專利名稱：一種新的大腸癌負(fù)相關(guān)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程，特別是關(guān)于腫瘤分子生物學(xué)方面一種新的大腸癌負(fù)相關(guān)基因(HSU17714)，為臨床腫瘤診斷與治療提供新的目的基因，為腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究提供新資料。
腫瘤是涉及到多基因多階段的疾病，全世界近十年來對腫瘤發(fā)生機(jī)制的探索均著重在腫瘤相關(guān)基因的研究，正逐步揭示其發(fā)病機(jī)制，如癌基因Ras、Myc、Fos、Jun等及抑癌基因p53、Rb、DCC等，雖然這些癌基因或抑癌基因的突變在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都有普遍性，但都只能從某一點(diǎn)上對腫瘤的發(fā)生起到作用，并不足以全面解釋各種腫瘤發(fā)生的完整途徑，因此需要尋找更多的腫瘤相關(guān)基因，積累更多的資料加以完善，從而在基因水平發(fā)病學(xué)基礎(chǔ)上控制、阻遏腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。
本發(fā)明的目的是為了全面了解腫瘤發(fā)病分子機(jī)制而探尋新的遺傳因素，通過差式雜交方法，從自建的人正常腸粘膜組織cDNA文庫中篩選得到新的大腸癌負(fù)相關(guān)基因(HSU17714)，不僅可以為腫瘤發(fā)病機(jī)制提供新的資料，也為臨床腫瘤診斷與治療提供新的目的基因。
本

發(fā)明內(nèi)容
為一種新的大腸癌負(fù)相關(guān)基因(HSU17714)，全長序列有2932bp，堿基計數(shù)為900A、515C、615G、902T，染色體定于人染色體22q13。利用本發(fā)明的序列全部或部分可進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能的研究，及進(jìn)行編碼的蛋白質(zhì)的全部或部分結(jié)構(gòu)和功能的研究，也可利用該序列翻譯產(chǎn)物進(jìn)行臨床診斷和治療及利用該核酸進(jìn)行診斷和治療。
本發(fā)明提供的大腸癌負(fù)相關(guān)基因(HSU17714)，是在當(dāng)前世界范圍內(nèi)僅找到10個左右抑癌相關(guān)基因的情況下，不僅為腫瘤發(fā)病子機(jī)制提供了新的資料，而且為腫瘤的臨床診斷和治療提供了新的目的基因。作為新基因，可利用其序列及其產(chǎn)物制成檢測、診斷、治療試劑盒，廣泛應(yīng)用于腫瘤診治各方面。


圖1為該基因的cDNA序列。
圖2為該基因的染色體定位圖。(A.熒光原位雜交B.R分帶)圖3為該基因編碼的蛋白序列。
本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1采用差式雜交(Subtractive hybri-dization)方法，以人正常腸粘膜來源的mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA與同一病人腸癌來源的mRNA進(jìn)行差式雜交所得的探針，從自建的人正常腸粘膜組織cDNA文庫中篩選得到該大腸癌負(fù)相關(guān)基因(HSU17714)的克隆，其長度2932bp，堿基計數(shù)為900A、515C、615G、902T，染色體定位于人雙染色體之一的長臂22q13。該基因的cDNA序列及染色體定位參見圖1.圖2。
實(shí)施例2參見圖2(A、B)，以該大腸癌負(fù)相關(guān)基因的cDNA為探針，采用熒光原位雜交(FISH)，將該基因定位于人染色體22q13。在供分析的50個人淋巴細(xì)胞分裂相中各有1-2個雜交點(diǎn)，進(jìn)行染色體分帶后鑒定發(fā)現(xiàn)其中40個分裂相(80％)的雜交點(diǎn)定位于22號染色體的長臂1區(qū)3帶，即22q13，從統(tǒng)計學(xué)和慣例，HSU17714基因定位于22q13是可靠的；更精確地辯認(rèn)還可以將該基因定位于22q13的遠(yuǎn)端部位。另有兩個分裂相中分別可以見到一個雜交點(diǎn)位于7號染色體長臂7q31帶，尚有部分位于10號、15號等染色體上，這可能是HSU17714基因的部分序列與上述染色體，尤其是7q31帶內(nèi)的DNA有部分互補(bǔ)雜交所致。我們研究的70％-80％的間期細(xì)胞，50％-70％的分裂相細(xì)胞中可以見到1-2個雜交點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過文獻(xiàn)報道的10％水平，可見我們的結(jié)果比較可靠。
參見圖2，染色體定位是該基因(HSU17714)確實(shí)為人類基因成員的可靠證據(jù)。
以該基因的全部或部分序列，結(jié)合染色體定位結(jié)果，可以幫助進(jìn)行人類基因組研究，繪制染色體物理圖譜和表達(dá)圖譜等，篩選和克隆其他人類新的基因，完善人類染色體DNA結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。
實(shí)施例3對12例大腸癌及同一病人的正常腸粘膜采用非同位素法做了RNAdot blot，結(jié)果見圖譜(1)

