚體的MALDI-TOF/MS分析在與如實(shí)施例3，方法A中制備的高分子量矢車菊苷配質(zhì)寡聚體相關(guān)的GPC洗脫物中進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)。目的是確定n＞12的矢車菊苷配質(zhì)寡聚體是否存在。如果存在，這些寡聚體代替本發(fā)明另外的化合物。調(diào)整現(xiàn)有的分離方法，本發(fā)明中包含的分離和純化可被用來獲得用于后面體外和體內(nèi)評(píng)價(jià)抗癌，抗腫瘤或抗瘤活性，抗氧化劑活性的這些寡聚體，抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，抑制DNA的氧化損傷，并具有抗微生物，NO或NO-合成酶，編程性細(xì)胞死亡，血小板凝聚，和血液或體內(nèi)葡萄糖調(diào)節(jié)活性，以及作為非類固醇抗炎劑的功效。
圖59代表上述GPC洗脫樣品的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。表征以四聚體至八聚體為代表的矢車菊苷配質(zhì)寡聚體的[M+Na]+和/或[M+K]+和/或[M+2Na]+離子是清楚易見的。
認(rèn)識(shí)到酸和熱處理將導(dǎo)致矢車菊苷配質(zhì)寡聚體的水解。因此，本發(fā)明包括作為制備較低分子量的矢車菊苷配質(zhì)寡聚體(如當(dāng)n為2至12)方法的高分子量矢車菊苷配質(zhì)寡聚體的受控制的水解。實(shí)施例37．矢車菊苷配質(zhì)寡聚體與犬類和貓類細(xì)胞系的劑量應(yīng)答關(guān)系評(píng)價(jià)矢車菊苷配質(zhì)寡聚體對(duì)幾種犬類和貓類細(xì)胞系的劑量應(yīng)答作用，其中所述細(xì)胞系從Waltham Center for Pet Nutrition,Walthamon-the-Wolds,Melton Mowbray,Leicestershire,U.K.獲得。這些細(xì)胞系為產(chǎn)生在實(shí)施例8，方法A中描述的條件下培養(yǎng)的白血病病毒的狗正常腎GH細(xì)胞系；狗正常腎MDCK細(xì)胞系；貓正常腎CRFK細(xì)胞系；及貓淋巴母細(xì)胞FeA細(xì)胞系。
如實(shí)施例14，方法D中描述地純化單體和其中n為2-10的矢車菊苷配質(zhì)寡聚體。還通過如實(shí)施例14，方法C所描述的分析正相HPLC檢測(cè)寡聚體，其中獲得下面結(jié)果。
矢車菊苷配質(zhì)HPLC純度％單體 95.4二聚體 98.0三聚體 92.6四聚體 92.6五聚體 93.2六聚體 89.2(含4.4％五聚體)七聚體 78.8(含18.0％六聚體)八聚體 76.3(含16.4％七聚體)九聚體 60.3(含27.6％八聚體)十聚體 39.8(含22.2％九聚體，16.5％八聚體和13.6％七聚體)在寡聚體純度小于90％的那些情況下，本發(fā)明包含的方法可用于它們的純化。
以10μg/mL,50μg/mL和100μg/mL對(duì)各種細(xì)胞系給藥單體和各種矢車菊苷配質(zhì)寡聚體。結(jié)果示于圖60-63中。如圖中所示，各種寡聚體的高劑量(100μg/mL)的給藥對(duì)貓F(tuán)eA淋巴母細(xì)胞和貓正常腎CRFK細(xì)胞系產(chǎn)生類似的抑制效果。在這些情況下，用四聚體出現(xiàn)細(xì)胞毒性，增加更高的寡聚體產(chǎn)生增加更大的細(xì)胞毒性效果。相反，對(duì)狗GH和MDCK正常腎細(xì)胞系的各寡聚體的高劑量(100μg/mL)給藥需要一個(gè)更高的寡聚體以啟動(dòng)細(xì)胞毒性的出現(xiàn)。對(duì)于狗GH正常腎細(xì)胞系，用五聚體出現(xiàn)細(xì)胞毒性。對(duì)于狗MDCK正常腎細(xì)胞系，用六聚體出現(xiàn)細(xì)胞毒性。在這兩種情況下，給藥較高寡聚體產(chǎn)生增加程度的細(xì)胞毒性。實(shí)施例38．片劑使用通過被本文引作參考的于1996年9月6日提出的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)08/709,406中描述的方法獲得的可可固體來制備片劑。簡(jiǎn)而言之，通過對(duì)它們?cè)趥鹘y(tǒng)加工的可可中發(fā)現(xiàn)的水平而言的增加本發(fā)明化合物天然存在的方法來制備該可食用材料，這樣在未加工的豆中發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明化合物的起始量與加工后獲得的量的比例小于或等于2。為了簡(jiǎn)單起見，該可可固體材料在本文稱為CP-可可固體。例如為分離和/或純化形式的本發(fā)明的化合物或多種化合物可被以如本實(shí)施例中所描述的片劑使用，以代替或與CP-可可固體一起結(jié)合使用。
片劑制劑包含下面成分(百分?jǐn)?shù)以重量百分?jǐn)?shù)表示)CP-可可固體 24.0％4倍天然香草提取物(Bush Boake Allen) 1.5％硬脂酸鎂(干燥潤(rùn)滑劑)(AerChem,Inc.) 0.5％狄派克壓片糖(Amstar Sugar Corp.)37.0％木糖醇(American Xyrofin,Inc.) 37.0％100.0％在食物加工機(jī)中將CP-可可固體和香草提取物在一起混合2分鐘。將糖和硬脂酸鎂輕輕地混在一起，接著在CP-可可固體/香草提取物混合物中混合。最大壓力下，將該材料經(jīng)過Manesty Tablet Press(B3B)并擠壓產(chǎn)生圓形片劑(15mm×5m)。其重量為1.5-1.8g。用可商購(gòu)的低脂肪天然可可粉(11％脂肪)代替CP-可可固體(11％脂肪)來制備上述形式的另一種片劑。兩種片劑制劑產(chǎn)生具有可接受香味特征和結(jié)構(gòu)特性的產(chǎn)品。
使用實(shí)施例4方法2中描述的方法進(jìn)行兩種片劑制劑的分析。在這種情況下，分析集中在五聚體的濃度以及單體和下面報(bào)導(dǎo)的其中n為2-12的本發(fā)明化合物的總水平。

ND=未檢測(cè)數(shù)據(jù)清楚表明了CP-可可固體片劑比其它片劑制劑更高的五聚體水平和本發(fā)明化合物的總水平。因此，用CP-可可固體制備的片劑制劑是用于藥物，添加物和食品應(yīng)用中的口服給藥本發(fā)明化合物的理想的運(yùn)送賦形劑。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地制備包含廣范圍的香料，色料，賦形劑，維生素，礦物質(zhì)，OTC藥物，糖類填料，紫外線保護(hù)劑(如二氧化鈦，著色劑等)，粘合劑，水凝膠等的除開將不可逆地結(jié)合本發(fā)明化合物或化合物的混合物的聚乙烯吡咯烷酮的其它片劑制劑。糖填料的量可被調(diào)節(jié)以控制本發(fā)明化合物或化合物混合物的劑量。
在不背離實(shí)施例的實(shí)質(zhì)及范圍時(shí)，許多對(duì)上面的明顯改變是不言而喻及可能的。實(shí)施例39．膠囊劑用由明膠制成的推入配合膠囊，以及由明膠和增塑劑，如甘油制成的軟密封膠囊進(jìn)行對(duì)用于口服運(yùn)送本發(fā)明化合物的實(shí)施例38的修改。該推入配合膠囊包含如實(shí)施例38和40所描述的，為可任選地與填料，如乳糖或蔗糖混合以控制本發(fā)明化合物劑量的粉末形式的本發(fā)明化合物或化合物混合物或CP-可可固體。在軟膠囊中，本發(fā)明化合物或化合物的混合物或CP-可可固體被懸浮在適宜液體中，如脂肪油或可可油或其混合物中。由于本發(fā)明化合物或化合物混合物可能對(duì)光敏感，如對(duì)紫外線敏感，因此膠囊可包含紫外線保護(hù)劑，如二氧化鈦或適宜色料以保護(hù)免于紫外線。該膠囊還可包含填料，如在前面實(shí)施例中提到的那些。
