專利名稱：：角質(zhì)細胞生長因子類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)及蛋白質(zhì)工程。具體而言，運用重組DNA方法以產(chǎn)生角質(zhì)細胞生長因子(KGF)的多肽類似物，它是一種有效的非成纖維上皮細胞生長的有絲分裂原，其中該類似物與親代KGF相比有改進的穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
：組織生成及再生的復雜過程是由一系列蛋白質(zhì)因子介導的，這些因子有時也稱為軟組織生長因子。這些分子通常由一類細胞所釋放并影響其它類型細胞的增殖(Rubin等(1989年)美國國家科學院院刊，86802-806)。某些軟組織生長因子由一些特殊類型細胞所分泌并在多細胞有機體的發(fā)育過程中影響效應細胞的增殖、分化和/或成熟(Finch等(1989年)，科學，245752-755)。除了它們在發(fā)育的有機體上作用以外，某些軟性組織生長因子在持續(xù)健康及更成熟的系統(tǒng)中的維護作用中更加重要。例如在哺乳動物體內(nèi)許多系統(tǒng)中發(fā)生快速的細胞轉(zhuǎn)換。這些系統(tǒng)包括皮膚、胃腸道，它們都包括有上皮細胞。這類軟組織生長因子所包括的因子是成纖維細胞生長因子(FGFs)的蛋白質(zhì)家族。目前八個已知的FGF家族成員在一級結(jié)構(gòu)上有相關(guān)性，它們是堿性成纖維細胞生長因子，bFGF(Abraham等(1986年)，EMBOJ.52523-2528)；酸性成纖維細胞生長因子，aFGF(Jaye等(1986年)，科學，233541-545)；int-2基因產(chǎn)物，int-2(Dickson及Peters(1987年)，自然，326833)；hst/kFGF(Delli-Bovi等(1987年)，細胞，50729-737和Yoshida等(1987年)，美國國家科學院院刊，847305-7309)；FGF-5(Zhan等(1988年)，分子細胞生物學，83487-3495)；FGF-6(Marics等(1989年)，癌基因，4335-340)；角質(zhì)細胞生長因子(Finch等(1989年)以及富組親動蛋白(hisactophilin)(Habazzettl等(1992年)，自然，359855-858)。在FGF蛋白質(zhì)家族中，角質(zhì)細胞生長因子(“KGF”)是起源于間充質(zhì)組織非成纖維上皮細胞(特別是角質(zhì)細胞)增殖的唯一效應物。術(shù)語“天然KGF”是指一種自然的人類(hKGF)或重組多肽(rKGF)(它帶有或不帶有信號序列)，其氨基酸序列為SEQIDNO2中示出的序列或其等位基因變異序列。(除了另外說明，此處所描述分子其氨基酸編號與SEQIDNO2中32至194位氨基酸顯示的天然分子的成熟形式(例如除去信號序列)中編號相對應。)天然KGF可以通過天然人類資源分離得到(hKGF)或通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)(rKGF)(Finch等(1989年)，Supra；Rubin等(1989年)，Supra；Ron等(1993年)，生物化學雜志268(4)2984-2988；和Yan等(1991年)，體外細胞發(fā)育生物學，27A437-438)。眾所周知天然KGF在水溶狀態(tài)相對不穩(wěn)定并且在處理及貯存過程中發(fā)生化學、物理降解導致生物活性的喪失(Chen等(1994年)，藥學研究，111582-1589)。天然KGF在溫度升高時易于聚集并在酸性條件下失活(Rubin等(1989年)，美國國家科學院院刊，86802-806)。水溶液中天然KGF的聚集也導致蛋白質(zhì)失活。這一點很不方便，因為失活使得天然KGF蛋白質(zhì)水溶制劑貯存較長時間及蛋白質(zhì)使用較長時間無法實現(xiàn)。而且這一點在生產(chǎn)藥物制劑時尤其成為問題，因為已知聚集的蛋白質(zhì)具有免疫原性(Cleland等(1993年)，Crit.治療性藥物載體系統(tǒng)鑒定性評論，10307-377；Robbins等(1987年)，糖尿病，36838-845；Rinckard等(1967年)，臨床實驗免疫學，2331-340)。重組DNA技術(shù)已用來修飾各種FGF家族成員的序列。例如，已通過刪除或替換一些帶正電荷殘基來修飾bFGF或aFGF，這些殘基對于結(jié)合帶中性電荷或負電荷的氨基酸的肝素是很重要的。據(jù)報道這些修飾分子使肝素結(jié)合活性下降。相應地，已知在患者體內(nèi)被肝素和或其類似物所整合的修飾分子數(shù)量可減少，因此隨著更多的FGF達到其靶受體而提高其作用(EP0298723)。為了改善或者改變天然KGF的一個或多個特性，可采用蛋白質(zhì)工程方法。Ron等在生物化學雜志268(4)2984-2988中報道了在N-末端3，8，27，38或49位氨基酸缺失的經(jīng)修飾的KGF多肽。那些缺失N-末端3，8或27位氨基酸殘基的多肽仍然具備肝素結(jié)合活性，其余則喪失此活性。而且據(jù)報道缺失3、8位殘基的多肽保留全部活性，但缺失27位殘基的多肽則使有絲分裂原活性下降10-20倍，缺失38位或49位氨基酸的多肽則喪失全部有絲分裂原活性。但修飾的KGF多肽其穩(wěn)定性未見討論或報道。上文已公開的PCT申請?zhí)?0/08771，supra也報道一種嵌合蛋白質(zhì)，它由成熟的天然KGFN-末端前40個氨基酸與aFGF的C末端部分(約140個氨基酸)組合而成。該嵌合物據(jù)報道同KGF一樣可定位至角質(zhì)細胞，但對肝素不敏感，這是aFGF而非KGF的特點。而該嵌合物穩(wěn)定性未見討論與報道。相對天然KGF，其穩(wěn)定性有顯著改進的修飾KGF分子未見有文字報道。而且也無任何文獻報道了足夠的范例或證據(jù)以提供能成功地生產(chǎn)具備期望特征的KGF分子的合理前景。目前尚不能僅僅根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)預測蛋白質(zhì)的特征。例如，在有肝素時aFGF有絲分裂原活性大大增強，但bFGF活性僅有少量增加，盡管肝素能與bFGF緊密結(jié)合[(Burgess和Maciag(1989年)，生物化學年鑒，58575-606；Schreiber等(1985年)，美國國家科學院院刊，826138-6142；及Gospodarowizc和Cheng(1986年)，細胞生理學，128475-485)；和PCT90/00418)]。相反，在含有KGF及肝素培養(yǎng)基中生長的BALB/MK細胞其胸腺嘧啶核苷脫氧核苷摻入受到抑制。通常改變氨基酸對蛋白質(zhì)生物活性的作用決定于一系列因素，包括蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)以及該修飾是否針對肝素結(jié)合域或受體結(jié)合域等處蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列。鑒于天然KGF的三維結(jié)構(gòu)以及其肝素結(jié)合域或受體結(jié)合域等處一級結(jié)構(gòu)序列均未見報道，即使在這些通常分類區(qū)分的蛋白質(zhì)，該領(lǐng)域的知識也無法進行基于對天然KGF的氨基酸修飾的效應總結(jié)。本發(fā)明的目的即提供KGF的多肽類似物以及編碼該類似物的核苷酸分子，它與天然KGF相比表現(xiàn)提高的穩(wěn)定性(例如，處于典型pH溫度和/或其它貯存條件)。發(fā)明概述本發(fā)明提供新的具生物活性的KGF多肽類似物。在本發(fā)明中，術(shù)語“KGF”包括天然KGF及一些蛋白質(zhì)，其特征在于其肽序列與天然KGF的肽序列基本相同，并且保留了天然KGF的部分或全部生物學活性，尤其是非成纖維上皮細胞增殖活性。