專利名稱：三環(huán)5，6-二氫-9H-吡唑并[3，4-C]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶的制作方法
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本發(fā)明涉及三環(huán)5，6-二氫-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶，它是IV型磷酸二酯酶(PDE)或產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)的選擇性抑制劑，它們可用于治療哮喘、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、慢性妨礙性導(dǎo)氣管疾病、牛皮癬、過敏性鼻炎、皮炎及其它炎癥性疾病和涉及TNF產(chǎn)生的艾滋病、膿毒癥、膿毒性休克及其它疾病如惡病質(zhì)的方法。本發(fā)明化合物可具有PDE IV和TNF的抑制活性。
本發(fā)明還涉及所述化合物用于治療哺乳動(dòng)物特別是人的上述疾病的方法及其有用的藥物組合物。
由于認(rèn)識(shí)到環(huán)AMP是細(xì)胞內(nèi)二級(jí)信使(E.W.Sutherland and T.W.Rall，Pharmacol.Rev.，1960，12，265)，抑制磷酸二酯酶是調(diào)節(jié)的目標(biāo)，因此在一些疾病范圍內(nèi)引入治療。最近，PDE已明確地分類(J.A.Beavo and D.H.Reifsnyder，TiPS，1990，11，150)，其選擇性抑制改善了藥物治療(C.D.Nicholson，R.A.Chall-iss and M.Shahid，TiPS，1991，12，19)。更特別地，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，抑制IV型磷酸二酯酶可導(dǎo)致抑制炎癥性介質(zhì)的釋放(M.W.Vergheseet al.J.Mol，Cell Cardiol.，1989，12，(Suppl.II)，S 61)和導(dǎo)氣管平滑肌肉的放松(T.J.Torphy Directions for NewAnti-Asthma Drugs，eds S.R.O′Donnell and C.G.A.Per-sson，1988，37，Birkhauser-Verlag)。這樣，在不造成心血管作用和抗血小板作用的條件下，抑制IV型PDE的化合物抑制了炎癥性介質(zhì)的釋放并放松了導(dǎo)氣管平滑肌肉，所述化合物對(duì)其它類型的PDE的活性較差。
一般認(rèn)為，TNF與許多傳染性疾病和自體免疫疾病有關(guān)，包括惡病質(zhì)(W.Friers，F(xiàn)EBS Letters，1991，285，199)。進(jìn)一步地，已經(jīng)表明在膿毒癥和膿毒性休克中，TNF是炎癥性反應(yīng)的主要介質(zhì)(C.E.Spooner et a1.，Clinical Immunology and Immunopa-thology， 1992，62，S11)。
本發(fā)明涉及式I化合物 及其藥學(xué)可接受鹽；其中R1為氫，(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C2-C4)鏈烯基、苯基、二甲基氨基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C3-C6)環(huán)烷基(C1-C3)烷基或(C1-C6)?；渲型榛?、苯基或鏈烯基可由最多兩個(gè)羥基、(C1-C3)烷基或三氟甲基或最多三個(gè)鹵原子取代；R2和R3各自獨(dú)立選自氫、(C1-C14)烷基、(C1-C7)烷氧基(C1-C7)烷基、(C2-C14)鏈烯基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基(C1-C2)烷基、飽和或不飽和的(C4-C7)雜環(huán)(CH2)n基團(tuán)，其中n為0、1或2，所含雜原子為一個(gè)或兩個(gè)選自氧、硫、磺?；?、氮和NR4，其中R4為氫或(C1-C4)烷基；或者式II基團(tuán) 其中a為1至5的整數(shù)；b和c為0或1；R5為氫、羥基、(C1-C5)烷基、(C2-C5)鏈烯基、(C1-C5)烷氧基、(C3-C6)環(huán)烷氧基、鹵素、三氟甲基、CO2R6、CONR6R7、NR6R7、NO2或SO2NR6R7，其中R6和R7各自獨(dú)立為氫或(C1-C4)烷基；其中Z為氧、硫、SO2、CO或NR8，其中R8為氫或(C1-C4)烷基；以及Y為任選地由最多兩個(gè)(C1-C7)烷基或(C3-C7)環(huán)烷基取代的(C1-C5)亞烷基或(C2-C6)鏈烯基；其中各個(gè)烷基、鏈烯基、環(huán)烷基、烷氧基烷基或雜環(huán)基團(tuán)可由1至14個(gè)(C1-C2)烷基、三氟甲基或鹵素取代，優(yōu)選1至5個(gè)；以及R9和R10各自獨(dú)立選自氫、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳基和(C6-C10)芳氧基。
除非另有指明，這里使用的術(shù)語“烷基”包括含直鏈、支鏈或環(huán)部分或其組合的飽和的一價(jià)烴基。
這里使用的術(shù)語“烷氧基”包括O-烷基，其中烷基如上文定義。
除非另有指明，這里使用的術(shù)語“噻吩甲基”是由噻吩-CH2-定義的。
除非另有指明，這里使用的術(shù)語“芳基”包括由芳烴除去一個(gè)氫原子衍生的有機(jī)基團(tuán)如苯基或萘基，所述基團(tuán)可由氟、氯、氰基、硝基、三氟甲基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基和(C1-C6)烷基中的1至3個(gè)取代基任意地取代。
