專(zhuān)利名稱(chēng)：：超氧化物歧化酶的新的治療應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及超氧化物歧化酶(SOD)的治療學(xué)上的新的應(yīng)用。在1968年，McCORD和FRIDOVICH描述了SOD的特征；它是一個(gè)促進(jìn)超氧化物基團(tuán)(O2-)消除的酶，構(gòu)成可防止這種基團(tuán)的有害作用的重要的機(jī)理，它可在體內(nèi)由空氣中的氧氣而形成，因此，在阻止由于暴露在氧化的空氣中而產(chǎn)生的毒性作用方面起著主要作用。作為氧氣衍生的自由基團(tuán)，它們看起來(lái)和許多疾病有關(guān)，因此，用SOD治療關(guān)節(jié)炎癥是可取的(R.NURDMANNeta1.，Cah.Nutr.Diet.，1991，26，6，398-402)；在用于肺部疾病的治療中，SOD也獲得了或大或小程度不同的成功，尤其是支氣管肺發(fā)育不良，或者是和氧氣富足有關(guān)的其它中毒情況(中樞神經(jīng)系統(tǒng)，局部缺血，非血管的胃腸失調(diào)，眼疾病(位于眼的前房)，或?qū)拱┲委熞鸬牟涣挤磻?yīng)的控制(GREENWALDR.A.，F(xiàn)reeRadicalBiol.Med.，1990，8，201-209)。已經(jīng)證實(shí)，SOD，處于脂質(zhì)體的，牛的Cu/Zn形式，對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)中放射性纖維化(BailletF.etal.，TreatmentofradiofibrosiswithLiposomalSuperoxidedismutase.Preliminaryresultsof50cuses，F(xiàn)reeRad.Res.commun.，1，387-394，HarwoodAcademicPublishersGmbH，1986)及后來(lái)的在豬體內(nèi)做的實(shí)驗(yàn)尤其有效(LefaixT.L.etal.，Lafibrosecutaneomusculaireradio-induiteefficacitetherapeutiquemajeuredelaSODCu/ZnLiposomiale(RadioinducedcutaneomuscularfibrosismajortherapeuticefficacyofliposomalCu/ZnSOD)，Bull.Cancer，1993，80，799-807)，我們尤其關(guān)注這些結(jié)果，是因?yàn)闆](méi)有其它產(chǎn)品可以產(chǎn)生同樣作用。SOD的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，它們半衰期長(zhǎng)，免疫疾病發(fā)生率較低，所以?xún)?yōu)選它們，尤其要提及以下情況牛來(lái)源的Cu/ZnSOD(一個(gè)可催化超氧化物基團(tuán)歧化的同型二聚體)，MnSOD，F(xiàn)eSOD，脂質(zhì)體的SOD，和聚乙二醇結(jié)合的SOD，SOD聚合物或SOD共聚物及重組人Cu/ZnSOD及MnSOD。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了以SOD為基礎(chǔ)的制劑的新用途，該制劑延長(zhǎng)了藥物的作用時(shí)間，用于治療或預(yù)防腦功能障礙，尤其是腦識(shí)別功能障礙，它們是由大腦特異性損傷或非特異性損傷而引起的。就本發(fā)明而言，非特異性損傷是指例如電刺激(足底電擊)，特異性腦損傷是指蔓延性全腦的輻射。出人意料的是，上述延長(zhǎng)作用時(shí)間的SOD制劑可以在預(yù)防和治療能力兩方面防止哺乳動(dòng)物腦功能出現(xiàn)障礙。此種延長(zhǎng)作用時(shí)間的SOD制劑，尤其優(yōu)選脂質(zhì)體SOD，和聚乙二醇結(jié)合的SOD及SOD聚合物或共聚物。有利地，超氧化物歧化酶(SOD)尤其是哺乳動(dòng)物(鼠、牛、人)的Cu/ZnSOD，MnSOD，F(xiàn)eSOD或重組SOD.這些制劑可以通過(guò)非腸道給藥，優(yōu)選皮下，或者口服給藥。如上描述的以SOD為基礎(chǔ)的制劑可用于哺乳動(dòng)物，尤其是人，用于治療或預(yù)防由特異性腦損傷(例如輻射)或非特異性腦損傷(例如電刺激)引起的腦識(shí)別功能障礙。對(duì)于放射治療并發(fā)癥來(lái)說(shuō)，SOD的有效劑量范圍很寬，其極端是從豬體內(nèi)的2.3mg/kg到人體內(nèi)的0.03mg/kg。對(duì)于人，處方日劑量?jī)?yōu)選0.03mg/kg至0.08mg/kg，皮下給藥。除去上述規(guī)則外，本發(fā)明也包括其它方面，從下述有關(guān)如何實(shí)現(xiàn)構(gòu)成本發(fā)明主題的方法實(shí)施例可看出來(lái)。