“其特征在于肽序列與天然KGF的肽序列基本相同”指的是保留有與SEQIDNO2中Arg41，Gln43，Lys55，Lys95，Asn137，Gln138，Lys139，Arg144，Lys147，Gln152，Lys153和Thr154相對應的殘基，并且由一個能夠與SEQIDNO1中201至684核苷酸序列雜交的DNA序列所編碼，優(yōu)選控制在嚴格的雜交條件下。為決定兩個氨基酸序列之間相應氨基酸位置，應將這兩個序列對比排列使之達到最大殘基匹配，包含氨基末端和/或羧基末端移位，在待選物中引入適當?shù)拈g隙和/或刪除插入的殘基。數(shù)據(jù)庫檢索，序列分析及操作可以使用眾所周知的常規(guī)用以確定序列同源/同一性掃瞄算術(shù)程序來進行(例如Pearson和Lipman(1988年)，美國國家科學院院刊，852444-2448；Altschul等(1990年)，分子生物學雜志，215403-410；Lipman和Pearson(1985年)，科學，2221435或Devereux等(1984年)，核酸研究，12387-395)。雜交時的嚴格條件指的是鹽、溫度、有機溶劑及其它在雜交反應中典型的控制參數(shù)等綜合在一起的嚴格條件。示范的嚴格條件為在4×SSC62-67℃雜交，繼而0.1×SSC在62-67℃中清洗，時間約為1小時?；蛘撸硪皇痉兜膰栏駰l件為在45-55％甲酰胺，4×SSC及40-45℃雜交。(見T.Maniatis等，MolecularCloning(ALaboratoryManual)；ColdSpringHarborLaboratory(1982年)，387-389頁)。這樣，該蛋白質(zhì)包括天然KGF中氨基酸的等位基因變異，或缺失、替換以及插入，還包括天然KGF分子的片段、嵌合及雜種分子。KGF所包括蛋白質(zhì)的一個例子是對應于序列SEQIDNO2中Cys1和Cys15位被置換或缺失，所得蛋白質(zhì)與親代蛋白質(zhì)相比其穩(wěn)定性已大大改善(在共同享有的U.S.S.N.08/487,825中加以說明，于1995年7月7日提交)。具體公開的分子包括C(1，15)S，這種KGF在1位及15位上的氨基酸由絲氨酸替換了半胱氨酸；ΔN15-ΔN24，這種KGF在天然KGFN末端的前15至24個氨基酸中刪除任意一個；ΔN3/C(15)S，這種KGF刪除天然KGFN末端前3個氨基酸并在15位上由絲氨酸替換半胱氨酸；ΔN3/C(15)-，這種KGF刪除天然KGFN末端前3個氨基酸并在15位上刪除了半胱氨酸；ΔN8/C(15)S，這種KGF刪除了天然KGFN末端前8個氨基酸并在15位上由絲氨酸替換了半胱氨酸；ΔN8/C(15)-，這種KGF刪除了天然KGFN末端前8個氨基酸并在15位上刪除了半胱氨酸；C(1，15，40)S，這種KGF在1，15，40位上氨基酸由絲氨酸替換半胱氨酸；C(1，15，102)S，這種KGF在1，15，102位上氨基酸由絲氨酸替換半胱氨酸；以及C(1，15，102，106)S，這種KGF在1，15，102，106位上氨基酸由絲氨酸替換半胱氨酸。KGF的另一范例包括這些蛋白質(zhì)，它(們)可由至少一個成環(huán)趨勢更高的氨基酸替換Asn115-His116-Tyr117-Asn118-Thr119這個成環(huán)區(qū)之內(nèi)至少一個氨基酸而得到(在共同擁有的U.S.S.N.08/323，473中加以說明，于1994年10月13日提交)，特別地包括H(116)G，這種KGF在天然KGF的116位上氨基酸由甘氨酸替換組氨酸。另一個范例還包括這些蛋白質(zhì)，它們在天然KGF的123-133區(qū)(SEQIDNO2中氨基酸154-164)內(nèi)帶有一至多個氨基酸替換，缺失或添加；這些蛋白質(zhì)可能有激動劑或拮抗劑活性。奇怪的是，當一個KGF分子(即，親代分子)刪除或以帶正電荷殘基替換中性或帶負電荷的肽時(即以中性殘基或帶正電荷殘基替換帶負電荷殘基，以帶正電荷殘基替換中性殘基)，所得KGF類似物較親代KGF分子有更好的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，除了穩(wěn)定性增加之外，本發(fā)明還使得這些類似物與天然KGF相比仍表現(xiàn)全部生物學活性(即，至少保留基本相同的受體結(jié)合或親和力)。本發(fā)明的另一方面，描述了編碼多種生物學活性的KGF多肽類似物的核苷酸的分離與純化。在一個實施方案中，這樣的核苷酸組成的DNA分子克隆進入有生物學功能的質(zhì)?；虿《据d體。在另一個實施方案中，利用核苷酸的構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化原核或真核宿主細胞。在另外一個實施方案中，本發(fā)明還包括在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件培養(yǎng)以一種核苷酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化原核(優(yōu)選大腸桿菌)或真核宿主細胞，使之表達KGF類似物。表達之后，所得重組多肽可以分離并提純。本發(fā)明的另外一方面涉及包含有療效量的KGF類似物及藥學上可接受的載體的藥物制劑。這種制劑可用于治療上皮疾病及損傷的患者。在這種情況下，另一方面還涉及給患者施用有療效量的KGF類似以刺激上皮細胞生長的方法。在一個實施方案中，非成纖維上皮細胞的增殖被激活。這些上皮細胞包括附件細胞，胰腺細胞，肝細胞以及呼吸道和消化道粘膜上皮(細胞)。附圖簡述圖1示出天然KGF的核苷酸(SEQIDNO1)及氨基酸(SEQIDNO2)序列(編碼成熟形式的天然KGF的核苷酸序列為SEQIDNO1中201至684位堿基所表達；成熟形式天然KGF的氨基酸序列為SEQIDNO2中32至194位氨基酸殘基所表達)。圖2A、2B、2C分別示出質(zhì)粒pCFM1156，pCFM1656和pCFM3102的圖譜。圖3示出構(gòu)建體RSH-KGF的核苷酸序列(SEQIDNO3)以及氨基酸序列(SEQIDNO4)。圖4示出質(zhì)粒KGF中所包括的核苷酸序列(SEQIDNO5)及氨基酸(SEQIDNO6)序列。圖5示出化學合成的寡核苷酸片段(OLIGO#6至#11；相應為SEQIDNO12-17)，它們被用來替換質(zhì)粒KGF的KpnI和EcoRI位點(SEQIDNO6中46至85位氨基酸)之間的DNA序列以得到質(zhì)粒KGF(dsd)。圖6示出化學合成的寡核苷酸片段(OLIGO#12至#24；相應為SEQIDNO18-30)，它們用以構(gòu)建KGF(最適密碼子)。圖7示出R(144)Q的核苷酸序列(SEQIDNO31)及氨基酸序列(SEQIDNO32)，該KGF類似物在天然KGF144位氨基酸處由谷氨酰胺替換精氨酸。圖8示出C(1，15)S/R(144)E的核苷酸序列(SEQIDNO33)及氨基酸序列(SEQIDNO34)，該KGF類似物在天然KGF1位和15位氨基酸處由絲氨酸替換半胱氨酸且144位氨基酸處由谷氨酸替換精氨酸。圖9示出C(1，15)S/R(144)Q的核苷酸序列(SEQIDNO35)及氨基酸序列(SEQIDNO36)，該KGF類似物在天然KGF的1位和15位氨基酸處由絲氨酸替換半胱氨酸且144位氨基酸處由谷氨酰胺替換精氨酸。圖10示出ΔN23/R(144)Q的核苷酸序列(SEQIDNO37)和氨基酸序列(SEQIDNO38)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸且144位氨基酸處由谷氨酰胺替換精氨酸。圖11示出可溶性蛋白質(zhì)數(shù)量，它由大小排阻高效液相色譜(HPLC)是在37℃溫育時間的函數(shù)。圖12示出天然KGF，C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E的估算融解溫度，是pH的函數(shù)。圖13示出R(144)Q的典型有絲分裂原活性曲線，由測定DNA合成時3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入量決定，并將它與天然KGF的標準曲線相比較。