專利名稱：抑制β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抑制或預(yù)防腦中淀粉樣蛋白沉積的化合物和藥物組合物以及方法。更進(jìn)一步地說，本發(fā)明涉及阿爾茨海默癥的治療。
背景技術(shù)：
據(jù)估計，65歲以上的美國人口中有5％以上的人和85歲以上的美國人口中有15％以上的人患阿爾茨海默癥。(Cross，A.J.，Eur.J.Pharmacol.(1982)8277-80；Terry，R.D.等人，Ann.Neurol.(1983)14497-506)。人們認(rèn)為老人限制在長期護(hù)理設(shè)施中的主要原因是由于這種疾病，而死在專業(yè)護(hù)理室中的人中大約有65％患有該病。
有關(guān)與阿爾茨海默癥的發(fā)生有關(guān)的生化和代謝現(xiàn)象的某些事實(shí)已為人們所知。在阿爾茨海默癥腦中看到的兩種形態(tài)和組織病理變化是神經(jīng)原纖維紊亂(NFT)和淀粉樣蛋白沉積。神經(jīng)類的神經(jīng)原纖維tangle也存在于其它退化性疾病中，但是在神經(jīng)內(nèi)空間(神經(jīng)斑)和在周圍的微脈管系統(tǒng)(脈管斑)中均存在淀粉樣蛋白沉積似乎是阿爾茨海默癥的特點(diǎn)。其中神經(jīng)斑是最為普遍的(Price，D.L.等人，Drug DevelopmentResearch(1985)559-68)。淀粉樣蛋白斑在患有阿爾茨海默癥的老年唐氏綜合征患者的腦中也能看到。
人們已經(jīng)采用阿爾茨海默癥病人的富含蛋白斑的腦作為提取約4.2kd“核心”多肽，淀粉樣蛋白斑核心蛋白(APCP)的一種源。這種多肽被Glener，G.等人，Biochem.Biophvs.Res.Commun.(1 984)120885-890命名為β-蛋白。其氨基-末端的氨基酸序列已被確定(Glenner，G.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1984)1221131-1135；Masters，C.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)824245-4259)。這兩組所報道的氨基酸序列是相同的，只是Glenner等人報道說在阿爾茨海默癥腦血管淀粉樣蛋白的位11處有一個谷氨酰胺殘基，而Masters等人報道說在11位為谷氨酸。此外，前一位作者報道說大腦血管淀粉樣蛋白具有同種氨基末端，而后一位作者報導(dǎo)說是異種氨基末端。這兩個小組均表示在成年的患有唐氏綜合征的個體的淀粉樣蛋白斑核心和血管淀粉樣蛋白中發(fā)現(xiàn)了相同的肽并且報道了在11位為谷氨酸。Wong，C.W.等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)828729-8732)表示與Masters(上文)所說的β-淀粉樣蛋白核心蛋白的前10種氨基酸同源的一種合成肽可以提高小鼠的抗體并且這些抗體可以用來不僅使充滿淀粉樣蛋白的大腦血管染色而且使神經(jīng)斑染色。這些結(jié)果被Allsop，D.等人(Neuroscience Letters(1986)68252-256)利用針對一種合成肽(對應(yīng)于氨基酸8-17)的抗體證實(shí)了。因此，一般說來，在阿爾茨海默癥病人的腦的不同位置發(fā)現(xiàn)的蛋白斑在免疫反應(yīng)性方面似乎是相似的。正如在多種常用的變性劑，如去污劑和離液劑中不能達(dá)到溶解所顯示的，它是高度不溶的(Masters，上文，Allsop，D.等人，上文)。
有六種已知的與疾病有關(guān)的淀粉樣蛋白沉積的例子，其中該淀粉樣蛋白是由前體蛋白產(chǎn)生的對于初始淀粉樣變性，該前體是一種免疫球蛋白輕鏈；對于次級淀粉樣變性，該前體為淀粉樣蛋白A蛋白；對于淀粉樣變性，該前體為前期白蛋白或其變體；對于甲狀腺髓樣癌，該前體為一種原降鈣素片段；對于遺傳性大腦出血，該前體為γ-示蹤片段(參見Glenner，G.New England Journal of Medicine(1980)3021283；Sletton，K等人，Biochem J(1981)195561；Benditt等人，F(xiàn)EBS Lett(1971)19169；Sletton，K.等人，Eur J Biochem(1974)41117Sletton，K.J Exp Med(1976)143993)。上面只是部分列出，至少還有許多其它有關(guān)作為甲狀腺癌的淀粉樣蛋白的前體的原降鈣素片段的文獻(xiàn)。
由其它已知的與疾病有關(guān)的淀粉樣蛋白沉積的例子類推，可以認(rèn)為與阿爾茨海默癥有關(guān)的β-淀粉樣蛋白核心蛋白是由一種前體蛋白形成的。在較大蛋白的框架中含有β-淀粉樣蛋白核心蛋白序列的蛋白已由Kang，J.等人描述(Nature(1987)325733-736)。這種蛋白的序列是由從人胎兒腦組織cDNA庫中分離出的cDNA克隆的序列推斷出的，并且由695個氨基酸殘基組成，在這些殘基中，β-淀粉樣蛋白核心蛋白的氨基端從597位開始。第二種含有β-淀粉樣蛋白序列的前體蛋白是從由Ponte等人(Nature(1988)331525-587)分離得到的cDNA克隆推測出來的。由Ponte等人分離得到的這種cDNA克隆編碼了一種與Kang等人識別的蛋白相同的前體蛋白，只是它在該β-淀粉樣蛋白核心蛋白序列的上游含有附加的57-氨基酸序列。這種57-氨基酸插入序列包含一種功能區(qū)域，該區(qū)域與一系列蛋白酶抑制劑(以Kunitz-型絲氨酸蛋白酶抑制劑為人們所知)高度同源。其它人已鑒定了另一種含有770氨基酸的淀粉樣蛋白前體蛋白(參見Kitaguchi等人，Nature(1988)331530-532)。由Kitaguchi鑒定的前體與Ponte等人鑒定的前體相同，除了它在靠近57-氨基酸蛋白酶抑制劑區(qū)域處含有附加的19個氨基酸以外。還不清楚這些附加的19個氨基酸使該分子具有何種附加的功能。已經(jīng)由cDNA克隆鑒定的各種淀粉樣蛋白前體蛋白是由于在單個淀粉樣蛋白前體基因的轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生了不同的信息剪接而造成的。
已經(jīng)表明該淀粉樣蛋白前體蛋白是通過正常的細(xì)胞代謝加工的，從而產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白核心蛋白(Haass等人，Nature(1992)359322-325；Shoji等人，Science(1992)258126-129；Seubert等人，Nature(1992)359325-327)。但是還不清楚是否患有阿爾茨海默癥的個體產(chǎn)生大量的β-淀粉樣蛋白核心蛋白，盡管已經(jīng)表明患有唐氏綜合征的個體(他們不可避免地患有阿爾茨海默癥)表達(dá)兩倍以上的β-淀粉樣蛋白前體蛋白(Neve等人，Neuron(1988)1669-677)?？梢哉J(rèn)為淀粉樣蛋白斑在阿爾茨海默癥腦中的發(fā)展是由于該β-淀粉樣蛋白的過量產(chǎn)生和/或降低的清除或螯合而造成的。因此，如果通過防止或抑制該前體發(fā)展產(chǎn)生淀粉樣蛋白核心蛋白而設(shè)計出用來干擾蛋白斑形成過程的手段，則這些手段可以構(gòu)成治療或改善阿爾茨海默癥發(fā)展的方法。但是，至今人們還沒有充分地理解淀粉樣蛋白前體蛋白產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白核心蛋白的加工過程，從而有效地治療干擾導(dǎo)致淀粉樣蛋白沉積的過程。
目前有多份報告描述了被推測為負(fù)責(zé)產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白和/或阿爾茨海默癥病理的推斷蛋白酶。這些推斷蛋白酶包括許多類型酶，例如，絲氨酸、半胱氨酸和金屬-蛋白酶。許多β-淀粉樣蛋白形成性蛋白酶已經(jīng)被分離并被鑒定。有些被報導(dǎo)的候選物包括多重催化蛋白酶(FEBS 30457-60(1992)和FEBS Lett.257388-392(1989))、乳細(xì)胞胃促胰酶(J.Biol.Chem.2653836-43(1990))、金屬-肽鏈內(nèi)切酶24.15(Biochem.Biophys.Res.Commun.185746-52(1992))、鈣活化中性蛋白酶(calpain)(J.Neurosci.)102400-2411(1990)、鈣活化絲氨酸蛋白酶(Biochem.Biophys.Res.Commu.174；790-796(1991))和脯氨酰-肽鏈內(nèi)切酶(FEBS Lett.160131-134(1990))。這些候選β-淀粉樣蛋白形成性蛋白酶每一種的生理關(guān)系尚未被證實(shí)，例如通過抑制酶活性同時阻止β-淀粉樣蛋白形成。
已經(jīng)報道了多種在阿爾茨海默癥腦組織中被改變的蛋白酶。舉例來說，已經(jīng)表明α-1-胰蛋白酶樣免疫反應(yīng)性在阿爾茨海默癥腦中增加了(Biochem.Biophys.Res.Comm.Vol.193(2)579-84(1993))，已經(jīng)報道有三種不同的金屬-蛋白酶在阿爾茨海默癥腦中被提高了(J.Neurochem.Vol.58983-92(1992))，已經(jīng)觀察到了多重催化蛋白酶的改變(Neurosc.Res.Comm，Vol.8(3)185-90(1991))，已經(jīng)報道了異常組織蛋白酶D和B免疫反應(yīng)性(Neurosc.Lett.130195-98(1991)和Proc.Natl.Acad.Sci.873861-65(1990))，在阿爾茨海默癥大腦組織中已經(jīng)顯示出鈣活化中性蛋白酶(calpain)被降低了(Neurobio.of Aging，11425-31(1990))、被增加了(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902628-32(1993))或未被改變(J.Neurol.Sci.102220-34(1991))。
上面的內(nèi)容證明盡管在該領(lǐng)域中報道了大量工作，但是對于在治療阿爾茨海默癥方面有效的蛋白酶的類別方面或這些蛋白酶在與阿爾茨海默癥腦組織接觸時是否被改變方面還沒有達(dá)成普遍的一致。