在不背離實(shí)施例的實(shí)質(zhì)和范圍時(shí)，對(duì)上面進(jìn)行的許多明顯的改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來講是不言而喻及可能的。實(shí)施例40．鑒定標(biāo)準(zhǔn)(SOI)和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)(非-SOI)的黑巧克力及牛奶巧克力制劑由本發(fā)明包含的方法產(chǎn)生的本發(fā)明化合物或化合物混合物制劑可被制備成作為人及獸醫(yī)用途的黑巧克力及牛奶巧克力。參考本文引作參考的于1996年9月6日提出的懸而末決的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)08/709,406。USSN 08/709,406涉及一種使用加工步驟的獨(dú)特組合制備具有恒定水平的來自可可豆的本發(fā)明化合物的可可油和/或可可固體的方法。簡(jiǎn)而言之，由該方法獲得的可食用可可固體對(duì)它們?cè)趥鹘y(tǒng)加工的可可中發(fā)現(xiàn)的水平而言保留了本發(fā)明化合物的天然存在。這樣在末加工豆中發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明化合物的起始量與加工后獲得的量的比例小于或等于2。為了簡(jiǎn)單起見，該可可固體材料在本文被稱為CP-可可固體。CP-可可固體被以粉末或溶液形式使用以制備SOI和非-SOI巧克力，飲料，小吃，烘焙物以及作為營(yíng)養(yǎng)用途中的一種成分。
本文所采用的術(shù)語“SOI巧克力”指根據(jù)聯(lián)邦食品，藥品，化妝品條例，通過由美國(guó)食品和藥品管理委員會(huì)提出的鑒定標(biāo)準(zhǔn)的在美國(guó)用于食品中的任何巧克力。對(duì)于各種類型的巧克力的美國(guó)定義及標(biāo)準(zhǔn)已很好地建立了。本文所采用的術(shù)語“非-SOI巧克力”指具有落在標(biāo)準(zhǔn)化巧克力的特定范圍之外的組成的任何非標(biāo)準(zhǔn)化巧克力。
當(dāng)可可油或牛奶脂肪被部分或完全取代時(shí)；或當(dāng)營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物增甜劑被部分或完全取代時(shí)；或加入香料模仿牛奶，黃油，可可粉或巧克力，或制劑中進(jìn)行的其它加入或刪除在針對(duì)巧克力或其混合物的美國(guó)FDA品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)之外。
作為混合制品，巧克力可采用巧克力固體塊的形式，如棒狀或新穎的形狀，且可被以作為其它更為復(fù)雜的混合藥劑的一種成分的形式摻入，其中巧克力任選與任何香料和提取物生產(chǎn)商協(xié)會(huì)(FEMA)物質(zhì)，天然汁液，調(diào)味品，藥草及被分類為天然香料物質(zhì)；具天然本質(zhì)的物質(zhì)；以及由FEMA GRAS列出的，F(xiàn)EMA和FDA列出的，歐洲議會(huì)(CoE)列出的，F(xiàn)AO/WHO Food Standard Programme,CodexAlimentarius采納的香料工業(yè)國(guó)際組織(IOFI)和Food ChemicalsCodex規(guī)定的人造香料物質(zhì)混合，并且通常包含其它食物，如焦糖，牛軋?zhí)牵」麎K，堅(jiān)果，餅片等。這些食品特征在于在65-85°F，正常空氣條件下為微生物貯存穩(wěn)定的。其它復(fù)雜的混合制品從用巧克力軟包裹物包圍而產(chǎn)生，如浸果酒櫻桃或花生醬。其它復(fù)雜的混合制品從用巧克力涂覆冰淇淋或其它冷凍或冷藏點(diǎn)心而制成。通常，用來涂覆或包圍食品的巧克力必須比用于普通巧克力固體棒或新鮮形狀的巧克力流動(dòng)性更大。
另外，巧克力也可為包含脂肪和非脂肪固體，具有營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物增甜劑和可食用乳化劑的低脂肪巧克力。對(duì)于低脂肪巧克力，參考美國(guó)專利號(hào)4,810,516,4,701,337,5,464,649,5,474,795和WO 96/19923。
黑巧克力它的黑色來自在任何給定制劑中的巧克力溶液，或堿化溶液或可可固體或堿化可可固體的量。然而，由于實(shí)施例27，表13教導(dǎo)本發(fā)明化合物的損失是由于堿化過程，因此，堿化可可固體或溶液的使用將不用在本發(fā)明的黑巧克力制品中。
SOI和非-SOI黑巧克力和牛奶巧克力制品的實(shí)施例示在表16和17。在這些制品中，存在于CP-可可固體中的本發(fā)明化合物的量類似于存在于可商購(gòu)可可固體中的本發(fā)明化合物。
下面描述用于制備這些巧克力制品的加工步驟。用于非-SOI黑巧克力的方法1．讓整個(gè)過程中涉及的所有混合機(jī)和勻料機(jī)避光。
2．分批將除開40％流動(dòng)脂肪(可可油和脫水牛奶脂肪)的所有成分保持在30-35℃之間的溫度下。
3．精研至20微米。
4．35℃下，在制巧克力機(jī)中干燥2小時(shí)。
5．在制巧克力機(jī)中的濕循環(huán)開始時(shí)加入全部卵磷脂和10％可可油，并在制巧克力機(jī)中濕潤(rùn)1小時(shí)。
6．加入所有剩余脂肪，如果需要進(jìn)行校準(zhǔn)，并在35℃下混合1小時(shí)。
7．回火，壓制并包裝巧克力。用于SOI黑巧克力的方法1．分批將除開牛奶脂肪的所有成分保持在60℃的溫度下。
2．精研至20微米。
3．60℃下，在制巧克力機(jī)中干燥3.5小時(shí)。
4．加入卵磷脂和牛奶脂肪并在60℃下在制巧克力機(jī)中濕潤(rùn)1小時(shí)。
5．如果需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并在35℃下混合1小時(shí)?；鼗?，壓制并包裝巧克力。用于非-SOI牛奶巧克力的方法1．讓整個(gè)過程涉及的所有混合機(jī)和勻料機(jī)避光。
2．75℃下，分批將糖，全脂奶粉，加入麥芽糖的如粉以及66％的可可油在制巧克力機(jī)中加工2小時(shí)。
3．分批冷卻至35℃，加入可可粉，乙基香草醛，可可溶液和21％可可油，35℃下混合20分鐘。
4．精研至20微米。
5．加入剩余的可可油，35℃下，在制巧克力機(jī)中干燥1.5小時(shí)。
6．加入脫水牛奶脂肪和卵磷脂，35℃下，在制巧克力機(jī)中濕潤(rùn)1小時(shí)。
7．標(biāo)準(zhǔn)化，回火，壓制并包裝巧克力。用于SOI牛奶巧克力的方法1．分批將除開65％可可油和牛奶脂肪的所有成分保持在60℃的溫度下。
2．精研至20微米。
3．60℃下，在巧克力機(jī)中干燥3.5小時(shí)。
4．加入卵磷脂，10％可可油和脫水牛奶脂肪；60℃下，在巧克力機(jī)中濕潤(rùn)1小時(shí)。
5．加入剩余的可可油，如果需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并在35℃下混合1小時(shí)。
6．回火，壓制并包裝巧克力。
在摻入制品之前，如實(shí)施例4方法4中所描述的，分析用于制品中的CP-可可固體和商品巧克力溶液中的五聚體以及單體和其中n為2-12的本發(fā)明化合物的總水平。接著將這些值用來評(píng)價(jià)如表16和17所示的各種巧克力制劑的預(yù)期水平。在為非-SOI黑巧克力和非-SOI牛奶巧克力的情況下，類似地分析其產(chǎn)品中的五聚體以及單體和其中n為2-12的本發(fā)明化合物的總水平。結(jié)果示于表16和17。
