專利名稱：：人生長激素的延續(xù)釋放組合物的制作方法與本發(fā)明相關(guān)的
背景技術(shù)：
人生長激素(hGH)是一種由腦下垂體分泌的蛋白質(zhì)，可以利用重組遺傳工程來制備。hGH可以促使任何具有生長潛力的身體組織的生長。hGH一般用于治療垂體機能減退的患者?，F(xiàn)在的常規(guī)方法是將人生長激素的水液對患者進行皮下注射，每周三次或每日一次，從而保證患者的適當(dāng)?shù)膆GH血清水平。對于長期接受人生長激素的患者來講，經(jīng)常性地注射人生長激素水液會導(dǎo)致患者應(yīng)變性的問題。為了解決伴隨著注射人生長激素水液的問題，已經(jīng)嘗試過制備含有比注射液濃度更高劑量的可控釋放裝置，將人生長激素包被在聚合物和/或蛋白質(zhì)內(nèi)，使人生長激素可以在體內(nèi)釋放一周或更長。然而，這些可控釋放裝置一般都表現(xiàn)出開始時的人生長激素釋放水平很高，隨后的釋放就減少了。進而，由于這些延續(xù)釋放裝置內(nèi)含有高劑量的人生長激素，所以，人生長激素分子就會在幾天后發(fā)生凝集的現(xiàn)象，形成凝集的人生長激素，這種凝集的人生長激素在體內(nèi)是免疫原性質(zhì)的，而且活性降低。因此，就存在著可以在體內(nèi)延續(xù)釋放生物學(xué)活性的人生長激素但又不引起免疫系統(tǒng)在人生長激素的釋放期間內(nèi)發(fā)生反應(yīng)的制劑和裝置。本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及延續(xù)釋放生物學(xué)活性的并被穩(wěn)定的人生長激素(hGH)的組合物和所述組合物的制備方法以及使用方法。本發(fā)明的延續(xù)釋放組合物包括生物學(xué)相容的聚合物以及生物學(xué)活性金屬陽離子穩(wěn)定的人生長激素的顆粒，其中，所述的顆粒被分散在所述的生物學(xué)相容的聚合物內(nèi)。本發(fā)明的制備延續(xù)釋放非凝集體人生長激素的組合物的方法包括將生物學(xué)相容的聚合物溶于聚合物溶劑中，形成聚合物溶液，將生物學(xué)化學(xué)的并穩(wěn)定化的人生長激素顆粒分散于該聚合物溶液中，再將聚合物固化，形成含有分散的所述的人生長激素顆粒的聚合物基質(zhì)。本發(fā)明延續(xù)釋放組合物的使用方法是給對象提供一定劑量的所述延續(xù)釋放組合物來使該對象獲得治療有效血液水平劑量的生物學(xué)活性非凝集體hGH。這種人生長激素的延續(xù)釋放制劑的優(yōu)點是提供在體內(nèi)的更長時間、更為一致的血液水平的人生長激素，降低開始時候的人生長激素的沖擊水平，并通過消除血清人生長激素水平的波動來提高治療效果。它的優(yōu)點還包括通過減少注射次數(shù)而使患者的接受和相容性得到提高。這些優(yōu)點還包括可以使用比注射更少量的人生長激素，因為血清人生長激素的水平被維持在靠近治療閾限值附近。本發(fā)明的技術(shù)方案本文中所述的人生長激素(hGH)，是分子形式(單體或非凝集體)生物學(xué)活性的hGH。分子形式的hGH一般都不是免疫原性的。凝集的hGH可以引起免疫反應(yīng)，引起抗hGH的抗體的產(chǎn)生。這就會削弱長期hGH治療的效果。再者，凝集的hGH可以刺激自體免疫系統(tǒng)對外源性hGH的反應(yīng)。生物學(xué)活性的非凝集體的人生長激素的延續(xù)釋放，是在比直接注射hGH水液獲得的釋放期更長的期間內(nèi)，釋放可以測量到的血清水平的生物學(xué)活性單體性hGH。優(yōu)選的延續(xù)釋放期將可以是約一周或更長，更為優(yōu)選的是兩周或更長。從聚合物基質(zhì)內(nèi)延續(xù)釋放生物學(xué)活性的非凝集體hGH，可以是連續(xù)的或不連續(xù)的，其釋放量可以是相對恒定的，也可以是變化的。hGH釋放的連續(xù)性和釋放的水平可以根據(jù)多種因素，例如，使用一種或多種聚合物組合物，hGH的加載量，和/或賦形劑的選擇等來達到理想效果。本文中，穩(wěn)定的人生長激素包括生物學(xué)活性的、并被至少一種來自于金屬陽離子組分中的多價金屬陽離子復(fù)合的hGH，所述金屬陽離子為+2價或更高。在本發(fā)明的延續(xù)釋放組合物中的穩(wěn)定的hGH是顆粒狀的。適宜的多價金屬陽離子包括在生物學(xué)相容的金屬陽離子組分中的金屬陽離子。生物學(xué)相容的金屬陽離子組分指的是，如果金屬陽離子組分對接受者不具有毒性，也不產(chǎn)生明顯的有害作用及副作用，例如不在注射位置產(chǎn)生免疫反應(yīng)，則該金屬陽離子就是生物學(xué)相容的。一般來講，在金屬陽離子穩(wěn)定的hGH中，金屬陽離子組分對hGH的摩爾比為約4∶1至約10∶1。優(yōu)選的用于穩(wěn)定hGH的金屬陽離子是Zn+2。在更為優(yōu)選的實施方案中，含有Zn+2陽離子的金屬陽離子組分對hGH的摩爾比為約6∶1。