圖14示出ΔN23/R(144)Q的典型有絲分裂原活性曲線，由測定DNA合成時3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的摻入量決定，并將它與天然KGF的標準曲線相比較。圖15示出C(1，15)S/R(144)Q的典型有絲分裂原活性曲線，由測定DNA合成時3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入量決定，并將它與天然KGF的標準曲線相比較。圖16示出C(1，15)S/R(144)E的典型有絲分裂原活性曲線，由測定DNA合成時3H-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入量決定，并將它與天然KGF的標準曲線相比較。圖17示出ΔN23/N(137)E的核苷酸序列(SEQIDNO41)及氨基酸序列(SEQIDNO42)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在137位氨基酸處由谷氨酸替換天冬酰胺。圖18示出ΔN23/K(139)E的核苷酸序列(SEQIDNO43)及氨基酸序列(SEQIDNO44)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在139位氨基酸處由谷氨酸替換賴氨酸。圖19示出ΔN23/K(139)Q的核苷酸序列(SEQIDNO45)及氨基酸序列(SEQIDNO46)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在139位氨基酸處由谷氨酰胺替換賴氨酸。圖20示出ΔN23/R(144)A的核苷酸序列(SEQIDNO47)及氨基酸序列(SEQIDNO48)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在144位氨基酸處由丙氨酸替換精氨酸。圖21示出ΔN23/R(144)L的核苷酸序列(SEQIDNO49)及氨基酸序列(SEQIDNO50)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在144位氨基酸處由亮氨酸替換精氨酸。圖22示出ΔN23/K(147)E的核苷酸序列(SEQIDNO51)及氨基酸序列(SEQIDNO52)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在147位氨基酸處由谷氨酸替換賴氨酸。圖23示出ΔN23/K(147)Q的核苷酸序列(SEQIDNO53)及氨基酸序列(SEQIDNO54)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在147位氨基酸處由谷氨酰胺替換賴氨酸。圖24示出ΔN23/K(153)E的核苷酸序列(SEQIDNO55)及氨基酸序列(SEQIDNO56)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在153位氨基酸處由谷氨酸替換賴氨酸。圖25示出ΔN23/K(153)Q的核苷酸序列(SEQIDNO57)及氨基酸序列(SEQIDNO58)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在153位氨基酸處由谷氨酰胺替換賴氨酸。圖26示出ΔN23/Q(152)E/K(153)E的核苷酸序列(SEQIDNO59)和氨基酸序列(SEQIDNO60)，該KGF類似物在天然KGF的N末端缺失前23個氨基酸，并在152位氨基酸處及153位氨基酸處分別由谷氨酸替換谷氨酰胺和賴氨酸。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供新的KGF類似物。通過在KGF中一或多個特定的、帶正電荷殘基處進行缺失或替換生產(chǎn)KGF類似物。KGF類似物除其他特性以外，在一系列純化和/或貯存條件中至少一種條件下具有改善的穩(wěn)定性。例如，KGF類似物通常以大量的、折疊形式正確的蛋白質(zhì)來產(chǎn)生。而且，一旦材料純化以后，與其親本分子相比在(同等的)pH及溫度等條件下更加穩(wěn)定。在下面實施例部分將描述的([R(144)Q和R(144)E)]，分別在144位氨基酸處由谷氨酰胺或谷氨酸替換精氨酸)類似物中表明，與天然KGF相比較，它們(1)在37℃貯存的半衰期由35天提高至37.2天；(2)在熱解折迭的過程中其熱融解溫度升高7.5-9.5％；(3)在一定范圍pH值內(nèi)Tm的升高。盡管并不想為理論所束縛，但R(144)Q及R(144)E穩(wěn)定性提高的可能原因來自總電荷密度中一簇堿性殘基的減少，在無肝素的情況下這些殘基由電荷排斥而固有不穩(wěn)定。下面給出的結(jié)果顯示144位精氨酸殘基可能與bFGF中的一個殘基相對應，根據(jù)X-光結(jié)晶學研究報道該殘基靠近或在一簇堿性殘基內(nèi)介導肝素的結(jié)合(Ago等(1991年)，生物化學雜志，110360-363；和Eriksson等(1993年)，蛋白質(zhì)科學，21274-1284)。天然KGF共有46個帶電荷的殘基，其中27個帶正電荷。為觀察所得KGF類似物的結(jié)果，將天然KGF一級結(jié)構(gòu)與bFGF一級結(jié)構(gòu)相比較表明這27個帶電荷殘基也形成bFGF一級結(jié)構(gòu)中相同的簇。根據(jù)這些殘基在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的位置，以帶負電荷或中性氨基酸替換這一簇殘基中的一至多個殘基可能會改變鄰近殘基之間的靜電作用從而實現(xiàn)提高穩(wěn)定性。除了此處特別提出的優(yōu)選的R(144)Q之外，本發(fā)明還考慮了其它類似物。在本發(fā)明中所用的“KGF類似物”或“KGF的多肽類似物”指的是在41-154位氨基酸(SEQIDNO2中72-185位氨基酸)之間有一至多個殘基發(fā)生電荷改變的多肽，特別包括123-133位氨基酸殘基(SEQIDNO2中154-164位氨基酸)被缺失或選擇中性或負電荷殘基置換以影響正電荷減少的蛋白質(zhì)。修飾時優(yōu)選的殘基為Arg41，Gln43，Lys55，Lys95，Lys128，Asnl37，Glnl38，Lys139，Arg144，Lys147，Gln152，Lys153，Thrl54，較優(yōu)選為Gln138，Lys139，Argl44，Lys147，Gln152，Lys153，最優(yōu)選為Arg144。用以替換的優(yōu)選的氨基酸包括谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，絲氨酸及蘇氨酸，其中谷氨酸，谷氨酰胺，天冬氨酸，天冬酰胺及丙氨酸是特別優(yōu)選的。任一修飾都應考慮到使該分子的三維結(jié)構(gòu)的電荷排斥減小；最優(yōu)選類似物與親本分子相比將使穩(wěn)定性提高。很明顯，缺失與替換不能過多也不能使殘基太靠近而使兩個負電荷殘基之間產(chǎn)生電荷排斥。當該KGF類似是由生物學方法生產(chǎn)，如細胞表達的產(chǎn)物而非固相合成產(chǎn)物或天然產(chǎn)生產(chǎn)物的水解或酶解等衍生物時，編碼這些多肽的核苷酸與天然KGF的核苷酸序列相比有一至多個堿基不同。這些核苷酸可以表達，所得到多肽可通過一系列為本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員熟知的重組技術(shù)方法之一純化。編碼全部或部分KGF類似物的DNA序列除了其它一些結(jié)構(gòu)以外，還可能包括在選定宿主中表達時整合的“優(yōu)選”密碼子(例如，大腸桿菌表達密碼子)；限制性內(nèi)切酶的切割位點；以及便于構(gòu)建可表達載體的附加起始、終止以及中間的核苷酸序列(例如在大腸桿菌中表達的起始甲硫氨酸殘基。)本發(fā)明還提供用以表達多肽的重組分子或載體。這些載體包括DNA或RNA，其性質(zhì)可為環(huán)形、線狀、單鏈或雙鏈，可以是天然產(chǎn)生的或由一系列天然產(chǎn)生或合成的部分裝配而成。