來自這些制品實(shí)施例的結(jié)果表明用CP-可可固體配得的SOI和非-SOI黑巧克力和牛奶巧克力在SOI和非-SOI黑巧克力中分別包含大約多于6.5倍的預(yù)期的五聚體，和多于3.5倍的預(yù)期總水平；以及在SOI和非-SOI牛奶巧克力中為大約多于4.5；7.0倍的預(yù)期的五聚體和多于2.5；3.5倍的預(yù)期的總水平。
由于存在于用CP-可可固體制備的最終巧克力中的本發(fā)明化合物的預(yù)期水平明顯高于用可商購(gòu)的可可固體制備的那些制劑，所有沒有分析一些巧克力產(chǎn)品。然而，在非-SOI黑巧克力和牛奶巧克力產(chǎn)品中評(píng)價(jià)了加工效果。如表中所示，產(chǎn)生25-50％的五聚體的損失，而僅觀察到總水平的很小的不同。希望不被任何理論所約束，認(rèn)為這些損失是由于加熱和/或來自牛奶成分(如乙酸，丙酸和丁酸)的可水解寡聚體(如三聚體可水解為單體和二聚體)的短鏈脂肪酸。另外，耗時(shí)的加工步驟可允許本發(fā)明化合物的氧化或與制劑中的蛋白質(zhì)來源不可逆地結(jié)合。因此，本發(fā)明包括巧克力制品的改進(jìn)方法以及實(shí)現(xiàn)這些效果以預(yù)防或使這些損失最少的加工方法。
技術(shù)人員將知曉這些實(shí)施例中的覆蓋廣范圍的制劑，成分，加工及混合物以合理調(diào)節(jié)用于各種巧克力用途的本發(fā)明化合物的天然產(chǎn)生水平的許多變化。
表16．用未堿化可可成分制備的黑巧克力制品

五聚體和全部寡聚體矢車菊苷配質(zhì)的預(yù)期水平(單體和n=2-12，單位為μg/g

五聚體和全部寡聚體矢車菊苷配質(zhì)的實(shí)際水平(單體和n=2-12，單位為μg/g

表17．用未堿化可可成分制備的牛奶巧克力制品

五聚體和全部寡聚體矢車菊苷配質(zhì)的預(yù)期水平(單體和n=2-12，單位為μg/g)

五聚體和全部寡聚體矢車菊苷配質(zhì)的實(shí)際水平(單體和n=2-12，單位為μg/g)

實(shí)施例41．矢車菊苷配質(zhì)寡聚體的水解實(shí)施例14方法D描述了純化本發(fā)明化合物的制備正相HPLC法。獲得寡聚體作為溶解在流動(dòng)相中的級(jí)分。接著在Rotovap設(shè)置上用標(biāo)準(zhǔn)真空蒸餾(20-29英寸高40℃)除去溶劑。當(dāng)延長(zhǎng)真空蒸餾停留時(shí)間或采用＞40℃的溫度時(shí)，觀察到特定寡聚體的損失與較小寡聚體的增加一起發(fā)生。
特定寡聚體的損失與伴隨性的較小寡聚體的增加是由于來自于存在于流動(dòng)相溶劑混合物中的剩余乙酸的時(shí)間-溫度酸水解。通過其中將100mg六聚體溶解在50mL含二氯甲烷，乙酸，水和甲醇(參見實(shí)施例14，方法D的溶劑部分)的流動(dòng)相并進(jìn)行時(shí)間-溫度依賴性蒸餾的下面的實(shí)驗(yàn)而得以證實(shí)這種觀察。在特定的時(shí)間處，如實(shí)施例4方法2中所描述的，取出等分樣品以用于分析正相HPLC分析。結(jié)果圖解在圖64和65中，其中六聚體水平以時(shí)間-溫度依賴的方式降低。圖65圖解以時(shí)間-溫度依賴的方式出現(xiàn)的一種水解產(chǎn)物(三聚體)。單體和其它寡聚體(二聚體至五聚體)也以時(shí)間-溫度依賴方式出現(xiàn)。
這些結(jié)果表明在處理本發(fā)明聚合化合物時(shí)必須注意極其小心和謹(jǐn)慎。
上述結(jié)果和在實(shí)施例5、15、18、19、20和29中的發(fā)現(xiàn)一起證明上述方法可被用來和本發(fā)明中包括的其它方法相配合證明本發(fā)明中給出的任何寡聚物。
例如，任何給定的只產(chǎn)生(+)-兒茶酸或(-)-表兒茶酸的寡聚物的完全水解消除了許多“混合”單體基的寡聚物結(jié)構(gòu)的可能性，并降低構(gòu)成任何給定寡聚物的每個(gè)單體的特征性立體化學(xué)鍵合的可能性。
另外，任何給定的以特定比例產(chǎn)生(+)-兒茶酸和(-)-表兒茶酸的寡聚物的完全水解給本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員提供關(guān)于任何給定寡聚物的單體組成并因此構(gòu)成該寡聚物的每個(gè)單體的特征性立體化學(xué)鍵合的可能性的信息。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，可以發(fā)生單個(gè)單體的酸催化差向立體異構(gòu)作用，并應(yīng)該考慮合適的控制措施和不活波的水解作用(例如使用有機(jī)酸如乙酸代替濃鹽酸、硝酸等)。
因此，因?yàn)橐言敿?xì)描述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，所以應(yīng)該明白通過所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明并不受上述描述中的個(gè)別細(xì)節(jié)的限制，并且在未偏離本發(fā)明的宗旨和范圍下可以進(jìn)行各種顯而易見的改變。
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權(quán)利要求
1.一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物，其中A是具有下面的結(jié)構(gòu)式的單體
其中，n是3～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中n是5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其是從天然源分離出的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的化合物，其中上述天然源是可可樹屬或Herrania屬或它們的種間或種內(nèi)雜種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其基本上是純的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其被純化至表觀同質(zhì)性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
9.一種抗腫瘤組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物以及藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是3～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中n是5～12。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中n是5。
15.一種用于治療需要接受抗腫瘤劑治療的患者的方法，其包括給該患者施用權(quán)利要求9中的組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括施用至少一種附加的抗腫瘤劑。
17.一種用于權(quán)利要求9組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合和施用的指示。
18.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