本發(fā)明的一個目的在于提供用于抑制患有阿爾茨海默癡呆的個體中β-淀粉樣蛋白核心蛋白的產(chǎn)生和淀粉樣蛋白斑形成的化合物和藥物組合物以及方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的在于提供用于治療或改善阿爾茨海默癥發(fā)展的藥物組合物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明包括用于通過抑制或防止β-淀粉樣蛋白核心蛋白在病人中產(chǎn)生而治療疾病的化合物和這些化合物的用途。這些疾病的一些例子為阿爾茨海默型老年癡呆和老年唐氏綜合征。
通式IA中的化合物可用于治療阿爾茨海默型老年癡呆和老年唐氏綜合征。但是這些化合物中有一些以前已被公開用于其它用途。因此，還描述了通式IB，該通式是通式IA的下屬，相信通式IB描述了以前沒有公開的化合物。通式IB在Xa和X的定義方面不同于通式IA。
在通式IA中描述了該化合物或其水合物、立體異構(gòu)體、等排物或藥物可接受的鹽，它們可以用來治療阿爾茨海默型老年癡呆K-P4-P3-P2-NH-CH(R)-[C(＝O)]n-xIA(肽序列1)其中X是H、CHF2、CF3、CF2F3、CF2CH2NHC(＝O)R1、CHFCH2NHC(＝O)R1、CF2C(＝O)W、C(＝O)NHR1、B(OH)2或C(＝O)R1，其中W為NHCH2Si(C1-C6烷基)2(Y)、NHR1或R1；R是C1-C10烷基、芐基、CH2Si(C1-C6烷基)2(Y)、C1-C4亞烷基-O-R1、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、(CH2)m-萘基、或取代的芐基，該取代基為獨(dú)立地選自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基、芐氧基、羥基、NHC(＝NH)NH2、NR1H、NO2、-O-(CH2)m-芳基、NHC(＝O)R1或鹵素的1、2或3個取代基，其中m為1或2；Y是C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基、芳基或芳基烷基；除非X是B(OH)2，n是1，否則n是0；R1是H、C1-C6烷基、芳基或芳基烷基；
P2是一個鍵，或Leu、Ala、Met、Ile、Val、Nva、Nle、Phe、Asp、Ser、Pro、His、環(huán)戊基-甘氨酸、環(huán)己基甘氨酸、或叔-亮氨酸的殘基或-HN-CH[CH2Si(C1-C6烷基)2(X)]C(＝O)-；P3是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；P4是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；K是氫、脫氨基(desamino)、甲?；?、乙?；?、琥珀?；⒈郊柞；⑹宥⊙趸驶?、芐氧羰基、甲苯磺?；?、丹酰基、異戊?；⒓籽趸牾；?-金剛烷基磺?；?、1-金剛烷基乙酰基、2-羧基苯甲?；⒈交阴；?、叔丁基乙酰基、雙[(1-萘基)甲基]乙?；?、-A-Rz，其中A是 Rz是芳基或芳基烷基，其中該芳基含有6、10或12個碳，這些芳基可以被1-3個獨(dú)立選自氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羥基、含有1-6個碳原子的烷基、含有1-6個碳原子的烷氧基、羧基、烷基羰基氨基(其中該烷基含有1-6個碳)、5-四唑基和含有1-15個碳原子的?；被酋；?即?；被酋；突酋；被驶?的基團(tuán)適當(dāng)取代，條件是當(dāng)該?；被酋；幸粋€芳基時，該芳基可以進(jìn)一步地被選自氟、氯、溴、碘和硝基的基團(tuán)取代；和在功能上與它們等價的其它末端氨基保護(hù)基團(tuán)，或 其中Z是N或CH，以及D是下列通式的基團(tuán) (波浪線 表示與該分子的其它部分相連處，即不是與Z相連)并且其中R′是H或C1-C6烷基，條件是同時X不是H、R不是芐基、P2不是Val、P3不是一個鍵、P4不是一個鍵而且K不是芐氧羰基。這些化合物可以用于抑制或預(yù)防淀粉樣蛋白在患有阿爾茨海默癥和唐氏綜合征的大腦中發(fā)生沉積。
通式IB的化合物或其水合物、立體異構(gòu)體、等排物或藥物可接受的鹽(它們被認(rèn)為是以前沒有被公開的通式IA的化合物)Ka-P4a-P3a-P2a-NH-CH(Ra)-[C(＝O)]n-xa(肽序列2)IB其中Xa是H、CHF2、CF3、CF2F3、CF2CH2NHC(＝O)R1a、CHFCH2NHC(＝O)R1a、CF2C(＝O)Wa、C(＝O)NHR1a、B(OH)2或C(＝O)R1a，其中Wa為NHCH2Si(C1-C6烷基)2(Ya)、NHR1a或R1a；條件是當(dāng)Xa為H時，Ra是CH2Si(C1-C6烷基)2(C1-C6鏈烯基)、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、被苯甲?；鵑HC(＝O)R1a、NHC(＝NH)NH2、鹵素或羥基取代的芐基；
當(dāng)Xa為CF3、CHF2、C(＝O)NHR1a或CF2(＝O)NHR1a時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、或被羥基取代的芐基；當(dāng)Xa為CF2CH2NHC(＝O)R1a時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、(CH2)m-萘基或被羥基取代的芐基；當(dāng)Xa為CF2CH2NHC(＝O)CH2C(CH3)3或CF2NHC(＝O)H時，Ra不是芐基；當(dāng)Xa是CF2C(＝O)NH-芐基時，Ra不是芐基、叔丁基、CH2Si(CH3)3或(CH2)m-萘基；當(dāng)Xa為CF2C(＝O)NHR1時，Ra不是被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基、芐氧基或-O-(CH2)m-苯基取代的芐基；以及當(dāng)Xa為C(＝O)Ra時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、C1-C4亞烷基-O-C1-C10烷基或(CH2)m萘基；Ra是C1-C10烷基、芐基、CH2Si(C1-C6烷基)2(Ya)、C1-C4亞烷基-O-R1a、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、(CH2)m-萘基、或取代的芐基，該取代基為獨(dú)立地選自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基、芐氧基、羥基、NHC(＝NH)NH2、NR1aH、NO2、-O-(CH2)m-芳基、NHC(＝O)R1a或鹵素的1、2或3個取代基，其中m為1或2；Ya是C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基、芳基或芳基烷基；
除非Xa是B(OH)2，n是1，否則n是0；R1a是H、C1-C6烷基、芳基或芳基烷基；P2a是一個鍵、-HN-CH[CH2Si(C1-C6烷基)2(Ya)]C(＝O)-，或Leu、Ala、Met、Ile、Val、Nva、Nle、Phe、Asp、Ser、Pro、His、環(huán)戊基-甘氨酸、環(huán)己基甘氨酸、或叔亮氨酸的殘基；P3a是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；P4a是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；Ka是氫、脫氨基、甲?；?、乙酰基、琥珀酰基、苯甲?；?、叔丁氧基羰基、芐氧羰基、甲苯磺?；?、丹?；愇祯；⒓籽趸牾；?-金剛烷基磺?；?-金剛烷基乙?；?-羧基苯甲?；?、苯基乙?；?、叔丁基乙?；?、雙[(1-萘基)甲基]乙?；?Aa-Rza，其中Aa是 Rza是芳基或芳基烷基，其中該芳基含有6、10或12個碳，可以被1-3個獨(dú)立選自氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羥基、含有1-6個碳原子的烷基、含有1-6個碳原子的烷氧基、羧基、烷基羰基氨基(其中該烷基含有1-6個碳)、5-四唑基和含有1-15個碳原子的?；被酋；?即?；被酋；突酋；被驶?的基團(tuán)適當(dāng)取代，條件是當(dāng)該?；被酋；幸粋€芳基時，該芳基可以進(jìn)一步地被選自氟、氯、溴、碘和硝基的基團(tuán)取代；和在功能上與它們等價的其它末端氨基保護(hù)基團(tuán)，或 其中Za是N或CH，以及Da是下列通式的基團(tuán) 并且其中R′a是H或C1-C6烷基。
發(fā)明詳述C1-C6或C1-C10烷基是指直鏈、支鏈、環(huán)狀的烷基或其組合，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、仲戊基、環(huán)戊基、己基、異己基、環(huán)己基、環(huán)己基甲基和環(huán)戊基甲基。類似地，C1-C6亞烷基和C1-C4亞烷基分別是指1-6個和1-4個碳的二價基團(tuán)，它們可以是直鏈的或支鏈的。C1-C6鏈烯基具有1-6個碳，它們是具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈。所有的C1-C10基團(tuán)優(yōu)選地是C1-C6基團(tuán)，更優(yōu)選的為C1-C4基團(tuán)。所有的C1-C6基團(tuán)優(yōu)選地為C1-C4基團(tuán)，更優(yōu)選的為C1-C2基團(tuán)。
具有天冬氨酸或谷氨酸部分的通式I的化合物可以是游離的形式或鹽的形式，如酸加成鹽或陰離子鹽。這種化合物可以以本領(lǐng)域已知的方式彼此轉(zhuǎn)變成其鹽或堿形式。優(yōu)選的鹽是三氟乙酸鹽、鹽酸鹽、鈉、鉀或銨鹽，盡管該范圍是要包括所有已知的用于肽化學(xué)領(lǐng)域中的鹽。
