專利名稱：Hcv感染的光滲透治療的制作方法
體外光滲透(Extracorporeal photopheresis)治療是一種治療方法，其中在治療之前兩小時(shí)將一種天然的光敏化合物8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)通過(guò)口服給藥；然后從病人體內(nèi)抽血，抗凝，利用離心法分離血液白細(xì)胞，并收集白細(xì)胞富集部分。然后利用紫外光(UVA)照射這些含8-MOP的白細(xì)胞，該紫外光使8-MOP與DNA中的嘧啶堿基和細(xì)胞內(nèi)-以及外-蛋白質(zhì)結(jié)合。然后將這些經(jīng)處理的白細(xì)胞送回病人體內(nèi)，這是一種免疫調(diào)節(jié)方法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在很多疾病中有很好的臨床效果。
有很多疾病被認(rèn)為主要與T細(xì)胞有關(guān)或者是T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病如皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、在移植之后的器官同種異體的移植排斥，以及一些被認(rèn)為是T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病例如漸進(jìn)性全身硬化(PSS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年起病型糖尿病(JODM)。
皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)是一種漸進(jìn)性的惡性腫瘤疾病。治療方法是有限的。Edelson等人進(jìn)行一種多中心實(shí)驗(yàn)2，表明29名患者中，24人(83％)的紅皮炎經(jīng)過(guò)治療疾病狀況明顯改善。這些積極的反應(yīng)在開始治療后的22.4星期的中間階段就可以觀察到。就臨床顯著性而言，這些患者是其疾病對(duì)以前的治療有抗藥性的那些病人，所述治療被認(rèn)為是很難預(yù)測(cè)那一類。此外，觀察到外周血(Sezary細(xì)胞)數(shù)量減少。實(shí)際數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，與小于30個(gè)月的存活中等時(shí)間相比，該中等存活從治療的開始起增加到60個(gè)月以上。在這原有一組的病人中，患有白血病的實(shí)驗(yàn)對(duì)象中的8個(gè)維持減輕狀態(tài)。與光滲透相關(guān)的不良反應(yīng)很少。
自身免疫性疾病的特征是免疫系統(tǒng)的失調(diào)，其特征還在于，病人體內(nèi)特定器官或組織中的特異性細(xì)胞或體液介導(dǎo)的破壞。這類疾病的實(shí)例是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和進(jìn)行性全身性硬化。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(R.A.)是一種炎癥疾病，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)損壞并且是一種涉及很多器官系統(tǒng)的全身性疾病。有很多種藥劑用于R.A.，然而，由于該疾病是終生性的，就同樣需要對(duì)于疾病能提高潛力的更加耐久的藥劑。特別是，對(duì)于開始第二種R.A.治療之后，在大量的病人中已觀察到效力的喪失和疾病逐漸發(fā)展。很多第二種藥劑是抑制免疫劑，并且本身成為引起主要副反應(yīng)例如感染的原因。因此需要開發(fā)一種更特異性的無(wú)毒性的改進(jìn)免疫調(diào)節(jié)治療方法3。
進(jìn)行性的全身性硬化(PSS)是一種結(jié)締組織疾病，其特征在于，在皮膚和內(nèi)臟中有炎癥和纖維性病變。治療是很困難的?？寡姿幬锖推べ|(zhì)類固醇在疾病的早期階段是有幫助的，但不能影響疾病的發(fā)展。利用D-青酶氨、氨甲喋呤，環(huán)孢菌素、鈣通道阻斷劑以及前列腺素的試驗(yàn)正在進(jìn)行，不過(guò)這些藥物不能影響疾病的總體發(fā)展。因?yàn)檫@些疾病被認(rèn)為是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，Rock和他的同事已經(jīng)利用光滲透來(lái)治療PSS病人4。在這一實(shí)驗(yàn)中，將56名病人隨機(jī)分配進(jìn)行非盲臨床實(shí)驗(yàn)。與用D-青酶氨(對(duì)照)組(32％反應(yīng)率)相比，觀察到采用光滲透治療的組(68％反應(yīng)率)有明顯高的反應(yīng)率。