這里使用的術(shù)語“芳氧基”包括O-芳基，其中芳基如上文定義。
除非另有指明，這里使用的術(shù)語“?；卑ㄍㄊ絉CO的基團(tuán)，其中R為烷基、烷氧基、芳基、芳烷基或芳基烷氧基，術(shù)語“烷基”或“芳基”如上文定義。
在優(yōu)選的式I化合物中，R1為甲基、乙基或異丙基。
在其它優(yōu)選的式I化合物中，R3為(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基(C1-C6)烷基或由氫、羥基、(C1-C5)烷基、(C2-C5)鏈烯基、(C1-C5)烷氧基、鹵素、三氟甲基、CO2R6、CONR6R7、NR6R7、NO2或SO2NR6R7中1或2個(gè)基團(tuán)任意取代的苯基，其中R6和R7各自獨(dú)立為氫或(C1-C4)烷基。
特別優(yōu)選的式I化合物包括下列9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-苯基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(呋喃-2-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，3-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(2-吡啶基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(4-吡啶基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；
9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(3-噻吩甲基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；3-芐基-9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-丙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，3-三唑并[4，3-α]吡啶；3，9-二環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(1-甲基環(huán)己-1-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；3-叔丁基-9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(2-甲基苯基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(2-甲氧基苯基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(噻吩-2-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；3-(2-氯苯基)9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(2-碘苯基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(2-三氟甲基苯基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；
5，6-二氫-7-乙基-9-(4-氟苯基)-3-(1-甲基環(huán)己-1-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶。
本發(fā)明還涉及抑制IV型磷酸二酯酶(PDE)以及TNF生成的方法，包括對(duì)患者服用有效劑量式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽。
本發(fā)明還涉及治療哺乳動(dòng)物炎癥性疾病的方法，該方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物服用消炎劑量式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽。
本發(fā)明還涉及用于(a)治療哮喘、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、慢性妨礙性導(dǎo)氣管疾病、牛皮癬、過敏性鼻炎、皮炎及其它以IV型磷酸二酯酶(PDE)活性為特征的炎癥性疾病、涉及TNF生成的艾滋病、膿毒癥、膿毒性休克及其它疾病如惡病質(zhì)，或(b)抑制IV型磷酸二酯酶(PDE)和TNF的生成，含有效劑量式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽以及藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防哮喘、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、慢性妨礙性導(dǎo)氣管疾病、牛皮癬、過敏性鼻炎、皮炎及其它炎癥性疾病、涉及TNF生成的艾滋病、敗血性休克及其它疾病如惡病質(zhì)的方法，包括對(duì)患者服用有效劑量式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽。
下述反應(yīng)流程揭示了本發(fā)明化合物的制備，但并不局限于此。除非另有指明，反應(yīng)流程及下文討論中的R1、R2、R3、R9和R10如上文定義。
制備1
制備2
制備3 制備4
流程1 流程2
流程3