術(shù)語“立體異構(gòu)體”是通常用于單個分子的所有異構(gòu)體的一個術(shù)語，這些分子僅僅是它們的原子在空間的取向不一樣。它包括鏡像異構(gòu)體(對映體)、幾何(順式/反式)異構(gòu)體和具有一個以上手性中心的化合物的異構(gòu)體(它們彼此不是鏡像(非對映體))。對于氨基酸來說，可以采用IUPAC-IUB JointCommission on Biochemical Nomenclature.Eur.J.Biochem.1389-37(1984)所述的D/L或R/S命名法。除了甘氨酸以外的天然氨基酸都含有一個手性碳原子。除非另有說明，優(yōu)選的化合物是L-構(gòu)型的旋光活性氨基酸；但是申請人認(rèn)為通式I化合物的氨基酸可以具有D-或L-構(gòu)型，或者可以是D-和L-異構(gòu)體的混合物，包括外消旋混合物。用于α-氨基酸的縮寫列于表I中。
用于本文時，“阿爾茨海默癥”還指阿爾茨海默型老年性癡呆。
“水合物”是指本發(fā)明的化合物的酮可以作為一種二-羥基亞甲基基團(tuán)存在。本發(fā)明的化合物在正常的生理條件下可以認(rèn)為是水合形式的。
“脫氨基基團(tuán)”是指其上沒有氨基相連的α-氨基酸。優(yōu)選的脫氨基基團(tuán)由沒有其末端氨基基團(tuán)的(α-氨基酸Val、PheAla、Asp、Ser和His表示。
“等排物”是指位于相連的氨基酸(-C(O)NH-)之間的正常的肽鍵是-CH2NH-(還原的)、C(O)N(CH3)(N-甲基酰胺)、-COCH2-(酮)、-CH2(OH)CH2-(羥基)、-CH(NH2)CH2-(氨基)、-CH2CH2-(烴)的變化形式，或者倒置的(-HN(C＝O)-)。用于本文中的等排物還指位于氨基酸和保護(hù)基團(tuán)K的羰基部分之間的C(＝O)NH鍵的倒置。舉例來說，例21具有兩種等排基團(tuán)一種等排物是位于保護(hù)基團(tuán)(K＝[C6H5-(CH2)2-C(＝O)]-和纈氨酸殘基的氨基部分之間，第二種等排物位于纈氨酸殘基和苯丙氨酸醛殘基之間。優(yōu)選地，該等排物僅僅適用于K-P4-P3-P2-部分或其一部分上。最優(yōu)選的是，本發(fā)明的化合物不是等排物形式。
“芳基”是指含有一個或多個芳香環(huán)的單環(huán)或雙環(huán)碳環(huán)系統(tǒng)，包括但不限于苯基、萘基、四氫萘基、2，3-二氫化茚基等等。芳基基團(tuán)可以被一個、二個或三個獨(dú)立選自C1-C6烷基、鹵代烷基、烷氧基、硫代烷氧基、氨基烷基氨基、二烷基氨基、羥基、鹵素、巰基、硝基、甲醛、羧基、烷氧羰基和氨基甲?；娜〈〈蛭幢蝗〈Ｉ鲜鐾榛屯檠趸衔锖?-6個碳原子。類似地，“芳烷基”是指與上述芳基相連的直鏈或支鏈的C1-C6亞烷基，如芐基。
“取代的芐基”是指芐基基團(tuán)在合適的碳原子上，即間、鄰和/或?qū)ξ辉谄浔交糠稚媳蝗〈?，取代的芐基具有1-3個取代基。優(yōu)選的是僅具有一個取代基，更優(yōu)選的是該取代基在對位上。
每一個α-氨基酸具有一個特殊的“R-基團(tuán)”，該R-基團(tuán)是與該α-氨基酸的α-碳原子相連的側(cè)鏈或殘基。舉例來說，甘氨酸的R-基團(tuán)側(cè)鏈為氫，對于丙氨酸來說，它是甲基，對于纈氨酸來說，它是異丙基。該α-氨基酸的特定的R-基團(tuán)或側(cè)鏈可以參見A.L.Lehninger關(guān)于生物化學(xué)的文章。
“(CH2)m-萘基”是在其1-或2-位上與萘基相連的直鏈或支鏈亞烷基。
除了甘氨酸以外的天然氨基酸都含有一個手性碳原子。除非另有說明，優(yōu)選的化合物是L-構(gòu)型的旋光活性氨基酸；但是申請人認(rèn)為通式I化合物的氨基酸可以是D-或L-構(gòu)型，也可以是D-和L-異構(gòu)體的混合物，包括外消旋混合物。用于α-氨基酸的縮寫列于表I中。
表I氨基酸 符號丙氨酸 Ala甘氨酸 Gly異亮氨酸Ile亮氨酸 Leu賴氨酸 Lys絲氨酸 Ser精氨酸 Arg蘇氨酸 Thr天冬氨酸Asn纈氨酸 Val正纈氨酸Nva正亮氨酸Nle谷氨酸 Glu半胱氨酸Cys組氨酸 His
值得注意的是，盡管通式IB其所有變量均具有一個“a”上標(biāo)，但是通式IA和IB的唯一的區(qū)別在于限制性條件中的X和Xa。下列方案是針對沒有“a”上標(biāo)的變體的，但是用來描述通式IA和IB兩者的合成。
一般說來，通式I的化合物可以采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)來制備并且如方案A中所述。
方案A (肽序列3)方案A提供了用于制備通式I的化合物的一種常規(guī)合成方案。
P2、P3和K-P4基團(tuán)可以連結(jié)到結(jié)構(gòu)(1)的氨基酸衍生物的游離氨基基團(tuán)上。該P(yáng)2、P3和K-P4可以通過公知的肽偶連技術(shù)而連接到未保護(hù)的游離氨基化合物上。
通常，可以通過將C-末端殘基的α-胺解除保護(hù)并使用上述方法通過一個肽鍵與后面的適當(dāng)保護(hù)的氨基酸相連而將肽延長。重復(fù)這種脫保護(hù)和偶連過程直到獲得所需的序列。這種偶連可以如方案A中所說以分步形式用組成氨基酸來進(jìn)行，也可以通過將片斷(兩種-數(shù)種氨基酸)縮合或?qū)⑸鲜鰞煞N方法結(jié)合起來進(jìn)行，也可以按照最初由Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，1963，85，2149-2154所述的方法，通過固相肽合成技術(shù)來進(jìn)行，上述文獻(xiàn)作為參考而引入本文。當(dāng)采用固相合成方法時，將C-端羧酸連接到一種不溶的載體(通常是聚苯乙烯)上。這些不溶的載體含有一個基團(tuán)，該基團(tuán)可以和醛基團(tuán)反應(yīng)形成一種對肽延長條件來說是穩(wěn)定的但在其后又很容易裂解的鍵。其例子為氯-或溴甲基樹脂、羥基甲基樹脂和氨基甲基樹脂。具有已經(jīng)引入的所需C-端氨基酸的這些樹脂當(dāng)中有許多可以購買到。對于其中X為H的通式I的化合物來說，還可以在方案A的反應(yīng)中采用一種連接化合物，從而將樹脂與其中X為H的結(jié)構(gòu)(1)的氨基酸衍生物的醛官能團(tuán)相連。合適的連接化合物的例子為 另外，本發(fā)明的化合物還可以利用自動肽合成設(shè)備來合成。除了上述內(nèi)容以外，肽合成技術(shù)還描述于Stewart和Young，“Solid Phasc Peptide Synthesis”，2nd ed.，Pierce ChemicalCo.，Rockford，IL(1984)；Gross，Meienhofer，Udenfriend，Eds.，“The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology”，Vol 1，2，3，5和9，Academic Press，New York，1980-1987；Bodanszky，“Peptide ChemistryA Practical Textbook”，Springer-Verlag，New York(1988)；和Bodanszky等人，“The Practiceof Peptide Synthesis”Springer-Verlag，New York(1984)，上述文件作為參考而引入本文。
兩種氨基酸，一種氨基酸和一種肽，或兩種肽片段之間的偶連可以采用標(biāo)準(zhǔn)偶連方法來完成，這些方法如疊氮化物法、混合碳酸酐(氯甲酸異丁酯)法、碳化二亞胺(二環(huán)己基碳化二亞胺、二異丙基碳化二亞胺，或可溶于水的碳化二亞胺)法、活性酯(對硝基苯酯、N-羥基琥珀酰亞氨基酯)法、Woodward試劑K法、羰基二咪唑法、磷試劑如BOP-Cl法，或氧化還原法。這些方法中有一些方法(特別是碳化二亞胺法)可以通過加入1-羥基苯并三唑而提高。這些偶連反應(yīng)可以在溶液(液相)或固相中進(jìn)行。
組成性氨基酸的官能團(tuán)在偶連反應(yīng)必須保護(hù)起來，以避免形成不需要的鍵。可以使用的保護(hù)基團(tuán)列于Greene，“Protecting Groups in Organic Chemistry”，John Wiley&Sons，New York(1981)和“The PeptidesAnalysis，Synthesis，Biology”，Vol.3，Academic Press，New York(1 981)中，上述文獻(xiàn)作為參考而引入本文。
該C-末端殘基的α)-羧基通常利用一種可以裂解以產(chǎn)生羧酸的酯而保護(hù)起來?？梢允褂玫谋Ｗo(hù)基團(tuán)包括1)烷基酯，如甲基和叔丁基，2)芳基酯，如芐基和取代的芐基，或3)可以通過弱堿處理或弱還原手段裂解的酯，如三氯乙酯和苯甲酰甲酯。
每一種氨基酸的α-氨基基團(tuán)都必須保護(hù)起來。可以采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何一種保護(hù)基團(tuán)。其例子包括1)酰基類，如甲?；?、三氟乙?；⑧彵蕉柞；蛯妆交酋；?；2)芳香族氨基甲酸酯類，如芐氧羰基(Cbz或Z)和取代的芐氧基羰基，1-(對-聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧基-羰基和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；3)脂肪族氨基甲酸酯類，如叔丁氧羰基(Boc)，乙氧羰基，二異丙基甲氧羰基和烯丙氧羰基；4)環(huán)烷基氨基甲酸酯類，如環(huán)戊氧基羰基和金剛烷氧基羰基；5)烷基類，如三苯甲基和芐基；6)三烷基甲硅烷，如三甲基甲硅烷；和7)含有巰基類，如苯基硫代羰基和二硫代琥珀酰基。優(yōu)選的α-氨基保護(hù)基團(tuán)是Boc或Fmoc，優(yōu)選的為Fmoc。許多用于肽合成的被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸衍生物可以從市場上買到。
該α-氨基保護(hù)基團(tuán)在與后面的氨基酸偶連之前裂解。當(dāng)采用Boc基團(tuán)時，所選擇的方法是三氟乙酸(純凈的或在二氯甲烷中)或在二噁烷中的HCl。隨后在偶連之前或當(dāng)時用堿性溶液，如水緩沖液，或在二氯甲烷或二甲基甲酰胺中的叔胺將所產(chǎn)生的銨鹽中和。當(dāng)采用Fmoc基團(tuán)時，所選擇的試劑為在二甲基甲酰胺中的哌啶或取代的哌啶，但是也可以采用任何一種仲胺或堿性水溶液。脫保護(hù)是在0℃至室溫的溫度下進(jìn)行的。