青少年發(fā)作性糖尿病(JODM)被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的，導(dǎo)致生成胰島素的胰細(xì)胞的破壞?；加羞@種疾病的病人不僅他們的血糖失調(diào)，而且該疾病的特征在于，由于血管病產(chǎn)生導(dǎo)致有顯著發(fā)病率和死亡率的特定器官損傷。
其它由T細(xì)胞介導(dǎo)的現(xiàn)象包含對(duì)宿主外源組織的排異。在器官同種異體移植的情況下，需要防止對(duì)被移植器官的排異，然而，還要維持免疫系統(tǒng)的能力，以便使身體能抵抗感染以及發(fā)揮其它正常的身體防御能力。在移植之后的常規(guī)治療限于用于引起全身免疫抑制狀態(tài)的免疫抑制方案，這會(huì)引起這種治療所常見的有害反應(yīng)，再次感染，可能是細(xì)菌感染或機(jī)遇性感染。
不具有免疫抑制性的免疫調(diào)節(jié)更理想。光滲透已經(jīng)表明是有效的，在Loyola大學(xué)的研究人員用光滲透已經(jīng)成功地治療了常規(guī)的免疫抑制藥劑難以治療的14例心臟排異病例中13例。在一種不同情況中，已經(jīng)成功地將光滲透于(Rossetti等人5)成功地治療一個(gè)患有慢性移植抗宿主病的病人。這種疾病特征在于，是一種無(wú)免疫能力的宿主，其中免疫感受態(tài)細(xì)胞(骨髓或者外周干細(xì)胞)被注入到這種狀態(tài)的病人體內(nèi)作為對(duì)各種惡性腫瘤和白血病的治療。這里，移植的免疫活性細(xì)胞攻主該病人(宿主)。這里還應(yīng)指出，其結(jié)果是調(diào)節(jié)免疫活性細(xì)胞，而不會(huì)引起進(jìn)一步抑制免疫和其副作用。
光滲透包含將外周血白細(xì)胞體外暴露于用紫外線A光光激活的8-甲基補(bǔ)骨質(zhì)素(8-MOP)，接著再輸注經(jīng)處理的白細(xì)胞。
血液中的8-甲基補(bǔ)骨質(zhì)素分子進(jìn)入白細(xì)胞核和插入雙鏈DNA螺旋中。在體外循環(huán)中，UVAR光滲透系統(tǒng)內(nèi)，長(zhǎng)波長(zhǎng)的紫外光照射白細(xì)胞富集的血液部分。經(jīng)光活化的藥物，對(duì)應(yīng)UVA能量與DNA螺旋中的胸苷堿基結(jié)合。這樣就形成胸苷堿的交聯(lián)，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，防止DNA的解旋。然后將血漿和經(jīng)轉(zhuǎn)變的白細(xì)胞重新注入病人體內(nèi)。再輸注光滲透損傷的白細(xì)胞會(huì)延緩對(duì)這些受損傷白細(xì)胞的免疫攻擊，而未經(jīng)修飾的WBC顯示相同的細(xì)胞表面抗原。
UVAR系統(tǒng)治療由3個(gè)階段組成1)采集血況棕黃色部分(白細(xì)胞富集的)，2)照射所采集的血沉棕黃色層部分；以及3)重新輸注處理過(guò)的白細(xì)胞。采集階段包含6次循環(huán)的抽血、離心和再輸注步驟。在每個(gè)循環(huán)的過(guò)程中，用兒科遷動(dòng)碗，將全血離心并分離。從所述分離中，在每一采集循環(huán)中保存血漿(在每一循環(huán)中的體積是由UVAR儀器的操作人員確定的)和40毫升血沉棕黃色層。在開始下一次采集循環(huán)之前，將紅細(xì)胞和所有其他血漿重新注入到病人體內(nèi)。最后，分離得到總共240毫升的血沉棕黃色層和300毫升的血漿，并保存用于UVA照射。
在第一采集循環(huán)的血沉棕黃色層采集過(guò)程中，開始照射在照射環(huán)路內(nèi)的白細(xì)胞富集的血液。將采集的血漿和血沉棕黃色層與200毫升的肝素化的生理鹽溶液和200毫克的UVADEX(可溶于水的8-甲氧基補(bǔ)骨脂素)相混合。這一混合物按1.4毫米厚的流層流動(dòng)通過(guò)插入在PHOTOSETTE的兩排UVA燈之間的PHOTOCEPTOR光活化室，PHOTOSETTEUVA燈照射這一UVA透過(guò)PHOTOCEPTOR室的兩側(cè)，使得能夠照射180分的紫外(A)光，形成平均照射能量為每個(gè)淋巴細(xì)胞為1-2焦?fàn)?平方厘米。最終的血沉棕黃色層制備物包含估計(jì)為20％到25％的總外周血單核細(xì)胞成分并且血球比為2.5％-7％。在光活化期之后，用30到45分鐘將該體積(血液)重新注入到病人體內(nèi)。
采用這種技術(shù)的系統(tǒng)是公知的，因此可進(jìn)行對(duì)病人血液的體外處理。例如，在Goss的4573960號(hào)美國(guó)專利中，向病人提供一種需要光活化的藥物，然后抽出病人的血液，并將其成分分離。將未經(jīng)處理的成分(紅血球、一些血漿等)送回病人體內(nèi)。然后將病人和治療設(shè)備分開，將分離的一些成分例如白細(xì)胞暴露于紫外光。在光活化之后，將經(jīng)處理的細(xì)胞送回病人體內(nèi)。
