專(zhuān)利名稱(chēng)：哺乳動(dòng)物眼睛提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種哺乳動(dòng)物眼睛的提取物，具體地講，本發(fā)明涉及的是一種從豬眼睛中提取的一組多肽。
從醫(yī)學(xué)上講，視網(wǎng)膜屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，其神經(jīng)元損傷后的再生和修復(fù)能力低下。各種原因引起的“視網(wǎng)膜神經(jīng)損害”一直缺乏有效的治療方法，近年來(lái)國(guó)外的研究表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、睫狀體神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)等在體內(nèi)外中樞神經(jīng)系及周?chē)窠?jīng)系的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺(jué)神經(jīng)元、交感神經(jīng)元的發(fā)育、存活、分化及損傷后修復(fù)等方面具重要作用；另外，坐骨神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦來(lái)源營(yíng)養(yǎng)因子等對(duì)成年鼠軸突損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活有較好的支持作用。
據(jù)此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠促進(jìn)視網(wǎng)膜及視神經(jīng)損傷后再生和修復(fù)的“神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”，具體地講，本發(fā)明的目的在于提供一種從健康哺乳動(dòng)物眼球組織中，用現(xiàn)代生化技術(shù)，提取的一組分子量約10KD左右的具生物活性的多肽，制成凍干注射制劑，用于治療各類(lèi)原因?qū)е碌囊暽窠?jīng)及視網(wǎng)膜損傷類(lèi)疾患，即本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物眼睛提取物。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)如下的過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)。
1、用現(xiàn)代生化技術(shù)從動(dòng)物眼睛組織中提取多肽物質(zhì)，分離出分子量約10KD左右的小分子量多肽，制成凍干制劑，每瓶多肽含量約1mg。
2、SDS-PAGE電泳分析的結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物眼睛提取物的分子量約為10KD的小分子多肽。
3、HPLC分析結(jié)果，哺乳動(dòng)物眼睛提取物(批號(hào)960928)，進(jìn)樣量20μl，用C18柱分析，波長(zhǎng)245nm，哺乳動(dòng)物的提取物為保留時(shí)間約2.64-8.72min的八組份多肽；用凝膠柱分析，波長(zhǎng)280nm，眼睛提取物為保留時(shí)間約13.13-17.03min的六組份多肽。
4、動(dòng)物過(guò)敏試驗(yàn)、降壓試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)及異常毒性試驗(yàn)均合格。
5、對(duì)新生鼠視網(wǎng)膜視神經(jīng)元存活和生長(zhǎng)促進(jìn)作用試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物眼睛提取物有維持視網(wǎng)膜神經(jīng)元存活，促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和易化突起生長(zhǎng)的作用，且神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用與眼睛提取物有明顯的量效關(guān)系。
下面是


，通過(guò)

并結(jié)合以后的詳細(xì)說(shuō)明，可以清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容。
附圖1是本發(fā)明所述的豬眼提取物以C18柱的HPLC的圖譜；附圖2是本發(fā)明所述的豬眼提取物的電泳照片；附圖3是本發(fā)明所述的眼睛提取物對(duì)新生鼠培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用的照片，其中，AB是相差顯微鏡照片。CD是硫堇染色的照片；AC是對(duì)照組；BD是實(shí)驗(yàn)組。
本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物眼睛提取物的制備過(guò)程可通過(guò)以下的實(shí)施例得到進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例1本實(shí)施例具體地涉及正常健康豬眼球的提取物，將豬的眼球去除筋膜，清洗搗碎，經(jīng)冷凍、加熱處理，采用離心、超濾、層析等現(xiàn)代生化技術(shù)分離提純出一組分子量約為10KD的多肽物質(zhì)，經(jīng)電泳、高效液相色譜等技術(shù)分析其組分，并經(jīng)活性鑒定后，無(wú)菌分裝冷凍干燥，制成每瓶生物活性物質(zhì)為1mg的豬眼提取物。
本實(shí)施例所述的豬眼睛提取物的質(zhì)量控制如下SDS-PAGE電泳分析，所述的豬眼提取物的多肽分子量約3.0-15KD。