在制備1的反應(yīng)1中，在只有銅粉和碳酸鉀存在下，通過式III化合物與4-碘苯甲醚或4-溴苯甲醚反應(yīng)，式III的2-吡咯烷酮化合物轉(zhuǎn)變成了相應(yīng)的N-(4-甲氧基苯基)-2-吡咯烷酮式IV化合物。在惰性反應(yīng)條件下，將反應(yīng)混合物加熱到大約110℃至170℃，優(yōu)選大約150℃；加熱時(shí)間大約14小時(shí)至22小時(shí)，優(yōu)選大約18小時(shí)。
在制備1的反應(yīng)2中，將R1為(C1-C6)烷基的R1鹵化物加入到鎂的無水非質(zhì)子傳遞溶劑懸浮液中。將反應(yīng)混合物加熱回流，直至鎂被消耗掉，然后冷卻至大約-15℃至15℃，優(yōu)選大約0℃。加入式IV的N-(4-甲氧基苯基)-2-吡咯烷酮化合物，將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝兀瑫r(shí)攪拌大約1.5小時(shí)至2.5小時(shí)，優(yōu)選大約2小時(shí)。適當(dāng)?shù)耐榛u化物包括溴甲烷、溴乙烷或溴丙烷。優(yōu)選的無水非質(zhì)子傳遞溶劑為無水乙醚。
通過將沉淀分散在非極性非質(zhì)子傳遞溶劑和堿的混合物中，分離所需的中間體，并將其轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式V的1，2，5，6-四氫吡啶化合物。加入乙基草酰氯，回流加熱反應(yīng)混合物大約1.5小時(shí)至4.5小時(shí)，優(yōu)選在約3.0小時(shí)。優(yōu)選的非極性非質(zhì)子傳遞溶劑為苯，優(yōu)選的堿為氫氧化鈉。除去溶劑，用烷醇鈉溶液的乙醇溶液處理所得的殘留物?；亓骷訜岽蠹s1小時(shí)至3小時(shí)，優(yōu)選大約1.5小時(shí)后，減壓濃縮混合物，用鹽酸酸化至pH大約為3。
在制備1的反應(yīng)3中，通過回流加熱式V和3-甲基-1-對(duì)-甲苯基三氮烯的在非質(zhì)子傳遞溶劑，優(yōu)選1，2-二氯乙烷中的反應(yīng)混合物，加熱時(shí)間大約為30分鐘至2小時(shí)，優(yōu)選45分鐘，將式V化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式VI的3-甲氧基-1，2，5，6-四氫吡啶化合物。
在制備2的反應(yīng)1中，通過式VII與R3為上文定義的式R3HNNH2的肼化合物反應(yīng)，將R11為氫或甲基的式VII的1，2，5，6-四氫吡啶化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式VIII的4，5，6，7-四氫-7-氧代-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶化合物。式VII化合物的兩種衍生物3-羥基和3-甲氧基均可在三組不同的反應(yīng)條件下用作起始原料。
在第一組反應(yīng)條件下，通過式VII與肼的鹽酸鹽和無水極性質(zhì)子傳遞溶劑中的烷醇鈉反應(yīng)，將式VII的1，2，5，6-四氫吡啶化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)式VIII化合物。優(yōu)選的烷醇鈉為甲醇鈉，優(yōu)選的無水極性質(zhì)子溶劑為無水乙醇?；亓骷訜岱磻?yīng)混合物大約9小時(shí)至15小時(shí)，優(yōu)選大約12小時(shí)。
在第二組反應(yīng)條件下，通過式VII與無水極性質(zhì)子傳遞溶劑優(yōu)選乙醇中的肼反應(yīng)，將式VII的1，2，5，6-四氫吡啶化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式VIII化合物?；亓骷訜岱磻?yīng)混合物大約16小時(shí)至24小時(shí)，優(yōu)選大約20小時(shí)。
在第三組反應(yīng)條件下，通過式VII與極性質(zhì)子傳遞溶劑優(yōu)選乙醇中的肼或肼的鹽酸鹽反應(yīng)，將式VII的1，2，5，6-四氫吡啶化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)式VIII化合物。在平和的氮?dú)饬鳁l件下，將反應(yīng)混合物加熱至大約70℃至110℃，優(yōu)選大約90℃，直至除去所有的溶劑。將純混合物加熱至大約120℃至180℃，優(yōu)選大約150℃，加熱時(shí)間大約為30分鐘至90分鐘，優(yōu)選大約60分鐘。
在制備2的反應(yīng)2中，通過將式VIII的極性質(zhì)子傳遞溶劑優(yōu)選乙腈的溶液與硝酸鈰(IV)銨的水溶液在大約-15℃至15℃優(yōu)選大約0℃下反應(yīng)大約20分鐘至50分鐘優(yōu)選大約35分鐘，將式VII化合物轉(zhuǎn)變成式IX的6-H-4，5，6，7-四氫-7-氧代-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶化合物。反應(yīng)完成后，用水稀釋混合物并用乙酸乙酯萃取。先用飽和碳酸氫鈉洗合并的有機(jī)物，然后再用亞硫酸鈉洗。
在制備3的反應(yīng)1中，通過在大約0℃至62℃優(yōu)選大約25℃下，用極性非質(zhì)子傳遞溶劑如四氫呋喃中的氫化鈉處理式XII大約1小時(shí)至6小時(shí)優(yōu)選大約1小時(shí)，將如利用美國專利3,423,414中描述的方法制備的式XII化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的R1為二乙基氨基的式VIII化合物。在室溫下向反應(yīng)混合物中加入過量的甲基碘，攪拌反應(yīng)混合物大約1小時(shí)至24小時(shí)，優(yōu)選大約2小時(shí)。