19.一種抗氧化組合物，其包括一種式A的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是3～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中n是2～10。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、梧酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中n是2～12。
15.一種用于治療需要接受抗氧化劑治療的患者的方法，其包括給該患者施用權(quán)利要求9中的抗氧化組合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其進(jìn)一步包括施用至少一種附加的抗氧化劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
28.一種用于權(quán)利要求19組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合或施用的指示。
29.一種保存或保護(hù)所希望項(xiàng)目免受氧化的方法，其包括使該項(xiàng)目與權(quán)利要求19的組合物接觸。
30.一種抗微生物組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中n是2～10。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
34.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中n選自2、4、5、6、8和10。
36.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
37.一種用于治療需要接受抗微生物劑治療的患者的方法，其包括給該患者施用權(quán)利要求30中的抗微生物組合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其進(jìn)一步包括施用至少一種附加的抗微生物劑。
39.一種用于權(quán)利要求30組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合或施用的指示。
40.一種環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中n是2～10。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
43.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
44.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
45.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中n是2～5。
46.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
47.一種用于治療需要接受環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制劑治療的患者的方法，其包括給該患者施用權(quán)利要求40中的一種環(huán)加氧酶和/或脂氧化酶調(diào)制組合物。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其進(jìn)一步包括施用至少一種附加的抗微生物劑。
49.一種用于權(quán)利要求40組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合或施用的指示。
50.一種NO或NO合酶調(diào)制組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中n是2～10。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
54.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
55.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
56.一種用于治療需要接受NO調(diào)制劑治療的患者的方法，其包括給該患者施用權(quán)利要求50中的NO或NO合酶調(diào)制組合物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其進(jìn)一步包括施用至少一種附加的NO或NO合酶調(diào)制劑。
58.一種用于權(quán)利要求50組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合或施用的指示。
59.一種治療需要接受NO或NO合酶調(diào)制劑治療的哺乳動(dòng)物的方法，其包括給該哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自由單體單元A、氫和糖組成的該組中，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
60.一種減少哺乳動(dòng)物中NO影響的高膽固醇血癥的方法，其包括給該哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
61.根據(jù)權(quán)利要求60的方法，其中n是2～10。
62.一種用于在哺乳動(dòng)物的單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)iNOS的方法，其包括時(shí)所述的單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞與一種組合物接觸，該組合物包括包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
63.一種刺激哺乳動(dòng)物單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞NO形成的方法，其包括給該哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中n是2～10。
65.一種體內(nèi)葡萄糖調(diào)制組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的組合物，其中n是2～10。
67.根據(jù)權(quán)利要求65的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
68.根據(jù)權(quán)利要求65的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
69.根據(jù)權(quán)利要求65的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
70.根據(jù)權(quán)利要求65的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
71.一種用于治療需要接受葡萄糖調(diào)制劑治療的患者的方法，其包括給該患者施用權(quán)利要求65中的葡萄糖調(diào)制劑。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的方法，其進(jìn)一步包括施用至少一種附加的葡萄糖調(diào)制劑。
73.一種用于權(quán)利要求65組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合或施用的指示。