任何一個帶有側(cè)鏈官能團(tuán)的氨基酸在肽的制備過程中都必須用任何一種上述基團(tuán)保護(hù)起來。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會認(rèn)識到選擇和使用適用于這些側(cè)鏈官能團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)將取決于該肽中的氨基酸和其它保護(hù)基團(tuán)的存在。這些保護(hù)基團(tuán)選擇的關(guān)鍵在于在該α-氨基基團(tuán)的脫保護(hù)和偶連過程中不能被除去。
舉例來說，當(dāng)采用Boc作為α-氨基保護(hù)基團(tuán)時，下列側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是適用的對甲苯磺?；?tosyl)可用來保護(hù)氨基酸如Lys和Arg的氨基側(cè)鏈；對甲基芐基、乙酰氨基甲基、芐基(Bzl)或叔丁基磺酰基可用來保護(hù)氨基酸如Cys的含硫側(cè)鏈；芐基(Bzl)醚可用來保護(hù)氨基酸如Ser或Thr的含羥基側(cè)鏈。
當(dāng)選擇Fmoc用于α-氨保護(hù)時，一般以叔丁基為基礎(chǔ)的保護(hù)基團(tuán)是合適的。舉例來說，對賴氨酸來說可以采用Boc，對絲氨酸和蘇氨酸來說可以采用叔丁基醚，對谷氨酸來說可以采用叔丁基酯。
一旦該肽的延長完成了，要將所有的保護(hù)基團(tuán)除去。當(dāng)采用液相合成時，可以采用在選擇保護(hù)基團(tuán)時所說的任何一種方式除去保護(hù)基團(tuán)。這些方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是已知的。
當(dāng)采用固相合成時，一般在保護(hù)基團(tuán)除去的同時，將肽與樹脂分離。當(dāng)在該合成中采用Boc保護(hù)方案時，優(yōu)選的用于將肽與樹脂分開的方法是在0℃下用含有添加劑如二甲硫、苯甲醚、硫代苯甲醚或?qū)追拥臒o水HF進(jìn)行處理。還可以利用其它酸性試劑如三氟甲磺酸/三氟乙酸混合物來完成肽的裂解。如果采用Fmoc保護(hù)方案，則采用前面所說的試劑使N-末端Fmoc基團(tuán)裂解。其它的保護(hù)基團(tuán)和肽可以采用三氟乙酸和各種添加劑如苯甲醚等等的溶液來與該樹脂分離。
對于其中X為H的通式I的那些化合物來說，通式I的肽化合物可以用含水酸/甲醛來與連接化合物和樹脂分開。
或者，通式I的化合物可以采用本領(lǐng)域已知的并且如方案B中所說的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)來制備。
方案B 方案B提供了另一種制備通式I化合物的一般合成方案。
P2、P3和K-P4基團(tuán)可以如前面方案A所述連接到結(jié)構(gòu)(2)的氨基醇衍生物的游離氨基基團(tuán)上，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)(3)的肽醇。
然后，通過本領(lǐng)域已知的和本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解的技術(shù)和方法，如利用草酰氯和二甲基亞砜的Swern氧化法，將結(jié)構(gòu)(3)的肽醇的醇官能團(tuán)氧化，從而產(chǎn)生通式I的化合物。
用于方案A和B中的起始物料對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是很容易獲得的。舉例來說，氨基酸P2、P3和其中K為氫的K-P4可以從市場上買到，結(jié)構(gòu)(L1)的連接化合物描述于J.Am.Chem.Soc.，114，3157-59(1992)中。此外，在歐洲專利申請0363284(1990年4月11日)中描述了取代的氨基酸K-P4，其中K是乙酰基、琥珀?；⒈郊柞；⑹宥⊙豸驶?、芐氧羰基、甲苯磺?；?、丹?；?、異戊酰基、甲氧基琥珀酰基、1-金剛烷基磺?；?、1-金剛烷基乙?；?、2-羧基苯甲?；⒈交阴；?、叔丁基乙酰基、雙[(1-萘基)甲基]乙?；?A-Rz，其中A是 Rz是含有6、10或12個碳的芳基，這些芳基可以被1-3個獨(dú)立選自氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羥基、含有1-6個碳原子的烷基、含有1-6個碳原子的烷氧基、羧基、烷基羰基氨基(其中該烷基含有1-6個碳)、5-四唑基和含有1-15個碳原子的?；被酋；?即?；被酋；突酋；被驶?的基團(tuán)適當(dāng)取代，條件是當(dāng)該酰基氨磺?；幸粋€芳基時，該芳基可以進(jìn)一步地被選自氟、氯、溴、碘和硝基的基團(tuán)取代；和在功能上與它們等價的其它末端氨基保護(hù)基團(tuán)的一個部分取代。
通式(1)的起始氨基化合物對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是很容易獲得的。舉例來說，其中
X為H和R為芐基的一些被保護(hù)的通式IA的氨基化合物描述于歐洲專利申請0363284和WO84/00365中；X為H和R為CH2Si(CH3)3的一些被保護(hù)的通式IA的氨基化合物描述于歐洲專利申請0363284中并且在本文中描述于實(shí)施例12中。如在例13和14中所說，在甲硅烷基上的取代基可以不同；X為H和R為取代的芐基的一些被保護(hù)的通式IA的氨基化合物描述于專利申請PCT/US91/09741中；X為CF3和CHF2，R為芐基或被NHC(NH)NH2取代的芐基的一些被保護(hù)的通式IA的氨基化合物描述于歐洲專利申請0195212(
公開日為1986年9月24日，發(fā)明人為Michel Jung等人)中；X為CF2CH2NHC(＝O)R1和R為芐基的一些被保護(hù)的通式IA的氨基化合物作為中間產(chǎn)物描述于歐洲專利申請OPI0275101(1988年1月14日提出，發(fā)明人為Daniel Schirlin等人)中；CFHCH2NHC(＝O)R1的單氟衍生物可以利用溴-氟乙酸乙酯代替溴-二氟乙酸乙酯通過相似的方法合成；X為CF2C(O)W，其中W為NHCH2Si(烷基)3和R為芐基、CH2Si(CH3)3或取代的芐基的一些被保護(hù)的通式IA的氨基化合物描述于專利申請PCT/US91/09741(發(fā)明人為DanielSchirlin等人，1991年12月20日提出)中，并且當(dāng)R為(CH2)m-萘基時，可以采用本領(lǐng)域已知的起始物料采用類似的方法制備；
X為CF2C(O)W，其中W為NHR1或R1和R為芐基、CH2Si(CH3)3或取代的芐基的一些被保護(hù)的通式IA的氨基化合物描述于專利申請PCT/US91/09741(發(fā)明人為DanielSchirlin等人，1991年12月20日提出)中，并且當(dāng)R為(CH2)m-萘基時，可以采用本領(lǐng)域已知的起始物料采用類似的方法制備；X為C(O)R1和R為芐基、CH2Si(CH3)3、(CH2)m-萘基或取代的芐基的一些被保護(hù)的通式IA的氨基化合物描述于美國專利4820691(1989年4月11日提出)中；以及用于其中X為H的通式I的化合物的合成中的連接化合物反式-4-(氨基甲基環(huán)己烷)甲酸芐酯如J.Am.Chem.Soc.，1992，114，3156-3157中所述由相應(yīng)的酸制備。所有上述引用文獻(xiàn)作為參考而引入本文。
此外，其它用于方案A和B中的起始物料可以通過下列已知的和為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員理解的合成方法制備。
利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)可以制備被取代的結(jié)構(gòu)1的氨基酸K-P4，其中K為 其中Z為N或CH，以及D為下列通式的基團(tuán) 其中R′為氫或C1-C6烷基。用于制備其中K為 其中D為-C(＝O)-的取代的氨基酸K-P4的方法描述于方案B中，其中P4和Z如前面所定義或是這些基團(tuán)的功能等同物。
方案C 更進(jìn)一步地說，其中K為 其中D為-C(＝O)-的氨基酸K-P4是通過在1-4摩爾當(dāng)量的一種合適的可以起鹵化氫受體作用的胺的存在下將其中K為氫的氨基酸K-P4與結(jié)構(gòu)(4)的酰鹵偶連而制得。適用作鹵化氫受體的胺是有機(jī)叔胺，例如三-(低級烷基)胺如三乙胺，或芳香胺如甲基吡啶、可力丁和吡啶。當(dāng)采用吡啶、甲基吡啶或可力丁時，它們可以以高度過量使用，因此還可以起到反應(yīng)溶劑的作用。特別適用于該反應(yīng)的是N-甲基嗎啉(“NMM”)。該偶連反應(yīng)可以通過將過量的，如1-5倍，優(yōu)選地約4倍摩爾過量的胺然后是結(jié)構(gòu)(4)的酰氯加入到其中K為氫的氨基酸K-P4的溶液中而完成。該溶劑可以是任何一種合適的溶劑，例如石油醚，氯代烴如四氯化碳、二氯乙烷、二氯甲烷或氯仿；氯代芳烴，如1，2，4-三氯苯，或鄰二氯苯；二硫化碳；一種醚溶劑，如乙醚、四氫呋喃、或1，4-二噁烷，或一種芳香溶劑，如苯、甲苯或二甲苯。對于該偶連反應(yīng)來說，二氯甲烷是優(yōu)選的溶劑。根據(jù)反應(yīng)物、溶劑、該濃度和其它因素，例如可以在約0℃-60℃的溫度，方便地是在室溫即25℃下，使該反應(yīng)進(jìn)行約15分鐘-約6小時。其中K為 其中D為-C(＝O)-的氨基酸K-P4可以通過任何一種合適的技術(shù)，如通過在硅膠上層析而從該反應(yīng)混合物中分離出來。
類似地，僅僅通過用合適的中間體 其中D不是-C(＝O)-和E為Cl或OH(相應(yīng)的酸、酰氯或磺酰氯)，取代方案C中結(jié)構(gòu)(5)的化合物，就可以制備得到其中K為 其中D不是-C(＝O)-的被取代的氨基酸K-P4。