在制備3的反應(yīng)2中，根據(jù)上述制備2的反應(yīng)2中的步驟，式VIII化合物進(jìn)一步反應(yīng)，得到相應(yīng)的式IX的6-H-4，5，6，7-四氫-7-氧代-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶化合物，其中R1為二烷基氨基。
在制備4的反應(yīng)1中，通過在大約0℃至25℃優(yōu)選大約25℃下，將式XII與溴三甲基硅烷和非質(zhì)子傳遞溶劑如四氯化碳中的亞硝酸鈉反應(yīng)大約6小時(shí)至48小時(shí)優(yōu)選大約24小時(shí)，將式XII化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式XIII化合物。
在制備4的反應(yīng)2中，通過在大約80℃至120℃優(yōu)選大約100℃下，將式XIII與非極性非質(zhì)子傳遞溶劑如苯中的乙烯基三丁基錫和催化量的四(三苯基膦)鈀(O)反應(yīng)大約24小時(shí)至72小時(shí)優(yōu)選大約48小時(shí)，將式XIII化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式VIII化合物，其中R1為乙烯基。
在制備3的反應(yīng)3中，根據(jù)上述制備2的反應(yīng)2中的步驟，式VIII化合物進(jìn)一步反應(yīng)，得到相應(yīng)的式IX的6-H-4，5，6，7-四氫-7-氧代-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶化合物，其中R1為鏈烯基。
在流程1的反應(yīng)1中，通過將式IX與極性非質(zhì)子傳遞溶劑如1，4-二噁烷或吡啶中的五硫化二磷反應(yīng)，將式IX的內(nèi)酰胺化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式X的硫代內(nèi)酰胺化合物?；亓骷訜岱磻?yīng)混合物大約12小時(shí)至48小時(shí)，優(yōu)選大約18小時(shí)。
在流程1的反應(yīng)2中，通過在惰性反應(yīng)條件下，在無水非質(zhì)子傳遞溶劑如吡啶存在下，將式X與無水肼反應(yīng)，將式X的硫代內(nèi)酰胺轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式I的三環(huán)5，6-二氫-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶化合物。反應(yīng)混合物加熱到大約50℃至100℃，優(yōu)選70℃，加熱時(shí)間為大約5分鐘至30分鐘，優(yōu)選5分鐘。然后減壓除去揮發(fā)性物質(zhì)，加入新的無水非質(zhì)子傳遞溶劑優(yōu)選吡啶，再加入式R2COCl的適當(dāng)酰氯，其中R2為上文定義。攪拌所得反應(yīng)混合物大約1小時(shí)至4小時(shí)，優(yōu)選大約2小時(shí)。再減壓除去揮發(fā)性物質(zhì)。殘留物溶解在非質(zhì)子傳遞溶劑如二甲基甲酰胺中，回流加熱大約1小時(shí)至4小時(shí)，優(yōu)選大約2小時(shí)。
在流程2的反應(yīng)1中，通過利用重氮甲烷的乙醚溶液處理非質(zhì)子傳遞溶劑如乙醚中的式X和硅膠混合物，將式X的硫代內(nèi)酰胺化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式XI的甲基硫代化合物。反應(yīng)溫度通常在大約-5℃至10℃，優(yōu)選大約0℃，反應(yīng)時(shí)間大約為30分鐘到5小時(shí)，優(yōu)選大約1小時(shí)。
在流程2的反應(yīng)2中，通過在惰性反應(yīng)條件下，將式XI與非質(zhì)子傳遞溶劑如吡啶中的式R2CONHNH2的酰肼或?qū)?yīng)的鹽酸鹽形式反應(yīng)，將式XI的甲硫基化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式I的三環(huán)5，6-二氫-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶化合物。加熱反應(yīng)混合物至大約120℃至150℃，優(yōu)選大約135℃；加熱時(shí)間大約為2小時(shí)至6小時(shí)，優(yōu)選大約4小時(shí)。減壓除去揮發(fā)性物質(zhì)，所得油狀物進(jìn)一步加熱到大約135℃至165℃，優(yōu)選大約150℃；加熱時(shí)間大約2小時(shí)至6小時(shí)，優(yōu)選大約4小時(shí)。
在流程3的反應(yīng)1中，根據(jù)Canadian Journal of Chemistry，33，1714(1955)中描述的方法，將式XIV化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式XV化合物。
在流程3的反應(yīng)2中，通過在大約-50℃至-80℃優(yōu)選大約-78℃下，將式XV與極性非質(zhì)子傳遞溶劑如乙醚中的烷基鋰反應(yīng)大約15分鐘至2小時(shí)優(yōu)選大約30分鐘，將式XV的化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的R12為(C1-C6)烷基的式XVI化合物。
在流程3的反應(yīng)3中，通過在室溫下，利用非極性非質(zhì)子傳遞溶劑如二氯甲烷中的氯鉻酸吡啶鎓處理式XVI大約6小時(shí)至24小時(shí)優(yōu)選12小時(shí)，將式XVI的化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的式I的5，6-二氫-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶化合物，其中R1為(C1-C6)?；?。
