專利名稱：與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于含有巴曲酶(batroxobin)作為有效成分的、預(yù)防和/或治療與細(xì)胞凋亡(apoptosis)有關(guān)的疾病的藥劑。
細(xì)胞凋亡是由Kerr、Wyllie’、Currie等人提出的細(xì)胞死的過程或方式之一(參見Brit，J.Cancer，26，239(1972))。在胚胎學(xué)中現(xiàn)已知道，在胚胎發(fā)生的一定時(shí)期在一定的地方必然發(fā)生細(xì)胞死，在隨著發(fā)生的程序而產(chǎn)生的細(xì)胞死的意義上也被稱作“程序細(xì)胞死”。因此，在形態(tài)學(xué)上與必要的細(xì)胞受到障礙而壞死的過程(necrosis)有所區(qū)別。作為細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)的特征，可以舉出與周圍的細(xì)胞缺少接觸、細(xì)胞質(zhì)的濃縮化、與核酸內(nèi)切酶的活性有關(guān)的染色質(zhì)的凝縮和核凝縮、以及核的分節(jié)化等，此外還可以觀察到細(xì)胞表面的微絨毛的消失以及細(xì)胞表面的平滑化(細(xì)胞表面的水泡形成membrane blebbing)等。另外，通過核酸內(nèi)切酶活性還可以觀察到DAN片段化的現(xiàn)象，細(xì)胞本身形成被稱作凋亡小體的細(xì)胞片段，所形成的凋亡小體迅速被周圍的細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等蠶食分解，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡。
現(xiàn)已知道，生物體通過細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的平衡而自動(dòng)調(diào)節(jié)、維持動(dòng)態(tài)平衡(homeostasis)。以往，人們對(duì)細(xì)胞增殖的控制研究得較多，但對(duì)細(xì)胞死亡的控制則幾乎毫無所知。眾所周知，細(xì)胞凋亡是由生理活性物質(zhì)(神經(jīng)生長因子(NGF)或集群刺激因子(CSF)等)的缺乏、凋亡誘導(dǎo)因子(腫瘤壞死因子(TNF)和淋巴細(xì)胞毒素等的因子以及C-myC、p-53基因產(chǎn)物等)誘導(dǎo)的(參見Cell，69，119(1992)；Nature，362，849(1993))，另一方面，細(xì)胞凋亡受到凋亡抑制因子(bC1-2等)的抑制(參見Nature，359，552(1992)；NATure，359，554(1992))等。
最近，人們已經(jīng)知道，這種細(xì)胞凋亡在多種疾病中都起到重要作用，并進(jìn)行了各種試驗(yàn)，試圖通過誘導(dǎo)或控制細(xì)胞的凋亡來診斷、預(yù)防和治療這些疾病，引起世人的關(guān)注(參見Science，267，1456(1995))。
另外，現(xiàn)在，在局部缺血后的神經(jīng)細(xì)胞死亡中海馬遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡由于與細(xì)胞凋亡有關(guān)而受到人們的注意。即，將沙土鼠或大鼠的兩側(cè)頸動(dòng)脈短時(shí)間(～10分鐘)閉塞后再開通，2天(48小時(shí))以后觀察到兩側(cè)海馬CA1區(qū)域的細(xì)胞死，經(jīng)過4天(96小時(shí))以上時(shí)，細(xì)胞縮小、呈樹狀突起，觀察到空包，在一周后完全消滅。
腦是全身的組織中耗氧量最高的組織，而且也是消耗大量能量的部位。因此，對(duì)于局部缺血來說是一個(gè)薄弱的部位，容易因神經(jīng)細(xì)胞壞死而引起腦功能障礙。神經(jīng)細(xì)胞死亡在發(fā)育過程中可以明顯地觀察到，細(xì)胞在產(chǎn)生之后不斷地死亡。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在人的大腦皮層中，每天大約有10萬個(gè)神經(jīng)細(xì)胞死亡。神經(jīng)細(xì)胞是不能再生的，因此，如果由于某種障礙而過度死亡，將導(dǎo)致功能障礙。特別成問題的是由于局部缺血、藥物、應(yīng)激反應(yīng)或病毒等而引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡，弄清楚其機(jī)理對(duì)于研制腦缺血性障礙的治療藥劑或因AIDS引起的神經(jīng)障礙等多種神經(jīng)疾病的治療藥劑和確定治療方法以及了解神經(jīng)細(xì)胞長期生存能力的線索都是致關(guān)重要的。