金屬陽離子對于穩(wěn)定hGH的適宜性可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員采用各類鑒定穩(wěn)定性的技術(shù)來獲得，例如，可以使用的方法有，聚酰胺凝膠電泳、等電聚焦、反向色譜、HPLC和對經(jīng)過冷凍干燥的含有金屬陽離子的hGH的效力實驗等，從而確定經(jīng)過冷凍干燥的hGH的效力和從微球中的釋放期。在將hGH與聚合物溶液接觸之前，將hGH與至少一種金屬陽離子復(fù)合，可以減少被穩(wěn)定的hGH由于延續(xù)釋放組合物的化學(xué)特性、形成該延續(xù)釋放組合物的方法、水合等造成的生物學(xué)活性的損失，也可以減少在體內(nèi)水合時hGH在微球內(nèi)發(fā)生的凝集傾向。穩(wěn)定的hGH一般可以在整個延續(xù)釋放期內(nèi)保持其不發(fā)生顯著的凝集。顯著的凝集指的是有約15％或更多的所包被的起始hGH被凝集。優(yōu)選的是，保持該凝集低于起始hGH單體劑量的約5％。更為優(yōu)選的是，保持該凝集低于起始hGH單體劑量的約2％。在hGH延續(xù)釋放組合物中的hGH還可以含有其它的賦形劑，例如填充劑和另外的穩(wěn)定劑，例如，在冷凍干燥期間穩(wěn)定hGH的緩沖液。填充劑一般包括惰性物質(zhì)。適宜的填充劑都是本領(lǐng)域所熟知的。適宜于本發(fā)明的延續(xù)釋放組合物的聚合物或聚合物基質(zhì)必需是生物學(xué)相容的。如果聚合物和其降解后的產(chǎn)物對接受者不具有毒性，也不產(chǎn)生明顯的有害作用及副作用，例如不在注射位置產(chǎn)生免疫反應(yīng)，則該聚合物或其聚合物基質(zhì)就是生物學(xué)相容的。在hGH延續(xù)釋放組合物中的聚合物還必須是生物學(xué)降解的，即該組合物會在體內(nèi)降解或腐蝕為化學(xué)小分子物質(zhì)。造成降解的原因可以是酶學(xué)過程、化學(xué)過程、或物理過程。適宜的生物學(xué)相容、生物降解的聚合物包括，例如，聚(丙交酯)，聚(乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚(乳酸-共-乙酯酸)，聚己內(nèi)酯，聚碳酸酯，聚酰胺酯，聚酐，聚(氨基酸)，聚原酸酯，聚縮醛，聚(對-二噁烷)，聚(亞烷基烷基酯)，生物降解的聚氨基甲酸酯，以及它們的混合物和共聚物。另外，聚合物的終端基團可以被修飾。例如，聚合物可以被封閉，未被封閉，或者是被封閉物與未被封閉物的混合物。被封閉的聚合物指的是本領(lǐng)域內(nèi)傳統(tǒng)定義的被封閉物，特別是羧基終端被封閉。通常，封閉基團從聚合反應(yīng)的起始物衍生而來，并且通常是?；鶊F。未被封閉的聚合物如本領(lǐng)域內(nèi)通常所定義，特別是具有自由羧基終端基團。本發(fā)明中可用的聚合物的分子量，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)所需的聚合物降解速率，物理性質(zhì)如機械強度，聚合物在溶液中的溶解速率等因素來確定。通常，可接受的分子量的范圍在約2,000道爾頓至約2,000,000道爾頓。在優(yōu)選方案中，聚合物是生物降解的聚合物或共聚物。在更優(yōu)選的方案中，聚合物是聚(丙交酯-共-乙交酯)(此后縮略為“PLGA”)，且丙交酯與乙交酯的比率為約1∶1，分子量大約為5,000道爾頓至約70,000道爾頓。在更為優(yōu)選的方案中，本發(fā)明中所用的PLGA的分子量為約6,000～31,000道爾頓。延續(xù)釋放組合物微球內(nèi)所含有的hGH數(shù)量，或者是在另外類型延續(xù)釋放裝置內(nèi)用含有的凝集穩(wěn)定的hGH顆粒的數(shù)量是預(yù)防性或治療性有效量，可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)體重，病狀，使用的聚合物的種類，從聚合物中釋放出來的量等因素來決定。在一個實施方案中，hGH延續(xù)釋放組合物含有約0.01％(w/w)至約50％(w/w)生物學(xué)活性穩(wěn)定的hGH顆粒。hGH顆粒的使用量將根據(jù)需要hGH達到的效果，計劃的釋放水平，釋放hGH的時間，hGH的釋放期等而變化。優(yōu)選的hGH顆粒裝載量的范圍在約0.1％(w/w)至約30％(w/w)hGH顆粒。更優(yōu)選的hGH顆粒裝載量的范圍在約0.1％(w/w)至約20％(w/w)hGH之間。最優(yōu)選的生物學(xué)活性凝集穩(wěn)定的hGH顆粒的裝載量為約15％(w/w)。在另一個優(yōu)選方案中，hGH延續(xù)釋放組合物還含有第二種金屬陽離子組分，但是，它并不含在生物學(xué)活性凝集穩(wěn)定的hGH顆粒之內(nèi)，而是分散在聚合物之中。優(yōu)選的第二種金屬陽離子組分是與穩(wěn)定的hGH中所含的金屬陽離子相同的金屬陽離子。此外，該第二種金屬陽離子組分可以含有一種或一種以上的不同的金屬陽離子。所述的第二種金屬陽離子組分起著調(diào)解hGH從延續(xù)釋放組合物的聚合物基質(zhì)中的被釋放，例如，可以起到金屬陽離子庫的作用，從而進一步延長釋放期，即hGH被金屬陽離子穩(wěn)定并使其在組合物中的穩(wěn)定性得到了提高。