在授予Edelson的4321919、4398906和4464166號(hào)美國(guó)專利中，已經(jīng)討論了一種疾病的體外治療方法，其中發(fā)生淋巴細(xì)胞的病理學(xué)增加，例如皮膚的T細(xì)胞淋巴瘤。按照這些方法，將病人的血液在存在化學(xué)藥品或抗體的情況下利用紫外光照射。紫外光影響淋巴細(xì)胞和化學(xué)藥品或抗體之間的結(jié)合，因此抑制淋巴細(xì)胞的代謝過(guò)程。
各種人體病毒能夠感染并在單核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，或者感染性病毒顆?？梢员３钟趩魏思?xì)胞內(nèi)。單核細(xì)胞或者可以用作為病毒的復(fù)制傳播源，或者用作為免疫系統(tǒng)難以消除的感染性病毒顆粒儲(chǔ)庫(kù)。不消除這些感染性病毒源可能導(dǎo)致形成慢性病。能夠感染、在單核細(xì)胞內(nèi)部復(fù)制或駐留的病毒包含，但不限于節(jié)肢動(dòng)物傳播病毒，腸道病毒、副粘病毒(RSV)、皰疹病毒，巨細(xì)胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、G型肝炎病毒(HGV)以及HIV。
各種人體非病毒病原體可以感染并在單核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，或者感染性非病毒病原體可以保持于單核細(xì)胞內(nèi)。單核細(xì)胞可以或者用作為非病毒病原體的復(fù)制傳播源，或者用作為免疫系統(tǒng)難以消除的感染性非病毒病原體的儲(chǔ)庫(kù)。不消除這些感染性非病毒病原體源可以導(dǎo)致形成慢性病?？梢愿腥尽⒃趩魏思?xì)胞內(nèi)復(fù)制或駐留在其內(nèi)的非病毒病原體包含，但不限于各種細(xì)菌，例如節(jié)肢動(dòng)物傳播細(xì)菌，支原體、分枝桿菌類；以及各種寄生蟲例如原蟲類和其它節(jié)肢動(dòng)物傳播的寄生蟲。
體外光滲透已成功地用于治療HIV感染(4960408號(hào)美國(guó)專利)，以及補(bǔ)骨脂素化合物與長(zhǎng)波紫外光的結(jié)合已表明在體外能使某些病毒失活，所述病毒例如HIV(Quinnan,G.V等人；1986,Transfusion(輸血)，26,481頁(yè)，Bisaccia,A等人；1990；Ann.Infem.Med.,113,270頁(yè)；Bisaccia,A等人，1991,Am.NY Acad.Sci.,636,PP321)，以及流感病毒和單純性皰疹病毒(Redfield.D.C等人；1981；Infect andImmun,32,1216頁(yè))。來(lái)自哥倫大學(xué)的Bisaccia在中試實(shí)驗(yàn)已經(jīng)研究了ECP治療患有與AIDS相關(guān)癥群侯的病人。其原理是將補(bǔ)骨脂素與UVA活化相結(jié)合，可以在體外殺傷HIV病毒，以及重新輸注受損傷的病毒可以引發(fā)免疫反應(yīng)。該作者發(fā)現(xiàn)，ECP使HIV抗體生產(chǎn)增加、CD8(+)淋巴細(xì)胞增加，p24抗原滴度降低，以及使HIV不能在3位病人身上繁殖。20個(gè)病人中的11人他們的皮膚抗原反應(yīng)性增加。
此外，已有報(bào)告在移植手術(shù)后接受關(guān)于抑制免疫的光滲透治療的一些病人中感染發(fā)病率降低(Meiser,B.M等人，Transplantation(移植術(shù))57,563頁(yè))。然而，對(duì)于進(jìn)行移植手術(shù)的病人的觀察結(jié)果與光滲透治療無(wú)關(guān)，這是由于包括接受各種治療以防止排斥移植的器官的病人通常都有感染。
本發(fā)明提供了一種利用體外光滲透來(lái)治療慢性HCV的方法。特別是，利用本發(fā)明的方法治療患有慢性HCV感染病的病人，使得經(jīng)過(guò)治療的病人體內(nèi)HCV遺傳物質(zhì)的數(shù)量降低或達(dá)到檢測(cè)不出的水平。本發(fā)明的方法包含利用一種可光活化或光敏化合物來(lái)處理治療病人的血液，該化合物通過(guò)紫外光活化后能夠結(jié)合受感染的有核細(xì)胞中的核酸。利用常規(guī)給藥技術(shù)可以將可光活化的或光敏化合物體外或體內(nèi)施用到病人血液中。
然后將病人的一部分血液利用光滲透在體外進(jìn)行處理，包括利用紫外光照射該血液，最好為波長(zhǎng)范圍320到400納米的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光，通常稱為UVA光。在體外光滲透后將經(jīng)處理的血液或其部分送回到病人體內(nèi)，以便刺激病人免疫系統(tǒng)的抗感染的細(xì)胞種和/或抗HCV的免疫反應(yīng)，從而抑制病毒感染的發(fā)展。通過(guò)這種處理還能損傷病毒遺傳物質(zhì)，使得病毒不能復(fù)制，因此中止病毒傳播并中和駐留在細(xì)胞內(nèi)的感染性病毒顆粒。