HPLC分析，分別以C18柱與凝膠柱分析，豬眼睛提取物各組分及各組分保留時(shí)間，峰值應(yīng)基本與標(biāo)準(zhǔn)一致。
動(dòng)物過(guò)敏試驗(yàn)，降壓試驗(yàn)，熱源試驗(yàn)等應(yīng)合格。
無(wú)異常毒性物質(zhì)，急性毒性試驗(yàn)及慢性毒性試驗(yàn)合格。
從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，本發(fā)明所述的眼睛提取物可以用于視神經(jīng)變性和視網(wǎng)膜損傷等方面疾患的治療。
本發(fā)明所述的豬眼提取物在用于臨床時(shí)還應(yīng)滿(mǎn)足如下的條件，即規(guī)格多肽含量1mg/支用法每支用注射用水1ml稀釋?zhuān)浞只靹虺沙吻迦芤海扇∏蚝蠡蚯蚺宰⑸?，隔日一次或每周二次?br> 保存4-8℃。
本實(shí)施例所述的豬眼提取物對(duì)新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)存活和生長(zhǎng)的促進(jìn)作用試驗(yàn)如下所用的材料和方法用24只出生1-3天的SD大鼠，分為6批實(shí)驗(yàn)，每批4只，在無(wú)菌條件下取出雙側(cè)眼球，用Hank′s液沖洗三次，在解剖鏡下沿角鞏緣剪開(kāi)眼球，剝離視網(wǎng)膜。視網(wǎng)膜在Hank′s液清洗三次，稍加剪碎，然后投入0.125％胰蛋白酶液中，于37℃培養(yǎng)箱中消化20-30分鐘。
然后，吸去消化液，用含10％小牛血清的DMEM/F12接種培養(yǎng)基洗二次，加接種培養(yǎng)2ml，用光滑管口的細(xì)吸管輕輕吹打，制成細(xì)胞懸浮液。將視網(wǎng)膜細(xì)胞接種于96孔板和24孔板上，分別作存活率計(jì)數(shù)和形態(tài)觀察。
存活率觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞每孔1×105的細(xì)胞密度培養(yǎng)在多聚賴(lài)氨酸包被的96孔板上，每孔實(shí)驗(yàn)容量為100μl，細(xì)胞貼壁后，吸去種植培養(yǎng)液，重新加入100μl無(wú)血清培養(yǎng)基或含5％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。其中每100μl培養(yǎng)液中分別含有4、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06μl等10個(gè)濃度的本發(fā)明所述的眼睛提取物(N=4)，對(duì)照組不加，于37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。吸去培養(yǎng)基后，用1％臺(tái)盼藍(lán)染色10分(室溫下)，然后用10％福爾馬林磷酸緩沖液固定，以PB洗一遍，在倒置鏡下(×400)計(jì)數(shù)臺(tái)盼藍(lán)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，每組4孔，每孔至少計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞，以計(jì)算細(xì)胞存活率。

同時(shí)計(jì)數(shù)有突起的細(xì)胞，以細(xì)胞突起長(zhǎng)度大于2倍細(xì)胞體的長(zhǎng)徑的細(xì)胞計(jì)為有突起細(xì)胞，并計(jì)算有突起細(xì)胞占存活細(xì)胞的百分比。
形態(tài)學(xué)觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞按每孔3.5×105的細(xì)胞密度種于多聚賴(lài)氨酸包被的24孔板上，每孔實(shí)驗(yàn)容量為600μl，每100μl的加藥量和其它實(shí)驗(yàn)步驟同上。
培養(yǎng)96小時(shí)后用固定液固定，用CajalⅢ氨酒精法鍍銀染色，或用硫堇染色，觀察細(xì)胞形態(tài)、突起生長(zhǎng)等情況，并用相差和明視野拍照。
結(jié)果光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜細(xì)胞在多聚賴(lài)氨酸支持物上生長(zhǎng)。在添加了本發(fā)明所述的眼睛組織提取液的實(shí)驗(yàn)組和為添加眼睛提取液的對(duì)照組之間生長(zhǎng)情況有差別。實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)較差。
在對(duì)照組，培養(yǎng)48小時(shí)視網(wǎng)膜繼胞多聚集成小團(tuán)，為具有短突起或無(wú)突起的小細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)有52％的陽(yáng)性細(xì)胞，即死細(xì)胞；在添加了提取液的實(shí)驗(yàn)組，視網(wǎng)膜細(xì)胞生長(zhǎng)良好，胞體飽滿(mǎn)有光澤，一部分細(xì)胞胞體增加，有突起細(xì)胞增多，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)結(jié)果是，每100μl添加了4、2、1μg組的陽(yáng)性細(xì)胞分別為40％、41％和47％。在0.8μg時(shí)的陽(yáng)性細(xì)胞為51％。表1顯示了視網(wǎng)膜培養(yǎng)細(xì)胞存活率情況，表明與對(duì)照組相比，本發(fā)明所述的眼睛提取液組細(xì)胞存活率較對(duì)照組升高，差異有顯著意義(P＜0.01)。