74.一種拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
75.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
76.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
77.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
78.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
79.一種抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的方法，其包括使拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ與權(quán)利要求74的組合物接觸。
80.一種用于權(quán)利要求74組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合或施用的指示。
81.一種非甾類抗炎組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
83.根據(jù)權(quán)利要求81的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
84.根據(jù)權(quán)利要求81的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
85.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定際準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
86.一種用于治療需要接受非甾類抗炎劑治療的患者的方法，其包括給該患者施用權(quán)利要求81中的組合物。
87.根據(jù)權(quán)利要求86的方法，其進(jìn)一步包括施用至少一種附加的非甾類抗炎劑。
88.一種用于權(quán)利要求81組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合或施用的指示。
89.一種抗齒齦炎或抗牙周炎組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
91.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
92.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
93.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
94.一種用于權(quán)利要求89組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或賦形劑，以及任選地混合或施用的指示。
95.一種減少哺乳動(dòng)物牙周疾病發(fā)展的方法，其包括給所述的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
96.根據(jù)權(quán)利要求95的方法，其中n是2～10。
97.一種治療牙周疾病的方法，其包括給需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
98.一種血小板聚集調(diào)制組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
99.根據(jù)權(quán)利要求98的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
100.根據(jù)權(quán)利要求98的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
101.根據(jù)權(quán)利要求98的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
102.根據(jù)權(quán)利要求98的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
103.一種用于權(quán)利要求98組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或稀釋劑，以及任選地混合或施用的指示。
104.一種調(diào)制血小板聚集的方法，其包括給需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求98的組合物。
105.一種編程性細(xì)胞死亡調(diào)制組合物，其包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
106.根據(jù)權(quán)利要求105的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
107.根據(jù)權(quán)利要求105的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
108.根據(jù)權(quán)利要求105的組合物，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
109.根據(jù)權(quán)利要求105的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
110.一種用于權(quán)利要求105組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或稀釋劑，以及任選地混合或施用的指示。
111.一種調(diào)制編程性細(xì)胞死亡的方法，其包括使COX-2表達(dá)癌細(xì)胞與一種組合物接觸，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
112.根據(jù)權(quán)利要求111的方法，其中n是5。
113.一種抑制DNA氧化性損傷的方法，其包括使DNA與一種組合物接觸，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
114.根據(jù)權(quán)利要求113的方法，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
115.根據(jù)權(quán)利要求113的方法，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
116.根據(jù)權(quán)利要求113的方法，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
117.根據(jù)權(quán)利要求113的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
118.一種用于權(quán)利要求113組合物的試劑盒，其包括獨(dú)立包裝的該化合物和載體或稀釋劑，以及任選地混合或施用的指示。
119.一種治療、預(yù)防或減少動(dòng)脈粥樣硬化或再狹窄的組合物，包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
120.根據(jù)權(quán)利要求119的組合物，其中糖選自葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。
121.根據(jù)權(quán)利要求119的組合物，其中所述的聚合化合物基本上是純的。
