專利名稱：黑皮素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及黑皮素(melanocortin)肽領(lǐng)域。
黑皮素(過去也稱為促黑激素)是最初來源于命名為阿黑皮原(pro-opiomelanocortin)這樣一種較大前體蛋白的肽類。天然黑皮素都具有七肽核心序列Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。這些黑皮素包括α-MSH(α-促黑激素)，β-MSH，γ-MSH，γ-LPH(γ-促脂解素)和ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)。
黑皮素有廣泛的生物學(xué)活性，很早就知道它們能夠刺激色素形成及皮質(zhì)類固醇的形成，同時也發(fā)現(xiàn)它們能夠誘導(dǎo)大鼠的過量梳理行為，促進(jìn)可控的行為規(guī)避反應(yīng)，升高血壓及加快心率，加速神經(jīng)重建和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。就在最近，鑒定和克隆了黑皮素的5種神經(jīng)肽受體。這些受體在不同的組織類型中具有不同的分布形式(在空間上以及豐度上)。它們屬于所謂的G-蛋白偶聯(lián)受體家族。黑皮素受體1(MCR-1)在黑色素細(xì)胞中表達(dá)，然而MCR-2是在諸如腎上腺中表達(dá)的促腎上腺皮質(zhì)激素受體。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黑皮素受體3、4和5表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。與這些受體相關(guān)的配體具有極大的神經(jīng)藥理學(xué)作用，例如使喚起、運動、注意力、記憶和學(xué)習(xí)變得容易。這些配體也與食物激發(fā)的行為有關(guān)。此外還發(fā)現(xiàn)它們與解熱活性有關(guān)。
已制備了許多不同的(合成的)黑皮素類似物，并建議用于激活或阻抑一種或多種黑皮素受體。已揭示這種激動性或拮抗性作用可用于涉及色素形成、神經(jīng)重建等方面的應(yīng)用中。然而，迄今為止研究的黑皮素均缺乏對神經(jīng)系統(tǒng)所表達(dá)受體的專一性(選擇性)，和/或缺乏足夠的結(jié)合親和性或誘導(dǎo)受體介導(dǎo)之反應(yīng)或阻礙所述反應(yīng)的能力。通常期望一種靶向MC-受體的藥物能夠高度有效、可以口服、能適度抵抗體內(nèi)的降解(具有足夠的半衰期)并能夠通過血腦屏障。
本發(fā)明提供了符合這些結(jié)構(gòu)要求、基本上可用作MC受體特異性藥物的肽或肽樣結(jié)構(gòu)。
這樣，本發(fā)明提供了對黑皮素受體，尤其是對mc3、mc4或mc5受體具有特異性結(jié)合親和力的肽，其包含下列序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(Z)或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(Z)其中，X和Y是氨基酸殘基，Z是一個芳香族氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明，上述肽是高度有效的MSH活性激動劑。達(dá)到這種高效力的原因可歸因于第7位(按原始ACTH分子的位置計)，這一位置應(yīng)是D-2-噻吩基-Ala或3-吡啶基-D-Ala，并且對該位置，只能替換成非常有限和非常相似的殘基才不至于影響激動劑效力的提高。MSH激動劑活性的另一重要原因是殘基1-3和/或殘基11-13的去除。第9位芳香族氨基酸的存在也對活性貢獻(xiàn)很大。第4和5位正常情況下不可以去除；這些殘基應(yīng)該存在，盡管在所述位置存在哪種氨基酸殘基遠(yuǎn)不那么關(guān)鍵。已經(jīng)清楚，在這些位置至少可以允許進(jìn)行保守的替換，并且不太保守的替換一般也不會導(dǎo)致效力的顯著喪失。第6位的組氨酸殘基和第8位的精氨酸殘基對活性非常重要，如果能夠進(jìn)行替換的話，那也只能進(jìn)行保守的替換。特別是，在同一分子內(nèi)，更重要的殘基一般不應(yīng)該全部被替換。第9位的優(yōu)選殘基是Naftyl-alanine，既可以是D構(gòu)象，也可以是L構(gòu)象。
這個殘基的存在導(dǎo)致效力進(jìn)一步提高。