表1本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物眼睛提取物對(duì)新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元培養(yǎng)存活率的影響(％)本發(fā)明所述的豬眼提取物組(μg/100μl)對(duì)照組0.10.40.8124存活率均數(shù)47.84 43.34 45.66 48.50 52.51*58.87**59.52**標(biāo)準(zhǔn)差 3.07 3.38 4.11 4.28 4.43 3.516.34*與對(duì)照組比較差異有顯著意義(P＜0.05)**與對(duì)照組比較差異有極顯著意義(P＜0.01)表2顯示本發(fā)明所述的豬眼提取液對(duì)新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用，與對(duì)照組相比，含0.1μg提取液組尚未見(jiàn)突起生長(zhǎng)效應(yīng)，當(dāng)增加到含0.4和0.8μg提取液時(shí)，有突起細(xì)胞排分比顯著升高，差異分別有顯著和極顯著意義(P＜0.05,P＜0.01)。且隨著劑量的增加突起生長(zhǎng)效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。表2本發(fā)明所的豬眼提取物對(duì)新生鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元培養(yǎng)突起生長(zhǎng)的作用(％)本發(fā)明所述的豬眼提取物(μg/100μl)對(duì)照組0.1 0.40.8 1 2 4均數(shù) 1.61 1.48 2.57*3.95**5.20**6.59**7.47**標(biāo)準(zhǔn)差0.25 0.24 0.31 0.340.420.440.65表中數(shù)據(jù)為有突起細(xì)胞占存活神經(jīng)元總數(shù)的百分比*與對(duì)照組比較差異有顯著意義(P＜0.05)**與對(duì)照組比較差異有極顯著意義(P＜0.01)在培養(yǎng)4天時(shí)，銀染色和硫堇染色顯示，實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜神經(jīng)元胞體進(jìn)一步增大，突起延長(zhǎng)，突起數(shù)及分支增多，對(duì)照組胞體較小，突起不明顯(見(jiàn)附圖3)。討論視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞，特別是節(jié)細(xì)胞，在出生后的存活、生長(zhǎng)和分化受許多因素和化學(xué)物質(zhì)的影響，特別是靶源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如中腦頂蓋組織提取液對(duì)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。
其它如腦來(lái)源營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和睫狀節(jié)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CDNF)都顯示了視網(wǎng)膜神經(jīng)元的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)。
本研究將眼睛組織提取液添加到培養(yǎng)液中，結(jié)果顯示提取物有維持視網(wǎng)膜神經(jīng)元存活，促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和易化突起生長(zhǎng)的作用，這種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用呈明顯的量效關(guān)系，其維持神經(jīng)元存活的作用在約2％的劑量時(shí)似乎達(dá)到最大效應(yīng)；其促神經(jīng)突起生的作用在0.4％的劑量時(shí)即有效，但在達(dá)到4％的劑量時(shí)尚未飽和。表3是采用C18柱的HPLC(即圖1)的測(cè)試數(shù)據(jù)System:P-W on Comn Port 2Analyst:AnalystAcquisitoin Method:C:\SPA\P-W｜Methods\DEFAULT.aqm10-04-96 09:39:34Calculation Method:C:\SPA\P-W｜Methods\DEFAULT.aqm07-31-96 08:25:40Report Method:C:\SPA\P-W\Methods\DEFAULT .rpm10-04-96 16:22:08Component RT(min) AreaHeight Area％ Peak Type1 2.6430857027936 5.95Fused2 3.5518002898683.47Fused3 3.8211104758982.14Fused4 4.201225014 85984 23.64 Fused5 4.5049620 58020.96Fused6 4.5185119 57521.64Fused7 4.9655019 51181.06Fused8 5.1416658490343.21Fused9 5.371866965 97440 36.02 Fused105.5969675431200 13.44 Fused117.6510513876022.03Fused127.6613147274702.54Fused138.5988690 63561.71Fused148.6010467 63660.20Fused158.6210217560941.97FusedTotals 5182662 317920 100.00表4是凝膠柱的HPLC的測(cè)試數(shù)據(jù)Mode:Acquired