結(jié)構(gòu)(4)的酰氯和合適的具有下列通式的中間體 其中D不是-C(＝O)-和E為Cl或OH(相應(yīng)的酸、酰氯或磺酰氯)，可以從市場上買到，也可以很容易地通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知并理解的技術(shù)和方法來制得。
舉例來說，具有下列通式的合適中間體 可以如方案D中所述而制得，其中所有的取代基如前所定義。
方案D 方案D提供了一種用于制備具有下列通式的合適中間體的一般合成方法 其中Z如前面所定義。
在步驟a中，合適的2，5-吡啶二羧酸，2-甲基酯(6)(Nippon Kagaku Zasshi，1967，88，563)的羧酸官能團(tuán)利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知和理解的技術(shù)和方法，例如使用亞硫酰氯，將其轉(zhuǎn)變成其酰氯，結(jié)果產(chǎn)生相應(yīng)的2，5-吡啶二羧酸，2-甲基酯，5-酰氯(7)。
在步驟b中，利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知和理解的技術(shù)和方法，將2，5-吡啶二羧酸，2-甲基酯，5-酰氯(7)用嗎啉(8)酰胺化，結(jié)果產(chǎn)生相應(yīng)的2，5-吡啶二羧酸，2-甲基酯，3-嗎啉代酰胺(9)。
在步驟c中，2，5-吡啶二羧酸，2-甲基酯，3-嗎啉代酰胺(9)的甲基酯官能團(tuán)利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知和理解的技術(shù)和方法，例如利用甲醇中的氫氧化鋰，使其水解，從而產(chǎn)生2，5-吡啶二羧酸，5-嗎啉代酰胺(10)。
此外，具有下列通式的合適的中間體 可以如方案E中所說而制得，其中所有的取代基均如前面所定義。
方案E
方案E提供了一種用于制備具有下列通式的合適中間體的一般合成方法 其中Z如前面所定義。
在步驟a中，2，5-吡啶二羧酸，2-甲基酯(6)(NipponKagaku Zasshi，1967，88，563)的游離羧酸官能團(tuán)利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知和理解的技術(shù)和方法，例如使用二環(huán)己基碳化二亞胺(Synthesis，1979，570)的叔丁基醇加成物，使其轉(zhuǎn)變成其叔丁基酯，結(jié)果產(chǎn)生相應(yīng)的2，5-吡啶二羧酸2-甲基酯5-叔丁基酯(11)。
舉例來說，可以將2，5-吡啶二羧酸2-甲基酯(6)在一種合適的有機(jī)溶劑如二氯甲烷中與過量摩爾數(shù)的二環(huán)基己碳化二亞胺的叔丁基加成物起反應(yīng)。該反應(yīng)典型地可以在0℃至室溫的溫度下進(jìn)行并且持續(xù)2-24小時。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)提取方法，將2，5-吡啶二羧酸2-甲基酯5-叔丁基酯(11)從反應(yīng)區(qū)中分離出來，并且可以通過結(jié)晶而純化。
在步驟b中，將2，5-吡啶二羧酸2-甲基酯5-叔丁基酯(11)用嗎啉(8)酰胺化，結(jié)果產(chǎn)生相應(yīng)的2，5-吡啶二羧酸2-嗎啉代酰胺5-叔丁基酯(12)。
舉例來說，將2，5-吡啶二羧酸2-甲基酯5-叔丁基酯(11)在一種合適的有機(jī)溶劑如四氫呋喃中與過量摩爾量的嗎啉接觸。典型地，將該反應(yīng)在從室溫到回流的溫度下進(jìn)行并持續(xù)5小時至3天。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)提取方法，將2，5-吡啶二羧酸2-嗎啉代酰胺5-叔丁基酯(11)從反應(yīng)區(qū)中分離出來，并且可以通過結(jié)晶而純化。
在步驟c中，2，5-吡啶二羧酸2-嗎啉代酰胺5-叔丁基酯(12)的叔丁基酯官能團(tuán)例如利用硝基甲烷中的HCl使其水解，從而產(chǎn)生2，5-吡啶二羧酸2-嗎啉代酰胺(13)。
一般說來，通式IA可以利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)反應(yīng)而制得。舉例來說，在方案F中描述了其中X為H的通式IA的化合物的合成。除非另有說明，所有的取代基均如前面所定義。試劑和起始物料對于熟悉本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是很容易獲得的。
方案F 當(dāng)X為H時的通式IA
由化合物(14)所定義的所需要的起始物料可以從市場上買到，也可以通過采用已知的現(xiàn)有技術(shù)而獲得。術(shù)語“Pg”是指如前面所完整定義的一種合適的保護(hù)基團(tuán)。這類化合物的例子為被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸如絲氨酸、高絲氨酸、蘇氨酸、別蘇氨酸等等。此外，利用Baldwin，J.E.等人，Tetrahedron，44，2633(1988)中所述的方法，可以將L-賴氨酸轉(zhuǎn)變成2(S)-2-氨基-6-羥基己酸，上述文獻(xiàn)被引入本文。
在方案F步驟A中，保護(hù)的氨基酸(14)被轉(zhuǎn)化成酰胺(15)。該酰胺化反應(yīng)可以采用一種與利用保護(hù)的氨基酸(14)和N-烷基O-烷基羥基胺在兩種氨基酸之間的反應(yīng)一樣的偶連反應(yīng)而完成，該標(biāo)準(zhǔn)的偶連反應(yīng)可以采用前面對在兩種氨基酸之間的偶連所說的標(biāo)準(zhǔn)偶連方法來實(shí)現(xiàn)，從而產(chǎn)生酰胺(15)。
在方案F步驟B中，在本領(lǐng)域已知的如T.H.Green，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley andSons，1981，Chapter 7中所說的條件下將酰胺(15)脫去保護(hù)，結(jié)果產(chǎn)生脫去保護(hù)的酰胺(16)。舉例來說，當(dāng)“Pg”是叔丁氧羰基(Boc)時，可以將酰胺(15)溶解于一種合適的溶劑，如用過量氯化氫(氣體)處理過的乙酸乙酯中，并且在約0℃-30℃的溫度下攪拌約30分鐘-4小時。然后在真空下除去溶劑，結(jié)果產(chǎn)生HCl鹽形式的脫去保護(hù)的酰胺(16)。
在方案F步驟C中，通過利用前面在方案A中所說的方法將后面的適當(dāng)保護(hù)的氨基酸經(jīng)肽鍵偶連，或者通過將片段縮合，或者通過將兩種方法結(jié)合起來而將該脫去保護(hù)的酰胺(16)延長，結(jié)果產(chǎn)生延長的肽(17)。
在方案F步驟D中，將延長的肽(17)還原，結(jié)果產(chǎn)生所需的通式IA的醛。
舉例來說，可以將延長的肽(17)溶解于一種合適的有機(jī)溶劑如四氫呋喃中，并且在氮?dú)鈿夥障吕鋮s至0℃。然后向該溶液中加入過量的一種合適的還原劑。合適的還原劑的例子為氫化鋰鋁、氫化二異丁基鋁、氫化三叔丁氧基鋁、氫化鈉鋁、氫化二氨基鋁等等。優(yōu)選的還原劑是氫化鋰鋁。該反應(yīng)在約0℃-20℃的溫度下攪拌20分鐘-2小時。然后終止該反應(yīng)，并通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)將產(chǎn)物分離出來。舉例來說，可以用10％硫酸氫鈉然后加入10％鹽酸終止該反應(yīng)。用一種合適的有機(jī)溶劑如乙酸乙酯將含水的混合物萃取。然后用水洗滌該有機(jī)萃取物，在硫酸鎂上干燥，過濾并在真空下濃縮，結(jié)果產(chǎn)生通式IA的醛。
根據(jù)方案F中所說的方法可以制得其中X為C(＝O)NHR1的通式IA的化合物。除非另有說明，所有的取代基均如前面所定義。試劑和起始物料對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是很容易獲得的。
方案G 當(dāng)X為C(O)NHR1時的通式IC
在方案G，步驟A中，通過用一種合適的堿進(jìn)行處理，將α-酮酯(18)選擇性地水解成α-酮酸(19)。[α-酮酯(18)可以按照Angelastro，M.R.等人，J.Med.Chem.，33.11(1990)中所述的方法而很容易地制得。]舉例來說，可以將適當(dāng)取代的α-酮酯(18)溶解于一種合適的溶劑混合物如甲醇∶水(50∶50)中，并且用等當(dāng)量的合適的堿如氫氧化鋰進(jìn)行處理。將該反應(yīng)在約0℃-30℃的溫度下攪拌約1-10小時。然后通過本領(lǐng)域已知的提取技術(shù)將α-酮酸(19)分離。舉例來說，用一種合適的有機(jī)溶劑如乙酸乙酯和等體積的水將該反應(yīng)烯釋。分離各層。水層用稀鹽酸酸化并用一種合適的有機(jī)溶劑，如乙酸乙酯萃取。將合在一起的有機(jī)萃取物在無水硫酸鎂上干燥，過濾，并在真空下濃縮，結(jié)果產(chǎn)生α-酮酸(19)。
在方案G步驟B中，在本領(lǐng)域已知的條件下，將該α-酮酸(19)與伯胺(20)偶連，結(jié)果產(chǎn)生所需的α-酮酰胺(21)。
舉例來說，將適當(dāng)取代的α-酮酸(19)溶解于一種合適的有機(jī)溶劑如二氯甲烷中。然后用1當(dāng)量的1-羥基苯并三唑、1當(dāng)量的二異丙基乙胺和1當(dāng)量的伯胺(20)對該溶液進(jìn)行處理。加入1當(dāng)量的二環(huán)己基碳化二亞胺，將該反應(yīng)在約0℃-25℃的溫度下攪拌約2-10小時。然后利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將產(chǎn)物分離。舉例來說，用乙酸乙酯稀釋該反應(yīng)物，用0.5N冷鹽酸，飽和的碳酸氫鈉進(jìn)行沖洗，在無水硫酸鎂上干燥，過濾并在真空下濃縮，結(jié)果產(chǎn)生α-酮酰胺(21)。