化合物或其藥學(xué)可接受鹽抑制磷酸二酯酶IV(PDE4)的能力及其因此治療炎癥性疾病的有效性的說明表示在下述的體外測(cè)定中。
生藥測(cè)定人的嗜酸性細(xì)胞PDE將人的外周血液收集在乙二胺四乙酸中，以1∶2在哌嗪-N，N′-二-2-乙基磺酸(PIPES)緩沖液中稀釋，然后在percoll溶液上成層。在4℃下，通過2000rpm離心形成梯度。根據(jù)Kita et al.，J.Immunol.，152，5457(1944)中的步驟，在4℃下進(jìn)行殘留物的分離過程。從percoll梯度中收集中性白細(xì)胞/嗜酸性細(xì)胞層，溶解血液紅細(xì)胞。在PIPES(1％FCS)中清洗剩下的細(xì)胞，用抗CD16微水珠(MACS)孵育1小時(shí)，穿過一磁柱以除去中性白細(xì)胞。嗜酸性細(xì)胞收集在洗脫液中，通過錐蟲藍(lán)分析存活能力，并通過快速分散染色(diff-quick stain)分析純度。使用該方法的嗜酸性細(xì)胞純度通常大于99％。
純化的嗜酸性細(xì)胞再懸浮在750μl PDE溶解緩沖液(20mM三乙胺、1mM乙二胺四乙酸、100μg/ml桿菌肽、2mm芐脒、50μmle-upeptin、50μm PMSF、100μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑)，并在液氮中快速冷凍。細(xì)胞慢慢地融化并聲處理。旋轉(zhuǎn)細(xì)胞模(通過在碎片上染錐蟲藍(lán)來確定細(xì)胞膜的破壞)。在4℃下，45k rpm將破壞的細(xì)胞離心分離細(xì)胞膜。潷析出細(xì)胞溶質(zhì)(cytosol)，細(xì)胞膜重新懸浮至200μg/ml，以供在水解測(cè)定中用作PDE源，從而產(chǎn)生一個(gè)3000-5000計(jì)數(shù)的窗口。
在10-2M，將化合物溶解在二甲基亞砜中，然后1∶25在水中稀釋至4×10-4M。此懸浮液連續(xù)1∶10在4％二甲基亞砜中稀釋，在測(cè)定中的最后二甲基亞砜濃度為1％。磷酸二酯酶抑制性測(cè)定向12×75mm玻璃管中加入25μlPDE測(cè)定緩沖液(200mM Tris/40mM MgCl2)25μl4nM/ml cAMP原料25μl測(cè)試化合物25μlPDE源(細(xì)胞膜)背景控制＝細(xì)胞膜沸騰10′陽性對(duì)照＝25μl未沸細(xì)胞膜在37℃水浴中孵育25分鐘。
通過沸騰樣品5分鐘使反應(yīng)停止。將樣品放置于先用0.25M乙酸乙酯平衡、再用0.1mM N-[2-羥基乙基]哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)/0.1mM NaCl清洗緩沖液(pH8.5)平衡的Affigel柱(1ml柱床體積)中。用HEPES/NaCl清洗掉柱上的cAMP，0.25M乙酸在4ml體積中洗脫5′-AMP。在3ml閃爍液體計(jì)數(shù)1ml洗脫液1分鐘([3H])。
基質(zhì)轉(zhuǎn)換＝(cpm陽性對(duì)照×4)/總活性。對(duì)于有效實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)換率必須在3-15％之間。
抑制％＝1－(洗脫cpm－背景cpm/對(duì)照cpm－背景cpm)×100。
IC50s是通過抑制滴定曲線(線性部分)的線性回歸產(chǎn)生的，并以μM表示。
TNF化合物及其藥學(xué)可接受鹽抑制TNF生成的能力以及治療涉及TNF產(chǎn)生的疾病的有效性的說明顯示在下述的體外測(cè)定中用乙二胺四乙酸(EDTA)收集人的志愿者的外周血液(100ml)。通過Ficoll/Hypaque分離單核細(xì)胞，在不完全Hanks′平衡鹽溶液(HBSS)清洗三次。細(xì)胞以最后濃度為每毫升1×106個(gè)細(xì)胞重新懸浮在預(yù)熱過的RPMI(含5％FCS、谷酰胺、pen/step和制真菌素)中。單核細(xì)胞以每1.0ml 1×106個(gè)細(xì)胞放置在24孔板上。細(xì)胞在37℃(5％二氧化碳)孵育，并允許粘在板上2小時(shí)，此后通過輕輕地清洗，除去沒有粘上的細(xì)胞。然后試驗(yàn)化合物(10μl)以每次3-4個(gè)濃度加入到細(xì)胞上，孵育1小時(shí)。在適當(dāng)?shù)募?xì)胞上加上脂多糖(LPS)(10μl)。板在37℃下孵育過夜(18小時(shí))。在孵育的后期，通過夾層ELISA(R& D Quantikine Kit)分析TNF。在線性回歸分析基礎(chǔ)上測(cè)定每次化合物的lC50。
本發(fā)明化合物的藥學(xué)可接受的酸加成鹽包括但不局限于那些與HCl、HBr、HNO3、H2SO4、H3PO4、CH3SO3H、對(duì)-CH3C6H4SO3H、CH3CO2H、葡糖酸、酒石酸、馬來酸和琥珀酸形成的鹽。其中R5為CO2R6和R6為氫的本發(fā)明式I化合物的藥學(xué)可接受陽離子鹽包括但不局限于那些鈉、鉀、鈣、鎂、銨、N，N′-二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺(麥格魯明)、乙醇胺和二乙醇胺的鹽。
對(duì)有療效性或預(yù)防性地治療炎癥性疾病的患者進(jìn)行給藥，式I化合物及其藥學(xué)可接受鹽(下文也被認(rèn)為是本發(fā)明的活性化合物)的口服劑量通常為平均成年患者(70kg)每天0.1-400mg。這樣，對(duì)典型的成年患者，在適合藥學(xué)可接受的載體中的每個(gè)藥片或膠囊可含0.1-50mg的活性化合物。根據(jù)需要，典型的靜脈給藥劑量為每劑量0.1-40mg。對(duì)鼻腔或吸管給藥，劑量通常是以0.1-1％(w/v)溶液形式。實(shí)際上，應(yīng)是醫(yī)生確定每位患者的實(shí)際劑量，所述劑量將根據(jù)患者的年齡、體重和特殊的患者反應(yīng)確定。上述劑量只是平均情況的實(shí)例，當(dāng)然特殊情況的高劑量或低劑量范圍也是值得的，所有這些劑量都是本發(fā)明的范圍。