另外，最近，細(xì)胞凋亡與包括阿爾茨海默氏病和帕金森氏病等在內(nèi)的神經(jīng)變性疾病的關(guān)系也受到人們的關(guān)注，弄清發(fā)病的機(jī)理以及研制預(yù)防的方法和治療藥劑成為日益重要的課題。
本發(fā)明的目的是，提供通過抑制細(xì)胞凋亡來有效地預(yù)防和/或治療與凋亡有關(guān)的疾病的治療藥。
在此之前，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，巴曲酶在局部缺血再灌流時(shí)可以有效地預(yù)防和/或治療心臟病、腦疾病，并且就此而申請(qǐng)了專利(特愿平7-161665)。該專利申請(qǐng)是基于發(fā)現(xiàn)巴曲酶可以抑制細(xì)胞受傷害而死亡的過程(壞死)而完成的。如上所述，“細(xì)胞凋亡”與“壞死”在形態(tài)學(xué)上是完全不同的，在上述專利申請(qǐng)中完全沒有提及巴曲酶與抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
本發(fā)明人對(duì)巴曲酶的藥理作用進(jìn)一步進(jìn)行了詳細(xì)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴曲酶具有抑制細(xì)胞凋亡的效果，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明中的巴曲酶是“由Bothrops atrox moojeni蛇毒提取的凝血酶樣酶”，作為市售的制劑例如可以舉出東菱藥品工業(yè)(株)制造的巴曲酶制劑。
本發(fā)明的與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥，能抑制凋亡，可以用來作為預(yù)防和/或治療這些與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病。上述與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病例如可以舉出局部缺血性疾病(再灌流障礙除外)、神經(jīng)障礙疾病、末梢神經(jīng)障礙、再生不良性貧血、肝障礙和HIV感染癥等。上述的局部缺血性疾病例如可以舉出心肌梗塞、心絞痛、淤血性心力衰竭和心律不齊等心臟病、中風(fēng)、蛛網(wǎng)膜下出血、腦梗塞和腦血栓等腦血管疾病等。另外，上述的神經(jīng)變性疾病例如可以舉出阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、色素性網(wǎng)膜炎和小腦變性等。
每1ml巴曲酶(由Bothrops atrox moojeni蛇毒提取的凝血酶樣酶)制劑中的成分及含量如下。巴曲酶(主要成分)10BU氯丁醇(防腐劑) 3mG明膠水解物(穩(wěn)定化劑)0.1mG氯化鈉(等張化劑)9mG注射用蒸餾水 總量1ml本發(fā)明的巴曲酶的用藥量，根據(jù)病癥而有所不同，一般地說，成人每天一次、1-20巴曲酶單位(Batroxobin Unit，簡稱BU)，根據(jù)癥狀適當(dāng)增減。最好是將其適當(dāng)稀釋，點(diǎn)滴靜脈內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥或者局部給藥。這里所說的巴曲酶單位，是表示巴曲酶的酶活性量的單位，在37℃的溫度下，標(biāo)準(zhǔn)人一枸櫞酸血漿0.3ml中添加0.1ml巴曲酶溶液時(shí)，在19.0±0.2秒內(nèi)使血漿凝固的活性量規(guī)定為2BU。
巴曲酶的急性毒性試驗(yàn)是通過將其給小鼠、大鼠、兔子和狗靜脈內(nèi)給藥來進(jìn)行。LD50(BU/kG)列舉如下。動(dòng)物種LD50值(BU/kG)小鼠(DDY系) 192-210大鼠(WISTAR系)105-110兔子(NW種)＞300狗(雜種) 190-208
下面通過實(shí)施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受下列實(shí)施例的限制。
實(shí)施例由巴曲酶產(chǎn)生的在大鼠腦局部缺血再灌流障礙模式中的細(xì)胞凋亡抑制效果。