第10位氨基酸殘基對該分子的活性不是必需的，但它確實有一些影響。如果存在殘基的話，那么優(yōu)選的是甘氨酸或賴氨酸，其中后者有另外的優(yōu)點，即可以提供反應(yīng)活性部分，所述部分可以用于將該肽與其它分子偶聯(lián)或使該肽環(huán)化。如果要形成環(huán)形肽(這比較優(yōu)選，因為這種環(huán)形肽的半衰期比線性形式有了提高)，那么在另一端也應(yīng)該提供反應(yīng)活性部分。環(huán)形肽另一個優(yōu)點是它們傾向于對MC受體有更高的選擇性，特別是二硫橋可提高對MC-4受體的選擇性。然而，也可以通過在基本核心之外提供可使環(huán)閉合的反應(yīng)活性部分(例如導(dǎo)致形成內(nèi)酰胺的反應(yīng)活性部分)而產(chǎn)生環(huán)形肽。
在位置X和Y(指在原始ACTH核心中第4和5位)最理想的殘基，X位置是Nle，Y位置是甘氨酸或天冬氨酸，其中天冬氨酸的存在還有其它優(yōu)點，即具有產(chǎn)生內(nèi)酰胺的反應(yīng)活性部分。
本發(fā)明的肽一般比MSH本身更有效。優(yōu)選肽的效力比MSH要高達(dá)100倍。本發(fā)明也包括一些效力較低的肽，因為效力并不是以肽為基礎(chǔ)的有效藥物必須符合的唯一標(biāo)準(zhǔn)。如上面已經(jīng)提到，半衰期和選擇性也是重要參數(shù)。
確定肽效力的試驗是常規(guī)的體外試驗，以及在大鼠中衡量梳理行為的體內(nèi)實驗。梳理實驗的結(jié)果很好地顯示出諸肽能夠激活受體，并且由此激活與所述受體偶聯(lián)的G蛋白級聯(lián)，因此，這些肽能夠用作MC受體的激動劑。本發(fā)明提供了對MC受體特別具有選擇性的肽，以激動劑的方式靶向MC受體、特別是MC-4受體可以用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，各種神經(jīng)病，肥胖癥，特別是與神經(jīng)病有關(guān)的糖尿病，以及由細(xì)胞毒性治療(化學(xué)治療法等)引起的神經(jīng)病。
因此，本發(fā)明也提供了能夠治療上述病情的藥物組合物。用于這種治療的劑量通常是每日給藥一次，用量為每劑量單位約1μg-100mg，優(yōu)選10μg-10mg，更優(yōu)選50μg-1mg。該劑量應(yīng)能使得體內(nèi)濃度可達(dá)0.1nM-1μM，優(yōu)選1nM-100nM，更優(yōu)選10-50nM。組合物中可含有用于肽藥物或肽衍生藥物常規(guī)劑型的常規(guī)添加劑。這種劑型優(yōu)選是口服劑型，如片劑、粒劑、粉劑或液體劑型，雖然也可以應(yīng)用腸內(nèi)和胃腸外施用方式。特別優(yōu)選的是這樣的組合物，其中本發(fā)明的肽與旨在預(yù)防或可導(dǎo)致神經(jīng)病的藥物(如胰島素和細(xì)胞毒性劑)一起合并使用。
本發(fā)明將在下面的試驗部分作詳細(xì)解釋。
實驗材料與方法黑皮素配體的受體活性通過磷酸鈣沉淀方法，用人MC3(Gantz等，JBC 1993.2688246-8250)、人MC4(Gantz等JBC 1993.26815174015179)或人MC5受體構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了人胚腎(HEK293)細(xì)胞。在每一個實驗的開始時，用pCRE-LacZ載體10μg(Chen等，1995，生化分析226349-354)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，充當(dāng)報告質(zhì)粒，該載體中LacZ基因的表達(dá)由一個cAMP響應(yīng)性元件驅(qū)動。在pCRE-LacZ轉(zhuǎn)化后第二天，將細(xì)胞分離到96孔板上。48小時后，用測試培養(yǎng)基(DMEM+0.1mg/ml BSA，0.1mM IBMX)中的不同濃度MC受體配體刺激細(xì)胞6小時。在裂解緩沖液中經(jīng)一輪凍融裂解細(xì)胞，加入底物緩沖液(60mM磷酸鈉，1mM氯化鎂，5mM β-巰基乙醇，200μg/ml ONPG)，然后將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)1小時。利用如Chen等所述的顯色測定法，在小平板讀數(shù)儀(Biorad Model 3500)中，于405nm檢測因受體激活所引起的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活情況。
動物，插管植入，腦室內(nèi)注射在深度麻醉狀態(tài)下，將插管植入體重為120-130g的雄Wistar大鼠的腦室內(nèi)孔中(Brakkee等，生命科學(xué)，第17卷，1979)。使大鼠恢復(fù)3天，再用于接下來的10天實驗中。如果大鼠被用于多次梳理實驗中，那么它們應(yīng)在連續(xù)的實驗之間恢復(fù)至少三天。用Hamilton注射器，對溶于3μg鹽溶液(154mM氯化鈉)中的肽(15ng)進(jìn)行腦室內(nèi)注射。按照Gispen等(實驗動物科學(xué)(Lab.Anim.Sci.)，29，1975)的方法進(jìn)行梳理實驗。注射后立即將大鼠置于觀察盒內(nèi)。在注射15分鐘后開始觀察，并持續(xù)50分鐘。在50分鐘的時間內(nèi)，每15秒對梳理行為進(jìn)行評分，這樣得到的大鼠梳理行為最高分為200。
