專利名稱：具有增強穩(wěn)定性和生物活性的酸性成纖維細(xì)胞增長因子類似物的制作方法
背景技術(shù)：
有時被稱為軟組織生長因子的許多蛋白質(zhì)因子可介導(dǎo)組織損傷如創(chuàng)傷或燒傷之后的復(fù)雜的愈合過程，新細(xì)胞生長和分化需要這些因子用于替代損傷的組織。這類軟組織生長因子包括一個成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)的蛋白質(zhì)家族。對于各種上皮、間質(zhì)、神經(jīng)起源的細(xì)胞FGFs是促有絲分裂和趨藥性的。另外，F(xiàn)GFs是促血管形成的，即他們能刺激血管的形成。FGFs家族的成員包括酸性FGF，堿性FGF、KGF、Int-2、HST、FGF-S和FGF。
酸性FGF(aFGF)和堿性FGF(bFGF)被認(rèn)為是FGF家族的兩個“原始”成員。已經(jīng)確定aFGF和bFGF起源于同一祖先基因，除具有相同的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)外，兩個分子具有大約55％的序列等同性。盡管不排除存在特殊的aFGF和bFGF受體，但是酸性FGF和bFGF結(jié)合于同樣受體也是已知的。在不同組織中發(fā)現(xiàn)了幾種分子量形式的aFGF和bFGF。然而，Southern印跡試驗表明對于aFGF和bFGF各自只有一個基因，這些分子之間的差別可能是由于翻譯后的加工造成的。在體外和體內(nèi)，對于許多種類的中胚層和神經(jīng)外胚層起源的細(xì)胞類型酸性和堿性FGF是分裂素，并能誘導(dǎo)血管形成(參見，例如Gospodarowicz等(1979))，Exp.Eye.Res，28501-514。盡管在大多數(shù)生物測試系統(tǒng)中bFGF比aFGF大約有高出十倍的效力，這兩類的生物學(xué)活性的范圍接近相同。
對于多種細(xì)胞KGF顯示了強有力的促有絲分裂活性并且它結(jié)合于aFGF和bFGF也可能結(jié)合的Balb/mk角蛋白細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體(Bottaro et al(1990)，J.Biol.Chem.26512767-12770)，但是，KGF與已知的FGFs(即aFGF和bFGF)的區(qū)別在于它對于成纖維細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞不能促有絲分裂。Rubin et al.，(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86802-806。在NIH/3T3成纖維細(xì)胞上還有不同于aFGF和bFGF受體的KGF受體該受體不能與KGF相互作用。Bottaro et al.。
aFGF和bFGF的一個共同的明顯的特性是這些因子與肝素緊密結(jié)合的趨勢。aFGF具有一個陰離子等電點，它表現(xiàn)出來的與肝素的親和力比bFGF弱(Thomas et al(1984)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA826409-6413)。aFGF和bFGF的這一獨特的肝素結(jié)合特性大大有利于這些因子的純化。
FGFs對固定化的肝素具有強親和力這一發(fā)現(xiàn)鼓舞了對FGFs體內(nèi)生物學(xué)上類肝素分子的調(diào)節(jié)作用的研究。盡管肝素的整個功能范圍還沒有確定，肝素可以以幾種方式調(diào)節(jié)FGF功能是已知的(Lobb(1988)，Eur.J.Chin Invest.，18321-326)，例如，類肝素分子在FGF功能上能起一個直接作用，包括aFGFs的激活和增效作用(Uhllrich等(1986)，Biochem Biophys.Res.Comm.，1371205-1213)。
但是，在FGF對固定化肝素的親和性它被可溶性肝素增效的能力之間沒有直接的相互作用。在這一點上，肝素的增效作用力似乎是有選擇地針對aFGF的。例如Uhllrich et al(1986)，同上，發(fā)現(xiàn)純aFGF的增效作用程度大約是純bFGF的十倍，把aFGF的增效力提高到大約與bFGF同樣的水平。但是在存在胎兒小牛血清時，發(fā)現(xiàn)肝素的增效作用效果明顯下降(Uhllrich et al.，sbs(1986)，同上)。
據(jù)信利用FGF蛋白能有效促進(jìn)屬于外傷的組織的愈合。FGFs的獨特的促血管形成特性使這些因子在深度創(chuàng)傷的治療上特別有價值。bFGFs天然蛋白質(zhì)曾經(jīng)被斷言對治療心肌梗塞有用(美國專利號4,296,100和4,378,347)。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人bFGF能提高胎鼠海馬神經(jīng)元中的神經(jīng)元存活力和軸突的伸展，這表明這些因子同時也可能對治療衰退的神經(jīng)紊亂，如Alzheimer’s疾病和Parkinson’s疾病有用(Wallicke etal，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 833012-3016)。
在治療應(yīng)用上，aFGF的有效應(yīng)用的一個主要障礙物似乎與它與bFGF相比明顯低的生物學(xué)活性有關(guān)。雖然用肝素研究表明所觀察到的aFGF和bFGF之間效力上的差異可以通過利用肝素提高aFGF的活性到一個可與bFGF相當(dāng)?shù)乃絹硐５撬帉W(xué)制備上肝素的利用并不總是令人滿意的。在這點上，重要的是要注意肝素是一個異源結(jié)構(gòu)的高度硫酸鹽化的葡糖胺聚糖，是已知為通過加快抗凝血酶III失活內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的蛋白酶的速度而起作用的抗凝血劑(Jacques(1980)，Pharmacol Rev.3199-166)。還不知道在治療深度創(chuàng)傷的藥物制備中利用肝素是否有害，其中某些程度的凝結(jié)可能是獲得適當(dāng)愈合所需要的。
另外，可以實際地考慮把肝素?fù)饺胫委焺?chuàng)傷的藥物制劑中。藥物釋放事項包括控制進(jìn)入病人機體的藥物制劑的組成(含有aFGF和肝素的組合物)，此外，胎兒小牛血清在肝素對aFGF的增效作用的負(fù)影響(Uhllrich et al觀察到)表明任何通過把肝素包括在藥物制劑中作為aFGF的激活或增效因子獲得的優(yōu)點，一旦與病人自己的血清接觸后可以完全無效或喪失。
本發(fā)明的一個目的是提供一種與天然存在的蛋白質(zhì)形式相比具有增強的穩(wěn)定性的來自FGF家族的蛋白質(zhì)類似物。本發(fā)明的另一目的是在缺乏肝素時提供一個具有增強的穩(wěn)定性和生物活性的aFGF的類似物。本發(fā)明的另一目的是提供用于治療的aFGF類似物。
發(fā)明概述本發(fā)明在FGF家族中提供新的蛋白質(zhì)類似物。一種這樣的類似物是一個在缺乏肝素時比天然存在的aFGF更加穩(wěn)定并具有更高生物活性的aFGF類似物。另一種這樣的類似物是與天然存在的KGF相比具有增強的熱穩(wěn)定性的KGF類似物。增強的穩(wěn)定性是通過在天然存在的蛋白質(zhì)的環(huán)形成序列Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr中或其周圍至少用一個較高環(huán)形成潛能的氨基酸替代一個較低環(huán)形成潛能的氨基酸殘基來獲得的。在aFGF情況下，這個環(huán)形成序列存在于大約氨基酸92到96的區(qū)域內(nèi)。在KGF的情況下，這個環(huán)形成區(qū)存在于大約氨基酸115-119的區(qū)域內(nèi)。本發(fā)明的一個優(yōu)選類似物包括將一個具有高環(huán)形成潛能的氨基酸對環(huán)形成序列中組氨酸殘基進(jìn)行取代。
附圖的簡要說明附

圖1顯示重組?！睞la47，Gly93〕的aFGF的核酸和氨基酸序列。
附圖2顯示重組人〔Gly93〕的aFGF的氨基酸序列。
附圖3顯示利用疏水作用層析的?！睞la47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物的洗脫曲線。
附圖4A和4B 顯示了?！睞la47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物的圓二色性光譜。
附圖5 顯示了在酰胺I′(C＝O在次生蛋白質(zhì)中伸展(strech)區(qū)中?！睞la47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物的第二衍生物FTIR光譜。
附圖6顯示?！睞la47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物和人〔Ser70，Ser88〕bFGF濃度的對數(shù)值相對最大刺激百分?jǐn)?shù)的曲線。
附圖7圖解顯示與人〔Ser70，Ser88〕bFGF相比，在缺少肝素時?！睞la47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物其活性隨著時間而喪失的情況。
附圖8顯示了如X-射線晶體衍射法測定的，本發(fā)明的?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物的結(jié)構(gòu)。