122.根據(jù)權(quán)利要求119的方法，其中酚部分選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、棓酸、羥基苯甲酸和芥子酸。
123.根據(jù)權(quán)利要求119的組合物，其中該組合物選自片劑、膠囊、鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力和非鑒定標(biāo)準(zhǔn)巧克力。
124.一種治療、預(yù)防或減少哺乳動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化或再狹窄的方法，其包括給所述的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
125.根據(jù)權(quán)利要求124的方法，其中n是2～10。
126.一種抑制哺乳動(dòng)物L(fēng)DL氧化的方法，其包括給所述的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
127.根據(jù)權(quán)利要求126的方法，其中n是2～10。
128.一種調(diào)制哺乳動(dòng)物血栓形成的方法，其包括給所述的哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1的化合物和一種合適的載體或稀釋劑。
129.根據(jù)權(quán)利要求128的方法，其中n是2～12。
130.一種調(diào)制環(huán)加氧酶-1(COX-1)用于治療炎性腸疾病的方法，其包括給需要這種治療的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
131.一種抑制哺乳動(dòng)物細(xì)菌生長(zhǎng)的方法，其包括給所述的哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
132.根據(jù)權(quán)利要求131的方法，其中n是2、4、5、6、8和10。
133.一種降低需要高血壓治療的哺乳動(dòng)物的高血壓的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用一種組合物，該組合物包括一種式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物和氧化產(chǎn)物與藥物學(xué)上可接受的載體和賦形劑，其中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和一個(gè)或多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代。
134.根據(jù)權(quán)利要求133的方法，其中n是2～10。
135.一種用于治療需要癌癥治療的哺乳動(dòng)物的癌癥的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用足以產(chǎn)生治療效果劑量的至少一種權(quán)利要求1中的化合物。
136.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述的癌癥是前列腺癌。
137.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述的癌癥是腎癌。
138.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述癌癥是結(jié)腸癌。
139.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述癌癥是乳腺癌。
140.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述的癌癥是貓白血病。
141.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述癌癥是子宮癌。
142.根據(jù)權(quán)利要求135的方法，其中所述癌癥是T-細(xì)胞白血病。
143.一種抑制哺乳動(dòng)物癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括給所述哺乳動(dòng)物施用權(quán)利要求1的化合物和合適的載體或稀釋劑、
144.根據(jù)權(quán)利要求143的方法，其中n是5。
145.用于包括可可提取物的藥物的載體或賦形劑。
146.一種來自可可樹屬或Herrania屬或它們的種間或種內(nèi)雜種的基本上純的多酚，其包括含寡聚物3～18的多酚。
147.權(quán)利要求1的化合物，其具有附圖48A-D的NMR質(zhì)譜給出的結(jié)構(gòu)。
148.權(quán)利要求1的化合物，其具有附圖49A-D的NMR質(zhì)譜給出的結(jié)構(gòu)。
149.一種提高可可豆中可可矢車菊苷配質(zhì)的濃度水平和分布的方法，其中采用發(fā)酵條件。
150.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物。
151.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物。
152.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物，其中該五聚物末端單體單元的3位任選是由棓酸鹽和/或β-D-葡萄糖衍生的。
153.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物。
154.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物。
155.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物。
156.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物。
157.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物。
158.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]10-EC的十一聚物。
159.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]11-EC十二聚物。
160.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中該化合物是選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]10-EC的十一聚物和結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]11-EC十二聚物。
161.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物。
162.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物。
163.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物。
164.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物。
165.根據(jù)權(quán)利要求65的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物。