在方案G步驟C中，將α-酮酰胺(21)在本領(lǐng)域已知的如T.H.Green，“Protective Groups in Organic Synthesis”，JohnWiley and Sons，1981，Chapter 7中所說的條件下脫去保護(hù)，結(jié)果產(chǎn)生脫去保護(hù)的α-酮酰胺(22)。舉例來說，當(dāng)“Pg”是叔丁氧羰基(Boc)時，可以將α-酮酰胺(21)溶解于一種合適的溶劑如用過量氯化氫(氣體)處理過的乙酸乙酯中，并且在約0℃-30℃下攪拌約30分鐘-4小時。然后在真空下除去該溶劑，結(jié)果產(chǎn)生HCl鹽形式的脫去保護(hù)的α-酮酰胺(22)。
然后將脫去保護(hù)的α-酮酰胺(22)放在方案A中所說的反應(yīng)條件下，結(jié)果產(chǎn)生其中X為C(＝O)NHR1的通式IA的化合物。
在其中X為B(OH)2的通式IA中，可以采用下列總方案(其中R不是芐基的其它起始物料可以如本領(lǐng)域已知的那樣使用)
方案H 其中X＝B(OH)2的通式IC
在方案H中，利用一種保護(hù)基團(tuán)(Pg1)(它可以是環(huán)狀的，如Pg1＝蒎烷)或兩種不同的保護(hù)基團(tuán)將硼酸衍生物(23)保護(hù)起來。
在步驟A中，發(fā)生了同系化反應(yīng)(homologation)，并且引入了一個離去基團(tuán)(Lg)如氯。然后在步驟B中該硼酸酯(24)被胺化。優(yōu)選地，胺(25)利用任意兩個保護(hù)基團(tuán)(Pg2和Pg3)保護(hù)起來。舉例來說，參見J.Am.Chem.Soc.，1981，1035241-5242中所述。在步驟C中，可以如前面所述或如本領(lǐng)域已知的那樣將該胺脫去保護(hù)。在步驟C中的偶連如前面在方案A中所述的那樣發(fā)生。然后通過已知的手段可以將該偶連化合物(27)的硼酸酯部分脫去保護(hù)(參見為前面反應(yīng)舉例的J.Am.Chem.Soc.1981，1035241-5242)。
為了引入下列種類的取代基NR1H，方案I中的起始物料應(yīng)該是如下所說的保護(hù)形式 當(dāng)芐基(R側(cè)鏈)上的取代基是NO2時，下列方案是優(yōu)選的方案I
在步驟a中，在二環(huán)己基碳化二亞胺和4-二甲基氨基吡啶的存在下，利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知并理解的技術(shù)和方法，如用甲醇，將-NO2苯丙氨酸衍生物轉(zhuǎn)變成一種酯。
在步驟b中，酯(29)在本領(lǐng)域已知的如T.H.Green，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley andSons，1981，Chapter 7中所說的條件下脫去保護(hù)，結(jié)果產(chǎn)生脫去保護(hù)的酯(30)。
在步驟c中，通過利用前面在方案I中所說的方法將后面的適當(dāng)保護(hù)的氨基酸經(jīng)肽鍵偶連，或者通過將片段縮合，或者通過將兩種方法結(jié)合起來而將該脫去保護(hù)的酯(30)延長，結(jié)果產(chǎn)生延長的肽(31)。
在步驟d中，利用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知并理解的技術(shù)和方法，如使用氫化二異丁基鋁(Dibal)，在甲苯/乙醚混合物中，在低溫(-78℃--50℃)下，將延長的肽(31)還原成醛(32)。
其中X為CHF2或CF3的通式IA的化合物可以根據(jù)方案J而制得。
對于其中X為-CF2H或-CF3的那些化合物來說，用于標(biāo)準(zhǔn)肽偶連技術(shù)應(yīng)用過程中的中間體是通式IIa-b的化合物 其中X′為-CF3或-CF2H，R如前面在通式IA所定義。類似地，在上述方案中的代號P1、P2、P3、P4和K如通式IA所定義，只是其下屬意義或其他變化(如在X中)使用加撇符號表示并對這些改變的符號有具體說明。這些化合物的制備和應(yīng)用在方案J中示出。
方案J 式中R6為烷基、苯基或其它等價，X′為-CF2H或-CF3。HA′表示一種酸。
通常，取代的吖內(nèi)酯(34)的形成是通過標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件由N-保護(hù)的氨基酸(33)進(jìn)行的，其中，將該氨基酸衍生物(33)在一種酸酐的存在下加熱。由此產(chǎn)生的吖內(nèi)酯(34)與二或三氟乙酸酐或酰鹵起反應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生一種氟化中間體，該中間體(分離或未分離)用無水草酸進(jìn)行處理，從而產(chǎn)生N-保護(hù)的氟化酮(35)，該酮隨后被化學(xué)還原成其醇酰胺(36)。在標(biāo)準(zhǔn)的酸性條件下將該酰胺(36)裂解，從而產(chǎn)生其酰胺酸鹽(例如其鹽酸鹽(37))。中和之后，可以利用標(biāo)準(zhǔn)的肽化學(xué)技術(shù)將醇(IIa)偶連到KP4P3P2OH上，從而產(chǎn)生進(jìn)行Swern氧化的化合物(38)，由此獲得所需的產(chǎn)物(39a)和(39b)(分別是酮或水合物)。另外，也可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的肽化學(xué)技術(shù)將醇(IIa)氧化成與KP4P3P2OH偶連的酮(IIb)。當(dāng)采用這種替代方法時，首先用Boc保護(hù)基團(tuán)將該氨基部分保護(hù)起來，通過Swern氧化工藝將OH官能團(tuán)氧化成其酮，并且隨后將Boc保護(hù)基團(tuán)除去，所得到的化合物(IIb)偶連到KP4P3P2OH上。
方案J也適用于制備其中X為CF2CF3的通式IA的化合物，取代的吖內(nèi)酯(34)在五氟丙酸酸酐或酰鹵的存在下被加熱。
在方案K中描述了另一種制備其中X為CF2CF3的通式IA的化合物的途徑。
方案K 在步驟a中，保護(hù)的氨基酸(40)被轉(zhuǎn)化成氧肟酸酯(41)。該酰胺化反應(yīng)可以利用保護(hù)的氨基酸(40)和N-烷基O-烷基羥基胺，利用如在兩種氨基酸之間的偶連反應(yīng)來完成。該標(biāo)準(zhǔn)偶連反應(yīng)可以利用前面對兩種氨基酸之間的偶連所說的標(biāo)準(zhǔn)偶連方法來進(jìn)行，從而產(chǎn)生氧肟酸酯(41)。
在步驟b中該保護(hù)的氧肟酸酯(41)被轉(zhuǎn)化成保護(hù)的五氟酮(43)或(44)。該反應(yīng)可以利用在下列參考文獻(xiàn)中所說的偶連反應(yīng)來進(jìn)行，M.R.Angelastro，J.P.Burkhart，P.Bey，N.P.Peet，Tetrahedron Letters，33(1992)，3265-3268。在步驟c中，氧肟酸酯(41)在本領(lǐng)域已知的如T.H.Green，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley andSons，1981，Chapter 7中所說的條件下脫去保護(hù)，從而產(chǎn)生脫去保護(hù)的氧肟酸酯(41)。通過利用前面在方案K中所說的方法將后面的適當(dāng)保護(hù)的氨基酸經(jīng)肽鍵偶連，或者通過將片段縮合，或者通過將兩種方法結(jié)合起來而將該脫去保護(hù)的氧肟酸酯(41)延長，結(jié)果產(chǎn)生延長的肽(42)。
在步驟d中，酮(43)在前面所說的條件下脫去保護(hù)。通過利用前面在方案K中所說的方法將后面的適當(dāng)保護(hù)的氨基酸經(jīng)肽鍵偶連，或者通過將片段縮合，或者通過將兩種方法結(jié)合起來而將該脫去保護(hù)的酮(43)延長，結(jié)果產(chǎn)生延長的酮(43)。
為了制備其中X為CF2CH2NHCOR1的通式IA的化合物，可以采用下列方案。
方案L 在進(jìn)行方案L的步驟時，優(yōu)選地是用醛(45)開始，其中保護(hù)基團(tuán)是一種氨基甲酸酯，優(yōu)選地其中Pg是芐氧羰基(CBZ)。對這種保護(hù)的醛在鋅的存在下與溴二氟乙酸的酯，優(yōu)選地為乙基酯進(jìn)行縮合反應(yīng)。優(yōu)選地，該反應(yīng)是在氮?dú)鈿夥障略谝环N無水非質(zhì)子傳遞溶劑如四氫呋喃、乙醚、二甲氧基乙烷等等中進(jìn)行的。在回流條件下，優(yōu)選地在約60℃下將該反應(yīng)混合物慢慢加熱約1-12小時。通過在無水條件下用液氨進(jìn)行處理，優(yōu)選地用如無水乙醚的溶劑將該酯(46)轉(zhuǎn)化成其伯酰胺(47)。該酰胺化反應(yīng)是在-78℃下開始的，在用氨飽和之后，將該反應(yīng)混合物緩慢升溫至室溫。將所形成的酰胺化學(xué)還原，從而形成游離胺。該化學(xué)還原可以很容易地通過在氮?dú)鈿夥障?、在一種無水非質(zhì)子傳遞溶劑(如THF)中、在回流條件下將該酰胺與二硼烷，優(yōu)選二硼烷/二甲基硫混合物起反應(yīng)而進(jìn)行。該還原反應(yīng)產(chǎn)生了一種酸(HCl)鹽形式的所需的胺，通過pH調(diào)整，可以產(chǎn)生游離的胺，這種游離胺可以采用標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件(例如在室溫下的(BOC)2O，THF)、用一種N-保護(hù)基團(tuán)(例如P′g是叔丁氧羰基)適當(dāng)?shù)乇Ｗo(hù)起來，從而保護(hù)該胺。另外，還可以將游離胺置于設(shè)計用來在二氟亞甲基部分的P′側(cè)上形成所需的α-氨基酸或肽部分的反應(yīng)條件下。
在獲得通式(48)的中間體以后，可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的α-氨基酸或肽偶連工藝，從而制得通式IA的各種化合物。在實(shí)踐中，可以更容易地在該二氟亞甲基部分的P′側(cè)上進(jìn)行偶連。
對其中X為CF2CH2NHCOR1的通式IA的化合物來說，應(yīng)該采用下列方案M。

可以通過已知的Swern氧化工藝，或者通過采用重鉻酸吡啶鎓，或鉻酸酐吡啶鎓配合物的改良Jones反應(yīng)，或者用1，1，1-三乙酰氧基-2，1-benzoxiodol(Dess-Martin試劑)而進(jìn)行該氧化步驟。