這類表達載體已知有許多范例。載體的各種成分，例如復制子，選擇基因，增強子，啟動子等，可通過天然資源或已知步驟合成獲得。在每一例中，本發(fā)明中所用表達載體至少包括一個與插入的編碼KGF類似物核苷酸序列功能相關(guān)的表達調(diào)控元件。該調(diào)控元件可以控制本發(fā)明中核苷酸分子表達多肽。有用的調(diào)控元件包括，lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，λ噬菌體的啟動子和操縱子，糖酵解酵母啟動子，酵母酸性磷酸酶啟動子，酵母α接合因子，腺病毒，Epstein-Barr病毒，多瘤病毒及猿猴病毒等的啟動子，以及各種逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子。當然，其它多種本領(lǐng)域所知的適合于原核或真核細胞表達的載體及控制元件都可在此發(fā)明的實施中加以運用。適當?shù)脑丝寺≥d體的實施例包括來自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如pBR322，colE1，pUC及F因子)，優(yōu)選為pCFM1156(ATCC69702)，pCFM1656(ATCC69576)及pCFM3102(在下面的實施例部分加以說明)等質(zhì)粒。其它適當?shù)谋磉_載體如在哺乳類、昆蟲、酵母、真菌和細菌中表達的眾所周知的類型也可用以實現(xiàn)此目的。以這些載體轉(zhuǎn)染適當?shù)乃拗骷毎梢允沟肒GF類似物多肽表達。本發(fā)明中有用的宿主微生物可為原核或真核生物。適當?shù)脑怂拗靼ǜ鞣N大腸桿菌(例如FM5，HB101，DH5α，DH10和MC1061)，假單胞菌，芽孢桿菌，及鏈霉菌菌株，其中優(yōu)選大腸桿菌。適當?shù)恼婧怂拗骷毎ń湍负推渌婢ハx細胞、植物細胞、動物細胞例如COS(COS-1及COS-7)細胞和CV-1猴細胞株，來自Swiss細胞株，Balb-c或NIH的3T3細胞系，HeLa和L-929小鼠細胞及CHO，BHK或Hak倉鼠細胞。根據(jù)所選用宿主，由它所產(chǎn)生的重組多肽可能被哺乳類或其它真核細胞的碳水化合物糖基化或不發(fā)生糖基化。優(yōu)選的生產(chǎn)方法根據(jù)不同的因素和考慮而有變化；對某一特定條件的最適生產(chǎn)步驟通過少量實驗后對本領(lǐng)域熟練人員來說是顯而易見的。運用本領(lǐng)域已知方法可使所得表達產(chǎn)物純化至近于均質(zhì)。一個典型由原核細胞生產(chǎn)的純化步驟包括以高壓或其他方法破碎細胞壁，離心或過濾除去細胞碎片，接著讓上清或濾液過離子交換層析，最后經(jīng)過疏水作用層析。如果表達產(chǎn)物是不溶形式，提純的步驟則包括溶解含有類似物的包涵體及隨后的離子交換色譜層析，蛋白質(zhì)重折疊以及疏水作用層析。純化技術(shù)的實施范例在共同享有，于1994年10月13日提交的U.S.S.N.08/323,339中加以說明。概括而言，U.S.S.N.08/323,339說明了包括如下步驟的純化角質(zhì)細胞生長因子的方法(a)獲得含有KGF的溶液；(b)將(a)中所得溶液中的KGF結(jié)合至陽離子交換樹脂上；(c)以洗脫液從陽離子樹脂上洗脫KGF；(d)將(c)中所得溶液通過適當?shù)姆肿恿颗抛杞橘|(zhì)或進行疏水作用色譜層析；(e)由分子量排阻介質(zhì)或疏水作用色譜層析回收KGF。當然，這些類似物可經(jīng)過快速篩選來評估它們的物理特性。盡管用來檢測類似物的特定的實驗并不重要，實施例中仍給出了各種眾所周知的穩(wěn)定性測定。另外，生物學活性水平(例如受體結(jié)合和/或親和性，有絲分裂原活性，細胞增殖和/或體內(nèi)活性)也可通過使用多種測定檢測，在實施例中提出了其中一些(方法)。已知有多種方法可以用來快速篩選KGF類似物來確定它們是否具有可接受的生物學活性。這類實驗中一個特定的實驗可以檢測KGF類似物與125I-KGF標記物競爭結(jié)合KGF受體(KGFR)的活性(Bottaro等(1990年)，生物化學雜志，25612767-12770；Ron等(1993年)，生物化學雜志，268.2984-2988)。檢測KGFR/KGF類似物相互作用的另一個方法涉及使用所謂實時生物特異性相互作用分析(BIA)技術(shù)(Felder等(1993年)，分子和細胞生物學，131449-1455)。而且有絲分裂原實驗可用來測定KGF類似物刺激DNA合成的能力(Rubin等(1989)，上文)。最后，細胞增殖實驗可用來檢測KGF類似物刺激細胞增殖的能力(Falco等(1988年)，癌基因，2573-578)。使用上述任何一個實驗體系，均能快速篩選KGF類似物的生物學活性。KGF類似物還可進一步修飾含有正常多肽所沒有的附加的化學成分。這些衍生的成分可能改善它的溶解性，吸附性及生物學半衰期等。這些成分可能消除或減輕蛋白質(zhì)等的不期望的副作用。能夠介導這些作用的(化學)成分在REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES，18版，Mack出版公司，Easton，PA(1990年)。使用能夠與選定的側(cè)鏈及末端殘基反應的有機衍生試劑與肽上的靶氨基酸殘基進行可在分子中引入共價修飾(T.E.Creighton(1983年)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特征，W.H.Freeman&amp;Co.，圣弗蘭西斯科，79-86頁)。聚乙二醇(PEG)是用來制備治療性蛋白產(chǎn)品的化學成分之一。在某些蛋白質(zhì)中，附加的聚乙二醇可防止蛋白水解，Sada等(1991)發(fā)酵生物工程雜志，71137-139，而且添加某種聚乙二醇成分的方法有效可用。見美國專利號，4,179,337，Davis等“免疫原性多肽”，1979年12月18日發(fā)行；以及美國專利號4,002,531，Royer“聚乙二醇修飾酶及由此產(chǎn)生的產(chǎn)物”，1977年1月11日發(fā)行。見Abuchowski等在Enzymesasdrugs(Holcerberg和Roberts，367-383頁(1981年))中的綜述。對于聚乙二醇，可以使用多種方法添加它至蛋白質(zhì)上。概括地說，聚乙二醇可以通過蛋白質(zhì)上的反應基團連接至蛋白質(zhì)上。例如賴氨酸及N-末端殘基上的氨基是此類添加很方便的基團。例如，Royor(美國專利號4,002,531)說明還原烷基化可用來添加聚乙二醇至酶。EP0539167，1993年4月28日出版，Wright的“Peg亞胺酸酯(imidate)及其蛋白質(zhì)衍生物”說明帶有自由氨基基團的肽及有機化合物可由聚乙醇或其它水溶性有機多聚物的亞胺酸衍生物進行修飾。美國專利號4,904,584，Shaw于1990年2月27日提交，涉及通過自由氨基基團添加聚乙二醇分子至蛋白質(zhì)中修飾賴氨酸的數(shù)量。在另一實施方案中，本發(fā)明針對單劑量服藥單位的藥物制劑，它能夠通過胃腸道外給藥及口服給藥安全地治療溫血動物的疾病(例如人)。這種藥物制劑是干粉形式或其他脫水形式的治療制劑或診斷制劑，它能通過添加生理上可接受的溶劑而重建。該溶劑可以是無菌水，生理鹽水，葡萄糖溶液或其它碳水化合物液體(例如甘露醇，木糖醇及甘油等多元醇)等能夠溶解干的組合物的任意介質(zhì)，它能夠與所選擇的給藥途徑相匹配并對于有效成分及使用的重建穩(wěn)定劑無負性干擾作用。在一特定的實施方案中，本發(fā)明針對產(chǎn)生單劑量給藥單位的試劑盒。該試劑包括兩個容器，第一個容器中為蛋白質(zhì)干粉，第二容器中為含有重建穩(wěn)定劑的液體制劑。至于溶液中蛋白質(zhì)濃度，每一容器中盛有溶液的體積及容器的體積(這些相關(guān)的參數(shù)可以根據(jù)有效成分最終劑量單位所需的濃度適當加以調(diào)整)，這些可能在很大范圍內(nèi)變動并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。