附圖9顯示天然存在的KGF的核酸和氨基酸序列。
附圖10顯示重組〔Gly116〕KGF的核酸和氨基酸序列。
本發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明提供了FGF家族的新的類似物。與相應(yīng)的天然存在的蛋白質(zhì)相比，這些類似物具有提高的穩(wěn)定性。對于本發(fā)明的aFGF類似物，該類似物在缺少肝素時具有增強的穩(wěn)定性和生物活性。對于本發(fā)明的KGF類似物，該類似物具有增強的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明的類似物在天然存在形式中發(fā)現(xiàn)的環(huán)形成序列Asn-His-Tyr-Asn-Thr-Tyr中，或其周圍至少有一個不同于相應(yīng)的天然存在蛋白質(zhì)的氨基酸。就aFGF而言，環(huán)形成序列存在于大約氨基酸殘基92到96的區(qū)域(基于牛aFGF的已知氨基酸序列的編號，如圖1所示)。就FGF而言，環(huán)形成序列存在于大約氨基酸殘基的115-119的區(qū)域，如圖9和10所示。為了使類似物的這個區(qū)域穩(wěn)定，選擇不同的氨基酸以得到的較高的環(huán)形成潛能。具有相對高的環(huán)形成潛能的氨基酸包括甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、和絲氨酸〔Leszcynski et al(1986)Science，234849-855(1986))。(根據(jù)在天然存在分子的環(huán)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)的頻率分配環(huán)形成潛能的相對值)〕。優(yōu)選地，一個具有較高環(huán)形成潛能的不同的氨基酸替代了環(huán)形成序列中的組氨酸殘基。更優(yōu)選地，用一個甘氨酸殘基替代了環(huán)形成序列中的組氨酸。
對于本發(fā)明的類似物可以進(jìn)行其它的加入，替代和/或缺失。例如，類似物也可以非強制性地包括一個對非保守半胱氨酸殘基(如牛aFGF分子的47位的半胱氨酸殘基和人aFGF分子的16位的半胱氨酸殘基)的氨基酸取代。另外，在E.coli寄主細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明的類似物可以包括一個起始的甲硫氨酸氨基酸殘基(即，在位-1，如圖1所示)。另一種可選擇的方法，正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知，從DNA序列中可以缺失一個或多個末端氨基酸殘基，但基本上保留了相應(yīng)于天然存在的蛋白質(zhì)的增強的生物學(xué)活性。
同時也提供了編碼本發(fā)明的全部或部分類似物的DNA序列。這樣的序列優(yōu)選地可以包括摻入了被所選擇的E.coli寄主菌株優(yōu)選表達(dá)的密碼子(“E.coli表達(dá)密碼子”)，提供限制性內(nèi)切酶切割位點，和/或提供了便于構(gòu)建容易表達(dá)的載體的附加起始，末端或中間DNA序列。這些新的DNA序列包括用于保證在真核和原核寄主細(xì)胞如大腸桿菌中表達(dá)本發(fā)明類似物的序列。
更詳細(xì)地說，本發(fā)明的DNA序列可以包括圖1中闡明的DNA序列，其中至少一個編碼在大約氨基酸92到96的區(qū)域的一個氨基酸殘基的密碼子被一個編碼具有更高環(huán)形成潛能的不同氨基酸殘基的密碼子替代(在下文中稱為“aFGF類似物序列”或“類似物序列”)，包括一個與一個類似物序列或其片段雜交的DNA序列，和一個如果不是遺傳密碼的簡并性，將和一個類似物序列雜交的DNA序列。
相應(yīng)地，本發(fā)明的DNA序列可以包括圖10中列出的DNA序列，其中至少一個為位于大約氨基酸115到119區(qū)域的一個氨基酸殘基編碼的密碼子被編碼具有更高環(huán)形成潛能的不同的氨基酸殘基的一個密碼子所取代(在下文中稱為“FGF類似物序列”或“類似物序列”)也包括一個與一個類似物序列或其片段雜交的DNA序列，和一個如果不是遺傳密碼的簡并性，將和類似物序列之一雜交的，得到的DNA序列。
本發(fā)明的類似物可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)熟練人員已知的許多重組技術(shù)方法中的任何一個來編碼，表達(dá)和純化。優(yōu)選的生產(chǎn)方法將依賴于許多因素和考慮而變化，包括材料的費用和可獲得性和其它經(jīng)濟(jì)考慮。通過最小實驗本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)熟練人員將明白對于一個給定條件的最適生產(chǎn)過程。利用大腸桿菌寄主細(xì)胞，本發(fā)明的類似物可以以特別高的水平表達(dá)。隨后利用本領(lǐng)域已知技術(shù)以將所得到的表達(dá)產(chǎn)物純化到接近同質(zhì)。一個典型的純化過程包括首先將含有類似物的包含體溶解，接著用離子交換層析方法，然后再折疊蛋白質(zhì)，最后，進(jìn)行疏水作用層析。
本發(fā)明的類似物具有一個驚人程度的增強的穩(wěn)定性。與天然存在的aFGF不同，本發(fā)明的aFGF類似物在缺乏肝素時具有增強的穩(wěn)定性和生物活性。已知可以通過在某些半胱氨酸殘其位用絲氨酸或其它中性氨基酸進(jìn)行替代來獲得更穩(wěn)定的bFGF類似物(例如，在公開的PCT專利申請No.88/04189中公開的)，而僅對天然存在的牛aFGF的47位的非保守半胱氨酸殘基進(jìn)行替代相信不會顯著增強aFGF類似物生物活性和/或穩(wěn)定性。通過將?！睞la47〕aFGF類似物(半胱氨酸被替代)顯示的低活性及?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物(在aFGF分子的殘基92到96區(qū)域有所期望的氨基酸替代)相比可證明了這一點，正如下面的實施例中所闡述的。具體地說，盡管與bFGF相比?！睞la47，Gly93〕類似物仍然效力較小，但已發(fā)現(xiàn)它大約比?！睞la47〕aFGF類似物效力高十倍。在加入45μg/ml的肝素之后，所有三種形式的FGF的生物活性都增強，牛〔Ala47，Gly93〕類似物，?！睞la47，Gly93〕類似物，和人〔Ser20，Ser88〕bFGF類似物具有基本上相同的效力。
在缺乏肝素時相對于?！睞la47〕aFGF而言?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物的促有絲分裂活性和穩(wěn)定性增強的原因至今不清楚。甘氨酸對93位的組氨酸殘基的替代似乎使aFGF分子更加具疏水性，但它顯然不激烈改變它的三級結(jié)構(gòu)，如圓二色性和FTIR光譜所確定的。然而，牛〔Ala47〕aFGF類似物(只在47位有替代)和?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物的體外生物測定中觀察到的活性的相對差異表明?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物的氨基酸93位的甘氨酸替代可能在或接近負(fù)責(zé)受體結(jié)合的區(qū)域。雖然aFGF中的受體結(jié)合區(qū)還沒有確定，aFGF的93位是對應(yīng)于據(jù)報道是在或接近受體結(jié)合區(qū)域的bFGF的一個區(qū)域，(Baird etal(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.852324-2328)。
另外，與?！睞la47〕類似物不同，在缺少肝素的250小時過程中，本發(fā)明的?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物具有增強的穩(wěn)定性，保持了它的初始的促有絲分裂活性，而?！睞la47〕類似物很快失去了活性。
將?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物結(jié)晶，得到結(jié)晶可以通過X-射線晶體衍射研究。對這些晶體研究獲得的X-射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)支持了來自疏水作用層析資料的假設(shè)即殘基93暴露于溶劑中，也即，93位的甘氨酸替代組氨酸后使分子降低親水性。詳細(xì)研究93殘基附近的?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物序列顯示出從大約90位的谷氨酸殘基到大約97位的酪氨酸殘基區(qū)域的具有高環(huán)形成潛能的一個約8個氨基酸簇。氨基酸的相對環(huán)形成潛能已經(jīng)被報道，甘氨酸被鑒別為在所有氨基酸中具有最高環(huán)形成潛能的氨基酸。(Leszcynski et al，同上)。所以，由于與組氨酸相比甘氨酸殘基具有更高的環(huán)形成潛能，因而確信甘氨酸對組氨酸進(jìn)行取代可穩(wěn)定假定的環(huán)。