為了制備其中X為CHFCH2NHCOR1的通式IA的化合物，可以采用方案L，第一步是在鋅的存在下、在醛(45)和溴氟乙酸的一種酯、優(yōu)選地為乙酯之間進(jìn)行縮合反應(yīng)。優(yōu)選地，該反應(yīng)可以在一種無水非質(zhì)子傳遞溶劑(THF、乙醚、二甲氧基乙烷)中、在氮?dú)夥障逻M(jìn)行。其條件如對方案L所說的那樣。
為了制備其中X為CF2(C＝O)W和W為NHCH2Si(C1-C6烷基)2(B)或NHR1的通式IA的化合物，可以采用方案N。
方案N
步驟a與方案L步驟a相似，并且適用于本發(fā)明的所有側(cè)鏈。在方案N中的酯(54)通過在無水條件下，優(yōu)選地用如THF的溶劑、采用相應(yīng)的伯胺(58)或(59)而轉(zhuǎn)化成仲酰胺(55)。該酰胺化反應(yīng)是在0℃下或在室溫下開始的，并且可以將該反應(yīng)混合物加熱至回流，以完成該反應(yīng)。
在步驟c中，在與方案F步驟b中所說相似的條件下，將所形成的酰胺(55)脫去保護(hù)。通過利用前面在方案A中所說的方法將后面的適當(dāng)保護(hù)的氨基酸經(jīng)肽鍵偶連，或者通過將片段縮合，或者通過將兩種方法結(jié)合起來而將該脫去保護(hù)的酰胺延長，結(jié)果產(chǎn)生延長的肽(56)。
在步驟d中，利用草酰氯和二甲基亞砜，將醇(56)的醇官能團(tuán)通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的并理解的技術(shù)和方法如Swern氧化法氧化，從而產(chǎn)生通式(58)的化合物。
為了制備其中X為CF2C(＝O)W并且W等于R1的通式IA的化合物，可以采用下列方案。 ★如前面所述在步驟a中，優(yōu)選地，通過在無水條件(如THF)下、在低溫(優(yōu)選地為0℃)下、在一種惰性溶劑中向氯二氟乙氧肟酸二甲酯(60)中加入MR1(由R1-鹵素產(chǎn)生)(優(yōu)選地為Li或Mg)的有機(jī)金屬衍生物而制得氯二氟甲基酮(61)。
在步驟a′中，優(yōu)選地，通過在無水條件(如THF)下、在低溫(優(yōu)選地為-20℃)下、在一種惰性溶劑中向氯二氟乙酸(60a)中加入MR1(由R1-鹵素產(chǎn)生)(優(yōu)選地為Li或Mg)的有機(jī)金屬衍生物而制得氯二氟甲基酮(61)。
在0℃下、在氮?dú)庀?，在THF中將上述酮(61)加入到鋅、四氯化肽和所需的醛的混合物中。
在步驟c中，利用草酰氯和二甲基亞砜，通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知并理解的技術(shù)和方法如Swein氧化法將結(jié)構(gòu)(62)的肽醇的醇官能團(tuán)氧化，結(jié)果產(chǎn)生通式(63)的化合物。參見D.Schirlin等人，Bioorg.and Medicinal Chem.Letters，3(1993)，253-258。
下列實(shí)施例表示典型的合成過程。這些實(shí)施例應(yīng)該被理解成是描述性的，它們并不是要對本發(fā)明的范圍進(jìn)行任何限制。用于本文時，下列述語具有所說的含義“g”是指克；“mmol”是指毫摩爾；“ml”是指毫升；“bp”是指沸點(diǎn)；“℃”是指攝氏度；“mmHg”是指毫米汞柱；“μl”是指微升；“μg”是指微克；“μM”是指微摩爾；“Z”或“Cbz”是指芐氧羰基；“THF”是指四氫呋喃；“DCU”是指N，N-二氯脲烷；“Eq”是指等當(dāng)量；“Atg”是指克原子。
實(shí)施例1 制備芐氧羰基-L-纈氨酰-環(huán)戊基甘氨醛(glvcinal)
步驟A芐氧羰基環(huán)戊基甘氨醇(glycinol)在氮?dú)夥障?，向充分?jǐn)嚢柽^的CbZ-環(huán)戊基甘氨酸(0.336g，1.2mmol)在3ml無水四氫呋喃中的溶液中滴加硼烷-二甲硫配合物(1M，在二氯甲烷中，2.4ml)。在室溫下攪拌所得溶液16小時。小心地加入水(1ml)，并蒸發(fā)該混合物。將油狀殘余物溶于乙酸乙酯中，用飽和檸檬酸、碳酸氫鈉和鹽水溶液洗滌該溶液。有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾，蒸發(fā)，得到0.2g(60％)油狀的醇。Rf＝0.25(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚3∶1)MSMH+＝264。
步驟B環(huán)戊基甘氨醇將實(shí)施例1步驟A的醇(0.74mmol)和0.05g碳載氫氧化鈀(Pearlman催化劑，10％)在20ml異丙醇中的混合物在室溫下和大氣壓下氫化16小時。過濾催化劑并蒸發(fā)濾液，得到0.076g(80％)未保護(hù)的氨基醇。
步驟C芐氧羰基-L-纈氨酰-環(huán)戊基甘氨醇將環(huán)戊基甘氨醇(0.065g，0.5mmol)在5ml二氯甲烷中的溶液加入芐氧羰基-L-纈氨酰-O-苯并三唑基酯[通常通過用羥基-苯并三唑(0.077g，0.5mmol)、二環(huán)己基碳化二亞胺(0.103g，0.5mmol)和N-甲基嗎啉(0.101g，1mmol)活化Cbz-纈氨酸(0.13g，0.5mmol)進(jìn)行制備]在5ml無水二氯甲烷中的溶液中。所得混合物在室溫下攪拌16小時并過濾。蒸發(fā)濾液，并將油狀殘余物溶于乙酸乙酯中。用飽和檸檬酸、碳酸氫鈉和鹽水溶液洗滌該溶液。用MgSO4干燥并蒸發(fā)溶劑，得到0.13g淡黃色油，該油在硅膠上進(jìn)行快速層析(乙酸乙酯∶石油醚1∶1，Rf＝0.2)。蒸發(fā)含有產(chǎn)物的合并的流份，得到0.13g(70％)油狀的二肽醇。MSMH+＝363。
步驟D芐氧羰基-L-纈氨酰-環(huán)戊基甘氨醛在室溫下，將上述二肽醇(0.086g，0.24mmol)、Dess-Martin全碘烷(periodinane)(0.2g，0.48mmol)和4ml無水二氯甲烷的混合物攪拌2小時。加入異丙醇(1ml)，蒸發(fā)溶液至干。對固體殘余物進(jìn)行快速層析(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚1∶7，Rf＝0.3)。蒸發(fā)含有產(chǎn)物的合并的流份，得到0.038g(47％)固體的標(biāo)題化合物。C20H28O4N2.025H2O的分析計算值C，65.90；H，7.74；N，7.68。實(shí)測值C，66.04；H，7.62；N，7.66。
實(shí)施例2 制備芐氧羰基-L-纈氨酰-環(huán)己基甘氨醛步驟A2-環(huán)己基甘氨醇將L-苯基甘氨酸(0.96g，7mmol)、0.1g5％碳載銠和50ml乙酸的混合物在室溫下和8巴的壓力下氫化48小時。過濾催化劑并蒸發(fā)溶液至干(用四氯化碳作共溶劑進(jìn)行幾次蒸發(fā))，得到油狀物。用飽和氯化氫氣體-醚溶液處理該油，并蒸發(fā)溶劑，得到白色固體狀標(biāo)題化合物(0.126g，100％)。
步驟B芐氧羰基-L-纈氨酰-環(huán)己基甘氨醇采用實(shí)施例1步驟C的偶連方法，由實(shí)施例2步驟A的產(chǎn)物和芐氧羰基-L-纈氨酸得到標(biāo)題化合物，產(chǎn)率47％。Rf＝0.3(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚4∶6)。C21H32O4N2的分析計算值C，66.99；H，6.57；N，7.44。實(shí)測值C，67.17；H，6.76；N，7.61。
步驟C芐氧羰基-L-纈氨酰-環(huán)己基甘氨醛采用實(shí)施例1步驟D所述的Dess-Martin氧化方法，由實(shí)施例2步驟B的醇得到標(biāo)題的醛，產(chǎn)率78％。Rf＝0.5(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚2∶3)。MSMH+＝375C21H30N2O4.0.25H2O的分析計算值C，66.55；H，6.11；N，7.39。實(shí)測值C，66.35；H，6.12；N，7.56。
實(shí)施例3 制備CBz-L-Ala-L-Phe-H將CBz-Ala-Phe-OH(0.5g，1.4mmol)溶于二氯甲烷(10ml)中。加入N，N′-二異丙基乙胺(DIEA，0.23ml)，并將該溶液冷卻至0℃。向反應(yīng)物中加入二(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(BOP-Cl，0.34g)、N，O-二甲基羥胺·HCl(0.15g，1.5mmol)和DIEA(0.46ml)。攪拌2小時，然后倒入水中。用乙酸乙酯萃取水層，用無水硫酸鈉干燥合并的有機(jī)提取物，過濾并真空濃縮。經(jīng)快速層析純化殘余物(30％乙酸乙酯/己烷，硅膠)，得到氧肟酸酯(0.23g)。
將上述制備的氧肟酸酯(16g)溶于乙醚(10ml)中，并將該溶液冷卻至0℃。加入氫化鋰鋁(0.20g)，并在-2℃下攪拌該反應(yīng)物25分鐘。然后通過滴加10％硫酸氫鉀水溶液終止反應(yīng)，并倒入水(100ml)中。用乙醚(3×50ml)萃取水層。合并有機(jī)提取液，用無水硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮。經(jīng)快速層析純化殘余物(30％乙酸乙酯/己烷，硅膠)，得到標(biāo)題化合物(0.05g)。
實(shí)施例4 制備CBz-L-Phe-L-Phe-H將CBz-Phe-Phe-OH(2.14g，4.8mmol，得自BachemBioscience)和N-甲基嗎啉(1.6ml，14.4mmol)溶于二氯甲烷(22ml)中。將該溶液冷卻至-22℃，并加入氯甲酸異丁酯(0.62ml，4.8mmol)。攪拌該溶液30分鐘，加入N，O-二甲基羥胺·HCl(0.6g，6.2mmol)。在-22℃攪拌反應(yīng)物45分鐘，然后溫?zé)嶂潦覝夭嚢柽^夜。將反應(yīng)物倒入稀鹽酸水溶液中，用乙醚(2×200ml)萃取水層。合并有機(jī)提取物，并用飽和碳酸氫鈉和飽和氯化鈉洗滌，用無水硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮，得到氧肟酸酯(1.81g)。