用于調(diào)控釋放的金屬陽離子成分包括至少一種多價金屬陽離子。適宜的調(diào)控釋放hGH的金屬陽離子組分的實例包括或含有Mg(OH)2、MgCO3(例如，4MgCO3·Mg(OH)2·5H2O)、ZnCO3(例如，3Zn(OH)2·2ZnCO3)、CaCO3、Zn3(C6H5O7)2、Mg(OAc)2、MgSO4、Zn(OAc)2、ZnSO4、ZnCl2、MgCl2和Mg3(C6H5O7)2。優(yōu)選的第二種金屬陽離子組分與聚合物的重量比例為約1∶99至約1∶2。最佳的比例取決于所使用的聚合物和金屬陽離子組分。在本申請的共懸未決美國專利申請08/237,057和共懸未決的PCT申請PCT/US95/05511號中，有對于用含有分散的金屬陽離子組分的聚合物基質(zhì)調(diào)控從聚合物基質(zhì)中釋放生物活性劑的進一步描述，這兩篇文獻的教導(dǎo)都通過在此引述而合并于本文。在本發(fā)明中的hGH延續(xù)釋放組合物可以為膜狀、片狀、筒形、盤狀和微顆粒狀。在本文中所說的微顆粒包括直徑小于約1毫米的聚合物顆粒，并有穩(wěn)定的hGH分散于其中。微顆?？梢允乔蛐蔚?、非球形的、或非規(guī)則狀的。優(yōu)選微顆粒是微球形的。一般，微顆粒的尺寸應(yīng)該適宜于注射。微顆粒的優(yōu)選直徑尺寸范圍是約1至180微米。在本發(fā)明的制備生物學(xué)活性非凝集的hGH延續(xù)釋放組合物的方法中，適宜量的生物學(xué)活性穩(wěn)定的hGH顆粒被分散在聚合物溶液中。適宜的聚合物溶液含有大約1％(w/w)至約30％(w/w)的適宜的生物學(xué)相容的聚合物，其中，生物學(xué)相容的聚合物通常溶于適宜的聚合物溶液中。優(yōu)選的是，聚合物溶液中含有約2％(w/v)至約20％(w/v)聚合物。最優(yōu)選的聚合物溶液中含有約5％至約10％(w/w)聚合物。適宜的聚合物溶劑指的是，聚合物在其中溶解，但是，穩(wěn)定的hGH顆粒在其中基本不溶解并且不反應(yīng)。適宜的聚合物溶劑的例子有，極性有機液體，例如，二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯和丙酮。制備生物學(xué)活性穩(wěn)定的hGH顆粒時，hGH與含有至少一種適宜的金屬陽離子適宜的水液在適宜形成金屬陽離子與hGH的復(fù)合體的pH條件下混合。一般，復(fù)合的hGH是絮狀沉淀，懸浮于溶劑中。然而，復(fù)合的hGH也可以是溶液形式的。在優(yōu)選的實施方案中，hGH與Zn+2復(fù)合。適宜于形成復(fù)合hGH的pH條件一般為約7.0～7.4。一般，獲得適宜的pH的方法是使用緩沖溶液作為溶劑，例如，用碳酸氫鈉來作為溶劑。適宜的溶劑是那些hGH及金屬陽離子組分各自可以至少微溶于其中的，例如碳酸氫鈉水液。對于水性溶劑，優(yōu)選使用的水是共離子水或注射用水。應(yīng)該理解的是，hGH在與抗凝集劑組分接觸之前，可以是固態(tài)或溶解狀態(tài)的。還應(yīng)該理解的是，抗凝集劑在與hGH接觸之前，可以是固態(tài)或溶解狀態(tài)的。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，是將hGH水溶液與抗凝集劑組分的水溶液相混合來形成穩(wěn)定的混合物。一般來講，復(fù)合的hGH是絮狀沉淀，懸浮于溶劑中。但是，復(fù)合的hGH也可以是溶液形式的。在優(yōu)選的實施方案中，hGH與Zn+2復(fù)合。對復(fù)合的hGH進行干燥，例如冷凍干燥，形成穩(wěn)定的hGH顆粒。在懸浮液或溶液中的穩(wěn)定的復(fù)合hGH可以成批量的冷凍干燥，也可分成小部分后干燥。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，復(fù)合的hGH懸浮液被微顆?；?，使用超聲噴嘴，然后冷凍干燥，形成穩(wěn)定的hGH顆粒?？梢员皇褂玫膶?fù)合的hGH的混合物進行冷凍干燥的方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，穩(wěn)定的hGH的顆粒直徑為約1至6微米。hGH顆?？梢云扑榉珠_，如在共懸未決的1993年1月21日提交的美國專利申請08/006,682所描述的生產(chǎn)生物學(xué)活性制劑小顆粒的方法，該篇文獻通過在此引述而全部合并于本文。另外，hGH顆?？梢栽诩尤氲骄酆衔锶芤褐笤倨扑椋?，使用超聲破碎、或超聲噴嘴。在本發(fā)明方法的一個技術(shù)方案中，聚合物溶液中還有不含在穩(wěn)定hGH顆粒內(nèi)的第二種金屬陽離子組分，該第二種金屬陽離子組分被分散在聚合物溶液中。應(yīng)該理解的是，第二種金屬陽離子組分和穩(wěn)定的hGH顆?？梢砸来危嵉?，間隔，分別和同時加入到聚合物溶液中。另外，聚合物，第二種金屬陽離子組分和穩(wěn)定的hGH可以依次，顛倒，間隔，分別和同時加入到聚合物溶劑中。