試驗(yàn)方法使用51只體重250-300G的Wistar系雄性大鼠，將其分為未處理組6只、假手術(shù)組9只、局部缺血對(duì)照組18只和巴曲酶給藥組18只。按照Smith等人的方法(參見Acta Neurol.Scand，69，385(1984))，將兩側(cè)的總頸動(dòng)脈閉塞，通過放血將平均動(dòng)脈壓保持在50mmHG.使總頸動(dòng)脈閉塞10分鐘后，將2ml生理食鹽水給局部缺血對(duì)照組用藥，進(jìn)行再灌流，在24、48、96小時(shí)后將它們斷頭致死。對(duì)于巴曲酶給藥組，將2ml生理食鹽水稀釋巴曲酶而得到的溶液、按1.6BU/kG的劑量靜脈內(nèi)給藥。假手術(shù)組不進(jìn)行總頸動(dòng)脈閉塞和放血，除此之外其它操作與局部缺血組同樣進(jìn)行。未處置組不進(jìn)行任何處置，直接斷頭、致死。
細(xì)胞凋亡的觀察使用“In situ細(xì)胞死亡檢測藥盒AP”(BoehringerMannheim公司制造)進(jìn)行。即用4％的多聚甲醛(Sigma公司制造)將冷凍組織切片固定，用PBS洗凈3次，用TUNEL(TdT using nick endlabeling)標(biāo)記DAN鏈分解物。在37℃下放置45分鐘后，用PBS洗凈，添加CONVERTER-AP，在37℃下處理60分鐘。按照規(guī)定方法脫水、透明化、封入，用光學(xué)顯微鏡觀察。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)在核膜周圍凝縮成新月形，觀察到紫青色的凋亡小體，用400倍光學(xué)顯微鏡測定每1mm長度的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目。用學(xué)生氏T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用(平均值(標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。
結(jié)果在未處置組和假手術(shù)組中未觀察到凋亡小體。在局部缺血對(duì)照組中，再灌流24小時(shí)后的海馬CA1區(qū)域中觀察到凋亡陽性細(xì)胞。該細(xì)胞的染色質(zhì)在核內(nèi)凝縮成典型的新月形，并且發(fā)現(xiàn)存在有凋亡小體。再灌流后，隨著時(shí)間的延長，凋亡陽性細(xì)胞的數(shù)量增加，經(jīng)過96小時(shí)后達(dá)到最大值。在巴曲酶給藥組中，再灌流24小時(shí)后未觀察到凋亡小體。經(jīng)過48小時(shí)后和經(jīng)過96小時(shí)后，觀察到凋亡小體存在，但與局部缺血對(duì)照組相比凋亡陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(表1)。如上所述，巴曲酶對(duì)于細(xì)胞凋亡顯示出明顯的抑制作用。
表1巴曲酶對(duì)于大鼠海馬CA1區(qū)域的凋亡抑制作用(每1mm長度的凋亡陽性細(xì)胞數(shù))再灌流時(shí)間(小時(shí))組別 動(dòng)物數(shù) 24 48 96未處置組6 0 0 0假手術(shù)組9 0 0 0局部缺血對(duì)照組 18 2.83±1.47 7.33±2.7526.17±4.83巴曲酶給藥組180**2.50±1.05**6.67±1.75****與局部缺血對(duì)照組的比較、P＜0.01發(fā)明的效果本發(fā)明的含有巴曲酶的、與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥，具有抑制細(xì)胞凋亡作用，可以用來作為預(yù)防和/或治療與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病的藥劑。
權(quán)利要求
1.與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥，其特征是，含有巴曲酶作為有效成分。
2.權(quán)利要求1所述的預(yù)防和/或治療藥，其中，與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病是局部缺血性疾病(再灌流障礙除外)、神經(jīng)變性疾病、末梢神經(jīng)障礙、再生不良性貧血、肝障礙或HIV感染癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病的預(yù)防和/或治療藥,該預(yù)防和/或治療藥含有巴曲酶作為有效成分。
文檔編號(hào)A61K38/43GK1179980SQ9711791
公開日1998年4月29日 申請(qǐng)日期1997年8月29日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月29日
發(fā)明者李慶有 申請(qǐng)人:東菱藥品工業(yè)株式會(huì)社