本發(fā)明的KGF類似物也證實了KGF中相應(yīng)的區(qū)域是一個暴露于溶劑的環(huán)，這個環(huán)可能參與受體結(jié)合。更詳細(xì)地說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的〔Gly116〕KGF類似物與天然存在的KGF相比具有改變的下降的促有絲分裂活性，如下面的實施例中闡述的。同時還發(fā)現(xiàn)〔Gly116〕KGF類似物相對于天然存在的KGF具有5-7℃較高熱穩(wěn)定性。
除了本文詳細(xì)闡述的優(yōu)選的〔Gly93〕aFGF和〔Gly116〕KGF類似物之外，本發(fā)明的仔細(xì)考慮了其它類似物。這些其它類似物通過本文酸提供的下面的技術(shù)可以容易地由本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員得到。例如，存在不少于15個據(jù)報道比組氨酸具有更高環(huán)形成潛能的氨基酸(Leszcynskiet al(1986)同上)。這些氨基酸是(以環(huán)形成潛能下降的順序排列)甘氨酸、脯氨酸或酪氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。預(yù)期在天然存在蛋白質(zhì)的環(huán)形成序列中任何這些殘基對組氨酸殘基的替代可以導(dǎo)致產(chǎn)生具有增強穩(wěn)定性的本發(fā)明的一個類似物。當(dāng)然，優(yōu)選的是用具有最高可能的環(huán)形成潛能的氨基酸替代環(huán)形成序列的組氨酸殘基，而不產(chǎn)生任何潛在的負(fù)效應(yīng)，如通過插入另外的半胱氨酸或胱氨酸殘基形成不需要的二硫健。所以，在環(huán)形成序列中替代組氨酸殘基的其它優(yōu)選的氨基酸(即除了甘氨酸之外)可以包括脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺，絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
本發(fā)明也仔細(xì)考慮了用一個具有高環(huán)形成潛能的氨基酸替代天然存在的aFGF的氨基酸92到96區(qū)(即，氨基酸92和94-96)和天然存在的aFGF的氨基酸115到119區(qū)(即，氨基酸92和115-117-119)之間的其它氨基酸殘基。本發(fā)明的aFGF類似物包括，例如，按優(yōu)先順序用甘氨酸、脯氨酸或酪氨酸、天冬氨酸或天冬酰胺、絲氨酸或谷氨酸替代在天然存在aFGF的96位的蘇氨酸殘基得到的aFGF類似物，盡管由于兩種氨基酸相似的環(huán)形成潛能，預(yù)期谷氨酸對蘇氨酸的替代有最小的穩(wěn)定性和/或生物活性的增強。
天然存在的aFGF中的位92、94、95和97的氨基酸殘基(分別為天冬酰胺、酪氨酸、天冬酰胺和酪氨酸)具有足夠高的環(huán)形成潛能以致對這些特殊殘基進(jìn)行替代僅得到最小利益是可想象得到的。
本發(fā)明的類似物包括人和動物(即牛)起源的類似物，以及具有下面環(huán)形成氨基酸序列的所有形式蛋白質(zhì)92 93 94 95 96(aFGF)-Asn-His-Tyr-Asn-Thr-115 116 117 118 119 (KGF)例如，人和牛的aFGF形式是已知的，并已經(jīng)被鑒定為在92到96位具有相同的氨基酸順序(上面所示)。此外，在人和牛aFGF之間大約有92％的序列等同性和97％的“相似性”(即在兩個aFGF類型之間的總的8％的變化中5％是“保守的”)。天然存在的人和牛aFGF類型基本上具有相同的體外促有絲分裂活性。
由于它們在缺乏肝素時具有增強的穩(wěn)定性和生物活性，本發(fā)明的新的生物活性aFGF類似物特別適用于醫(yī)生和/或獸醫(yī)對哺乳種類的許多類型的創(chuàng)傷的進(jìn)行治療的藥物制劑。由于它們增強的熱穩(wěn)定性，本發(fā)明的KGF類似物可能也特別適用于藥物制劑。當(dāng)然，用于這樣的治療的生物活性類似物的量依賴于所治療的創(chuàng)傷的嚴(yán)重性，所選擇的給藥途徑，類似物的比活或純度而定，并由參加的醫(yī)生或獸醫(yī)決定。術(shù)語“類似物治療有效”的量指在一個哺乳動物中確定產(chǎn)生治療效果的類似物的量。這樣的治療有效量是很容易由本領(lǐng)域任一技術(shù)人員確定的。
本發(fā)明的類似物可以通過適于待治療創(chuàng)傷或治療條件的任何途徑給藥。用本發(fā)明的類似物的醫(yī)療應(yīng)用能有益治療的條件包括但不限于，表面創(chuàng)傷的愈合，骨愈合，血管形成，神經(jīng)再生，器官形成和/或再生。
對于獸用和人用，本發(fā)明的藥劑制劑包括治療有效量類似物和其一種或多種的藥學(xué)可接受載體，并且可選擇地含有其它治療成分。載體必須是與其它配方成分的相容性意義上“可接受”的并對其接受者不是有害的。該藥劑可以方便地以單位劑量形式存在并可以任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。所有的方法都包括將活性成分與構(gòu)成一個或更多附加成分的載體結(jié)合的步驟。一般地說，通過均勻地和緊密地將類似物與液體載體或精細(xì)分散的母體載體或兩者結(jié)合制備的。
提供下面的實施例目的在于幫助理解本發(fā)明和提供附加的權(quán)利要求中闡述的真實的范圍?？梢岳斫獾氖窃陉U述的程序中可以作一些修飾而不偏離本發(fā)明的精神。
實施例1〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物的生產(chǎn)合成利用定點誘變可制備一個〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物和一個〔Gly116〕KGF類似物。然而，本發(fā)明的這些和其他類似物亦可以通過其它方法包括化學(xué)合成制備。就〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物而言，利用到一個牛序列。具體地說，〔Ala47， Gly93〕aFGF類似物制備如下在下面的實施例中制備和檢查了本發(fā)明一個牛aFGF類似物。這個類似物，?！睞la47，Gly93〕aFGF被構(gòu)建為含有一個在aFGF分子的殘基92到96環(huán)形成序列中的所期望的氨基酸替代(在93位甘氨酸替代組氨酸)和在47位由另外的丙氨酸對非保守的半胱氨酸殘基的氨基酸取代，如圖1所示。也可制備僅具有丙氨酸對半胱氨酸的氨基酸取代的一個?！睞la47〕aFGF類似物用作為所需要的?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物的一個對照。雖然這些實施例顯示了本發(fā)明的一個牛aFGF類似物，但對于高度同源的人aFGF類似物也可以獲得同樣的結(jié)果。例如，本發(fā)明相應(yīng)的人〔Gly93〕aFGF類似物的氨基酸序列顯示于圖2。
將一個編碼牛aFGF〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物的合成基因由總數(shù)為28個組分的寡核苷酸組裝為兩個片段，Gimenez-Gallego et al(1985)，Science，2301385-1388的氨基酸序列被用作這個基因的基礎(chǔ)，密碼子的選擇以在E.coli中類似物最適表達(dá)來選擇(Gimenez-Gallego et al(1985)，同上)。片段I是從16個寡核苷酸組裝而來產(chǎn)生一個287個核苷酸的片段，可以將其在XbaI和XhoI限制酶位點插入一個質(zhì)粒質(zhì)體中。片段II是從12個寡核苷酸組裝而得的170個核苷酸的片段，該片段是經(jīng)XhoI和BamHI的相容性末端結(jié)合。將這兩部分插入表達(dá)質(zhì)粒pCEM1156，質(zhì)粒先前已經(jīng)在一個3組分的連接中用XbaI和BamHI消化，產(chǎn)生了整個處于λpL啟動子的控制下的aFGF基因。
從已知質(zhì)粒pCFM836制備了質(zhì)粒pCFM1156。在U.S.專利No.4,710,473中敘述了質(zhì)粒pCFM836的制備；說明書的有關(guān)部分特別是實施例1-7被引入本文作為參考文獻(xiàn)。為了從pCFM836制備pCFM1156，切開了兩個內(nèi)源的NdeI限制性位點，用T4聚合酶填充暴露的末端，并且填充后的末端是平齊末端。
然后用ClaI和KpnI消化得到的質(zhì)粒并用下面序列的一個DNA寡核苷酸替代切下的DNA片段5 ′-CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC-3′3′-TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC-5′用這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞生長于一個16升的發(fā)酵罐中(如Foxet al(1988)，J.Biol.Chem.，26318452-18458中敘述的)。