調(diào)控從生物降解聚合物中釋放生物活性劑的組合物的形成方法在共懸未決的美國專利08/237,057中有進一步的描述。在該方法中，聚合物溶劑被固化，形成含有被分散的穩(wěn)定hGH顆粒的聚合物基質(zhì)。一種適宜的以聚合物溶液固化形成含有凝集穩(wěn)定的hGH的聚合物基質(zhì)的方法是溶劑蒸發(fā)法，見于授予Schnoring等的美國專利3,737,337，授予Vranchen等的美國專利3,523,906，授予Kitajima等的美國專利3,691,090，以及授予Tice等的美國專利4,389,330，這些文獻都通過在此引述而全文合并于本文。溶劑蒸發(fā)法通常都用作形成hGH延續(xù)釋放微顆粒的方法。在溶劑蒸發(fā)方法中，含有穩(wěn)定的hGH顆粒懸浮液的聚合物溶液混合到或攪拌到使聚合物溶劑部分混溶的連續(xù)相中，形成乳化液。通常，乳化劑都包括在連續(xù)相中以穩(wěn)定乳化液。然后，對聚合物溶劑進行數(shù)小時或更長的蒸發(fā)，使得聚合物固化，得到分散有穩(wěn)定的hGH顆粒的聚合物基質(zhì)。優(yōu)選的從聚合物溶液中制備凝集穩(wěn)定的hGH微顆粒的方法采用了快速冷凍和溶劑萃取的方法，可見于授予Gombotz等的美國專利5,019,400和在1995年5月18日申請的共懸未決美國專利申請08/433,726，這兩篇文獻中的教導(dǎo)都通過在此引述而合并于本文。與其它方法相比，例如，與分相法相比，這種形成微球的方法可以進一步地減少制備對某種hGH的延續(xù)釋放組合物的方法中的hGH的用量。在這種方法中，含有穩(wěn)定的hGH顆粒分散液的聚合物溶液被處理以生成液滴，而且這些液滴中的大部分都含有聚合物溶液和穩(wěn)定的hGH顆粒。這些液滴再經(jīng)過適宜的方法冷凍，形成微顆粒。對聚合物溶液分散液進行處理來生成液滴的方法的示例包括將分散液直接通過超聲噴嘴，壓力噴嘴，瑞利噴射(Rayleighjet)，或者其它的已知的制造溶液液滴的方法。適宜的將液滴冷凍來形成微顆粒的方法包括將液滴放置于或使其接近于液態(tài)氣體，例如，液態(tài)氬，液態(tài)氮，形成冷凍的微液滴，然后再與液態(tài)氣體分離。隨后，再將微液滴與非溶劑液體接觸，例如，乙醇，或者是乙醇與己烷或戊烷的混合物。冷凍的微液滴中的溶劑被以固體和/或液體的形式萃取到非溶劑中，形成含有生物學(xué)活性凝集穩(wěn)定的hGH微顆粒。加入乙烷與其它的非溶劑液體例如己烷或戊烷的混合物，可以提高從聚合物中萃取溶劑的萃取率，例如，從聚(丙交酯-共-乙交酯)聚合物中萃取溶劑的比率。通過改變液滴的大小，可以制備很寬尺寸范圍的hGH延續(xù)釋放微顆粒，例如，可以通過改變超聲噴嘴的口徑來改變液滴的大小。如果需要尺寸比較大的微顆粒，可以用注射機直接將微顆粒擠壓到冷液體中來制備。增大聚合物溶液的粘度也可以增大微顆粒的尺寸。由這種方法生產(chǎn)的微顆粒大小可在很寬的范圍內(nèi)變化，例如，可在直徑為1000微米至1微米或者更小的范圍內(nèi)變化。從聚合物溶液中制備hGH延續(xù)釋放組合物的另一種方法包括擠壓成膜，例如，使用模具制備薄膜或其它形狀。例如，當(dāng)把含有穩(wěn)定的hGH顆粒分散液的聚合物溶液放入模具后，聚合物溶劑就可以通過已知的方法去除，或者通過降低聚合物溶液的溫度，直到形成具有均勻干重薄膜或其它固定形態(tài)為止。在共懸未決的美國專利申請08/237,057中，對用聚合物溶液制備含有生物活性物質(zhì)的成膜方法有進一步的描述。據(jù)信，hGH的釋放有兩種機制。hGH可以通過聚合物基質(zhì)中的充滿液體的通道滲透釋放，例如，通過溶解hGH或者通過在合成延續(xù)釋放組合物的過程中去除聚合物溶劑形成的空腔來完成。第二種機制是通過聚合物的降解來釋放hGH。降解的速率可以通過改變聚合物水合速率的聚合物性質(zhì)來控制。這些性質(zhì)包括，例如，聚合物中不同單體的比例，例如，丙交酯與乙交酯的比例；使用L-旋異構(gòu)體來替代外消旋混合物；聚合物的終端基團和分子量等。這些性質(zhì)影響親水性和結(jié)晶性，從而控制聚合物的水合速率。親水性賦形劑，例如，鹽、碳水化合物、表面活性劑也可以被加入來提高水合性，從而改變聚合物的侵蝕速率。通過改變聚合物的性質(zhì)，可以控制滲透和/或聚合物降解對hGH釋放的作用。例如，提高聚(丙交酯-共-乙交酯)聚合物中乙交酯成分的含量、降低聚合物的分子量都可以提高聚合物的水解，從而使聚合物腐蝕造成的hGH釋放得到提高。此外，聚合物的水解速率可以在非中性pH值的范圍內(nèi)得到提高。因此，可以將酸性或堿性物質(zhì)加入到用于形成微球的聚合物溶液中，來改變聚合物侵蝕的速率。本發(fā)明的組合物可使用于人和動物，可以通過注射，埋植(例如，皮下，肌肉，腹膜內(nèi)，顱內(nèi)，陰道內(nèi)和皮內(nèi))使用，也可以施用于粘膜(例如，鼻腔內(nèi)或以栓劑的方式施用)，或就地施用(例如，灌腸或噴霧劑)，從而根據(jù)已知的病理條件對各種需要hGH治療的病狀提供理想的hGH劑量。本發(fā)明將由以下的實施例進一步詳細描述。