166.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]10-EC的十一聚物和結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]11-EC十二聚物。
167.根據(jù)權(quán)利要求81的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]10-EC的十一聚物和結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]11-EC十二聚物。
168.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物。
169.根據(jù)權(quán)利要求98的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]10-EC的十一聚物和結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]11-EC十二聚物。
170.根據(jù)權(quán)利要求105的組合物，其中該化合物是結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物。
171.根據(jù)權(quán)利要求119的組合物，其中該化合物選自結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]-EC的二聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]2-EC的三聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]3-EC的四聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]4-EC的五聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]5-EC的六聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]6-EC的七聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]7-EC的八聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]8-EC的九聚物、結(jié)構(gòu)式為[EC-(4β→8)]9-EC的十聚物。
172.一種鑒定通過式An的聚合化合物及其藥物學(xué)上可接受的鹽、衍生物、氧化產(chǎn)物或它們的組合物誘導(dǎo)或抑制的基因的方法，式An中A是具有結(jié)構(gòu)式
的單體，n是2～18的整數(shù)，這樣至少存在一個(gè)末端單體單元A和多個(gè)附加單體單元；R是3-(α)-OH、3-(β)-OH、3-(α)-O-糖或3-(β)-O-糖；相鄰單體之間的鍵合發(fā)生在選自4、6和8位的位置上；在4位中附加單體單元的鍵具有α或β立體化學(xué)構(gòu)型；X、Y和Z選自單體單元A、氫和糖，但條件是對(duì)于至少一個(gè)末端單體單元來說，在此鍵合的附加單體單元在4位上以及任選地Y=Z=氫；糖任選地被酚部分取代，所述的方法包括使所述的至少一種基因或基因產(chǎn)物與聚合化合物接觸，進(jìn)行基因表達(dá)測(cè)定。
173.根據(jù)權(quán)利要求172的方法，其中所述的基因表達(dá)測(cè)定選自差別顯示、cDNA庫的序列測(cè)定、基因表達(dá)的系列分析和通過與高密度寡核苷酸排列雜交進(jìn)行的表達(dá)監(jiān)測(cè)。
174.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y 和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
175.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
176.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
177.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
178.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
179.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
180.根據(jù)權(quán)利要求65的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
181.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
181.根據(jù)權(quán)利要求81的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
183.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
184.根據(jù)權(quán)利要求98的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
185.根據(jù)權(quán)利要求105的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
186.根據(jù)權(quán)利要求119的組合物，其中該化合物進(jìn)一步包括相鄰單體在4位上通過(4→6)或(4→8)鍵合；X、Y和Z各自是氫、糖或相鄰單體，但條件是，如果X和Y是相鄰單體，那么Z是H或糖，如果X和Z是相鄰單體，那么Y是H和糖，以及條件是對(duì)于二個(gè)末端單體至少之一來說，相鄰單體的鍵合在4位上以及任選地，Y=Z=氫。
187.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC的三聚物。
188.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C的四聚物。
189.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C的五聚物。
190.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C的六聚物，其中六聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的。
191.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C的七聚物，其中七聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的。
192.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]7-EC、[ EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[ EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C的八聚物，其中八聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的。
193.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C的九聚物，其中九聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的。