利用寡聚定點突變把編碼?！睞la47，Gly93〕aFGF的基因轉(zhuǎn)化成〔Ala47〕形式。aFGF基因首先被轉(zhuǎn)移進(jìn)入噬菌體載體M13mp 18，并制備了用作突變反應(yīng)的模板的單鏈DNA。大約0.5μg該DNA與5微微mol的突變引物(5′-GAAGAAAACCATTAACAACAC-3′)和用于DNA序列分析的M13通用引物混合，加熱到65℃，3分鐘，慢慢冷卻。退火的模板-引物與ATP，一個dNTP混合物，DNA聚合酶I大片段和T4DNA連接酶混合，然后在1 5℃溫育4小時。這一反應(yīng)混合物的等分試樣被加到感受態(tài)大腸桿菌JM101細(xì)胞中并在0.7％L-agar上平板培養(yǎng)。產(chǎn)生的噬菌斑被影印到硝酸纖維濾紙上，濾紙與32P標(biāo)記的突變引物雜交。將從雜交的噬菌斑制備的DNA進(jìn)行測序分析來證實成功地完成了所期望的突變過程。然后合成的基因被轉(zhuǎn)移回到PCFM1156載體來表達(dá)重組蛋白質(zhì)。aFGF類似物純化從機械裂解的表達(dá)重組蛋白的E.coli細(xì)胞離心而獲得的不溶部分純化牛〔Ala47，Gly93〕和〔Ala47〕aFGF類似物。將沉淀部分溶解于8M尿素，0.1M甘氨酸，pH25并離心除去不溶物質(zhì)，上清液上樣到一個用6M尿素，10mM甘氨酸，pH3.0平衡并用6M尿素，20mM檸檬酸鈉pH6.5洗過的S-瓊脂糖Sepharose(Pharmacia，Uppsala，Sweelen)柱上，用在20mM檸檬酸鈉中pH6.5的0到0.5M的NaCl線性梯度洗脫結(jié)合到柱上的蛋白質(zhì)。將含有aFGF的組分合并，用20mM檸檬酸鈉，0.1硫酸銨稀釋20倍，并離心除去任何沉淀。上清液與一倍體積的20mM檸檬酸鈉，2M硫酸銨，混合，加到一個用20mM檸檬酸鈉，1M硫酸銨，pH6.5平衡過的苯基-Sepharose瓊脂糖柱上。用線性下降梯度(1M到0M)的硫酸銨從柱上洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。含有aFGF的組分合并并在20mM檸檬酸鈉pH6.5中透析。正如SDS凝膠上顯示沒有其它的考馬斯亮蘭染色譜帶的事實所證明，如圖4中所顯示的，這些產(chǎn)物基本上是同源的。
實施例2aFGF類似物的凝膠過濾層析在一個Pharmacia FPLC系統(tǒng)(Pharmacia，Uppsala，Swedem)中利用一個Sepharose12柱在室溫下進(jìn)行凝膠過濾，在20mM檸檬酸鈉，0.2M NaCl pH6.5以0.5ml/min洗柱。
凝膠過濾層析顯示在相同于核糖核酸酶A(Mr＝13,700)的洗脫位純化的?！睞la47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物在以單一峰洗脫。這表明兩個蛋白質(zhì)是單體的并具有同樣的流體半徑，盡管有可能兩種形式的蛋白質(zhì)與柱基質(zhì)相互作用并導(dǎo)致一個從柱中的遲延的洗脫。
實施例3aFGF類似物的疏水作用層析在Pharmacia FPLC系統(tǒng)中利用一個苯基-Sepharose柱在室溫進(jìn)行疏水作用層析。在2M硫酸銨，20mM檸檬酸鈉，pH6.5中的樣品加到已經(jīng)用2M硫酸銨平衡過的柱上。在用2M硫酸銨洗之后，用一個從2M到0M下降梯度的硫酸銨洗脫殘留的蛋白質(zhì)，最后用20mM檸檬酸鈉pH6.5洗滌。
由于一個蛋白質(zhì)在疏水作用層析(HIC)中的洗脫位強烈、地依賴于折疊態(tài)疏水區(qū)的暴露，該技術(shù)提供了一個相似蛋白質(zhì)的構(gòu)象均一性的靈敏探測。圖3顯示了牛〔Ala47〕和〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物的洗脫曲線?！睞la47〕aFGF在以0.25M硫酸銨處洗脫出一個主要的洗脫峰，而〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物在以0.13M硫酸銨洗脫時顯示一個單一峰，表明兩個蛋白質(zhì)主要以一個單一獨特構(gòu)象存在?！睞la47，Gly93〕在低鹽濃度的洗脫指出它比〔Ala47〕形式略具疏水性。如果蛋白質(zhì)的構(gòu)象是使殘基暴露于溶劑中，那么這一觀察所得與93位甘氨酸替代組氨酸殘基是一致的。另一種可選擇方法，這一殘基的變化可以誘導(dǎo)分子構(gòu)象的整個變化來產(chǎn)生一個更加疏水的結(jié)構(gòu)。
實施例4aFGF類似物光譜學(xué)圓二色性在一個用Oki If800型30計算機(Oki，Tokyo，日本)裝備的Jasco型J-500C分光偏振儀(Jasco，Tokyo，日本)在室溫下測定圓二色性光譜。測量是分別對近和遠(yuǎn)紫外區(qū)用1和0.02cm的杯在一個寬為1nm的帶中進(jìn)行。數(shù)據(jù)表達(dá)為平均殘基橢圓率，〔θ〕，用兩種形式的aFGF的113平均殘基重來計算。
如圖4A和4B所示，在近和遠(yuǎn)紫外區(qū)?！睞la47，Gly93〕和〔Ala47〕aFGF類似物的圓二色性光譜接近相同。類似物的CD也非常相似于對人bFGF報道的光譜(Arakawa et al(1989)，BBRC，161335-341)。在近紫外區(qū)的光譜的相似性與FGFs相似的三級結(jié)構(gòu)是一致的。熱轉(zhuǎn)換在一個用熱程序和持熱杯器裝備的ResponstII分光光度計(Gilford，Medfield，Massachusetts)上測定蛋白質(zhì)的熱轉(zhuǎn)換。樣品以一個0.1℃/min或0.5℃/min的增長量加熱并在287nm處測定吸光值。利用在280nm處，就0.1％的蛋白質(zhì)而言，對bFGF為0.98，對兩個牛aFGF類似物為1.04的消光系數(shù)，用分光光度計測定蛋白質(zhì)濃度。
在存在和缺乏肝素時，在pH6.5和7.0，20mM檸檬酸鈉中測定aFGF類似物的熱變性。在所有情況下，隨著溫度的增加，蛋白質(zhì)沉淀。光吸收值突然增加的溫度是變性溫度。在缺乏肝素時，這一溫度對牛〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物大約是高于?！睞la47〕aFGF類似物10℃。加入1.4倍或8倍過量(w/w)的肝素根據(jù)所用溫度增長的速度，將兩種形式的變性溫度增加14-20℃。兩種形式的變性溫度的差異保持在約10℃。雖然在8倍過量的肝素存在時，在240-260nm區(qū)域的aFGF光譜被肝素本身的吸光值掩蓋，但在240-340nm范圍超過1.4倍或8倍(w/w)的肝素對每個蛋白質(zhì)的CD光譜沒有明顯效果。傅立葉轉(zhuǎn)化紅外(FTIR)光譜檢測通過測定傅立葉轉(zhuǎn)化紅外光譜進(jìn)一步測定兩個aFGFs的構(gòu)象的相似性。對于FTIR光譜學(xué)，蛋白質(zhì)在水中完全透析。以在用水制備的20mM咪唑緩沖液(Sigma Chemical Co，99.9％同位素純度)的2％溶液制備每種蛋白質(zhì)。溶液被放在具有CaF2窗和100μm隔離片的IR室中。對于每個光譜，收集了1500個干涉圖并在裝備了一個鍺包被的KBr光束分離器和一個DTGS探測器的一個NiColet800 FTIR系統(tǒng)上編碼，用干燥氮氣體連續(xù)清潔光學(xué)工作臺，計算次生(second)衍生物光譜(如SuSiet al(1988)，Biochem，Biophys Res.Comm.，115391-397中敘述的)。一個9點平滑函數(shù)被用于水蒸汽扣除(water vapor-subtracted)光譜，圖5顯示了在酰胺I′(C＝0在次生蛋白質(zhì)中伸展)區(qū)〔Ala47〕和〔Ala47， Gly93〕牛aFGF類似物的次生衍生物光譜。對于多肽和蛋白質(zhì)，在這個區(qū)域內(nèi)的組分帶的出現(xiàn)頻率與二級結(jié)構(gòu)含量有關(guān)Surewicz et al，(1988)，Biochem.Biophys，Acta，952115-130。光譜在1630和1685cm-1處顯示了強帶指示了兩個蛋白質(zhì)中，顯著含量的β-結(jié)構(gòu)，一個接近1647cm-1處的強帶指示了存在不規(guī)則或無序結(jié)構(gòu)，由轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了接近1666和1673cm-1處的弱峰，在兩個蛋白質(zhì)的光譜的接近1651cm-1處存在一個小峰，接近這個頻率的酰胺I′組分被典型地歸結(jié)于α-螺旋。但是，最近表明這條帶可能是由環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的，Wilder et al，(1990)，Abstracts of the Fourth Symposiumof the Protein Soliety，San Diego，如圖5所示，不象CD，高分辨的FTIR光譜清楚地證實了β-結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)角的存在。?！睞la47〕aFGF類似物和?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物的光譜幾乎是可重疊的，又一次表示這兩上蛋白質(zhì)具有相似的構(gòu)象。
次生衍生物光譜清楚地表明了兩個aFGF類似物之間在構(gòu)象上沒有差別，但是，顯然在用D2O溶液平衡冷凍干燥的蛋白質(zhì)過程中對于牛〔Ala47〕aFGF類似物可變換質(zhì)子的再生比〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物發(fā)生得更快。由于兩個蛋白質(zhì)具有相同的構(gòu)象，不能從它們之間可交換質(zhì)子暴露程度的差異來解釋所觀察到的H-D交換速度的不同。更可能〔Ala47〕aFGF類似物具有一個更柔性的結(jié)構(gòu)，使酰胺質(zhì)子更易接近溶劑。