本發(fā)明的最佳實施例實施例1Zn+2-穩(wěn)定的hGH的制備在本實施例中使用的是人生長激素(hGH)，其DNA序列在授予Goeddel等人的美國專利第4,898,830號中給予了描述。人生長激素與鋅形成不溶性復(fù)合體而穩(wěn)定。hGH溶于4mM碳酸氫鈉緩沖液(pH7.2)中，形成濃度為約0.1～0.5mM的hGH溶液。用乙酸鋅二水合物與去離子水形成0.9mM的Zn+2溶液，然后加入到hGH溶液中形成Zn+2-hGH復(fù)合物。該Zn+2-hGH復(fù)合物的pH值用加入1％乙酸來調(diào)節(jié)到7.0～7.4之間。形成絮狀沉淀，含有形成的Zn+2-穩(wěn)定的hGH復(fù)合物。該Zn+2-穩(wěn)定的hGH復(fù)合物懸浮液用超聲噴嘴(V1A型；SonicsandMaterials，Danbury，CT)霧化，噴灑到含有液氮的聚丙烯管內(nèi)(17厘米直徑，8厘米深)形成冷凍顆粒。然后將該聚丙烯管放入-80℃的冷凍箱內(nèi)，直至液氮揮發(fā)。含有Zn+2-穩(wěn)定的hGH復(fù)合物的顆粒經(jīng)過冷凍干燥得到Zn+2-穩(wěn)定的hGH顆粒。實施例2含有生物學(xué)活性凝集穩(wěn)定的人生長激素的PLGA微球的制備含有Zn+2-穩(wěn)定的hGH用親水性的帶有自由終端羧基的聚(丙膠酯-共-乙膠酯)聚合物RG502H(此后稱為“未封閉的PLGA”)(50∶50PLGA，9,300道爾頓；BoehringerIngelheimChemicals，Inc.)，或更加疏水性的帶有封閉的終端羧基的PLGA聚合物(此后稱為“封閉的PLGA”)(50∶50；分子量10000道爾頓；標(biāo)號#115-56-1，BirminghamPolymers，Inc.，Birmingham，AL)來制備。室溫下將聚合物溶解于二氯甲烷中。在聚合物溶液中加入冷凍干燥的hGH顆粒和碳酸鋅。對該混合物進行超聲處理得到均質(zhì)的的懸浮液。用超聲噴嘴將該懸浮液霧化到附加有液氮的冷凍乙醇床中。含有微球的容器被放在-80℃下保藏來萃取二氯甲烷，然后凍干得到自由流動的粉末。實施例3包被的hGH蛋白質(zhì)的分析對包被的hGH的整體性進行確定，將未水合的微球溶于二氯甲烷和丙酮中，收集蛋白質(zhì)，凍干，再次溶于含有10mMEDTA的HEPES緩沖液中。同時進行對照分析，保證萃取過程沒有影響蛋白質(zhì)的整體性。采用尺寸排除色譜法(sizeexclusionchromatography(SEC))檢測在包被之后hGH中含有的hGH單體的百分數(shù)來確定包被的hGH的整體性。對延續(xù)釋放hGH微球微球的hGH整體性的SEC檢測結(jié)果見于下表。</tables>這些分析表明，包被的過程沒有造成蛋白質(zhì)的凝集。在提取過程所獲得的蛋白質(zhì)的百分數(shù)(相對于測定的微球中的氮的含量)為40～98％。發(fā)生差異的原因被認為是在檢測方法中的轉(zhuǎn)移步驟造成了材料的損失，因而對該提取程序進行了修正以提高蛋白質(zhì)的回收率。實施例4碳酸鋅對體外釋放動力學(xué)的影響按照實施例2制備微球，微球含有15％w/whGH(6∶1的Zn∶hGH蛋白質(zhì)復(fù)合物)，分別含有0％、1％、6％、10％、20％w/w碳酸鋅，以及聚(丙膠酯-共-乙膠酯)聚合物。含有不同濃度的碳酸鋅的hGH延續(xù)釋放微球的體外釋放動力學(xué)的確定，是將每種微球的等份試樣(10mg)置于1.5ml的HEPES緩沖液(50mMHepes，10mMKCl，0.1％NaN3)pH7.2中，然后在37℃培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始后的第1、3、7、10、14、21、28天對緩沖液取樣，取樣后補充新鮮的緩沖液，然后定量樣品中釋放的蛋白質(zhì)含量。以釋放的百分數(shù)的積累值(相對于在微球中開始的hGH含量)對時間做作圖。用尺寸排除色譜對每一個時間點的釋放蛋白質(zhì)的樣品測定其hGH單體的含量。碳酸鋅被認為是起著鋅離子庫的作用，因此，對形成Zn-hGH復(fù)合物是有利的，而對于解離為溶解性hGH是不利的。因為碳酸鋅的水溶解性低，所以從該庫中釋放鋅離子的速度低，從而調(diào)節(jié)了蛋白質(zhì)的溶解性。該分析發(fā)現(xiàn)，如果沒有碳酸鋅，則包被的hGH的釋放速率非常高，蛋白質(zhì)在很短的時間內(nèi)就全部被釋放。實施例5封閉的PLGAZn+2-穩(wěn)定的hGH微球在體內(nèi)降解后的hGH分析按照實施例制備含有15％w/wZn+2-穩(wěn)定的hGH并分別含有0％、6％、10％、或20％碳酸鋅的封閉的PLGA微球。受試的大鼠接受50mg不同hGH微球樣品的皮下注射。60天后處死大鼠，剪除下注射部位的皮膚樣品。將該剪除下來的皮膚樣品放入10％中性緩沖的福爾馬林中至少24小時。然后用剃刀去除多余的皮膚，并放入PBS中。組織樣品由PathologyAssociates，Inc.(Frederick，MD)處理。