根據(jù)本發(fā)明的KGF類似物可以用作治療制劑，診斷制劑和研究制劑。這些KGF類似物可用于體外或體內(nèi)診斷實驗以定量測量組織或器官樣品中KGF的數(shù)量和/或測定分離表達KGFR的細胞。(Bottaro等(1990年)，生物化學雜志，25612767-12770；Ron等(1993年)，生物化學雜志，2682984-2988)。在組織或器官的實驗中125I-KGF類似物與KGFR結(jié)合的放射活性較標準的125I-KGF類似物放射活性的標準曲線要低，其原因在于未標記的天然KGF與KGFR也結(jié)合。同樣，125I-KGF類似物也可用于檢測各種不同類型細胞中KGFR的存在情況。本發(fā)明還考慮到利用KGF類似物以產(chǎn)生針對該肽的抗體，這種抗體也與天然KGF結(jié)合。在本實施方案中，抗體性質(zhì)可分為單克隆與多克隆抗體并由KGF類似物產(chǎn)生。所得抗體優(yōu)先與天然KGF結(jié)合，尤其是該蛋白質(zhì)處于天然構(gòu)象(生物學活性)時。這些抗體可用于檢測或純化KGF。另外，本發(fā)明還考慮利用KGF類似物發(fā)現(xiàn)有治療應用價值的高親和力或低親和力KGF結(jié)合分子，例如使用它作為有效地KGF給藥方法或KGF活性抑制劑。KGF類似物的熱穩(wěn)定性對于在生理條件下(例如37℃)鑒定這類結(jié)合分子很重要，因為它們對KGF的親和性具很強的溫度依賴性，而在4℃時則無法從親和性上加以預測。在體內(nèi)使用時，KGF類似物配方時需要添加劑。這些添加劑包括緩沖劑，載體，穩(wěn)定劑，賦形劑，防腐劑，張力調(diào)節(jié)劑及抗氧化劑等(例如粘度調(diào)節(jié)劑及填充劑)。特定添加劑的選擇依賴于貯存形式(例如液體或干粉)及KGF類似物的給藥方式。本領(lǐng)域所周知的適當配方可來自REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。KGF類似物可以有效治療劑量特異性地應用于組織中，其特征在于該組織有損傷或臨床無足夠數(shù)量的非成纖維上皮細胞。因為KGF與肝素結(jié)合，故有可能肝素，硫酸肝素，肝素類glycosaminglycans和肝素類糖胺聚糖類化合物等存在胞外環(huán)境的分子也可與KGF在體內(nèi)結(jié)合。這樣與肝素結(jié)合活性降低的KGF類似物將有增強的效用，因為有更多的KGF將達到其靶受體而不被胞外環(huán)境的肝素或類肝素化合物所螯合。這些類似物在治療更加有效，因為每次治療所需的特定的KGF劑量較低。KGF類似物可以有效治療劑量應用于組織中，該組織其特征在于有損傷或臨床上無足夠數(shù)量的非成纖維上皮細胞。KGF類似物可以成功地使用包括但不局限的區(qū)域有燒傷及淺度、深度受傷患者的毛囊、汗腺、皮脂腺等附件結(jié)構(gòu)的刺激、增生和分化；加速由表皮松解泡(Dullosa)造成傷口的上皮再生，這種表皮松解泡是表皮與其下層真皮粘附缺陷，可導致有嚴重發(fā)病率的開放性、疼痛性水皰；防止化療誘發(fā)的脫發(fā)癥及治療男性禿頂(癥)及男性或女性進行性脫發(fā)；治療胃及十二指腸潰瘍；治療諸如Crohn′s病(主要感染小腸)和潰瘍性結(jié)腸炎(主要感染大腸)等腸炎；通過治療(例如治療前和/或治療后)來防止或減輕放射及化學治療的內(nèi)臟毒性，誘導細胞保護和/或細胞再生；刺激全部胃腸道產(chǎn)生粘液；誘導II型肺細胞的增生與分化，可輔助治療或防止早產(chǎn)兒的透明膜疾病(例如嬰兒呼吸衰竭綜合癥及肺支氣管發(fā)育異常)；刺激急性或慢性肺損傷或吸入性損傷(包括高氧水平)導致的肺功能不全，肺氣腫，使用損傷肺的化學治療，通風器創(chuàng)傷或其他肺損傷情況下細支氣管/呼吸上皮細胞的產(chǎn)生與分化；提高肝功能以治療或防止肝硬化，暴發(fā)性肝衰竭，急性病毒性肝炎引起的損傷和/或中毒性肝的損害；誘導角膜細胞再生，例如治療角膜擦傷；誘導上皮細胞再生以治療進行性牙齦疾病；誘導鼓室上皮細胞再生以治療耳鼓損傷和治療與防止糖尿病發(fā)作或作為胰島細胞移植時輔助制劑。需要增生非成纖維上皮細胞的患者將服用有效劑量的KGF類似物。“有效劑量”指的是在被治療患者可激發(fā)預期效應所需的KGF類似物劑量，并通常由主治醫(yī)師決定。影響KGF類似物施用劑量的因素通常包括患者的年齡及一般狀況，治療的疾病等。典型的劑量為0.001mg/公斤體重～500mg/公斤體重。KGF類似物能夠胃腸道外(例如通過靜脈滴注、氣管吸入、肌肉注射、皮下注射或腹腔注射等途徑)、口服或表面使用等安全地施用于溫血動物(例如人)。KGF類似物可使用一次或多次施用，主要是根據(jù)病情與患者狀況。在某些病例中，KGF類似物可用于其他治療的輔助劑和與其他藥物制劑共同使用。下列實施例包括在對本發(fā)明更全面的說明中?？梢岳斫庀旅嫣岢龅牟僮鞑襟E可以修飾而不背離本發(fā)明的宗旨。實施例在下述實施例中描述的許多操作步驟的標準方法或適當?shù)奶鎿Q操作步驟，可由廣泛認可的分子生物學操作手冊提供，它們包括分子克隆，第二版，Sambrook等，冷泉港實驗室出版社(1987年)和現(xiàn)代分子生物學方法，Ausabel等，GreenePublishingAssociates/WileyInterscience，NewYork(1990年)。實施例1制備編碼KGF及KGF類似物的DNA使用來自動物細胞RNA及化學合成(大腸桿菌最適密碼子)寡核苷酸(OLIGOS)通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法來克隆人KGF基因全長片段(編碼天然KGF序列的多肽)。兩個方法敘述如下使用由已知產(chǎn)生該多肽的細胞中提取RNA進行PCR擴增。首先，人成纖維細胞株AG1523A(由HumanGeneticMutantCellCultureRepositoryInstituteForMedicalResearch獲得，Camden，NewJersey)細胞由硫氰酸胍破碎，隨后抽提(根據(jù)Chomyzinski等(1987年)生物化學年鑒，172156中的方法)。使用對全部RNA的標準化逆轉(zhuǎn)錄操作步驟，得到KGF的cDNA。使用KGFcDNA作為模板及編碼KGF基因緊鄰5′和3′端的DNA序列的引物1(OLIGO#1)和引物2(OLIGO#2)進行PCR擴增(PCR#1)[9600型熱循環(huán)器(Perkin-ElmerCetus，Norwalk，CT)；28個循環(huán)；每個循環(huán)包括94℃下1分鐘變性，60℃下2分鐘退火，72℃下3分鐘延伸]。PCR#1的產(chǎn)物中取1小等份作為模板進行第二次PCR擴增(PCR#2)，循環(huán)條件除50℃退火溫度外，其余均同上所述。為表達克隆的KGF基因，使用嵌套引物以便于在KGF基因兩端產(chǎn)生限制性酶切位點。使用OLIGO#3和OLIGO#4修飾PCR#2中的KGFDNA產(chǎn)物，使它分別在5′端、3′端帶有MluI及BamHI的限制酶切位點[PCR#3；30個循環(huán)；每一循環(huán)包括94℃下1分鐘變性，60℃下2分鐘退火以及72℃下3分鐘延伸]。該DNA隨后以MluI及BamHI切割，苯酚抽提，乙醇沉淀。重新懸浮后與含有“RSH”信號序列的pCFM1156質(zhì)粒(圖2A)連接(使用T4連接酶)構(gòu)建RSH-KGF(圖3)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化(根據(jù)Hanahan(1983年)，分子生物學雜志，166557頁中的方法)進入大腸桿菌FM5菌株(ATCC53911)并在28℃下鋪于LB+卡那霉素平板。選擇一些轉(zhuǎn)化體使之在含20μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基中生長。