實施例5〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物的肝素層析肝素-瓊脂糖(Pharmacia)被裝進(jìn)一個1×8cm的柱中并用10mMTris-HCl pH7.2平衡，用10mM Tris-HCl pH7.2，裝載，洗柱。并用一個在同樣緩中液中0到2.8M梯度系列的NaCl以0.5ml/min的流速在一個Pharmacia FPtC系統(tǒng)中洗脫。
通過與肝素和類肝素分子的密切結(jié)合可區(qū)別酸性和堿性FGF。?！睞la47，Gly93〕和〔Ala47〕aFGF類似物顯示了一個在1.54M NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.2中洗脫的單一峰。
實施例6aFGF類似物的生物活性體外測定來自先前實施例的aFGF類似物對NIH 3T3細(xì)胞的促有絲分裂活性測定如下，另外，一個如公開PCT專利申請No.88/04189中敘述制備的人〔Ser70，Ser88〕bFGF類似物在生物活性測定中，與aFGF類似物一并被測定。
從ATCC獲得NIH3T3細(xì)胞，細(xì)胞生長在供應(yīng)了10％牛血清，10單位/ml的青霉素，2mM谷氨酰胺和10單位/ml的鏈霉素的DME中。細(xì)胞以1∶40的比率每星期兩次傳代。在第1天的測試中，幾乎鋪滿的培養(yǎng)物被胰蛋白酶分解并以在上述培養(yǎng)基中20,000細(xì)胞/ml，1ml/每孔的濃度鋪在24孔的平板中，在第五天，用1ml/孔不含血清但含有上述濃度的青霉素，鏈霉素和谷氨酰胺的DMEM替代培養(yǎng)基，在第六天，實驗樣品以體積不大于100μm加到培養(yǎng)基中。18小時后，用1ml含有2-10μCi的氚標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷的上述培養(yǎng)基在37℃脈沖細(xì)胞1小時，脈沖之后，用培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，然后加入250mM蔗糖，10mM磷酸鈉，1mM EDTA，pH8，平板在37℃溫育10分鐘釋放細(xì)胞。在一個Skatron收集器上收集細(xì)胞(Skatron Inc.Stering，Virgmia)濾紙被干燥，放入閃爍液中，并在一個Beckman閃爍計數(shù)器中計數(shù)(Beckman儀器，Inc.，F(xiàn)ullerton，Califomia)。
?！睞la47，Gly93〕和〔Ala47〕aFGF類似物對NIH3T3細(xì)胞的促有絲分裂活性被檢測。如圖6所示，在缺少肝素時，〔Ala47〕aFGF類似物產(chǎn)生一個1到100ng/ml范圍中的3H-胸腺嘧啶吸收的劑量依賴型刺激，50％最大刺激為25ng/ml。在同樣的測試條件下，〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物能在一個更低的蛋白質(zhì)濃度，50％最大劑量大約為1ng/ml時產(chǎn)生同樣的促有絲分裂效果。重組bFGF比〔Ala47，Gly93〕aFGF有4-5倍高的潛力，具有一個50％最大劑量為220pg/ml，當(dāng)4.5μg/ml肝素加到兩種類似物中，它們的體外活性增加，〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物保留更高潛能，在存在45μg/ml肝素時，活性增強以致所有三種分子的劑量反應(yīng)接近相同，具有一個50％最大劑量為90pg/ml。
正如通過保留他們各自的促有絲分裂活性確定的，通過在存在和缺乏1mg/ml肝素時，在37℃在20mM檸檬酸鈉，pH7溫育每個FGF類似物的0.1mg/ml溶液來檢測aFGFs類似物的穩(wěn)定性。在缺乏肝素時，?！睞la47〕aFGF類似物快速失去活性，具有一個大約13小時的半壽期，如圖7所示。然而，在存在肝素時，在實驗的250小時過程中?！睞la47〕aFGF沒有失去生物活性。相反，不管有或沒有肝素存在，?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物和人〔Ser70，Ser88〕bFGF類似物250小時都沒有失去任何活性。
實施例7〔Ala47，Gly93〕aFGF類似物的結(jié)晶學(xué)使用0.2M NH4SO4，2M NaCl，0.099M檸檬酸鈉，和0.02M磷酸鉀鈉，pH5.6采用氣相擴(kuò)散的方式生長?！睞la47，Gly93〕aFGF類似物的晶體，蛋白質(zhì)液滴含有等體積的外液和10mg/ml的蛋白質(zhì)溶液，晶體是三方晶體(空間群p3121，a＝78.6A，c＝1159A)衍射的數(shù)據(jù)是25A的分辨率下收集到的。使用18KW轉(zhuǎn)靶X光源和Siemens(Madison，Wisconsin)多絲正比面探器收集強度數(shù)據(jù)，Siemens軟件包被用于數(shù)據(jù)回歸，把來自兩個衍生物的同晶置換衍生物(mir)3A分辨率的數(shù)據(jù)合并，在其多原子峰合并幾率圖上，以幾率最大處為其起始相位，。在溶劑過濾處理之后，對應(yīng)于不對稱單位中的兩個獨立的aFGF分子的區(qū)域是相同的，從旋轉(zhuǎn)函數(shù)，實空間平移函數(shù)以及密度修正，對分子間的非晶體學(xué)對稱性進(jìn)行研究。分子殼層修正是用修飾的B.CWang算法作分子平均，并對相位進(jìn)行多輪分子平均和溶劑過濾修正。
由于一個小的分子殼層，將折疊區(qū)截成平面，最初的圖揭示了β-片層的伸展結(jié)構(gòu)，如圖8所示。分子模型最終的圖以多對同晶置換法所得相位建立(來自對平均相位反復(fù)修正的重原子參數(shù)，如Rould et al(1989)，Science，2461135-1142中敘述〕使用該模型在6A范圍內(nèi)對初始模型進(jìn)行原子構(gòu)建，對3A分辨率數(shù)據(jù)進(jìn)行歸并，最終，R因子為17.8％，(R因子是從平均的核對溶液過濾的圖的計算值和觀測值之差的百分比〕。，aFGF序列的殘基10到135位氨基酸的電子密度圖采用C.Cambillan的備有TOM/FRODO制圖軟件的Silicon Graphics 4D80工作站進(jìn)行計算。
結(jié)晶學(xué)結(jié)果支持了90-97區(qū)包含于一個環(huán)結(jié)構(gòu)中的假設(shè)，如果事實上，這個區(qū)參與了受體結(jié)合(如Baircl et al(1988)建議的，上述)，任何穩(wěn)定環(huán)的氨基酸替代可以穩(wěn)固和或增強分子的生物活性，這是觀察到的牛〔Ala47，Gly93〕aFGF獲得的活性的增強的假設(shè)機制。
實施例8〔Gly116〕KGF類似物的生產(chǎn)合成為了制造〔Gly116〕KGF類似物，首先獲得一個天然存在的KGF的編碼序列，然后為了獲得類似物的編碼序列在氨基酸116的密碼子處改變。
利用把人成纖維細(xì)胞(細(xì)胞素AG1523)作為利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制造KGF的cDNA的起始材料來分離得到的RNA獲得天然存在的KGF的編碼序列。然后KGF CDNA被用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一個模板來放大KGF基因，由于在KGF基因中存在一個內(nèi)部的NdeI位點，PCR DNA被制成兩個片段，然后在一個單一的BsmI位點連接在一起，寡聚核苷酸238-231和238-24(下面所示)被用于制造隨后用BsmI和BamHI切割的DNA產(chǎn)物，并分離產(chǎn)生一個188堿基對的KGF片段，低聚核苷酸238-22和238-24被用于制造一個隨后用NdeI和BsmI的DNA產(chǎn)物，產(chǎn)生一個311個堿基對的KGF片段，這兩個DNA片段連接在一起產(chǎn)生天然存在的KGF基因，如圖9中所示。
為了獲得一個所期望的〔Gly116〕KGF類似物的編碼序列，必須在KGF基因中用一個甘氨酸密碼子替代His116密碼子，這是利用寡聚核苷酸315-17和315-18的PCR重疊寡聚核苷酸誘變，編碼對應(yīng)于具有合適堿基對變化的His116區(qū)的KGF DNA序列來編碼〔Gly116〕KGF類似物達(dá)到的。除了如圖10中所示的KpnI和EcoRI位點之間的DNA序列被化學(xué)合成的DNA替代，PCR的KGF DNA模板與圖9中所示的相同，任何對應(yīng)于定點突變變化的KGF DNA區(qū)域5′-和3′-的合適的寡聚核苷酸，如寡聚核苷酸238-22和238-24可以用于提供重疊誘變PCR的外部引物，為了用一個含有必需變化的編碼序列的區(qū)域替代KGF基因的相應(yīng)區(qū)域來編碼〔Gly116〕KGF類似物(圖10)，一個含有〔Gly116〕KGF類似物編碼序列的EcoRI到BamHI DNA片段隨后被連接進(jìn)入先前敘述的已經(jīng)含有KGF基因的表達(dá)質(zhì)粒pCFM1156連接的DNA然后被轉(zhuǎn)化進(jìn)一個FM5(ATCC#539117寄主并且分離克隆含有pCFM1156〔Gly116〕KGF類似物質(zhì)粒，然后發(fā)酵FM5/pCFM1156〔Gly116〕KGF類似物。菌株并用標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵技術(shù)收獲細(xì)胞糊。