附圖描述

圖1A、1B和1C分別表示第1組、第2組和第3組病人的治療結(jié)果。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及光滲透使HCV失活利或殺死已感染HCV之血細(xì)胞的用途。本發(fā)明的范圍并不局限操作的具體原理，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到利用本發(fā)明的光滲透損傷受感染的有核血細(xì)胞(例如單核細(xì)胞)可以治療不由病人的正常免疫反應(yīng)控制的HCV感染。然后利用經(jīng)處理的細(xì)胞以及被殺死的和/或減毒病毒、肽、病毒本身的天然亞單位(它們是當(dāng)細(xì)胞破裂和/或脫開進(jìn)入血液中時(shí)釋放的)和/或致病的非感染性病毒產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
HCV能夠感染并在單核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，或者感染性病毒顆?？梢员Ａ粼趩魏思?xì)胞內(nèi)。所述單核細(xì)胞可以作為病毒的復(fù)制和傳播源，或者可以作為各種免疫系統(tǒng)難以消除的感染性病毒顆粒的儲(chǔ)庫(kù)。不消除這些感染性病毒源，可能導(dǎo)致形成慢性病。
根據(jù)權(quán)利要求所要求保護(hù)的方法，首先將一種可光活化的或光敏化合物施用給HCV慢性感染的病人血液中?？梢詫⒖晒饣罨蚬饷艋衔矬w內(nèi)給藥(例如口服或通過(guò)靜脈注射)，或者通過(guò)采用常規(guī)的抽血技術(shù)體外施用到由病人體內(nèi)抽出的病人血液中。
根據(jù)本發(fā)明，可光活化的或光敏的化合物在受到規(guī)定頻譜的電磁射線例如紫外光照射而活化后，應(yīng)能與核酸結(jié)合。
接著，通過(guò)利用紫外光對(duì)該部分血液進(jìn)行光滲透處理，以便對(duì)已施用了光活性化合物的病人血液進(jìn)行處理。優(yōu)選利用一體外光滲透裝置體外實(shí)施光滲透步驟。本發(fā)明的光滲透步驟也可以在體內(nèi)完成。目前用于本發(fā)明方法的優(yōu)選體外光滲透裝置，是以UVAR名稱由Therakos,Inc.,Westchester,Pa制造的。對(duì)于這一裝置的介紹可以在1987年8月14授權(quán)給R.L.Edelson的4683889號(hào)美國(guó)專利中找到。在光滲透裝置中用紫外線照射血液是本技術(shù)領(lǐng)域中的一般技術(shù)人員能夠做到的。
在體外實(shí)施光滲透步驟時(shí)，將至少一部經(jīng)處置的血液送回到病人體內(nèi)，以便增強(qiáng)病人對(duì)于感染細(xì)胞種群和對(duì)HCV本身的免疫反應(yīng)。優(yōu)選，這里所述的治療方法按照約每周一次到約每隔三周一次的時(shí)間間隔重復(fù)進(jìn)行。用于本發(fā)明的優(yōu)選光活化化合物是在4321919號(hào)美國(guó)專利中所介紹的稱之為補(bǔ)骨脂素(或呋喃并香豆精)的化合物。另外，病人的血液可在一標(biāo)準(zhǔn)的光滲透型裝置上分離并在一單獨(dú)的裝置上進(jìn)行光活化。
用于本發(fā)明的優(yōu)選可光活化的或光敏化合物包括補(bǔ)骨脂素；8-甲氧基補(bǔ)骨脂素；4,5’,8-三甲基補(bǔ)骨脂素；5-甲氧基補(bǔ)骨脂素；4-甲基補(bǔ)骨脂素；4,4-二甲基補(bǔ)骨脂素；4,5’-二甲基補(bǔ)骨脂素，4’-氨甲基-4,5’,8三甲基補(bǔ)骨脂素；4’-羥甲基-4,5’,8-三甲基補(bǔ)骨脂素；以及4’,8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。用于本發(fā)明特別優(yōu)選的光敏化合物是8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。
當(dāng)要體內(nèi)施用于患者血液中時(shí)，優(yōu)選將光敏化合物通過(guò)口服施用，不過(guò)也可以通過(guò)靜脈內(nèi)和/或通過(guò)其它常規(guī)給藥途徑施用。
光敏化合物的優(yōu)選的口服劑量為約0.3-0.7毫克/公斤，最好為約0.6毫克/公斤。當(dāng)通過(guò)口服服用時(shí)，光敏化合物應(yīng)在進(jìn)行光滲透處理之前至少約一個(gè)小時(shí)之前以及在進(jìn)行光滲透處理之前不大于約三個(gè)小時(shí)服用。如果通過(guò)靜脈內(nèi)施用，時(shí)間應(yīng)更短。