肽的合成肽的純化利用配備了Waters RCM組件的Waters Prep 4000液體層析系統(tǒng)進(jìn)行制備性HPLC，所述組件帶有兩個PrepPak柱和quard柱(25×210mm)，內(nèi)裝Delta-Pak C18材料。在制備性小室中利用Waters 486分光光度計在230nm處檢測肽。用含0.1％三氟乙酸(TFA)的水和含0.1％TFA的乙腈進(jìn)行梯度純化。
α-MSH肽的合成和環(huán)化方法復(fù)肽的合成我們用Hamilton Microlab 2200同時合成了多達(dá)40種肽，合成水平為30μmol。將Hamilton Microlab 2200的程序設(shè)置為將洗滌溶劑和反應(yīng)試劑送遞到帶有40個獨立的具濾膜的4ml柱的架子上，柱中含有Rink(4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基)樹脂用于肽合成。柱子在每一步驟后都自動真空抽干。依據(jù)Fmoc/HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸)化學(xué)[Fields等，肽研究4，95-101]進(jìn)行偶聯(lián)循環(huán)，雙偶聯(lián)步驟為40分鐘。利用1.5ml的三氟乙酸/苯酚/苯硫基甲烷/水/乙二硫醇(10/0.75/0.5/0.5/0.25)混合物，在2小時內(nèi)使肽去保護(hù)并裂解，然后加入己烷/二乙醚1/1沉淀2次。沉淀物干燥，并從水/乙腈中凍干。
肽的環(huán)化利用經(jīng)HPLC純化的肽或粗提的肽，通過半胱氨酸間的二硫橋或通過天冬氨酸和賴氨酸側(cè)鏈間的內(nèi)酰胺橋進(jìn)行環(huán)化A.二硫橋?qū)⒋种芃BJ06(40mg)溶于40ml的0.5％碳酸氫銨溶液(pH8)中，攪拌過夜。24小時后，用Ellman’s試劑檢測不到游離巰基，向其中加入0.5ml乙酸后再凍干產(chǎn)物。將肽溶于3ml的40％乙酸中，再通過30分鐘內(nèi)梯度為14％至20％乙腈水溶液(包含0.1％TFA)的制備性HPLC純化肽。純化后的產(chǎn)率為22.8mg。
B.內(nèi)酰胺橋?qū)?0ml DMF(肽級)，26mg苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷鏻六氟磷酸鹽(PyBOP，0.05mmol)和0.017mlDIEA(0.1mmol)的混合物加入粗制MBJ07(20mg，0.012mmol)中。環(huán)化反應(yīng)后進(jìn)行分析HPLC。2小時后，用0.1M HCl將混合物酸化至pH4。產(chǎn)物用30ml水稀釋后，通過30分鐘內(nèi)梯度為21％至30％乙腈水溶液(包含0.1％TFA)的制備性HPLC進(jìn)行純化。產(chǎn)率為15.4mg。
結(jié)果通過PEPSCAN對產(chǎn)生的MSH肽進(jìn)行的篩選表明有幾個氨基酸可以提高M(jìn)SH效力。MSH肽中第7位的D-2-噻吩基-Ala和3-吡啶基-D-Ala對于提高M(jìn)SH的效力作用最大。第9位的Naftyl-Ala也提高了MSH效力(

圖1b)。第1-3位和第11-13位的刪除進(jìn)一步提高了MSH活性。圖1顯示了下列肽的劑量-反應(yīng)曲線MBU 23*2GH6R7G# 線性MBU 24*2GH6R8G# 線性MBU 27*CGH6R8C# 環(huán)形二硫橋MBU 28*2DH6R8K# 環(huán)形內(nèi)酰胺MBU 29*2DH6R7K 環(huán)形內(nèi)酰胺*乙酰基 #carboxamid 2＝正亮氨酸 6＝D-噻吩基，7＝2-naftyl-L-丙氨酸，8＝2-naftyl-D-丙氨酸第4和5位可能不太關(guān)鍵(圖3和4)。
在第9位高度優(yōu)選芳香族氨基酸(F，W，Y)(圖2)。圖3至9分別表示在Nle-MSH第4-10位進(jìn)行不同氨基酸替換的效果。
圖6顯示，腦室內(nèi)注射后，這些肽誘導(dǎo)梳理行為的活性。MSH可以誘導(dǎo)過量梳理行為的最低劑量為1500ng。此處所測試的5種化合物在體內(nèi)比MSH的效力高100倍。表1在三個不同的細(xì)胞系中計算的EC50值hMC3 hMC4 hMC5MBU23 5.510-95.510-9n.d.