oligo 238-21 5′-ACAACGCGTGCAATGACATGACTCCA-3′oligo 238-22 5′-ACACATATGTGCAATGACATGACTCCA-3 ′oligo 238-24 5′-ACAGGATCCTATTAAGTTATTGCCATAGGAA-3′oligo 315-17 5′-GGAAAACGGTTACAACACATATGCA-3′oligo 315-18 5′-GTGTTGTAACCGTTTTCCAGAATTAG-3′〔Gly116〕KGF類似物的純化首先通過在大約4升20mM磷酸鈉，pH6.8，0.2M NaCl中懸浮665gE.coli細(xì)胞糊打碎上面提到的來自發(fā)酵含有〔Gly116〕KGF類似物的細(xì)胞，并把懸浮液在9,000psi通過一個Gaulin均化器3次，然后在一個Beckman JA-10離心機(Beckman儀器，F(xiàn)ullerton，California)中，10,000rpm 4℃離心懸浮液30分鐘。
通過把來自離心的懸浮液的上清液加到一個用20mM磷酸鈉，pH7.5，0.2M NaCl平衡過的S-瓊脂糖快流(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱(5×23cm，450ml總體積)以一個25ml/min的流速進(jìn)行離子交換層析，然后用2升20mM磷酸鈉中的0.M到0.6M NaCl的線性梯度洗脫〔Gly116〕KGF類似物。總的梯度體積為7升(大約16倍的柱體積)，含有KGF的部分合并并在一個400ml的攪拌室內(nèi)在一個XM-10膜上濃縮22倍。
通過把一半體積的從離子交換層析得到的濃縮KGF(總體積為80ml)加到用20mM磷酸鈉，pH6.8，0.5M NaCl平衡過的一個瓊脂糖G-75(Pharmalia)柱(4.4×85cm，總體積為1300ml)中進(jìn)行分子排除層析(SEC)，并用這一緩沖液展開柱。然后，對第二個一半的濃縮KGF制備物重復(fù)這一過程。
通過首先合并對應(yīng)于〔Gly116〕KGF類似物的單體形式的SEC部分，然后用5個體積的20mM磷酸鈉，pH6.8，0.2M NaCl稀釋合并的部分并把稀釋部分加到20mM磷酸鈉，pH6.8，0.4M NaCl平衡過的S-瓊脂糖快流(Pharmacia)柱(5×23cm，450ml總體積)來進(jìn)行第二次離子交換層析過程，然后用大約1.5升的20mM磷酸鈉，pH6.8，0.4NaCl洗柱，用20mM磷酸鈉中pH6.8中的0.4M到0.6M NaCl線性梯度洗脫純化的〔Gly116〕KGF類似物?？偺荻润w積為10L(大約22倍的柱體積)。如SDS-PAGE確定的含有〔Gly116〕KGF類似物的樣品合并，用UV吸收測定KGF的含量。
實施例9KGF類似物的光譜學(xué)傅立葉轉(zhuǎn)換紅外(FTIR)光譜通過將含20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，pH68蛋白質(zhì)溶液透析過濾至含20mM磷酸鈉，0.15M NaCl，pD＝6.8的氘代水溶液中(Sigma，99.9％+同位素純度〕制備紅外光譜分析的樣品，根據(jù)Covmgton et al.，(1968)，Anal Chem 40700-706，pD值為玻璃電極PH計的PH讀數(shù)加0.45。蛋白質(zhì)終濃度為30mg/ml的蛋白質(zhì)溶液被放入帶有CaF2窗和100μM Teflon隔離片的LR室。
采用一個Nicolet 800FTIR系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，首先應(yīng)用Happ-genzel變跡函數(shù)，之后對256個雙邊干涉圖共加和傅立葉轉(zhuǎn)換，分辨率被確定在2cm-1，根據(jù)Susi和BylerBiochem，Biophys Res，Comm，115391-397，利用Nicolet軟件操作衍生物的光譜和傅立葉自我解旋，利用程序PeadfitTM(Jandel科學(xué)公司)進(jìn)行曲線裝配，KGF的紅外光譜顯示了與bFGF和aFGF強烈的相似性，表明這三種蛋白質(zhì)的同樣的結(jié)構(gòu)。
通過把IR室放在一個自動溫度控制器控制的電熱套中進(jìn)行天然存在的KGF和〔Gly116〕KGF類似物的熱穩(wěn)定性研究，以一個0.5℃/min的速度增加溫度，以8cm-1的分辨率收集IR光譜。
溫度低于50℃時，光譜與處于室溫時的光譜幾乎沒有差別，在溫度高于50℃時，光譜表明天然存在的KGF歷經(jīng)一個熱致轉(zhuǎn)變。其證據(jù)是，在光譜上接近1616和1685cm-1處有一峰，在65℃，這些峰成為譜線的主峰，而在1643cm-1處有一相應(yīng)的強度下降，這一光譜轉(zhuǎn)變代表了天然存在的KGF協(xié)同解折疊。所觀察到的熱轉(zhuǎn)變是不可逆的，原因很可能是解折疊的蛋白產(chǎn)生偏聚。天然存在的KGF的Tm估計是60℃，而〔Gly116〕KGF類似物Tm估計為65℃，高出天然存在的KGF5℃，表明〔Gly116〕KGF類似物比天然存在的KGF有一個更高的相對熱穩(wěn)定性。紫外光譜利用一個具有Reltier溫度控制器和熱程序計的Resporse II UV分光光度計(Gilford，Medfield，Massachusetts)研究〔Gly116〕KGF類似物和天然存在的KGF的熱變性，在20mM磷酸鈉，pH6.8中的KGF溶液與8M鹽酸胍或20mM磷酸鈉混合到一個最后的蛋白質(zhì)濃度大約為0.5mg/ml和一個最后的鹽酸胍濃度0到2M，熱掃描速度確定在0.5℃/min，檢測的波長為286nm在熱變性過程中加入少量的去除鹽酸胍的蛋白質(zhì)沉淀，但不使變性可逆，所以，所比較的樣品同時進(jìn)行。
由于加熱過程中混濁度的出現(xiàn)，鹽酸胍濃度為0至1M鹽酸胍中利用UV光譜學(xué)的熱變性實驗是不成功的。然而，天然存在的KGF比〔Gly116〕KGF類似物發(fā)生混濁的溫度更低，表明前面的蛋白質(zhì)變性并偏聚在一個更低的溫度。在1.5M的鹽酸胍中，隨著蛋白質(zhì)變性287nm處的吸光值下降，然后由于聚集而增高，發(fā)生吸光值下降和增高的溫度對〔Gly116〕KGF類似物分別為25和44℃，在25℃加入2M鹽酸胍導(dǎo)致天然存在KGF和〔Gly116〕KGF類似物的部分變性。增加溫度導(dǎo)致蛋白質(zhì)的完全變性，對于天然存在的KGF變性結(jié)束在37℃，對于〔Gly116〕KGF類似物為46℃。這些結(jié)果表明從熔點看，〔Gly116〕KGF類似物具有高出幾度的熱穩(wěn)定性，這與紅外分析表明〔Gly116〕KGF類似物的Tm高出天然KGF大約5℃的結(jié)果是一致的。
實施例10〔Gly116〕KGF類似物的促有絲分裂活性利用Rubin et al(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86802-806的有絲分裂發(fā)生測試分析了〔Gly116〕KGF類似物的促有絲分裂活性，〔Gly116〕KGF類似物展示了比對天然存在的KGF觀察到的更少的3H-胸腺嘧啶摻入，表明〔Gly116〕KGF類似物的一個更低的專一活性。
序列表(1)一般的信息(i)申請人Amgen Inc.(ii)發(fā)明題目具有增強穩(wěn)定性和生物活性的酸性成纖維細(xì)胞生長因子的類似物(iii)序列數(shù)17(iv)通信地址(A)通信人Amgen Inc.
(B)街道1840 DeHavilland Drive(C)城市Thousand Ouks(D)州California(E)國家USA(F)郵編91320-1789(v)計算機可讀形式(A)媒體類型Floppy盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatertIn Release #1.0，#1.25版(vi)最新申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度463個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1TCTAGAAAAA ACCAAGGAGG TAATAAATAA TGTTCAACCT GCCGCTGGGT AACTACAAAA 60AACCTAAGCT TCTGTACTGC TCTAACGGCG GTTACTTCCT GCGCATTCTC CCGGATGGCA 120CTGTAGACGG TACCAAAGAT CGTTCCGACC AGCACATTCA GCTCCAGCTC GCTGCAGAAT 180CTATCGGTGA AGTTTACATC AAATCCACCG AAACTGGTCA GTTCCTGGCT ATGGATACTG 240ATGGTCTCCT CTACGGTTCT CAGACTCCGA ACGAAGAGTG CCTGTTCCTC GAGCGTCTGG 300AAGAAAACGG TTACAACACC TACATCTCCA AAAAACACGC TGAAAAACAC TGGTTCGTTG 360GTCTGAAAAA AAACGGTCGT TCTAAACTGG GTCCGCGCAC TCACTTCGGT CAGAAAGCTA 420TCCTGTTCCT CCCTCTGCCG GTTTCTTCCG ATTAATAGGA