另外，光敏化合物可以在抽出病人血液之后以及在利用紫外光照射之前或同時(shí)施用到病人的血液中。只要靶血細(xì)胞或血液成分接受了光敏化合物，則光敏化合物可以施用到全血或其一部分中。
優(yōu)選利用320到400納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外光(UVA)完成本發(fā)明的治療方法中的光滲透處理。在光滲透治療過(guò)程中，紫外光的照射時(shí)間應(yīng)足夠長(zhǎng)，以便向血液輸送約1-2焦?fàn)?平方厘米。
當(dāng)在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明的光滲透治療時(shí)，應(yīng)認(rèn)真注意控制最大輻射劑量，以避免對(duì)患者的不必要傷害。計(jì)算紫外光的最大輻射劑量的方法是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明還提供了制備抗HCV的疫苗的方法。根據(jù)本發(fā)明，可按如下所述利用一受感染HCV的供體來(lái)生產(chǎn)抗其病毒感染的疫苗。
首先，在抽血前，經(jīng)口或靜脈內(nèi)將如上所述的光敏化合物施用到供體病人的至少一部分的血液中，在病人抽血之后，體外施用上述化合物。以可供選擇的方式，首先利用公知的方法對(duì)供體的一部分血液進(jìn)行處理，以便基本上除去紅細(xì)胞，然后將光活化化合物施用到所得的富集白細(xì)胞部分中。
總之，已經(jīng)提供有光敏化合物的血液部分(或其富集的白細(xì)胞部分)都要利用紫外光優(yōu)選UVA按照前述方式進(jìn)行光活化處理。然后將經(jīng)處理的血液或經(jīng)處理富集白細(xì)胞部分返還注入到供體體內(nèi)。
提供如下的一些實(shí)施例用以說(shuō)明本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1減少在慢性HCV感染的病人身上的HCV。
在急性HCV感染之后形成C型慢性肝炎的基本缺陷是未知的。幾位研究人員都認(rèn)為受損的細(xì)胞免疫無(wú)論是T細(xì)胞還是自然殺傷細(xì)胞都可以起作用。來(lái)自Chiron Corporation的Weiner和合作者已經(jīng)證明在E2/NS1片段中存在HCV基因組的超可變區(qū)。這一區(qū)域編碼分離物特異性的，B細(xì)胞抗體一結(jié)合線性表位，這些表位是在HCV顆粒包膜表面上表達(dá)的。這一結(jié)構(gòu)域的特性與人免疫缺陷性病毒l’s gp 120蛋白的V3環(huán)相似。在這一區(qū)域內(nèi)的快速突變可以解釋免疫識(shí)別的喪失和丙型肝炎病毒的清除。
其它作者則主張對(duì)于干擾素蛋白治療的抗性或許有其它可能性。有證據(jù)表明，病毒基因型在影響治療效果方面是很重要的。似乎丙型肝炎病毒的某些基因型(亞型)對(duì)干擾素α治療的抗性可能強(qiáng)于其它類型。其它的人員發(fā)現(xiàn)，丙型肝炎病毒預(yù)處理的病毒滴度與利用干擾素α治療之后的效果有關(guān)。
不過(guò)，導(dǎo)致丙型肝炎病毒清除的基本免疫基理仍然是未知的。國(guó)家癌癥研究中心的Shirai已經(jīng)證明，CD8(+)細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞能識(shí)別與RNA聚合酶同源的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，所述RNA聚合酶的表達(dá)與肝細(xì)胞表面上的Ⅰ型HLA抗原有關(guān)7。這樣就導(dǎo)致病毒感染之肝細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒破壞作用。這與清除乙型肝炎病毒的作用過(guò)程相似。
丙型肝炎病毒是一種通過(guò)生成作為模板的負(fù)鏈RNA來(lái)復(fù)制的正鏈病毒。在活性HCV病毒復(fù)制的過(guò)程中，這些負(fù)鏈RNA模板存在于病人肝內(nèi)。研究人員還發(fā)現(xiàn)，活性的正在復(fù)制的丙型肝炎病毒顆粒存在于病人的外周血單核細(xì)胞中8。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞可含有負(fù)鏈HCV RNA。