MBU24 3.010-91.310-84.810-8MBU27 1.310-76.010-92.510-6MBU28 6.310-71.710-84.510-8MBU29 1.410-91.510-82.310-8α-MSH1.410-82.610-83.010-8圖注圖1.不同的MSH肽在穩(wěn)定表達(dá)人MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞中的劑量響應(yīng)曲線。MBU27顯示對MC4受體具有特異性。MBU23是所有三種受體的有效配體。
圖1b.第7和9位的不同氨基酸以及MBU23和MBU24的影響。所有肽都是在100nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。各值表示相比于100nM NDP-MSH最大活性的活性百分比。
圖2.在NDP-MSH第9位氨基酸進(jìn)行單個氨基酸替代的效果。X軸上繪出的是取代內(nèi)源氨基酸(Trp)的各個氨基酸。各值表示相比于10nMα-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在10nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。在NDP-MSH背景下，此位置高度優(yōu)選芳族氨基酸。
圖3.在Nle-MSH第4位氨基酸進(jìn)行的單個氨基酸替代的結(jié)果。X軸上繪出的是取代內(nèi)源氨基酸(Met)的各個氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。
圖4.在Nle-MSH第5位氨基酸進(jìn)行的單個氨基酸替代的結(jié)果。X軸上繪出的是取代內(nèi)源氨基酸(Glu)的各個氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。
圖5.在Nle-MSH第6位氨基酸進(jìn)行的單個氨基酸替代的結(jié)果。X軸上繪出的是取代內(nèi)源氨基酸(His)的各個氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。
圖6.在Nle-MSH第7位氨基酸進(jìn)行的單個氨基酸替代的結(jié)果。X軸上繪出的是取代內(nèi)源氨基酸(Phe)的各個氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。
圖7.在Nle-MSH第8位氨基酸進(jìn)行的單個氨基酸替代的結(jié)果。X軸上繪出的是取代內(nèi)源氨基酸(Arg)的各個氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。只檢測了5種氨基酸替換。
圖8.在Nle-MSH第9位氨基酸進(jìn)行的單個氨基酸替代的結(jié)果。X軸上繪出的是取代內(nèi)源氨基酸(Trp)的各個氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。
圖9.在Nle-MSH第10位氨基酸進(jìn)行的單個氨基酸替代的結(jié)果。X軸上繪出的是取代內(nèi)源氨基酸(Gly)的各個氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的濃度下對穩(wěn)定表達(dá)三種不同MC受體MC3、MC4和MC5受體的HEK293細(xì)胞進(jìn)行檢測。
圖10.
肽誘導(dǎo)的梳理行為將3μl鹽溶液，或者3μl鹽溶液與15ng MBU肽或150ng α-MSH或1500ng α-MSH一起腦室內(nèi)注射到大鼠中，并且對梳理行為進(jìn)行評分(平均值±s.d.)。
權(quán)利要求
1.一種對黑皮素受體、優(yōu)選MC3或MC4或MC5受體具有特異結(jié)合親和性的肽，其包括序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(Z)或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(Z)其中X和Y是氨基酸殘基，且Z是一個芳族氨基酸殘基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其包括序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(2-naftyl-Ala)或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(2-naftyl-Ala)其中X和Y如權(quán)利要求1中的定義。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，其包括序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(Z)-Z2或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(Z)-Z2其中X、Y和Z如權(quán)利要求1或2中的定義，Z2是一個氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的肽，其中Z2是甘氨酸或賴氨酸。
5.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的肽，其中Y是甘氨酸或天冬氨酸。
6.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的肽，其中X是Nle。
7.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求的肽，其是環(huán)形的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的肽，其中環(huán)形肽是通過形成二硫橋產(chǎn)生的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的肽，其中環(huán)形肽是通過形成內(nèi)酰胺產(chǎn)生的。
10.含有上述任何一項權(quán)利要求的肽的藥物組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其進(jìn)一步包含胰島素或其功能等同物。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其進(jìn)一步包含細(xì)胞毒性劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了衍生自包括ACTH在內(nèi)的一組激素中的一些新型肽。這些命名為黑皮素的肽可以靶向在數(shù)種組織中分布常各異的不同受體。本發(fā)明的肽可用于以激動劑方式靶向神經(jīng)系統(tǒng)中的受體。也公開了一些藥物組合物以及它們的用途。
文檔編號A61P5/38GK1246868SQ97181332
公開日2000年3月8日 申請日期1997年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月17日
發(fā)明者R·A·H·阿丹, J·P·H·布巴奇, W·H·吉斯佩 申請人:扇形支撐劍橋有限公司