對(duì)于抑制TNF的人進(jìn)行給藥，可采用的各種常規(guī)給藥途徑包括口服、非腸道給藥和局部給藥。一般地，活性化合物可以大約每天每千克患者體重0.1-25mg的劑量口服或非腸道給藥，優(yōu)選大約0.3-5mg。式I化合物也可以濃度為大約0.5％-1％的油膏或乳膏局部給藥，一般對(duì)感染面每天施用2次或3次。但是根據(jù)接受治療的患者的病情?？杀匾馗淖儎┝俊o論如何，負(fù)責(zé)給藥的人應(yīng)確定患者個(gè)體的適當(dāng)劑量。
對(duì)人施用，本發(fā)明的活性化合物可以單獨(dú)使用，但通?？筛鶕?jù)給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物規(guī)程選擇藥物稀釋劑或載體混合給藥。例如，以含賦形劑如淀粉或乳糖的片劑形式，或以單獨(dú)的或與賦形劑混合的膠囊或卵狀丸體形式，或以含香味劑或著色劑的酏劑或懸浮劑形式口服。還可非腸道注射，如靜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下。對(duì)于非腸道給藥，最好是以含其它物質(zhì)如使溶液等滲的足夠鹽或葡萄糖的無菌水溶液形式存在。
通過下述實(shí)施例說明本發(fā)明，但不局限于這些具體內(nèi)容。在制備1-4中使用的起始原料是通過PCT公開WO 95/01980中描述的方法制備的。
制備11-環(huán)戊基-4，5-二氫-3-乙基-7-甲基硫代-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶將在500ml愛倫美氏燒瓶中的磁攪拌著的1-環(huán)戊基-3-乙基-7-硫代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶(0.322g)、中性硅膠(10g)和乙醚(100m1)混合物冷卻至0℃。向該混合物中慢慢加入過量的重氮甲烷的乙醚溶液。放出氣體，1小時(shí)后，用乙酸(1滴)驟冷反應(yīng)，過濾并減壓濃縮得到黃色油狀物。硅膠柱色譜純化所述油狀物，利用1∶4乙酸乙酸/己烷洗脫得到0.232g黃色油狀物。C14H21N3S的元素分析計(jì)算值C，63.85；H，8.04；N，15.94。實(shí)測(cè)值C，64.01；H，8.37；N，15.71。
制備21-環(huán)戊基-3-乙基-7-硫代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶利用五氧化二磷(3.9g)處理1-環(huán)戊基-3-乙基-7-氧代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶(10.0g)的無水1，4-二噁烷溶液?；亓鲾嚢?2小時(shí)后，將混合物冷卻至環(huán)境溫度并減壓濃縮。所得黃色油狀物溶解在二氯甲烷中，用水和鹽水清洗，在硫酸鈉上干燥，減壓濃縮。硅膠柱色譜純化桔黃色殘留物，利用己烷的二氯甲烷梯度混合物洗脫，得到9.3 g黃色固體。MP 152-3℃；C13H19N3S的元素分析計(jì)算值C，62.63；H，7，68；N，16.86。實(shí)測(cè)值C，62.14；H，7.51；N，16.35。
制備31-環(huán)戊基-3-乙基-6-(4-甲氧基苯基)-7-氧代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶將攪拌著的3-甲氧基-1-(3-甲氧基苯基)-2-氧代-4-丙酰-1，2，5，6-四氫-吡啶(0.49g，1.7mmol)、環(huán)戊基肼鹽酸鹽(0.40g)和甲醇鈉(46mg，0.85mmol)的混和物于無水乙醇加熱至回流。16小時(shí)后，減壓濃縮混合物，硅膠柱色譜純化，利用1∶4乙酸乙酯/己烷洗脫得到白色固體。由乙醚重結(jié)晶得到白色針狀物。MP 64-65℃；MS m/z[M+]340.2025；HRMS[M+]340.2046。
制備41-環(huán)戊基-3-乙基-7-氧代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶在0℃利用硝酸高鈰銨(12.5g，22.8mmol)的水溶液(110ml)處理攪拌著的1-環(huán)戊基-3-乙基-6-(4-甲氧基苯基)-7-氧代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶(2.58g，7.60mmol)的乙腈(90ml)溶液。攪拌35分鐘后，用水(550ml)稀釋混合物，用乙酸乙酯(100ml×4)萃取。先用50％飽和碳酸氫鈉(250ml)清洗合并的有機(jī)物，再用10％亞硫酸鈉清洗，直至含水洗液變成淺黃色。有機(jī)層再進(jìn)一步用飽和碳酸氫鈉和鹽水清洗，并用脫色炭處理。攪拌30分鐘后，在硫酸鈉上干燥，通過硅藻土過濾，減壓濃縮。由乙醚重結(jié)晶褐色殘留物得到0.814g褐色固體。M.P.143-145℃；MS(M/Z)234，1H NMR(250MHz，CDCI3)1.21(t，J＝7.6Hz，3H)，1.62-2.13(m，8H)，2.62(q，J＝7.6Hz，2H)，2.73(t，J＝6.8Hz，2H)，3.51(dt，J＝2.7和6.8Hz，2H)，5.47(s，1H)，5.61(pentet，J＝7.7Hz，1H)。