在利用干擾素α治療的過(guò)程中，當(dāng)利用RT-PCR測(cè)量時(shí)發(fā)現(xiàn)丙型肝炎病毒可由病人的肝和血液中消失。盡管在某些病人身上這樣顯然清除了病毒，但在干擾素治療之后，有很高的復(fù)發(fā)率(80-85％)。研究人員已經(jīng)證明，在治療結(jié)束時(shí)，在PBMC中沒(méi)有檢測(cè)到HCV復(fù)制的(少數(shù))病人在干擾素治療之后沒(méi)有復(fù)發(fā)并且明顯痊愈9,10,11.。似乎單核細(xì)胞可以作為丙型肝炎免于免疫系統(tǒng)識(shí)別和攻擊的免疫保護(hù)位點(diǎn)。一旦干擾素α治療取消，病毒可能脫離PBMC并重新感染病人的血液和肝。
很明顯理想治療應(yīng)當(dāng)是同時(shí)從肝、血液和受感染的單核細(xì)胞清除丙型肝炎病毒。體外光滲透的作用機(jī)理能形成一種抗異常T細(xì)胞的免疫作用，使異常T細(xì)胞形成更強(qiáng)的免疫原性。在ECP照射之后，再注入這些改變的T細(xì)胞引起反疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)針對(duì)未受照射的帶有相同表面抗原的T細(xì)胞12。這樣就會(huì)產(chǎn)生抵抗那些異常細(xì)胞(或者癌克隆、或者為在其表面上表達(dá)病毒抗原的T細(xì)胞)的高度特異性的免疫反應(yīng)。
此外，理想的治療應(yīng)當(dāng)不受丙型肝炎有突變傾向的超可變E2/NS1區(qū)的影響。病毒顆粒被膜抗原的這種變化使之能擺脫B細(xì)胞中和抗體。光滲透還可誘導(dǎo)對(duì)經(jīng)照射的血液中的任何游離病毒顆粒損害。這種治療形式還可導(dǎo)向任何新形成的丙型肝炎脫(escape)突變體。
在1986年，Hoofnagle13等人公開了第一份在無(wú)對(duì)照的實(shí)驗(yàn)中成功地用干擾素α治療慢性丙型肝炎的報(bào)告。10個(gè)患有慢性丙型肝炎的病人接受了長(zhǎng)達(dá)一年的干擾素皮下注射治療。七年之后，6個(gè)病人仍然具有正常的LFT和利用RT-PCR未能檢測(cè)到的HCV RNA。
時(shí)至今日，干擾素α-2b，即重組體(內(nèi)含子A)是在美國(guó)僅有獲得FDA批準(zhǔn)的用于慢性肝炎的治療方法。Davis等人報(bào)告說(shuō)，按照每周三次3百萬(wàn)單位的劑量施用干擾素α-2b的6個(gè)月的療程中，最終18％保持了反應(yīng)，停止了治療14。多個(gè)其它的實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)了這一反應(yīng)比率。生化反應(yīng)復(fù)發(fā)發(fā)生在停止治療之后的大多數(shù)病人中。利用RT-PCR對(duì)血清中HCV RNA的檢測(cè)也已表明與血清轉(zhuǎn)氨酶正?；嘘P(guān)，一旦停止治療，生化反應(yīng)復(fù)發(fā)發(fā)生(文獻(xiàn)16,17)。
研究人員繼續(xù)研究新的療法以提高該較低的反應(yīng)比率。更高的干擾素劑量18、更長(zhǎng)的治療時(shí)間19。不同的干擾素20、21以及用于除去過(guò)量鐵的輔助治療放血術(shù)22都已進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，獲得了不同程度的成功。其它的治療方式有效性更低，并經(jīng)常帶來(lái)副作用。皮質(zhì)類固醇和無(wú)環(huán)鳥苷已表明沒(méi)什么好處。
15個(gè)病人被隨機(jī)分組，或者單獨(dú)用ECP單一治療(5個(gè)病人)，或者用ECP和干擾素α-3MIU TIW聯(lián)合治療(5個(gè)病人)，或者用ECP和干擾素α6MIU TIW聯(lián)合治療(5個(gè)病人)。所有的病人都在賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)院的臨床研究中心(CRC)接受ECP治療。
組Ⅰ(單獨(dú)用ECP)病人都隨機(jī)分組，以便接受單獨(dú)ECP的兩種治療方式，每隔一星期連續(xù)兩天接受治療。病人在6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)接受24次ECP治療。
組Ⅱ(ECP和IFN-(3MIU)在組Ⅰ開始ECP之后三個(gè)月，病人被隨機(jī)分組，以便接受以ECP和干擾素α-3MIU開始的治療。病人開始在每隔一周連續(xù)兩天接受ECP治療。在ECP開始之后兩個(gè)星期，病人一周3次皮下接受干擾素-α3MIU治療。如果耐受性好，病人將每隔一周連續(xù)兩天接受ECP治療，持續(xù)另外6個(gè)月，同時(shí)聯(lián)用干擾素α。在6個(gè)月內(nèi)病人接受24次ECP治療。
組Ⅲ(PUAV和IFN-(6MIU))在組Ⅱ開始ECP之后三個(gè)月，將病人隨機(jī)分組，以便接受以ECP和干擾素α6MIU開始的治療。病人每隔一周連續(xù)兩天接受ECP治療。在開始ECP之后的兩周，病人每周三次皮下接受干擾素-α6MIU。