將皮膚樣品放入糖代異丁烯酸鹽中，切塊，并依照生產(chǎn)廠商的說明書進行染色以對hGH進行存在的檢測[用HistoScan/LymphoScanStainingKit染色(產(chǎn)品標(biāo)號#24-408M；AccurateChemical&amp;ScientificCorp.，Westbury，NY)]。組織樣品中沒有發(fā)現(xiàn)染色，這就標(biāo)明組織樣品中不存在hGH。所有與hGH微球注射有關(guān)的皮膚樣品都有hGH存在的陽性結(jié)果，因此就標(biāo)明封閉的PLGA微球在體內(nèi)60天后還含有hGH。按照實施例2的方法，將0％或15％的Zn∶hGH復(fù)合物形式的hGH，以及0％、1％或6％w/w的碳酸鋅包被在封閉的和未封閉的PLGA中形成微球。比較未封閉的和封閉的PLGA微球的體內(nèi)降解，即將微球樣品注射給大鼠，然后分析注射后不同時間的注射位置所殘留的微球。對每一種微球樣品在每一個時間的檢測都是對三只大鼠進行的。在注射微球的當(dāng)天，在含有50±1mg微球的藥瓶中加入750μl的載體[3％羧甲基纖維素(低黏度)和1％Tween-20于生理鹽水中]。然后，立即劇烈搖動該藥瓶并形成懸浮液，再用不帶針頭的1.0cc注射器吸取藥液。大鼠(雄性Sprague-Dawley)用三氟氯溴甲烷與氧氣的混合物麻醉。注射位置(肩胛區(qū))去毛，用永久性圖標(biāo)進行標(biāo)記以保證在取樣的時候準(zhǔn)確剪切皮膚。用18至21號注射器給每只大鼠注射一整藥瓶的微球藥液。在預(yù)定的時間(對于接受封閉的PLGA微球的大鼠來講為注射后的第15、30、59和90天，對于接受未封閉的PLGA微球的大鼠來講為注射后的第7、14、21、28和45天)，用二氧化碳使大鼠窒息致死，剪切下注射位置的皮膚(包括微球)。由于微球會在注射位置集結(jié)，因此，可以用肉眼觀察辨認是否有微球存在于注射位置。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)的是，未封閉的PLGA微球的降解速率比封閉的PLGA微球快很多，并且，加入碳酸鋅到封閉的PLGA中明顯降低了聚合物的降解。例如，在接受了含有0％hGH和0％或1％碳酸鋅的未封閉的PLGA微球注射的大鼠中，在第21天時沒有觀察到微球。此外，對于接受了含有0％hGH和0％碳酸鋅的封閉的PLGA微球注射的大鼠來講，在第60天時觀察到有少量微球，在第90天時沒有觀察到微球。再者，接受含有0％或15％hGH以及6％碳酸鋅的封閉的PLGA微球注射的大鼠，在第90天有可觀察到的微球。實施例6hGH延續(xù)釋放微球在大鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)的研究本研究在大鼠中進行，篩選不同的hGH微球的配方，確定靜脈注射(IV)、皮下注射(SC)和SC滲透泵(Alzet)給藥hGH后的藥物動力學(xué)參數(shù)，評價各種hGH微球配方的體內(nèi)釋放速率和血清水平。對Sprague-Dawley大鼠隨機按照體重分為三只一組，每組給予一種hGH微球制劑。注射采用皮下注射，7.5mg的hGH在50mg的一種微球中，懸浮于0.75ml注射用水性載體中。載體的成分是，3％CMC(低黏度)、1％Polysorbate20、在0.9％NaCl中。對注射的微球的劑量采用間接方法確定，即稱量注射藥瓶中的殘留劑量并對殘留注射載體進行校正。然后，用氮的分析確定微球中加載的蛋白質(zhì)量，并計算出hGH劑量。在預(yù)定的時間，即注射后30天內(nèi)收取血樣。在第一個24小時內(nèi)收集250μl血樣，在第一個24小時之后，各個取樣時刻收取的血樣至少為400μl。使血樣凝結(jié)，用放射免疫檢測方法確定血清中hGH濃度。對來自ICN的放射免疫(RIA)試劑盒進行鑒定，然后用于確定大鼠血清中hGH的水平。為了確定藥物動力學(xué)的參數(shù)，給大鼠皮下注射、靜脈內(nèi)注射或用埋植于皮下的滲透泵(Alzet型號2ML4)給藥處于生理鹽水中的hGH。有三組大鼠接受了單一皮下注射處于0.9％NaCl中的hGH，劑量為0.5或7.0mg/kg，體積為1.0ml/kg，有兩組接受了單一靜脈內(nèi)注射處于0.9％NaCl中的hGH，劑量為約1.0和5.0mghGH/公斤大鼠體重，體積為1.0ml/kg。對于Alzet泵來講，大鼠按每組三只分為四組，體重隨機，對泵(Alzet型號2002，200μl，14天釋放期)內(nèi)加載的劑量是約20mg/ml和40mg/mlhGH處于0.9％生理鹽水中，對泵(Alzet型號2ML4，2ml，28天釋放期)為約4mg/ml和12mg/mlhGH處于0.9％生理鹽水中。各個泵的預(yù)期釋放速率分別為約2％和4％至6％的ProLeasehGH劑量(約15mg/kg)每天。這些Alzet泵被埋植在肩胛區(qū)的皮下，并用無菌生理鹽水預(yù)先浸泡1-2分鐘。按照實施例2合成的hGH延續(xù)釋放微球制劑含有15％w/w與鋅復(fù)合的hGH，比例為6∶1Zn∶hGH；0％、1％、3％、或6％w/w碳酸鋅；8k未封閉的PLGA、10k封閉的PLGA或31k未封閉的PLGA。