HSU17714基因RNA dot blot圖譜(1)經(jīng)激光密度圖像掃描儀掃描，所得的積分吸光度值以β-actin校正后(HSU17714/β-actin的比值)顯示見下表1。
表1 HSU17714基因在大腸癌及同一病人的正常腸粘膜中的表達(dá)積分吸光度(HSU17714/β-actin)例號 倍數(shù)(N/C)大腸癌組織 正常腸粘膜1 0.121 0.396 3.272 0.051 0.148 2.903 0.058 0.395 6.814 0.266 0.413 1.555 0.411 0.792 1.936 0.242 0.517 2.147 0.272 0.284 1.048 0.083 0.575 6.939 0.137 0.284 2.0710 0.044 1.38431.4511 0.406 2.658 6.5512 0.337 0.942 2.80P ＜0.01說明HSU17714基因的表達(dá)水平在大腸癌組織中明顯低于在同一病人的正常腸粘膜中(P＜0.01)。其中一例在大腸癌中幾乎不表達(dá)，還有8例則在大腸癌中的表達(dá)水平比在正常腸粘膜中低2倍以上，共占75％。說明了HSU17714基因在大腸癌中存在著不同程度的表達(dá)缺陷。
另對3例大腸癌及同一病人的正常腸粘膜采用同位素法做RNANorthern blot，結(jié)果見圖譜(2)

HSU17714基因Northern blot圖譜(2)其中1例該基因不表達(dá)，2例正常腸粘膜標(biāo)本中，在28S和18S之間接近18S處有一條明顯的放射自顯影條帶，而在大腸癌標(biāo)本中，放射自顯影條帶極淡，也說明了在大腸癌中HSU17714基因的表達(dá)水平明顯低于在同一病人的正常腸粘膜中，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。
除了利用Dot blot方法以外，還可利用Primer Extension、Exon-trapping、以該基因全部或部分序列為探針篩選基因組DNA文庫和YAC文庫，或利用Southern Blot、Northern Blot、Western Blot等各種研究方法，對基因組結(jié)構(gòu)與基因功能以及表達(dá)調(diào)控進(jìn)行研究?？赏ㄟ^檢測該基因在各種腫瘤及相關(guān)疾病中的表達(dá)及突變(點(diǎn)突變、移碼突變、缺失)以作診斷指標(biāo)；或?qū)⒃摶蛐蛄胁糠只蛉繉?dǎo)入腫瘤及相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行基因治療；以該基因cDNA的全部或部分序列，進(jìn)行基于cDNA的轉(zhuǎn)錄圖構(gòu)建；作為EST位點(diǎn)(Exoressed Sequence Taqs)進(jìn)行人類基因組研究，可以藉此發(fā)現(xiàn)人類新的基因。
還可以該基因的全部或部分序列，尋找該基因或該基因編碼蛋白在進(jìn)化上同源的基因和蛋白，也可以在其它物種上尋找同源的基因或蛋白，也可以尋找基因類似物或假基因。
實(shí)施例4對該基因全長cDNA序列進(jìn)行分析，在第54核苷酸位上的ATG比較符合Kozac規(guī)則，以它起始的蛋白開放閱讀框架共816個核苷酸，在第969核苷酸位上遇到終止密碼子TAA而終止。所以我們推測該基因編碼蛋白讀框從第154核苷酸位至968核苷酸位，翻譯成氨基酸序列共271個殘基。蛋白編碼示意參見圖3。
利用該基因編碼的蛋白全部或部分序列，可以通過體外翻譯、表達(dá)融合蛋白、合成多肽、蛋白電泳、親合層析、Western印跡雜交、蛋白測序等方法，對該基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能予以研究，可以純化該基因編碼的蛋白用以研究，醫(yī)療或商品化。還可以制備針對該基因編碼蛋白的單克隆抗體、多克隆抗體、抗血清等，利用該基因編碼的蛋白及其抗體進(jìn)行診斷檢測或作為藥物進(jìn)行治療。
權(quán)利要求
1.一種新的大腸癌負(fù)相關(guān)基因(HSU17714)，其特征在于全長序列有2932bp，堿基計數(shù)為900A、515C、615G、902T，該基因的cDNA序列編碼的蛋白序列271aa及染色體定位于人染色體22q13。
2.如權(quán)利要求1所述的新的大腸癌負(fù)相關(guān)基因，其特征在于利用該序列全部或部分可進(jìn)行結(jié)構(gòu)及功能研究，及進(jìn)行編碼的蛋白質(zhì)的全部或部分結(jié)構(gòu)及功能的研究，也可利用該核酸進(jìn)行診斷和治療。還可利用該序列翻譯產(chǎn)物進(jìn)行臨床診斷和治療。
全文摘要
一種新的大腸癌負(fù)相關(guān)基因(HSU17714)，全長序列有2932個核苷酸，堿基計數(shù)為900A、515C、615G、902T、該基因不僅可以為腫瘤發(fā)病機(jī)制提供新的資料，也為臨床腫瘤診斷與治療提供了新的目的基因。
文檔編號A61K38/17GK1167827SQ9610779
公開日1997年12月17日 申請日期1996年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月7日
發(fā)明者鄭樹, 蔡心涵, 曹江, 施正政, 莫益群, 陸敏, 耿禮義, 鄭雷, 張?zhí)K展, 楊驊, 張顏明 申請人:浙江醫(yī)科大學(xué)