實(shí)施例19-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(3-吡啶基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶在火焰干燥的燒瓶中，將1-環(huán)戊基-4，5-二氫-3-乙基-7-甲基硫代-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶(0.036g，0.14mmol)和煙酸肼酰(0.21g，0.15mmol)溶解在無水吡啶(5ml)中。加入烘干的濃縮器，該濃縮器由隔膜密封并有一泡吹器出口。一根長(zhǎng)的不銹鋼針穿過隔膜和濃縮器中心至磁性攪拌的溶液。通過長(zhǎng)針吹入氮?dú)?。燒瓶加熱?35℃4小時(shí)。在氮?dú)獯迪礂l件下，除去吡啶。所得油狀物加熱至150℃4小時(shí)。燒瓶冷卻至環(huán)境溫度，燒瓶中含0.045g粗的白色固體標(biāo)題化合物。通過薄層色譜測(cè)定，粗產(chǎn)物中不含任何雜質(zhì)。硅膠柱色譜純化產(chǎn)物，利用乙酸乙酯/己烷梯度混合物洗脫，或者由乙酸乙酯的己烷混合物重結(jié)晶。MP140-5℃(粗)；1HNMR(300MHz，CDCI3)δ1.24(t，J＝7.6Hz，3H)，1.72(m，2H)，1.94(m，2H)，2.16(m，4H)，2.66(q，J＝7.6Hz，2H)，2.98(t，J＝7.0Hz，2H)，4.25(t，J＝7.0Hz，2H)，5.60(quintet，J＝7.7Hz，1H)，7.48(dd，J＝4.9和7.8Hz，1H)，8.05(d，J＝8.0Hz，1H)，8.75(dd，J＝1.4和4.9Hz，1H)，8.9(d，J＝1.7Hz，1H)；C19H22N6的元素分析計(jì)算值C，68.23；H，6.63；N，25.13.實(shí)測(cè)值C，67.39；H，6.87；N，24.00。
實(shí)施例2-18根據(jù)實(shí)施例1的類似步驟，利用適當(dāng)?shù)碾迈Ｅc1-環(huán)戊基-4，5-二氫-3-乙基-7-甲基硫代-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶反應(yīng)，得到下述R1為乙基、R3為環(huán)戊基的式I化合物。
實(shí)施例199-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(噻吩-2-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶在氮?dú)鈿夥障?，在火焰干燥的燒瓶中?-環(huán)戊基-3-乙基-7-硫代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶(0.35g，1.4mmol)溶解在4ml無水吡啶中。燒瓶溫?zé)嶂?0℃，加入1.5ml無水肼。黃色溶液變成了桃紅，攪拌5分鐘。減壓除去吡啶和過量的肼，得到桃紅固體，放置真空(大約0.1mm)30分鐘后變成淺綠色。接著向燒瓶中先加入無水吡啶(4ml)，再加入2-硫代苯碳酰氯(0.69g，4.7mmol)，攪拌混合物2小時(shí)。減壓除去吡啶，殘留物溶解在二甲基甲酰胺(4ml)，回流加熱2小時(shí)。然后將混合物冷卻至環(huán)境溫度，用水稀釋并用乙酸乙酯萃取。用1N NaOH將水層堿化至pH＝12，乙酸乙酯萃取3次。用1N NaOH、水和鹽水清洗合并的有機(jī)物，在硫酸鈉上干燥并減壓濃縮。硅膠柱色譜純化油狀產(chǎn)物，利用乙酸乙酯/己烷梯度混合物洗脫得到304g白色固體標(biāo)題化合物。MP 125-6℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.25(t，J＝7.5Hz，3H)，1.60-1.74(m，2H)，1.9-2.0(m，2H)，2.11-2.21(m，4H)，2.67(q，J＝7.6Hz，2H)，3.00(t，J＝7.1Hz，2H)，4.30(t，J＝7.1Hz，2H)，5.60(quintet，J＝7.7Hz，1H)，7.20(dd，J＝3.9和5.1Hz，1H)，7.49-7.54(m，2H)，C18H21N5S的元素分析計(jì)算值C，63.68；H，6.24；N，20.63。實(shí)測(cè)值C，63.66；H，6.19；N，21.00。
實(shí)施例20-30根據(jù)實(shí)施例19的類似步驟，利用適當(dāng)?shù)孽；扰c1-環(huán)戊基-3-乙基-7-硫代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶反應(yīng)，得到下述R1為乙基、R3為環(huán)戊基的式I化合物。
實(shí)施例315，6-二氫-7-乙基-9-(4-氟苯基)-3-(1-甲基環(huán)己-1-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶將3-乙基-1-(4-氟苯基)-7-硫代-4，5，6，7-四氫-1H-吡唑并[3，4-c]吡啶(0.092g)溶解在無水吡啶(5ml)中，溶液溫?zé)嶂?0℃。加入無水肼(2ml)，所得黃色溶液慢慢地變成米色。5分鐘后，減壓除去揮發(fā)性物質(zhì)，得到黃色固體。接著，先加入無水吡啶(5ml)，再加入1-甲基環(huán)己烷碳酰氯(0.2g)。環(huán)境溫度攪拌2小時(shí)后，減壓除去吡啶，殘留物溶解在二甲基甲酰胺(5ml)中?；亓鲾嚢?2小時(shí)后，溶液冷卻至環(huán)境溫度，用水稀釋，用乙酸乙酯萃取。用水和鹽水清洗合并的有機(jī)物，然后在硫酸鈉上干燥。減壓濃縮得到淺褐色油狀物。硅膠柱色譜純化油狀物，用1∶2乙酸乙酯/己烷洗脫，得到0.09g淺黃色固體。MP 60-61℃；MS(M/Z)380。
權(quán)利要求
