專利名稱：：含有海藻糖的干燥的血液因子組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及血液因子的干燥的組合物，用于用水或水溶液重建(reconstitution)。血液因子，特別是因子VIII和因子IX，是目前治療由缺少適當(dāng)因子引起的疾病，特別是血友病的標(biāo)準(zhǔn)治療藥劑。血液因子一般是通過各種提取技術(shù)來源于人的血液的，例如EP-A-0083483中所公開的，或者通過在基因修飾的微生物中表達(dá)得到，例如EP-A-0160457和EP-A-0182448中所公開的。血液因子制品(例如因子VIII)是非常敏感、不穩(wěn)定的蛋白。它們通常是以溶于合適的緩中液中的，冰凍的溶液的形式提供的，更一般地，它們是以凍干的粉末形式提供的。但甚至凍干的粉末在保存時(shí)也必須保持在低溫下。為了使凍干的物質(zhì)穩(wěn)定，商業(yè)制品含有穩(wěn)定化蛋白，特別是人血清白蛋白(HSA)。制備在環(huán)境溫度和巴氏消毒(例如60℃)下穩(wěn)定的，不合HSA的干燥的血液因子組合物被認(rèn)為是不可能的。但是，HSA的存在將帶來不可忽視的純化方面的問題，因?yàn)榈鞍撞槐徊《疚廴具@一點(diǎn)是必需的?？朔@些問題的重組HSA的應(yīng)用是昂貴的。已知海藻糖是敏感蛋白的高效穩(wěn)定劑，如US-A-4891319中所公開的，能夠使蛋白在冰點(diǎn)以上的溫度干燥。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在完全不含有HSA的條件下，如果用海藻糖來穩(wěn)定血液因子制品，該制品不僅可以在冷凍或不冷凍的條件下干燥，并且甚至在60℃溫度下持續(xù)一定時(shí)間后也是穩(wěn)定的。因此，根據(jù)本發(fā)明，我們提供了穩(wěn)定的干燥的血液因子組合物，該組合物含有穩(wěn)定化量的海藻糖，不含有白蛋白。通?？梢詰?yīng)用任意穩(wěn)定化量的海藻糖，過量一般不會帶來問題。實(shí)際上，海藻糖的存在有助于再水化過程，它用于注射時(shí)是生理可接受的，能夠迅速地被代謝成葡萄糖。該組合物對因子VIII的制劑是特別適用的，該制劑也可包含適當(dāng)?shù)木彌_鹽或離子增強(qiáng)鹽，特別是鈣源。一般地，每單位的因子VIII對應(yīng)大約1.0至1.5毫克鈣離子的比率是合適的。其他緩沖或改性劑(例如組氨酸)也可存在于干燥的物質(zhì)中，用于重建成注射液。但是，我們發(fā)現(xiàn)鹽(特別是氯化鈉)的存在水平可影響干燥制品的保存性。用于注射的商業(yè)制品被認(rèn)為需要具有等滲鹽濃度。但是，凍干的制劑最好是高滲的，典型地含有大約500mMNaCl(等滲NaCl＝150mM)，這被認(rèn)為有助于穩(wěn)定血液因子。結(jié)果，商業(yè)性凍干制劑通常具有高的鹽含量，需用合適量的無菌水重建以得到等滲的溶液用于注射。顯著減少的鹽含量對本發(fā)明的干燥的物質(zhì)是優(yōu)選的，需要干燥的每毫升大約500單位的因子III溶液通常優(yōu)選地含有少于200mM，例如75-150mM的NaCl，特別是大約100mM，或者甚至低于例如20-50mM，特別是大約22-30mM。低鹽制備物具有更高的干燥穩(wěn)定性?？捎名}溶液而不是常規(guī)的水將干燥制品重建到所需的鹽濃度。海藻糖與鹽的摩爾比通常應(yīng)當(dāng)高于1∶1，特別是高于2.5∶1，例如高于10∶1，優(yōu)選地高于12.5∶1?？赏ㄟ^干燥血液因子的適當(dāng)溶液得到干燥的組合物，所述血液因子溶液含有正確比例的海藻糖和其他所需的成分。通常，被干燥的溶液應(yīng)僅僅含有重建的注射溶液中所需的全部成分，雖然用于干燥的溶液不必處于同樣的稀釋度。典型地，每毫升用于干燥的溶液含有1-1000單位的因子III。干燥的方法可包括凍干、真空干燥和噴霧干燥。本發(fā)明特別優(yōu)選的方法包括在不高于25℃，優(yōu)選不高于10℃的溫度下進(jìn)行真空干燥，以形成泡沫，使暴露表面和干燥效果最大化。下述實(shí)施例將進(jìn)一步闡明本發(fā)明。實(shí)施例1重組的因子VIII是以深度冷凍溶液的形式得到的，含有大約2000-2500單位/毫升，溶于制造者的高鹽緩中劑中。