必須說(shuō)明的是，為了闡述本發(fā)明的主題，這些實(shí)施例都是單獨(dú)給出的，但不構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1SOD對(duì)于非特異性損傷(電刺激)的預(yù)防效果-損傷電刺激高于特定臨界值(1.1-1.2mA)的足底電擊強(qiáng)烈地抑制了限制條件下反應(yīng)的出現(xiàn)(避免)。在以下的研究中，采用1.5mA足底震蕩，通常條件下是0.8mA。*方法及裝置-動(dòng)物12只5月齡的Wistar系雄性大鼠被隨機(jī)分成兩組，每組6只，1)對(duì)照組和2)脂質(zhì)體Cu/ZnSOD組。-處置每次訓(xùn)練前2小時(shí)，給脂質(zhì)體Cu/ZnSOD組0.5mg/kg的脂質(zhì)體Cu/ZnSOD，皮下給藥，給藥比例是0.05ml/100g體重。對(duì)照組接受同樣體積的0.9％NaCl。-行為測(cè)試雙向躲避動(dòng)物被迫從室A移向室B以便避免電擊(1.5mA15秒鐘)，交替地用于籠子A的地板或籠子B的地板。一個(gè)聽(tīng)覺(jué)的條件刺激(300Hz)使它們可避免這種電擊，條件是它們的反應(yīng)時(shí)間在6秒鐘之內(nèi)(條件刺激的持續(xù)時(shí)間和間隔)。這種訓(xùn)練每天一組，連續(xù)三天。每組由15個(gè)試驗(yàn)組成。每個(gè)實(shí)驗(yàn)間隔是50秒。逃避次數(shù)，逃跑失敗次數(shù)及受到足底電擊的時(shí)間記錄下來(lái)。-統(tǒng)計(jì)資料用原始單獨(dú)數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算平均值，平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(Sem)，組的規(guī)模及Student氏t測(cè)試值。應(yīng)用所有獲得的結(jié)果在兩組間比較。*結(jié)果-逃避百分率對(duì)照組和脂質(zhì)體Cu/ZnSOD組的比較(表I)表明在訓(xùn)練的第一天治療組具有明顯的優(yōu)勢(shì)(12.22％比0％，p＝0.02)。這種區(qū)別程度隨后變小，但是繼續(xù)存在，第二天(14.44％比1.11％，p＝0.15)和第三天(23.33％比4.45％，p＝0.09)。-逃跑失敗百分率可以看出(表II)脂質(zhì)體Cu/ZnSOD組第一天逃跑失敗百分率明顯減少(13.33％比58.88％，p＝0.02)在訓(xùn)練的第二天，這種減小仍保持在一定水平(0％比14.45％p＝0.11)。-每次接觸足底電擊的持續(xù)時(shí)間施用脂質(zhì)體Cu/ZnSOD(表III，圖1)能夠使大鼠更好地控制非條件刺激(1.5mA電擊)的損害，因?yàn)樗鼈冊(cè)诘谝惶炜擅黠@地減少接觸電擊時(shí)間(88.93秒比165.62秒，p＝0.04)，第三天(13.61秒比45.64秒，p＝0.03)，訓(xùn)練的第二天達(dá)到一定程度(37.52秒比82.50秒，p＝0.15)。這表明，在每次實(shí)驗(yàn)包含的15個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，脂質(zhì)體Cu/ZnSOD組不僅對(duì)于電擊時(shí)間而且對(duì)于兩個(gè)連續(xù)試驗(yàn)間的其余時(shí)間50秒均能夠有效地作出反應(yīng)。*結(jié)論當(dāng)我們考慮雙向逃避試驗(yàn)獲得的3個(gè)參數(shù)時(shí)，脂質(zhì)體Cu/ZnSOD的保護(hù)效果很明顯。出人意料的是，施用脂質(zhì)體Cu/ZnSOD可減少干擾訓(xùn)練獲得的非特異性損傷(電刺激)的副作用。事實(shí)上，先皮下注射SOD使得訓(xùn)練能力得以保持。<p>表II雙向逃避逃跑失敗百分率預(yù)試驗(yàn)脂質(zhì)體SOD對(duì)5月齡雄性Wister大鼠產(chǎn)生的不利影響加強(qiáng)試驗(yàn)表III雙向逃避每組對(duì)足底電壓的接觸的持續(xù)時(shí)間(秒)預(yù)試驗(yàn)-脂質(zhì)體SOD對(duì)5月齡雄性Wister大鼠產(chǎn)生的不利影響<p>實(shí)施例2頭部輻射導(dǎo)致的識(shí)別功能障礙脂質(zhì)體的Cu/Zn超氧化物歧化酶對(duì)被輻射的4月齡大鼠產(chǎn)生的效果。*方法和裝置-動(dòng)物15只雄性Wistar系大鼠，4月齡，被輻射，分成兩組1)對(duì)照組n＝7，2)2l輻射后被施用脂質(zhì)體Cu/ZnSOD9個(gè)月，n＝8。-處置每天一次，連續(xù)5天，皮下給第二組動(dòng)物0.5mg/kg脂質(zhì)體Cu/ZnSOD，給藥比例為0.05ml/100g體重，同時(shí)組1)接受同樣體積的0.9％NaCl。3天后，于進(jìn)行行為試驗(yàn)之前的2小時(shí)，注射6次脂質(zhì)體Cu/ZnSOD或0.9％NaCl。-輻射(處置前9個(gè)月)用250mg/kg的水合氯醛將大鼠麻醉(腹膜內(nèi)給藥)，比率為0.5ml/100g體重。大鼠的腦用同量的相對(duì)的放射性鈷處置。兩種射線(xiàn)同天應(yīng)用。30Gy的劑量分10部分釋放12天，于等角點(diǎn)處按照計(jì)算機(jī)劑量學(xué)的95％響應(yīng)的等劑量為基礎(chǔ)。