由每個培養(yǎng)物細胞中分離RSH-KGF質(zhì)粒并測序。由于KGF基因內(nèi)部有一個NdeI位點，所以不能將天然KGF基因直接克隆進入所得所表達質(zhì)粒的NdeI和BamHI位點之間。這可由三段(three-way)連接來完成。以僅有單一限制性酶切點的BsmI和SstI切割質(zhì)粒RSH-KGF，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離得到3kbpDNA片段(含有KGF基因3′端)。以O(shè)LIGO#5代替OLIGO#3如上所述再次進行PCR(PCR#4)。PCR產(chǎn)物以NdeI和BsmI切割后由4％瓊脂糖凝膠電泳分離得到331bp的DNA片段。用來連接的第三段是質(zhì)粒pCFM1156由NdeI和SstI切割后由1％瓊脂糖凝膠電泳分離得到的1.8kbpDNA片段。連接后(用T4連接酶)，如上進行轉(zhuǎn)化、卡那霉素選擇和DNA測序，一個選出的克隆含有圖4中所示結(jié)構(gòu)，該質(zhì)粒稱為KGF。由于一個內(nèi)部的核糖體結(jié)合位點會產(chǎn)生截短產(chǎn)物，在單一的KpnI和EcoRI之間的KGFDNA序列用化學合成的寡核苷酸所取代(OLIGO#6～OLIGO#11)以減少內(nèi)部起始位點的使用(圖5)。寡核苷酸#1(SEQIDNO7)5＇-CAATGACCTAGGAGTAACAATCAAC-3＇寡核苷酸#2(SEQIDNO8)5＇-AAAACAAACATAAATGCACAAGTCCA-3＇寡核苷酸#3(SEQIDNO9)5＇-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3＇寡核苷酸#4(SEQIDNO10)5＇-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3＇寡核苷酸#5(SEQIDNO11)5＇-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3＇寡核苷酸#6(SEQIDNO12)5＇-CTGCGTATCGACAAACGCGGCAAAGTCAAGGGCACCC-3＇寡核苷酸#7(SEQIDNO13)5＇-AAGAGATGAAAAACAACTACAATATTATGGAAATCCGTACTGTT-3＇寡核苷酸#8(SEQIDNO14)5＇-GCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAAGGTGTTGAATCTG-3＇寡核苷酸#9(SEQIDNO15)5＇-TCTTGGGTGCCCTTGACTTTGCCGCGTTTGTCGATACGCAGGTAC-3＇寡核苷酸#10(SEQIDNO16)5＇-ACAGCAACAGTACGGATTTCCATAATATTGTAGTTGTTTTTCATC-3＇寡核苷酸#11(SEQIDNO17)5＇-AATTCAGATTCAACACCTTTGATTGCAACGATACCA-3＇這些寡核苷酸以T4多核苷酸激酶磷酸化后加熱變性。溫度緩慢降至室溫使單鏈寡核苷酸形成雙鏈片段。使用T4連接酶共價連接寡核苷酸內(nèi)部粘性末端及雙鏈寡核苷酸片段至KpnI和EcoRI切割的KGF質(zhì)粒。新質(zhì)粒稱為KGF(dsd)。使用化學合成OLIGO#12～24通過PCR擴增構(gòu)建完整的大腸桿菌最適密碼子的KGF基因。寡核苷酸#12(SEQIDNO18)5＇-AGTTTTGATCTAGAAGGAGG-3＇寡核苷酸#13(SEQIDNO19)5＇-TCAAAACTGGATCCTATTAA-3＇寡核苷酸#14(SEQIDNO20)5＇-AGTTTTGATCTAGAAGGAGGAATAACATATGTGCAACGACATG-ACTCCGGAACAGATGGCTACCAACGTTAACTGCTCCAGCCCGGAACGT-3＇寡核苷酸#15(SEQIDNO21)5＇-CACACCCGTAGCTACGACTACATGGAAGGTGGTGACATCCGT-GTTCGTCGTCTGTTCTGCCGTACCCAGTGGTACCTGCGTATCGACAAA-3＇寡核苷酸#16(SEQIDNO22)5＇-CGTGGTAAAGTTAAAGGTACCCAGGAAATGAAAAACAACTACAACATC-ATGGAAATCCGTACTGTTGCTGTTGGTATCGTTGCAATCAAA-3＇寡核苷酸#17(SEQIDNO23)5＇-GGTGTTGAATCTGAATTCTACCTGGCAATGAACAAAGAAGGTAAACT-GTACGCAAAAAAAGAATGCAACGAAGACTGCAACTTCAAAGAA-3＇寡核苷酸#18(SEQIDNO24)5＇-CTGATCCTGGAAAACCACTACAACACCTACGCATCTGCTAAATGGAC-CCACAACGGTGGTGAAATGTTCGTTGCTCTGAACCAGAAAAGGT-3＇寡核苷酸#19(SEQIDNO25)5＇-ATCCCGGTTCGTGGTAAAAAAACCAAAAAAGAACAGAAAACCGCTC-ACTTCCTGCCGATGGCAATCACTTAATAGGATCCAGTTTTGA-3＇寡核苷酸#20(SEQIDNO26)5＇-TACGGGTGTGACGTTCCGGGG-3＇寡核苷酸#21(SEQIDNO27)5＇-CTTTACCACGTTTGTCGATA-3＇寡核苷酸#22(SEQIDNO28)5＇-ATTCAACACCTTTGATTGCA-3＇寡核苷酸#23(SEQIDNO29)5＇-CCAGGATCAGTTCTTTGAAG-3＇寡核苷酸#24(SEQIDNO30)5＇-GAACCGGGATACCTTTCTGG-3＇OLIGO#12～OLIGO#24是這樣來設(shè)計的，即編碼天然KGF全長的DNA序列分別由“Waston”鏈或“Crick”鏈代表，經(jīng)過PCR擴增就能獲得期望的雙鏈DNA序列(圖6)。[PCR#5，Model9600熱循環(huán)器，Perkin-ElmerCetus]；21個循環(huán)，每個循環(huán)包括在94℃下31秒變性，50℃下31秒退火以及73℃下31秒延伸；在21個循環(huán)完畢以后最后的延伸步驟仍然進行7分鐘]。PCR擴增后，DNA片段以XbaI和BamHI切割得到521bp片段與以相同酶切割的表達質(zhì)粒pCFM1156連接。PCR#5利用外部引物(100pmoles/100μlrxn)寡核苷酸#12(OLIGO#12)和寡核苷酸#13(OLIGO#13)及1μl/100μlrxn的KGF模板，同時使用OLIGO#20～OLIGO#24作為輔助寡核苷酸帶(Jayaraman等，(1992年)，Biotechniques，12392)來連接OLIGO#14～OLIGO#19(OLIGO#15～OLIGO#18由T4多核苷酸激酶磷酸化)。最終的質(zhì)粒稱為KGF(最適密碼子)。這里所描述的所有KGF類似物其DNA序列部分來自KGF(dsd)或KGF(最適密碼子)，或者兩者的復合。這些序列進一步通過插入適當?shù)南拗菩悦盖形稽c至一類DNA序列中進行修飾，該類DNA序列編碼特定的KGF類似物的氨基酸且是利用一種至多種上述合成DNA片段技術(shù)制造出來。任何類似物都可由上述技術(shù)完整地獲得。盡管最適大腸桿菌密碼子作為通用寡核苷酸設(shè)計的一部分在適當?shù)胤郊右赃\用，它的一部分或全部在任何被檢測基因中的存在并不能顯著地提高由這些培養(yǎng)的細菌細胞中蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。圖7-10和圖17-26提出了特定的KGF類似物核苷酸序列和氨基酸序列結(jié)構(gòu)一適當?shù)膶嵤├齊(144)Q(圖7)；C(1，15)S/R(144)E(圖8)；C(1，15)S/R(144)Q(圖9)；ΔN23/R(144)Q(圖10)；ΔN23/N(137)E(圖17)；ΔN23/K(139)E(圖18)；ΔN23/K(139)Q(圖19)；ΔN23/R(144)A(圖20)；ΔN23/R(144)L(圖21)；ΔN23/K(147)E(圖22)；ΔN23/K(147)Q(圖23)；ΔN23/K(153)E(圖24)；ΔN23/K(153)Q(圖25)；ΔN23/Q(152)E/K(153)E(圖26)。