DataResults:O:\SPA\P-W1\Data\GMT1.resComponent RT(min)AreaHeight Area％ Peak Type112.96 930763 127527.42 Fused213.90 2066908 3646216.47Fused314.20 1799469 4002814.34Fused414.86 1449024 3004411.54Fused515.95 2839991 6644822.63Fused617.03 3466038 7147627.61FusedTotals 12552193 257210 100.00 Tailine上述結(jié)果證實(shí)本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物眼睛提取物具有促進(jìn)新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元培養(yǎng)的存活和生長(zhǎng)的作用，可以用于視神經(jīng)變性和視網(wǎng)膜損傷的治療。
權(quán)利要求
1.一種哺乳動(dòng)物眼睛的提取物，其特征在于所述的哺乳動(dòng)物提取物是一種從豬眼睛中提取的一組多肽，所述的提取物同時(shí)還應(yīng)該滿(mǎn)足如下條件a、用現(xiàn)代生化技術(shù)從動(dòng)物眼睛組織中提取多肽物質(zhì)，分離出分子量約10KD左右的小分子量多肽，制成凍干制劑，每瓶多肽含量約1mg。b、SDS-PAGE電泳分析的結(jié)果顯示，本發(fā)明所述的哺乳動(dòng)物眼睛提取物的分子量約為10KD的小分子多肽。c、HPLC分析結(jié)果，哺乳動(dòng)物眼腈提取物(批號(hào)960928)，進(jìn)樣量20μl，用C18柱分析，波長(zhǎng)245nm，哺乳動(dòng)物的提取物為保留時(shí)間約2.64-8.72min的八組份多肽；用凝膠柱分析，波長(zhǎng)280nm，眼睛提取物為保留時(shí)間約13.13-17.03min的六組份多肽。d、動(dòng)物過(guò)敏試驗(yàn)、降壓試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)及異常毒性試驗(yàn)均合格。e、是采用C18柱的HPLC(即圖1)的測(cè)試數(shù)據(jù)System:P-Won Comn Port 2Analyst:AnalystAcquisitoin Method:C:\SPA\P-W｜Methods\DEFAULT.aqm10-04-96 09:39:34Calculation Method:C:\SPA\P-W｜Methods\DEFAULT.aqm07-31-96 08:25:40Report Method:C:\SPA\P-W\Methods\DEFAULT .rpm10-04-96 16:22:08Component RT(min) AreaHeight Area％ Peak Type1 2.64 308570 27936 5.95Fused2 3.55 180028 98683.47Fused3 3.82 111047 58982.14Fused4 4.20 1225014 85984 23.64 Fused5 4.50 4962058020.96Fused6 4.51 8511957521.64Fused7 4.96 5501951181.06Fused8 5.14 166584 90343.21Fused9 5.37 1866965 97440 36.02 Fused105.5969675431200 13.44 Fused117.6510513876022.03Fused127.6613147274702.54Fused138.5988690 63561.71Fused148.6010467 63660.20Fused158.6210217560941.97FusedTotals 5182662 317920 100.00f、是凝膠柱的HPLC的測(cè)試數(shù)據(jù)Mode:Acquired DataResults:O:\SPA\P-W1\Data\GMT1.resComponent RT(min) Area Height Area％ Peak Type1 12.96930763127527.42 Fused2 13.902066908 3646216.47Fused3 14.201799469 4002814.34Fused4 14.861449024 3004411.54Fused5 15.952839991 6644822.63Fused6 17.033466038 7147627.61FusedTotals 12552193 257210 100.00 Tailing
全文摘要
本發(fā)明涉及的是一種哺乳動(dòng)物眼睛的提取物,具體地講,它是用生化技術(shù)從動(dòng)物眼睛組織中提取的多肽物質(zhì),分子量約為10KD;本發(fā)明所述的眼睛提取物有維持視網(wǎng)膜神經(jīng)元存活,促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和易化突起生長(zhǎng)的作用,可以用于視神經(jīng)變性和視網(wǎng)膜損傷等方面疾患的治療。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1221751SQ97125799
公開(kāi)日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1997年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月30日
發(fā)明者陳光明, 謝宗法, 楊富強(qiáng), 黃英, 吳樂(lè)園 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四五八醫(yī)院