用5cm厚，定制的鉛罩放于皮膚的入口點(diǎn)來(lái)保護(hù)口腔、鼻、眼、頸髓等。鈷60源和軸線(xiàn)間的距離是80厘米。輻射之后，大鼠被安置在最初的籠子中(每個(gè)籠中有4-5只動(dòng)物)。-行為試驗(yàn)雙向逃避動(dòng)物被迫從室A移向另一個(gè)室B，以避免電擊(0.8mA，15秒)，即交替地置于A籠或B籠的地板上。聽(tīng)覺(jué)的條件刺激(300Hz)使它們能避免這種電擊，給它們反應(yīng)的時(shí)間是6秒(條件刺激的持續(xù)時(shí)間和間隔)。此訓(xùn)練連續(xù)5天，每天一組。每組由15個(gè)訓(xùn)練組成。實(shí)驗(yàn)間隔50秒。此試驗(yàn)于輻射后一個(gè)月開(kāi)始。于輻射后2個(gè)半，4個(gè)半，8和9個(gè)月重復(fù)四組訓(xùn)練。記錄逃避次數(shù)。-統(tǒng)計(jì)數(shù)字用原始個(gè)體數(shù)字計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差，平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)，組的規(guī)模和用于成對(duì)系列的Student氏t測(cè)試值。*結(jié)果-逃避百分率組內(nèi)比較(表IV)顯示出在輻射處置過(guò)的組內(nèi)(30.83％比49.170％，p＝0.05，自由度(dof)＝7)于第三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)組(D257)和6次注射脂質(zhì)體Cu/ZnSOD組(D283)即第4組之間在逃避百分率的變化方面存在顯著的差異。這種變化在對(duì)照輻射組同樣時(shí)間里沒(méi)有被觀測(cè)到(36.19％比34.29％p＝0.83)。表IV</tables>*3.5Gy/天*結(jié)論通過(guò)對(duì)第四次重復(fù)(D283)雙向逃避試驗(yàn)中參數(shù)的研究，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體Cu/ZnSOD的輻射后療效顯著。輻射導(dǎo)致的反應(yīng)缺陷的表達(dá)的提高可以和先前觀察到的(實(shí)施例1)保護(hù)效果相比較。出乎意料的是，SOD的應(yīng)用提高了患有由于輻射作用引起的慢性腦功能缺陷的大鼠的腦功能。事實(shí)上，用30Gy分10組輻射12天后，大鼠的腦識(shí)別功能受到實(shí)質(zhì)性與慢性損害，沒(méi)有引起光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)異常，其中，輻射后9個(gè)月皮下注射SOD可明顯地提高大鼠腦功能，使它們和那些非輻射對(duì)照組大鼠形成相似。如上所述，很明顯，本發(fā)明并不僅限于所完成的具體實(shí)施方案和已經(jīng)更加清楚地描述過(guò)的應(yīng)用模式；相反，它包括所有本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可能遇見(jiàn)的變體，這并不背離本發(fā)明的框架和范圍。權(quán)利要求1.以SOD為基礎(chǔ)的延長(zhǎng)作用時(shí)間的藥物制劑的應(yīng)用，用于治療或預(yù)防特異性腦損傷或非特異性損傷而引起的腦功能障礙。2.權(quán)利要求1的用途，其特征在于非腸道給藥，優(yōu)選皮下給藥。3.權(quán)利要求2的用途，其特征在于每日給藥劑量為0.03mg/kg-0.08mg/kg。4.權(quán)利要求1的用途，其特征在于口服給藥。5.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的用法，其特征在于預(yù)防由非特異性損傷而引起的腦識(shí)別功能障礙。6.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的用法，其特征在于治療由非特異性損傷而引起的腦識(shí)別功能障礙。7.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的用法，其特征在于預(yù)防特異性腦損傷而引起的腦識(shí)別功能障礙。8.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的用法，其特征在于治療由特異性腦損傷而引起的腦識(shí)別功能障礙。全文摘要超氧化物歧化酶的新的治療應(yīng)用，以SOD為基礎(chǔ)的延長(zhǎng)作用時(shí)間的藥物制劑的應(yīng)用，用于治療或預(yù)防特異性腦損傷或非特異性損傷而引起的腦功能障礙。文檔編號(hào)A61P25/28GK1167441SQ95196538公開(kāi)日1997年12月10日申請(qǐng)日期1995年11月29日優(yōu)先權(quán)日1994年11月30日發(fā)明者F·巴勒里特,I·拉姆普羅格洛申請(qǐng)人:公共救濟(jì)事業(yè)局-巴黎醫(yī)院