TCC463(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度141個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Phe Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr1 5 10 15Cys Ser Asn Gly Gly Tyr Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val20 25 30Asp Gly Thr Lys Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ala35 40 45Ala Glu Ser Ile Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln50 55 60Phe Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro65 70 75 80Asn Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn85 90 95Thr Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys His Trp Phe Val Gly Leu100 105 110Lys Lys Asn Gly Arg Ser Lys Leu Gly Pro Arg Thr His Phe Gly Gln115 120 125Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp130 135 140(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度155個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Met Ala Glu Gly Glu Ile Thr Thr Phe Thr Ala Leu Thr Glu Lys Phe1 5 10 15Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Ala Ser20 25 30Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp Gly35 40 45Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala Glu50 55 60Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr Leu65 70 75 80Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn Glu85 90 95Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr100 105 110Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys Lys115 120 125Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys Ala130 135 140Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp145 150 155(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度502個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA 60GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTC 120TGTCGAACAC AGTGGTACCT GAGGATCGAT AAAAGAGGCA AAGTAAAAGG GACCCAAGAG 180ATGAAGAATA ATTACAATAT CATGGAAATC AGGACAGTGG CAGTTGGAAT TGTGGCAATC 240AAAGGGGTGG AAAGTGAATT CTATCTTGCA ATGAACAAGG AAGGAAAACT CTATGCAAAG 300AAAGAATGCA ATGAAGATTG TAACTTCAAA GAACTAATTC TGGAAAACCA TTACAACACA 360TATGCATCAG CTAAATGGAC ACACAACGGA GGGGAAATGT TTGTTGCCTT AAATCAAAAG 420GGGATTCCTG TAAGAGGAAA AAAAACGAAG AAAGAACAAA AAACAGCCCA CTTTCTTCCT 480ATGGCAATAA CTTAATAGGA TC 502(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度497個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞(B)位編制數(shù)(1..497)(xi)序列描述SEQ ID NO5CTATTAAGTT ATTGCCATAG GAAGAAAGTG GGCTGTTTTT TGTTCTTTCT TCGTTTTTTT 60TCCTCTTACA GGAATCCCCT TTTGATTTAA GGCAACAAAC ATTTCCCCTC CGTTGTGTGT 120CCATTTAGCT GATGCATATG TGTTGTAATG GTTTTCCAGA ATTAGTTCTT TGAAGTTACA 180ATCTTCATTG CATTCTTTCT TTGCATAGAG TTTTCCTTCC TTGTTCATTG CAAGATAGAA 240TTCACTTTCC ACCCCTTTGA TTGCCACAAT TCCAACTGCC ACTGTCCTGA TTTCCATGAT 300ATTGTAATTA TTCTTCATCT CTTGGGTCCC TTTTACTTTG CCTCTTTTAT CGATCCTCAG 360GTACCACTGT GTTCGACAGA AGAGTCTTCT CACTCTTATA TCCCCTCCTT CCATGTAATC 420ATAACTTCTT GTGTGTCGCT CAGGGCTGGA ACAGTTCACA TTTGTAGCCA TTTGCTCTGG 480AGTCATGTCA TTGCACA 497(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度164個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys1 5 10 15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly20 25 30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg35 40 45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn50 55 60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65 70 75 80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys85 90 95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu100 105 110Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His115 120 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val130 135 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145 150 155 160Met Ala Ile Thr(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度503個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO7TATGTGCAAT GACATGACTC CAGAGCAAAT GGCTACAAAT GTGAACTGTT CCAGCCCTGA 60GCGACACACA AGAAGTTATG ATTACATGGA AGGAGGGGAT ATAAGAGTGA GAAGACTCTT 120CTGTCGAACA CAGTGGTACC TGCGTATCGA CAAACGCGGC AAAGTCAAGG GCACCCAAGA 180GATGAAAAAC AACTACAATA TTATGGAAAT CCGTACTGTT GCTGTTGGTA TCGTTGCAAT 240CAAAGGTGTT GAATCTGAAT TCTATCTTGC AATGAACAAG GAAGGAAAAC TCTATGCAAA 300GAAAGAATGC AATGAAGATT GTAACTTCAA AGAACTAATT CTGGAAAACG GTTACAACAC 360ATATGCATCA GCTAAATGGA CACACAACGG AGGGGAAATG