所有此處描述KGF類似物質(zhì)粒其DNA序列都已驗證。實施例2大腸桿菌中的生產(chǎn)克隆KGF類似物基因時使用三種不同的表達質(zhì)粒。它們是pCFM1156(ATCC#69702)，pCFM1656(ATCC#69576)和pCFM3102(分別為圖2A，2B和2C)。使用PCR重疊寡核苷酸突變法對質(zhì)粒pCFM1656進行一系列定點堿基變換可得到質(zhì)粒p3102。由緊鄰5′的BglII位點(pCFM1656質(zhì)粒堿基號#180)至質(zhì)粒復制啟動子PcopB，向著質(zhì)粒復制基因，堿基對變換如下所示pCFM1656堿基號pCFM1656中堿基對改為pCFM3102中堿基對#204T/AC/G#428A/TG/C#509G/CA/T#617--插入兩個G/C堿基對#677G/CT/A#978T/AC/G#992G/CA/T#1002A/TC/G#1005C/GT/A#1026A/TT/A#1045C/GT/A#1176G/CT/A#1464G/CT/A#2026G/C堿基對缺失#2186C/GT/A#2479A/TT/A#2498-2501AGTGGTCATCACCAGT#2641-2647TCCGAGC堿基對缺失AGGCTCG#3441G/CA/T#3452G/CA/T#3649A/TT/A#4556--插入堿基對(SEQIDNO39)5′-GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG-3′(SEQIDNO40)3′-CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC-5′如上所見，pCFM1156，pCFM1656及pCFM3102非常相似且含有多個相同的限制性位點。質(zhì)粒的選擇是為方便，載體DNA的組成可以隨新質(zhì)粒而簡便地交換。用來克隆的宿主細胞是大腸桿菌FM5菌株(ATCC53911)，其轉(zhuǎn)化方法參照(Hanahan(1983年)，上文中方法)或參照生產(chǎn)商說明使用GenePulserTM轉(zhuǎn)染裝置(Bio-RadLaboratories，Inc.，Hercules，CA)進行電洗脫。首先，由甘油凍存的適當菌株貯存管內(nèi)取出0.1ml至含有500mlLuria肉湯的2升燒瓶中，開始小量新鮮的接種培養(yǎng)，這種期望的大腸桿菌重組克隆帶有三個期望的pCFM載體所構(gòu)建質(zhì)粒的任一種。該培養(yǎng)物在30℃下振蕩16小時，隨后轉(zhuǎn)移至盛有8L滅菌批量培養(yǎng)基(Tsai等(1987年)，工業(yè)微生物雜志，2181-187)的15L發(fā)酵罐中。以Feed#1培養(yǎng)基中配料成分給批量培養(yǎng)配料(Tsai等(1987年)，supra)。當OD600達到35時，將培養(yǎng)溫度快速提至37℃2小時以誘導期望KGF的表達，然后升至42℃以使CI阻遏物變性。終止Feed1的添加而改為Feed2，起始的加料速率為300ml/hr。Feed2包括175g/l胰酶解蛋白胨，87.5g/l酵母浸出物和260g/l葡萄糖。在42℃1小時后，培養(yǎng)溫度降至36℃，此后該培養(yǎng)溫度維持6小時。停止發(fā)酵，將放入1L的細胞離心管內(nèi)通過離心收集到塑料袋中。在400rpm離心60分鐘沉淀細胞，去上清將細胞膏狀物置-90℃冷凍。在大腸桿菌中表達了各種KGF類似物之后，使用下列操作步驟純化天然KGF，R(144)Q，C(1，15)S/R(144)E，C(1，15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q蛋白。由高密度細胞發(fā)酵所得細胞膏狀物在4℃以0.2MNaCl，20mMNaPO4，pH7.5溶液中由適當?shù)母咚偌羟谢旌掀髦瞥?0-20％懸浮溶液(質(zhì)量體積比)。懸液細胞在均漿器(APVGaulin，Inc.，Everett，MA)中通過三次以裂解。使用適當?shù)臒峤粨Q器將流出的均漿冷卻至4-8℃。使用JS4.2轉(zhuǎn)頭將裂解物置J-6BTM離心機(BeckmanInstruments，Inc.，Bera，CA)在4℃4,200rpm離心30-60分鐘除去細胞殘渣。將上清小心地傾注入預先制備450ml(5em×23cm)并以0.2MNaCl，20mMNaPO4，pH7.5溶液在4℃平衡的S-SepharoesFastFlowTM樹脂柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)。在4℃以5倍柱體積(2250ml)的0.4MNaCl，20mMNaPO4，pH7.5溶液洗柱，以5L0.5MNaCl，20mMNaPO4，pH7.5在4℃洗脫所期望蛋白質(zhì)。分部收集50ml在監(jiān)測流出液的A280值。由A280鑒定含有洗脫材料的分部收集樣品進行14％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳以確認期望多肽的存在。合并含有感興趣蛋白的分部收集液，隨后加入等體積的蒸餾水。稀釋的樣品再傾注入預先制備450ml(5cm×23cm)并以0.4MNaCl，20mMNaPO4，pH6.8溶液在4℃平衡的S-SepharoseFastFlow樹脂柱。在4℃以5倍體積(2250ml)的0.4MNaCl，20mMNaPO4，pH6.8溶液洗柱，用20倍柱體積0.4MNaCl，20mMNaPO4，pH6.8至0.6MNaCl，20mMNaPO4，pH6.8的線性梯度洗脫蛋白質(zhì)。同樣，在A280處持續(xù)監(jiān)測流出液時分部收集50ml液體。那些含有蛋白質(zhì)的分部收集液合并后在350cc攪拌容器內(nèi)(Amicon，Inc.，Mayberry，MA)通過YM-10膜(隔離分子量為10,000)使?jié)饪s體積至30-40ml。濃縮液上樣至1,300ml(4.4cm×85cm)以含有1×PBS(Dulbecco′s磷酸緩沖鹽溶液，“D-PBS”，無Ca++和Mg++)或0.15MNaCl，20mMNaPO4，pH7.0的柱緩沖液預平衡的Superdex-75TM樹脂(Pharmacia)柱。待樣品完全進入柱中，使用柱緩沖液由凝膠過濾介質(zhì)中洗脫蛋白質(zhì)。此后，分部回收10ml并合并那些含有類似物的收集液(由14％SDS-PAGE方法確定)。上述操作如非另外特指，均在4-8℃下進行。分析分析源自大腸桿菌的天然KGF；R(144)Q，C(1，15)S/R(144)E；C(1，15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q。構(gòu)象穩(wěn)定性這些蛋白質(zhì)在貯存穩(wěn)定性、熱解折疊變換溫度(Tm)及寬的pH值范圍內(nèi)的穩(wěn)定性等進行比較。天然KGF，R(144)Q，C(1，15)S/R(144)E，C(1，15)S/R(144)Q和ΔN23/R(144)Q在升高溫度防聚集的作用也進行檢測。以D-PBS制備含0.5mg/ml蛋白質(zhì)的樣品。每0.5ml樣品分別加至3cctype-1玻璃瓶中。玻璃瓶加上橡膠塞后并封上13mm(flip-off)鋁質(zhì)包口。將瓶子置37℃溫箱中。放置預定的時間后取出瓶子分析喪失的可溶性蛋白。通過0.22μMSpin-X濾器(Costar，Cambridge，MA)離心除去每個250μl樣品中可見的沉淀。隨后對濾過溶液中可溶性蛋白進行大小排阻高效液相色譜。對于高效液相色譜中所得峰面積求積分并以它的結(jié)果對37℃時的溫育時間為函數(shù)作圖。據(jù)此動力學曲線可估算出這種喪失了可溶性的單體蛋白的半衰期。表1示出這些蛋白質(zhì)在37℃貯存時仍保持可溶狀態(tài)KGF的半衰期。