為了評價各種hGH延續(xù)釋放制劑，采用的體內(nèi)指標(biāo)為Cmax、Cd5、和Cmax/Cd5，其中，Cmax是觀測到的最大血清濃度，Cd5是第5天的血清濃度，大約是穩(wěn)定期的濃度。結(jié)果如下</tables>*同一制劑的雙份實驗的數(shù)據(jù)該篩選的實驗結(jié)果表明，兩種未封閉的(8k和31k)的體內(nèi)釋放動力學(xué)與原始配方即封閉的10kPLGA和6％w/w碳酸鋅的釋放動力學(xué)不同。一般來看，使用了未封閉的聚合物的制劑的Cmax數(shù)值比較低，指示這類制劑的體內(nèi)始發(fā)沖擊比較低。始發(fā)沖擊指的是在注射后的第一個24小時內(nèi)釋放的hGH的百分數(shù)。體外始發(fā)沖擊的數(shù)值為8-22％。各制劑內(nèi)的碳酸鋅成分看來好象沒有影響始發(fā)沖擊和體外釋放分布型。在第4天到第6天，未封閉的聚合物的血清濃度基本上保持穩(wěn)定于基線(或采取血樣之前的水平)之上，在同一時間的封閉的聚合物的血清濃度則很接近基線。7天的體外釋放數(shù)據(jù)表明釋放的hGH蛋白質(zhì)是單體的。在第6天以后，因為大鼠產(chǎn)生了抗-hGH抗體，所以無法獲得有用的數(shù)據(jù)。實施例7獼猴的藥物動力學(xué)的研究本研究的目的是評價不同的hGH延續(xù)釋放制劑與傳統(tǒng)hGH給藥方式(例如，皮下注射、每日皮下注射、以及皮下注射與滲透泵的結(jié)合)之間的藥物動力學(xué)。從而確定那種hGH延續(xù)釋放制劑提供最佳的hGH血液濃度分布型。接受實驗的hGH延續(xù)釋放微球制劑有①15％hGH(與鋅按照6∶1Zn∶hGH的比率復(fù)合)、6％w/w碳酸鋅和10k封閉的PLGA；②15％hGH(與鋅按照6∶1Zn∶hGH的比率復(fù)合)、1％w/w碳酸鋅和8k未封閉的PLGA(“RG502H”PLGA聚合物)；和③15％hGH(與鋅按照6∶1Zn∶hGH的比率復(fù)合)、1％w/w碳酸鋅和31k未封閉的PLGA(“RG503H”PLGA聚合物)。每組中有四只猴子，每只猴子在第一天接受頸背區(qū)單一皮下注射。用20號針頭將處于1.2ml注射載體中的劑量為160mg的hGH延續(xù)釋放微球(24mg的hGH)注射給每一只猴子。注射載體是水性載體，含有3％w/v羧甲基纖維素(鈉鹽)、1％v/vTween20(Polysorbate20)和0.9％氯化鈉。這樣的hGH劑量是為了提供可以被檢測到的hGH血清濃度來進行藥物動力學(xué)分析。為了獲得藥物動力學(xué)參數(shù)，還包括了另外的每組四只猴子的研究組，每一組的處理如下①單一皮下注射(24mghGH)；②每日皮下注射(24mg/28天＝0.86mghGH/天)；③皮下注射(3.6mghGH)結(jié)合Alzet滲透泵(20.4mghGH)；和④皮下注射載體作為對照(對照組只用了三只猴子)。對于hGH、IGF1、IGFBP3和抗-hGH抗體的分析，在下述時間采取血樣-7、-5、-3、給藥前、和給藥后的第0.5、1、2、3、5、8、10、12、24、28、32和48小時，第4、5、6、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53和56天。然后測定血清中的IGF-1和hGH。使用了來自RADIM(提供者為WeinLaboratories，P.O.Box227，Succasunna，NJ)的IRMA試劑盒來定量猴子血清中的hGH。該IRMA檢測的定量性極限在PBS緩沖液中為0.1ng/mL，在合并的年幼獼猴血清中為1.5ng/mL，基準(zhǔn)GH水平為約4ng/mL。該IRMA檢測對合并的年幼獼猴血清在1.5-75ng/mL之間為有效的。該測定的準(zhǔn)確性和精確性在±10％內(nèi)。結(jié)果表明，hGH延續(xù)釋放微球可以在一個月的時間內(nèi)釋放出顯著的和延續(xù)性水平的hGH，而皮下注射則不能夠維持同樣的水平。IGF-1血清分布型表明，在注射了微球后的第2天到第29天，血清IGF-1濃度高于基線值。這就說明有足夠的hGH被從延續(xù)釋放微球中釋放出來并造成了藥物動力效應(yīng)。同時，還表明，所釋放的hGH是生物學(xué)活性的，從而說明包被過程沒有對hGH的生物學(xué)效力產(chǎn)生副作用。等同物本領(lǐng)域的技術(shù)人員都將或能夠在采用常規(guī)實驗的條件下認識和確定本發(fā)明的具體技術(shù)方案的等同物。這些等同物都是本發(fā)明的權(quán)利要求書所要求保護的。權(quán)利要求1.一種延續(xù)釋放人生長激素的組合物，包括(a)生物學(xué)相容的聚合物；和(b)金屬陽離子穩(wěn)定的人生長激素顆粒，其中所述的金屬陽離子是Zn(II)。2.一種延續(xù)釋放人生長激素的組合物，包括(a)生物學(xué)相容的聚合物；和(b)金屬陽離子穩(wěn)定的人生長激素顆粒，其中所述的金屬陽離子與蛋白質(zhì)的比率是約4∶1～10∶1，優(yōu)選6∶1。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述的金屬陽離子是Zn(II)。