篩選期篩選期的測(cè)量包含病歷和身體檢查，癥狀評(píng)定，體重和血壓檢查。實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)包含區(qū)分的進(jìn)行全血計(jì)數(shù)、甲狀腺功能測(cè)試、凝血酶原時(shí)間，化學(xué)化驗(yàn)項(xiàng)目(panel)以及血清HCG(如果說(shuō)明的話)。血清妊娠HCG在開始治療的24小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行。完整的血液計(jì)數(shù)據(jù)包括血細(xì)胞比容、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)以及按照包含嗜中性白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞示差的總的WBC。化學(xué)化驗(yàn)項(xiàng)目包含總蛋白、白蛋白、總膽紅素、ALT、AST、堿性磷酸酶、γGT、氯化鈉、鉀、CO2含量、脲氮、肌酸酐、葡萄糖、鈣、磷酸鹽、膽固醇、甘油三脂以及尿酸。收集血清和外周血單核細(xì)胞(PBMC)以便用RT-PCR測(cè)定HCV-RNA滴度并用于HCV基因型分析。收集來(lái)自7毫升全血的血清并在-70℃下冷凍，以便進(jìn)一步研究。
治療期在治療過(guò)程中在第2星期，然后每隔3個(gè)星期進(jìn)行癥狀評(píng)定、體重、血壓、全血計(jì)數(shù)以及ALT測(cè)量。在治療過(guò)程中在第2星期，然后每隔3個(gè)星期監(jiān)測(cè)血清中的HCV-RNA滴度。在治療結(jié)束時(shí)測(cè)量PBMC中的HCV RNA滴度。每隔7個(gè)星期收集來(lái)自7毫升全血液的血清并在-70℃下冷凍以便進(jìn)一步研究。在治療結(jié)束時(shí)，進(jìn)行隨訪病歷和身體檢查、化學(xué)化驗(yàn)項(xiàng)目、甲狀腺功能測(cè)試和凝血酶原時(shí)間測(cè)試。
隨訪期在隨訪期內(nèi)每隔7周和最后一次隨訪時(shí)，進(jìn)行癥狀評(píng)定、體重、血壓、全血計(jì)數(shù)和血清HCV RNA測(cè)試。在最后一次隨訪時(shí)測(cè)量PBMC的HCV RNA滴度。每隔3星期并在最后一次隨訪時(shí)，測(cè)量ALT。在隨訪的過(guò)程中每隔7星期收集來(lái)自7毫升全血液的血清并在-70℃下冷凍以便進(jìn)一步研究。在隨訪期內(nèi)的最后一次探訪時(shí)進(jìn)行隨訪病歷和身體檢查、化學(xué)化驗(yàn)項(xiàng)目，甲狀腺功能測(cè)試和凝血酶原時(shí)間測(cè)試。
血清收集利用血清分離器(BD SST)試管收集血清。在抽血后2小時(shí)之內(nèi)，將血液收集試管進(jìn)行離心分離，按1500xg持續(xù)20分鐘。立即收集血清并在-70℃下存儲(chǔ)。
單核細(xì)胞制備用8毫升容量真空容器型CPT單核細(xì)胞制備試管(Becton Dickinson)收集血液。以1500xg,18-25℃將這些試管進(jìn)行離心20分鐘。在不破壞細(xì)胞層的情況下取出血漿，并按照1毫升等份在-70℃下冷凍。將細(xì)胞層用滴管移到15毫升的錐形瓶中并加入10毫升PBS(磷酸鹽緩沖的鹽)。將該試管平緩地進(jìn)行混合五次，然后以300xg離心15分。一旦細(xì)胞沉淀在試管底部后，取出上清液并丟棄。將該沉淀重新懸浮在2毫升的PBS中，然后將其分成1毫升等份倒入1.5毫升Sarstedt管中。將該Sarstedt管在一微離心分離器高速旋轉(zhuǎn)持續(xù)10分鐘。除去上清液并存儲(chǔ)在-70℃下，直到進(jìn)行PCR分析。利用Amplicor檢測(cè)(如下)進(jìn)行PCR分析。
血清或單核細(xì)胞HCV的擴(kuò)增子檢測(cè)HCV RNA檢測(cè)是利用來(lái)自HCV的5’非翻譯區(qū)的單引物對(duì)(經(jīng)生物素化的下游引物)所進(jìn)行的原型PCR檢測(cè)。加入尿嘧啶-N-糖基化酶，以防止擴(kuò)增子污染。將HCV靶RNA在存在Mn++的情況下反轉(zhuǎn)錄并用rTth DNA聚合酶用單一試管反應(yīng)擴(kuò)增。擴(kuò)增之后，將該產(chǎn)物經(jīng)堿變性并與HCV特異性探針雜交。利用帶抗生物毒蛋白辣根過(guò)氧化酶在96微孔平板進(jìn)行檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)微孔平板讀數(shù)器，將檢測(cè)的結(jié)果用A450單位來(lái)表示。