TTTGTTGCCT TAAATCAAAA 420GGGGATTCCT GTAAGAGGAA AAAAAACGAA GAAAGAACAA AAAACAGCCC ACTTTCTTCC 480TATGGCAATA ACTTAATAGG ATC 503(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度497個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞-(B)位編制數(shù)(1..497)(xi)序列描述SEQ ID NO8CTATTAAGTT ATTGCCATAG GAAGAAAGTG GGCTGTTTTT TGTTCTTTCT TCGTTTTTTT 60TCCTCTTACA GGAATCCCCT TTTGATTTAA GGCAACAAAC ATTTCCCCTC CGTTGTGTGT 120CCATTTAGCT GATGCATATG TGTTGTAACC GTTTTCCAGA ATTAGTTCTT TGAAGTTACA 180ATCTTCATTG CATTCTTTCT TTGCATAGAG TTTTCCTTCC TTGTTCATTG CAAGATAGAA 240TTCAGATTCA ACACCTTTGA TTGCAACGAT ACCAACAGCA ACAGTACGGA TTTCCATAAT 300ATTGTAGTTG TTTTTCATCT CTTGGGTGCC CTTGACTTTG CCGCGTTTGT CGATACGCAG 360GTACCACTGT GTTCGACAGA AGAGTCTTCT CACTCTTATA TCCCCTCCTT CCATGTAATC 420ATAACTTCTT GTGTGTCGCT CAGGGCTGGA ACAGTTCACA TTTGTAGCCA TTTGCTCTGG 480AGTCATGTCA TTGCACA 497(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度l64個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys1 5 10 15Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly20 25 30Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg35 40 45Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn50 55 60Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile65 70 75 80Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys85 90 95Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu100 105 110Ile Leu Glu Asn Gly Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His115 120 125Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val130 135 140Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro145 150 155 160Met Ala Ile Thr(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度55個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO10CGATTTGATT CTAGAAGGAG GAATAACATA TGGTTAACGC GTTGGAATTC GGTAC 55(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度49個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO11CGAATTCCAA CGCGTTAACC ATATGTTATT CCTCCTTCTA GAATCAAAT 49(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO12GAAGAAAACC ATTACAACAC 20(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO13ACAACGCGTG CAATGACATG ACTCCA 26(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO14ACACATATGT GCAATGACAT GACTCCA 27(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO15ACAGGATCCT ATTAAGTTAT TGCCATAGGA A 31(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO16GGAAAACGGT TACAACACAT ATGCA25(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征
(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)未知(D)拓樸結(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO17GTGTTGTAAC CGTTTTCCAG AATTAG 2權(quán)利要求
1.一種FGF家族中天然存在蛋白質(zhì)的類似物，其中在所說的天然存在的蛋白質(zhì)中的環(huán)形成序列-Asn-His-Tyr-Asn-Thr-中的至少一個氨基酸被一個具有更高環(huán)形成潛能的不同的氨基酸殘基替代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的類似物，其中所說的天然存在的蛋白質(zhì)是KGF。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的類似物，其中所說的替代氨基酸是氨基酸116。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的類似物，其中所說的具有一個更高環(huán)形成潛能的氨基酸選自甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類似物，其中所說的具有更高環(huán)形成潛能的氨基酸是甘氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的類似物，它具有圖10中闡述氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的類似物，其中至少一個末端氨基酸殘基被缺失，而所說的類似物實際上保留了所說的增強的生物活性。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所說的類似物，其中至少一個所說的天然存在的KGF的半胱氨酸殘基被一個中性氨基酸殘基替代。
9.一個編碼原核生物或真核生物表達(dá)的權(quán)利要求1所述的類似物的DNA序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所說的DNA序列，其中所說的類似物是權(quán)利要求6的類似物。
11.一種藥物組合物，它含有有治療有效量的權(quán)利要求1所述的類似物和一種或多種可藥用佐劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的藥物組合物，其中所說的類似物為權(quán)利要求6的類似物。
13.一種治療創(chuàng)傷的方法，包括給所說的創(chuàng)傷施用治療有效量的權(quán)利要求1所說的類似物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所說的類似物是權(quán)利要求6的類似物。
15.根據(jù)權(quán)利要求5的類似物，它具有附圖1中闡述的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求5中的類似物，它具有附圖2中闡述酸的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了FGF家族的蛋白質(zhì)類似物。這些類似物比相應(yīng)的天然存在的蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定。增強的穩(wěn)定性是通過在蛋白質(zhì)氨基酸序列的一個已鑒定為環(huán)形成區(qū)域，用至少一個具有較高環(huán)形成潛能的氨基酸替代一個具有較低環(huán)形成勢能的氨基酸來獲得的。本發(fā)明的類似物特別適用于治療。
文檔編號A61P43/00GK1169158SQ95196717
公開日1997年12月31日 申請日期1995年10月12日 優(yōu)先權(quán)日1994年10月13日
發(fā)明者荒川力, G·M·福斯 申請人:安姆根有限公司