1.一種式I化合物， 及其藥學(xué)可接受鹽；其中R1為氫、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C2-C4)鏈烯基、苯基、二甲基氨基、(C3-C6)環(huán)烷基、(C3-C6)環(huán)烷基(C1-C3)烷基或(C1-C6)?；?，基中烷基、苯基或鏈烯基可由最多兩個(gè)羥基、(C1-C3)烷基或三氟甲基或最多三個(gè)鹵原子取代；R2和R3各自獨(dú)立選自氫、(C1-C14)烷基、(C1-C7)烷氧基(C1-C7)烷基、(C2-C14)鏈烯基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基(C1-C2)烷基、飽和或不飽和的(C4-C7)雜環(huán)(CH2)n基團(tuán)，其中n為0、1或2，所含雜原子為一個(gè)或兩個(gè)選自氧、硫、磺?；⒌蚇R4，其中R4為氫或(C1-C4)烷基；或者式II基團(tuán) 其中a為1至5的整數(shù)；b和C為0或1；R5為氫、羥基、(C1-C5)烷基、(C2-C5)鏈烯基、(C1-C5)烷氧基、(C3-C6)環(huán)烷氧基、鹵素、三氟甲基、CO2R6、CONR6R7、NR6R7、NO2或SO2NR6R7，其中R6和R7各自獨(dú)立為氫或(C1-C4)烷基；其中Z為氧、硫、SO2、CO或NR8，其中R8為氫或(C1-C4)烷基；以及Y為任選地由最多兩個(gè)(C1-C7)烷基或(C3-C7)環(huán)烷基取代的(C1-C5)亞烷基或(C2-C6)鏈烯基；其中各個(gè)烷基、鏈烯基、環(huán)烷基、烷氧基烷基或雜環(huán)基團(tuán)由1至14個(gè)(C1-C2)烷基、三氟甲基或鹵素取代，優(yōu)選1至5個(gè)；以及R9和R10各自獨(dú)立選自氫、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C6-C10)芳基和(C6-C10)芳氧基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1為甲基、乙基或異丙基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R3為(C1-C6)烷基、(C2-C6)鏈烯基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基(C1-C6)烷基或由氫、羥基、(C1-C5)烷基、(C2-C5)鏈烯基、(C1-C5)烷氧基、鹵素、三氟甲基、CO2R6、CONR6R7、NR6R7、NO2或SONR6R7中1或2個(gè)基團(tuán)任意地取代的苯基，其中R6和R7各自獨(dú)立為氫或(C1-C4)烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，該化合物選自9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-苯基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(4-吡啶基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(3-噻吩甲基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；3，9-二環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(1-甲基環(huán)己-1-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；3-叔丁基-9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(噻吩-2-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；3-(2-氯苯基)9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；9-環(huán)戊基-5，6-二氫-7-乙基-3-(2-碘苯基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；和5，6-二氫-7-乙基-9-(4-氟苯基)-3-(1-甲基環(huán)己-1-基)-9H-吡唑并[3，4-c]-1，2，4-三唑并[4，3-α]吡啶；
5.一種抑制IV型磷酸二酯酶(PDE)以及腫瘤壞死因子(TNF)生成的方法，包括對(duì)患者服用有效劑量權(quán)利要求1化合物。
6.一種治療哺乳動(dòng)物炎癥性疾病的方法，該方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物服用消炎劑量式I化合物或其藥學(xué)可接受鹽。
7.一種治療或預(yù)防哮喘、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、慢性妨礙性導(dǎo)氣管疾病、牛皮癬、過敏性鼻炎、皮炎及其它炎癥性疾病和涉及TNF產(chǎn)生的艾滋病、膿毒性休克及其它疾病如惡病質(zhì)的方法，包括對(duì)患者服用有效劑量權(quán)利要求1化合物。
8.一種藥物組合物，用于(a)治療哮喘、關(guān)節(jié)炎、支氣管炎、慢性妨礙性導(dǎo)氣管疾病、牛皮癬、過敏性鼻炎、皮炎及其它以IV磷酸二酯酶(PDE)活性為特征的炎癥性疾病，涉及TNF產(chǎn)生的艾滋病、膿毒癥、膿毒性休克及其它疾病如惡病質(zhì)，或(b)抑制IV型磷酸二酯酶(PDE)和生成TNF，其含有效劑量權(quán)利要求1化合物以及藥學(xué)可接受載體。
全文摘要
一種式I化合物，其中R
文檔編號(hào)A61P37/08GK1142499SQ96107630
公開日1997年2月12日 申請(qǐng)日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日
發(fā)明者艾倫·J·杜普蘭蒂爾, 凱爾文·庫珀 申請(qǐng)人:美國輝瑞有限公司