表1喪失可溶性單體蛋白的半衰期</tables>如上面表1及圖11所見，天然KGF聚集最快，半衰期為0.6天。R(144)Q提高半衰期至4.1天。C(1，15)S/R(144)Q，ΔN23/R(144)Q及C(1，15)S/R(144)E則顯示相當大的提高，半衰期分別為13.3、22.3、38天。熱解折疊熱解折疊由配有PTC-343Peltier-型溫度控制系統(tǒng)的J-720TM旋光分光計(Jasco，Inc.，Easton，MD)在230nm處監(jiān)測其園二色性(CD)。進行CD分析時，用來分析的含有0.1mg/ml多肽的單個樣品由D-PBS(LifeTechnologies，Inc.，GrandIsland，NY)制備。每個樣品約2.5ml裝入光路長為10mm的直角SuprailTM石英(HeraeusQuarzschmelze，GmbH，Hanau，Germany)熒光杯(HellmaCells，Inc.，Jamaica，NY)。然后將該杯置旋光分光計的Peltier型溫度控制系統(tǒng)中。熱解折疊速度為50℃/小時。在230nm處監(jiān)測橢圓率變化表明解折疊情況。通過鑒定在某一溫度下溶液中有50％的蛋白質(zhì)解折疊來估算每一個樣品的Tm值(BiophysicalChemistry，CantorandSchimmel(eds)，W.H.FreemanandCo.SanFrancisco(1980年))。三種蛋白質(zhì)的估算Tm值在表2中列出。表2估算的融解溫度如結(jié)果所示，R(144)Q與天然KGF相比其Tm值要高7℃多。如果將R(144)Q替換成C(1，15)S/R(144)Q或ΔN23則Tm值至少升高1℃而比天然KGF要高8℃多。而且C(1，15)S/R(144)E則比天然KGF穩(wěn)定溫度高9℃多。因此，將144位氨基酸由帶正電荷殘基變?yōu)橹行曰蜇撾姾蓺埢艽蟠笤鰪姸嚯姆€(wěn)定性。pH加濃鹽酸或濃氫氧化鈉調(diào)D-PBS至不同pH范圍，比較C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E與天然KGF的酸穩(wěn)定性。約2.35ml不同pH值的D-PBS與100μl2.45mg/mlKGF蛋白質(zhì)在石英杯中混合。這些樣品以50℃/小時速度進行熱解折疊并在230nm處監(jiān)測園二色性。圖12示出了天然KGF、C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E的Tm對pH的函數(shù)。在所測試的pH范圍內(nèi)，C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E的Tm值均高于KGF。體外生物學活性通過Balb/MK細胞攝取[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷的半最高濃度與蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)檢測了R(144)Q，ΔN23/R(144)Q，C(1，15)S/R(144)Q和C(1，15)S/R(144)E體外有絲分裂原活性(參照Rubin等(1989年)，上文中的方法)。通常每一個與已知天然KGF相關(guān)的KGF類似物其濃度可使用體外生物分析測定。每一個KGF類似物稀釋后使用Balb/MK有絲分裂原實驗來檢測其生物學活性。每一樣品首先用生物分析培養(yǎng)基稀釋，該培養(yǎng)基包括50％定做的Eagle′sMEM，50％定做的Eagle′sMEM，5μG/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白，5ng/ml亞硒酸鈉，0.0005％HSA和0.005％吐溫20。KGF樣品隨后加進接種有Balb/MK細胞的Falconprimeria96孔板中。測定DNA合成時[3H]-胸腺嘧啶脫氧核苷摻入并參照天然KGF標準曲線轉(zhuǎn)換算成加入的天然KGF濃度。結(jié)果在13-16中示出。如圖13-16所見，每種KGF類似物都有有絲分裂原活性。盡管本發(fā)明以上描述是概括性及優(yōu)化實施方案，可以理解根據(jù)上述描述本領(lǐng)域技術(shù)人員仍可進行其他變化與改進。權(quán)利要求1.一種天然KGF的多肽類似物，包括有圖2(SEQIDNO2中72-185位氨基酸)中所示41-154位氨基酸殘基中一至多個氨基酸殘基由缺失或替換而導致的電荷變化。2.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽類似物，其中缺失或替換的氨基酸選自Arg41，Gln43，Lys55，Lys95，Lys128，Asn137，Gln138，Lys139，Arg144，Lys147，Gln152，Lys153和Thr154。3.根據(jù)權(quán)利要求1的多肽類似物，選自R(144)Q，C(1，15)S/R(144)Q，C(1，15)S/R(144)E和ΔN23/R(144)Q。4.一種藥物制劑，包括治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的一種KGF多肽類似物和藥學上可接受的載體。5.一種藥物制劑，包括治療有效量的冷凍干燥的根據(jù)權(quán)利要求1的一種KGF多肽類似物。6.權(quán)利要求4中的藥物制劑，還包括藥學上可接受的載體。7.一種選自DNA和RNA的核苷酸分子，其中該核苷酸編碼的一種天然KGF的多肽類似物，其包括有圖2中(SEQIDNO2中72-185位氨基酸)所示41-154位氨基酸殘基中一至多個氨基酸由缺失或替換而導致的電荷變化。8.根據(jù)權(quán)利要求7的一種核苷酸分子，其中缺失或替換的氨基酸選自Arg41，Gln43，Lys55，Lys95，Lys128，Asn137，Gln138，Lys139，Arg144，Lys147Gln152，Lys153和Thr154。9.根據(jù)權(quán)利要求7的一種核苷酸分子，其中多肽類似物選自R(144)Q，C(1，15)S/R(144)Q，C(1，15)S/R(144)E和ΔN23/R(144)Q。10.一種具生物學功能的質(zhì)?；虿《据d體，包括根據(jù)權(quán)利要求7的一種核苷酸分子。11.一種用根據(jù)權(quán)利要求8中具生物學功能載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的原核或真核宿主細胞。12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的原核宿主細胞，其為大腸桿菌。13.一種根據(jù)權(quán)利要求11的真核宿主細胞，其為哺乳動物細胞。14.一種根據(jù)權(quán)利要求11的真核宿主細胞，其為中國倉鼠卵巢細胞。15.一種生產(chǎn)KGF多肽類似物的方法，它包括根據(jù)權(quán)利要求7中的一種核苷酸分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的原核或真核宿主細胞在適當?shù)臓I養(yǎng)條件下生長，該方式允許編碼多肽類似物的表達，以及分離由此產(chǎn)生的多肽類似物。16.一種刺激非成纖維上皮細胞產(chǎn)生的方法，它包括使這些細胞與有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求1的KGF多肽類似物接觸。全文摘要提供了KGF蛋白的新型類似物,該等類似物包含由圖2中41—154氨基酸殘基(SEQIDNO:272—185氨基酸)的一個或多個的缺失或取代而引起的電荷變化。這些類似物比對應的KGF母體分子更穩(wěn)定。文檔編號A61K38/18GK1169732SQ95196741公開日1998年1月7日申請日期1995年10月12日優(yōu)先權(quán)日1995年10月12日發(fā)明者陳保路,荒川力申請人:安姆根有限公司