194.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C的十聚物，其中十聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的。
195.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]10-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-C的十一聚物，其中十一聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的。
196.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是選自[EC-(4β→8)]11-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-C的十二聚物，其中十二聚物末端單體單元的3位任意地是由棓酸或β-D-葡萄糖衍生的。
197.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中該化合物選自五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物、十聚物、十一聚物和十二聚物，這里，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C，十一聚物選自[EC-(4β→8)]10-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-C，十二聚物選自[EC-(4β→8)]11-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-C。
198.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C。
199.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C。
200.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[ EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C。
201.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[ EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C。
202.根據(jù)權(quán)利要求65的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C。
203.根據(jù)權(quán)利要求74的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物、十聚物、十一聚物和十二聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C，十一聚物選自[EC-(4β→8)]10-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→8)-C和[ EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-C，十二聚物選自[EC-(4β→8)]11-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-C。
204.根據(jù)權(quán)利要求81的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物、十聚物、十一聚物和十二聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C，十一聚物選自[EC-(4β→8)]10-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-C，十二聚物選自[EC-(4β→8)]11-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-C。
205.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[ EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C。
206.根據(jù)權(quán)利要求98的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物、十聚物、十一聚物和十二聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C，十一聚物選自[EC-(4β→8)]10-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]9-EC-(4β→6)-C，十二聚物選自[EC-(4β→8)]11-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]10-EC-(4β→6)-C。
207.根據(jù)權(quán)利要求105的組合物，其中該化合物選自五聚物，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C。
208.根據(jù)權(quán)利要求89的組合物，其中該化合物選自三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物，這里，三聚物選自[EC-(4β→8)]2-EC、[EC-(4β→8)]2-C和[EC-(4β→6)]2-EC，四聚物選自[EC-(4β→8)]3-EC、[EC-(4β→8)]3-C和[EC-(4β→8)]2-EC-(4β→6)-C，五聚物選自[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，六聚物選自[EC-(4β→8)]5-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]4-EC-(4β→6)-C，七聚物選自[EC-(4β→8)]6-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]5-EC-(4β→6)-C，八聚物選自[EC-(4β→8)]7-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]6-EC-(4β→6)-C，九聚物選自[EC-(4β→8)]8-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]7-EC-(4β→6)-C，十聚物選自[EC-(4β→8)]9-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]8-EC-(4β→6)-C。
全文摘要
公開和在權(quán)利要求中要求保護(hù)的是可可提取物,化合物及其組合和含有相同物質(zhì)如多酚類或矢車菊苷配質(zhì)的組合物;制備此類提取物,化合物和組合物的方法及其用途;特別是式A
文檔編號(hào)A61P1/02GK1221344SQ9719518
公開日1999年6月30日 申請(qǐng)日期1997年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月2日
發(fā)明者小L·J·羅曼塞克, 小J·F·哈姆梅爾斯通, M·M·布克, L·S·波斯特, G·G·西波拉, C·A·麥克勒蘭德, J·A·蒙德特, H·H·施米茨 申請(qǐng)人:火星有限公司