4.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求所述的組合物，其中所述的金屬陽離子是以水溶性鹽的形式加入到人生長激素中的。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述的金屬陽離子是以乙酸鹽的形式加入到人生長激素中的。6.根據(jù)上述任何一項權(quán)利要求所述的組合物，其中所述的金屬陽離子穩(wěn)定的人生長激素是被分散在所述的生物學(xué)相容的聚合物中的。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中所述的聚合物選自聚(丙交酯)，聚(乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)，聚己內(nèi)酯，聚碳酸酯，聚酰胺酯，聚酐，聚(氨基酸)，聚原酸酯，聚縮醛，聚(二噁烷)，聚(亞烷基烷基酯)，聚氨基甲酸酯，以及它們的混合物和共聚物。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述的聚合物選自聚(丙交酯)，聚(乙交酯)，聚(丙交酯-共-乙交酯)。9.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求所述的組合物，其中所述的金屬陽離子穩(wěn)定的人生長激素顆粒在所述聚合物中的重量含量為約0.1％至約30％，優(yōu)選的重量含量為約0.1％至約20％。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述的金屬陽離子穩(wěn)定的人生長激素顆粒在所述聚合物中的重量含量為約15％。11.根據(jù)前述任何一項權(quán)利要求所述的組合物，其中所述的生物學(xué)相容的聚合物還進一步含有金屬陽離子組分。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述的金屬陽離子組分的金屬陽離子是Zn(II)。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述的金屬陽離子組分選自ZnCO3、Zn3(C6H5O7)2、Zn(Oac)2、ZnSO4、ZnCl2。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述的金屬陽離子組分的金屬陽離子是Mg(II)。15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述的金屬陽離子組分選自Mg(OH)2、MgCO3、Mg3(C6H5O7)2、Mg(Oac)2、MgSO4、MgCl2。16.根據(jù)上述權(quán)利要求12-15中的任何一項所述的組合物，其中所述的金屬陽離子組分與聚合物的重量比為約1∶99～1∶2，優(yōu)選的重量比為約1％。17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人生長激素延續(xù)釋放組合物，該組合物包括(a)生物學(xué)相容的聚(丙膠酯-共-乙膠酯)，并且其中分散有以ZnCO3形式加入的Zn(II)；以及(b)被Zn(II)穩(wěn)定的人生長激素顆粒，其中的Zn(II)是被以乙酸鋅的形式按照Zn∶hGH為約6∶1的摩爾比加入到人生長激素中的。18.上述任何一項權(quán)利要求所述的組合物在制備藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及延續(xù)釋放人生長激素(hGH)的組合物以及所述組合物的制備及使用方法。本發(fā)明的延續(xù)釋放組合物包括生物學(xué)相容的聚合物以及生物活性并穩(wěn)定的人生長激素的顆粒,其中,所述的顆粒被分散在所述的生物學(xué)相容的聚合物內(nèi)。本發(fā)明的制備延續(xù)釋放生物學(xué)活性hGH的組合物的方法包括將生物學(xué)相容的聚合物溶于聚合物溶液中,得到聚合物溶液,將生物學(xué)活性并金屬陽離子穩(wěn)定的hGH顆粒分散于該聚合物溶液中,再將聚合物固化,形成含有分散的所述hGH顆粒的聚合物基質(zhì)。本發(fā)明組合物的使用方法是給對象提供治療有效血液水平劑量的生物學(xué)活性非凝集體hGH來實現(xiàn)一段時間的延續(xù)釋放。采用本方法,就可以給對象提供有效劑量的本發(fā)明的延續(xù)釋放組合物。本發(fā)明延續(xù)釋放組合物的使用方法是給對象提供治療有效血液水平劑量的生物學(xué)活性非凝集體hGH來實現(xiàn)一段時間的延續(xù)釋放。文檔編號A61K9/16GK1187120SQ96194614公開日1998年7月8日申請日期1996年6月3日優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日發(fā)明者歐路梵德·莉莉·約翰遜,梅蒂哈·M·坎姆金,霍華德·伯斯滕,亨利·奧爾,M·阿明·可汗申請人:阿爾克姆斯控制治療公司