融化的溶液被透析，所用緩中液含有500mMNaCl，15mMCaCl2和10mM組氨酸，pH6.8。在同樣緩沖液中稀釋透析后的蛋白，但是加入海藻糖，終濃度為每毫升500單位，10％重量比的海藻糖，pH6.8。該溶液以1毫升的等分試樣被真空干燥。真空度從大氣壓逐級減少到4Pa(30mTorr)，以避免樣品冷凍。在形成泡沫之前，樣品的溫度不允許超過12℃，在形成泡沫之后，溫度保持在低于30℃?？偟母稍飼r(shí)間是24小時(shí)至28小時(shí)。樣品在40℃下保存0、1.5、3和6個(gè)月，然后在進(jìn)行活性檢測之前用5毫升等分試樣的無菌蒸餾水重建。結(jié)果顯示于下表，與含有HSA的商品化凍干制品進(jìn)行對比。受試樣品和商品化樣品都具有高的鹽含量。干燥后的結(jié)果顯示，在不含有HSA而含有海藻糖的條件下，雖然可以成功地干燥因子VIII，但即使在含有HSA時(shí)，高的鹽含量對于長期保存也是不利的。初始活性的百分?jǐn)?shù)</tables>實(shí)施例2如實(shí)施例1所述干燥樣品，但所使用的緩沖制劑包含100mMNaCl，15mMCaCl2，15mM組氨酸和1.27摩爾海藻糖(48％)，并在重建之前保存在60℃。結(jié)果顯示在下表中，其中活性是在ACL100自動凝度計(jì)(InstrumentationLaboratorySpA，Milan，Italy)上測量的。即使在60℃下保存4周之后，具有低鹽含量的受試樣品也沒有顯示出明顯的活性損失?；謴?fù)的初始活性的百分?jǐn)?shù)</tables>實(shí)施例3制備含有如下不同鹽濃度的兩種制劑制劑A制劑BNaCl0.13％NaCl1.03％CaCl20.011％CaCl20.011％L-組氨酸0.12％L-組氨酸0.12％Tris0.002％Tris0.002％Tween800.002％Tween800.002％PEG33500.004％PEG33500.004％海藻糖7.5％海藻糖7.5％因子VIII50U/ml因子VIII50U/ml加水至100％加水至100％將10毫升的制劑分配到各個(gè)30毫升的瓶中，使得因子VIII的濃度為500單位/瓶。凍干是在Laconco(Lyph-lock12stoppering)凍干機(jī)中進(jìn)行的。開始時(shí)，樣品被冷卻至-40℃，然后在加溫至-35℃之前被置于真空。80小時(shí)之后，以2.5℃/小時(shí)的速率將樣品加溫，直到擱板溫度達(dá)到25℃。然后在封閉之前，在真空下將樣品保持在25℃兩小時(shí)，并從干燥機(jī)中移出。干燥之后，用10毫升水將樣品重新水化，測定兩次(測定1和2)因子VIII的濃度。結(jié)果由下表給出，以因子VIII濃度相對于預(yù)補(bǔ)充(prefill)對照(在-70℃下冷凍)的百分?jǐn)?shù)表示。從該結(jié)果可以看出，因子VIII可以在不含有HSA的，基于海藻糖的制劑中被成功地凍干。</tables>權(quán)利要求1.一種穩(wěn)定的，干燥的血液因子組合物，其含有穩(wěn)定化量的海藻糖，不含有白蛋白。2.權(quán)利要求1的組合物，其中每單位的血液因子含有0.15至2.5毫克的海藻糖。3.權(quán)利要求1或2的組合物，其含有因子VIII。4.權(quán)利要求3的組合物，其中每單位的因子VIII含有1.0至1.5毫克的鈣離子。5.權(quán)利要求1至4中任一權(quán)項(xiàng)的組合物，其中每摩爾鹽含有超過2.5摩爾的海藻糖。6.權(quán)利要求5的組合物，其中每摩爾鹽含有超過10摩爾的海藻糖。7.一種制備權(quán)利要求1至6中任一權(quán)項(xiàng)的組合物的方法，其中含有海藻糖的血液因子的水溶液是在不超過25℃的溫度下被干燥的。8.權(quán)利要求7的方法，其中溶液是在不超過10℃的溫度下被干燥的。全文摘要一種穩(wěn)定的血液因子組合物,它在不含有人血清白蛋白的條件下,含有穩(wěn)定化量的海藻糖,以提供一種可穩(wěn)定至60℃的制品。文檔編號A61K47/00GK1179107SQ96192660公開日1998年4月15日申請日期1996年1月19日優(yōu)先權(quán)日1995年1月19日發(fā)明者B·J·羅色爾申請人:廓德倫特控股劍橋有限公司