效力標(biāo)準(zhǔn)利用如下的病毒學(xué)和生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量對(duì)治療的反應(yīng)病毒學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(初步標(biāo)準(zhǔn))研究前，治療過(guò)程中監(jiān)測(cè)血清中的HCV-RNA，以確定反應(yīng)，在24星期的隨訪期內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)以便測(cè)定反應(yīng)的穩(wěn)定性。根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)，記錄治療反應(yīng)a)無(wú)反應(yīng)在治療過(guò)程中和隨訪期，利用PCR仍可檢測(cè)到HCV RNA。b)完全反應(yīng)在治療結(jié)束時(shí)利用PCR檢查治療未檢測(cè)到HCV RNA，而在隨訪期結(jié)束前是可檢測(cè)到的。c)痊愈在治療結(jié)束時(shí)利用PCR未能檢測(cè)到HCV RNA，在隨訪期結(jié)束時(shí)仍未能檢測(cè)到。
這一研究表明，單獨(dú)用光滲透或與干擾素治療相結(jié)合，可明顯降低HCV遺傳物質(zhì)的水平。
單獨(dú)采用光滲透降低了對(duì)先前的其它治療無(wú)效的慢性HCV病人的病毒水平。表1(和圖1A)描述了每個(gè)病人原始和經(jīng)8星期治療后(圖1A中的方塊區(qū))的HCV水平。
正如利用RT-PCR所檢測(cè)的，光滲透和干擾素α的聯(lián)合治療消除了在慢性感染HCV的病人的外周血中的病毒。圖1B和1C描述了關(guān)于病人在治療過(guò)程中和完成治療之后的HCV水平。在光滲透治療被中斷后，治療效果也消失了。
表1丙型肝炎組Ⅰ僅用光滲透治療
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權(quán)利要求
1.一種用于治療慢性HCV感染病人的方法，包括a)將一種可光活化的化合物施用到所述病人的血液中；以及b)利用一種其波長(zhǎng)適于活化所述可光活化的化合物的光處理在步驟a)中所述的病人的至少一部分血液，并將經(jīng)處理的血液送回到所述病人身上。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可光活化的化合物是補(bǔ)骨脂素。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的補(bǔ)骨脂素是8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。
4.一制用于治療慢性HCV感染病人的方法，其中所述病人以前已利用干擾素α治療過(guò)，該方法包含a)將一種可光活化的化合物施用到病人的血液中；以及b)利用一種其波長(zhǎng)適于活化所述可光活化的化合物的光處理在步驟a)中所述病人的至少一部分血液，并將經(jīng)處理的血液送回到所述病人身上。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的可光活化的化合物是補(bǔ)骨脂素。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的補(bǔ)骨脂素是8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。
7.一種用于治療慢性HCV感染的病人的方法，包括a)干擾素α施用給所述病人；b)一種可光活化的化合物施用到病人的血液中；以及c)利用一種其波長(zhǎng)適于活化所述可光活化的化合物的光處理步驟b)的所述病人的至少一部分血液，并將經(jīng)處理的血液送回到所述病人。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述可光活化的化合物是補(bǔ)骨脂素。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述補(bǔ)骨脂素是8-甲氧基補(bǔ)骨脂素。
全文摘要
公開一種治療慢性HCV感染病人的方法。該方法包括利用干擾素α對(duì)病人的選擇性治療和利用一種補(bǔ)骨脂素化合物接著通過(guò)利用紫外光活化該補(bǔ)骨脂素處理病人的血液的治療。將按照一種稱之為體外光滲透方法這樣處理的病人的血液返回到病人體內(nèi)。
文檔編號(hào)A61K31/35GK1214636SQ97193296
公開日1999年4月21日 申請(qǐng)日期1997年3月26日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月29日
發(fā)明者S·N·麥勞林, B·C·斯托奇, C·B·奧布里恩 申請(qǐng)人:特拉科斯有限公司