將上述制備的氧肟酸酯(1.0g，2.0mmol)溶于THF(60ml)中，并將該溶液冷卻至0℃。加入氫化鋰鋁(0.21g，5.5mmol)，并攪拌該反應(yīng)物40分鐘。然后通過滴加10％硫酸氫鉀水溶液(約3ml)終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物倒入水(300ml)中。用乙醚(2×200ml)萃取水層。用無水硫酸鈉干燥合并的有機(jī)提取液，過濾并真空濃縮。從乙酸乙酯/己烷中結(jié)晶殘余物，得到標(biāo)題化合物(0.25g)。
實(shí)施例5 制備N-(N-嗎啉基羰基)-L-苯丙氨酰-L-(O-芐基)蘇氨醛酰胺將Boc-Thr(Bn)-OH(5.00g，16.3mmol，得自BachemBioscience)溶于二氯甲烷(65ml)中。然后連續(xù)加入1-羥基苯并三唑水合物(2.20g，16.3mmol)、N，O-二甲基羥胺·HCl(1.59g，16.3mmol)、N-甲基嗎啉(1.79ml，16.3mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺·HCl(3.10g，16.3mmol)。在氮?dú)夥障聰嚢柙摲磻?yīng)物1小時。然后用10％鹽酸水溶液(200ml)稀釋反應(yīng)物，并用二氯甲烷(135ml)萃取。用10％鹽酸水溶液(100ml)、飽和碳酸氫鈉(100ml)、飽和氯化鈉(100ml)洗滌分離的有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮，得到所需的氧肟酸酯(4.83g)，為無色澄清的油。
在氮?dú)夥障?，將上述制備的氧肟酸?4.80g，13.6mmol)溶于乙酸乙酯(270ml)中，并將該溶液冷卻至0℃。向溶液中鼓入氯化氫(氣體)50分鐘。然后向溶液中鼓入氮?dú)?，同時將其溫?zé)嶂潦覝?。真空濃縮，加入己烷(100ml)并再次真空濃縮，得到酰胺的鹽酸鹽(3.64g)，為白色泡沫。
將Boc-Phe-OH(3.22g，12.12mmol)溶于二氯甲烷(48ml)中。然后連續(xù)加入1-羥基苯并三唑水合物(1.64g，12.12mmol)、上述制備的氧肟酸酯的鹽酸鹽(3.50g，12.12mmol)、N-甲基嗎啉(1.23ml，12.12mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺·HCl(2.23g，12.12mmol)，并在室溫下和氮?dú)夥障聰嚢璺磻?yīng)物過夜。然后用二氯甲烷(100ml)稀釋反應(yīng)物，并加入10％鹽酸水溶液(150ml)。分離各層，用10％鹽酸水溶液(2×75ml)、飽和碳酸氫鈉(2×75ml)、飽和氯化鈉(75ml)洗滌有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮，得到偶連的酰胺(5.19g)，為白色泡沫。
在氮?dú)夥障拢瑢⑸鲜鲋苽涞呐歼B的酰胺(5.00g，10.01mmol)溶于乙酸乙酯(200ml)中，并將該溶液冷卻至0℃。向溶液中鼓入氯化氫(氣體)1小時。然后向溶液中鼓入氮?dú)?，同時將其溫?zé)嶂潦覝亍Ｕ婵諠饪s，加入己烷(100ml)并再次真空濃縮，用氫氧化鉀干燥殘余物，得到偶連酰胺的鹽酸鹽(定量產(chǎn)率)。
將上述制備的偶連酰胺的鹽酸鹽(0.750g，1.72mmol)溶于二氯甲烷(34ml)中。加入氯化嗎啉(0.399ml，3.44mmol)和N-甲基嗎啉(0.389g，3.44mmol)。在室溫下和氮?dú)夥障聰嚢柙摲磻?yīng)物約2小時。真空濃縮反應(yīng)物，通過快速層析純化殘余物(80％乙酸乙酯/丙酮，硅膠)，得到嗎啉甲酰胺(0.430g)，為白色泡沫。
在氮?dú)夥障?，將上述制備的嗎啉甲酰?0.4g，0.780mmol)溶于THF(7.8ml)中，并冷卻至0℃。加入氫化鋰鋁(36.9g，0.975mmol)，并在0℃攪拌該反應(yīng)物1小時。然后通過滴加10％硫酸氫鉀終止反應(yīng)，加入乙酸乙酯(20ml)和10％鹽酸水溶液(20ml)。分離各層，用10％鹽酸水溶液(2×15ml)、飽和碳酸氫鈉(15ml)、飽和氯化鈉(15ml)洗滌有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮，得到標(biāo)題化合物(0.264g)，為白色泡沫。
實(shí)施例6 制備2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-4，4-二氟-1，7-二苯基-3，5-二氧代庚烷步驟AN-芐氧羰基-L-纈氨酰-L-苯丙氨酸，氧肟酸N，O-二甲酯向CBz(L)-Val-Phe-OH(0.220g，0.55mmol)和羥基苯并三唑(0.93g，0.61mmol)在二氯甲烷(12ml)中的溶液中加入N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(0.920g，4.5mmol)。在0℃攪拌1小時，向反應(yīng)物中加入N，O-二甲基羥胺·HCl(0.59g，0.61mmol)和N-甲基嗎啉(0.61g，0.61mmol)，并在25℃攪拌12小時。過濾該混合物，用二氯甲烷洗滌，真空濃縮濾液，得到油狀的粗品酰胺。經(jīng)快速層析(硅膠，2∶8乙酸乙酯∶環(huán)己烷)純化該粗品殘余物，得到標(biāo)題化合物(0.250g)。
步驟BN-芐氧羰基-L-纈氨酰-L-苯丙氨醛在0℃和惰性氣氛下，將上述制備的氧肟酸酯(0.220g，5mmol)加入氫化鋰鋁(0.19g，0.49mmol)在乙醚(10ml)中的溶液中。攪拌30分鐘，使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝夭嚢?小時。分離各相，有機(jī)相用飽和碳酸鈉(10ml)、飽和氯化鈉洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮，得到標(biāo)題化合物CBz(L)-Val-Phe-H(0.179g)，該產(chǎn)物不需純化即可使用。
步驟C2-(N-芐氧羰基纈氨酰)氨基-4，4-二氟-1，7-二苯基-3-羥基-5-氧代庚烷在0℃和氮?dú)夥障?，向活化鋅(0.196g，3mAtg)在無水THF(3ml)中的懸浮液中加入四氯化鈦(0.019g，0.1當(dāng)量)。攪拌30分鐘，并加入在無水THF(4ml)中的CBz(L)-Val-Phe-H(0.42g，1.1mmol)，1-氯-1，1-二氟-2-氧代-4-苯基丁烷(0.218g，1.0mmol)。使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝夭嚢?2小時。加入飽和氯化銨溶液(2ml)。用乙醚(4ml)萃取兩次，用鹽水洗滌有機(jī)相，并用無水硫酸鎂干燥。真空濃縮有機(jī)相。殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，3∶7乙酸乙酯∶環(huán)己烷)，得到標(biāo)題的醇(0.381g)。
步驟D2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-4，4-二氟-1，7-二苯基-3，5-二氧代庚烷在-55℃和氮?dú)夥障?，向草酰?0.269g，2.13mmol)在無水二氯甲烷(2ml)中的溶液中加入二甲基亞砜(0.331g，4.26mmol)。在-55℃攪拌10分鐘，加入在無水二氯甲烷(2ml)中的上述制備的醇(0.3g，0.53mmol)、在此溫度下攪拌反應(yīng)物2小時，并使反應(yīng)物溫?zé)嶂?20℃。加入三乙胺(0.321g，1.68mmol)，并將反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?。再攪拌該混合物幾分鐘。用乙酸乙?10ml)稀釋。用鹽酸(3×3ml，0.1N)和飽和氯化銨水溶液洗滌有機(jī)相。用硫酸鎂干燥有機(jī)相，過濾并真空濃縮，得到粗品化合物(0.22g)。該粗品物質(zhì)經(jīng)重結(jié)晶純化，得到標(biāo)題化合物(0.102g)。分析計算值C，67.59；H，6.24；N，4.95。實(shí)測值C，66.99；H，6.15；N，5.30。
實(shí)施例7 制備4-(N-苯基丙?；?L-纈氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-芐基戊酰胺步驟AN-芐氧羰基-苯丙氨醛按照實(shí)施例6(步驟A和B)所述的方法，通過還原CBz(L)-Phe-OH(15.00g，50mmol)得到醛CBz(L)-Phe-H(4.19g)。
步驟B4-芐氧羰基氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基戊酸乙酯向回流著的活化鋅屑(2.0g，31mAgt)在無水THF(10ml)中的懸浮液中加入在無水THF(40ml)中的CBz(L)-Phe-H(4.19g，14.8 mmol)和溴二氟乙酸乙酯(6.30g，31mmol)，保持該混合物適度回流。在室溫下攪拌該溶液12小時。向該混合物中加入乙酸乙酯(100ml)、鹽水(20ml)、硫酸氫鉀(20ml)。用乙酸乙酯(3×60ml)萃取水相，用硫酸鎂干燥并真空濃縮。經(jīng)快速層析純化殘余物(硅膠，3∶7乙酸乙酯∶環(huán)己烷)，得到標(biāo)題化合物(3.70g)。
步驟C4-芐氧羰基氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-芐基戊酰胺向在THF(10ml)中的該乙酯(1.42g，3.5mmol)溶液中加入在THF(10ml)中的芐胺(1.93g，18mmol)溶液。攪拌12小時。加入乙酸乙酯(100ml)，用0.1N鹽酸水溶液(2×100ml)、水(100ml)和鹽水(100ml)洗滌。用無水硫酸鎂干燥。粗產(chǎn)物經(jīng)快速層析純化(硅膠，2∶8乙酸乙酯∶環(huán)己烷)，得到標(biāo)題化合物(1.16g)。
步驟D4-氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-芐基戊酰胺向在無水乙醇(75ml)中的10％披鈀炭(0.28g)的懸浮液中加入上述制備的酰胺(0.81g，1.70mmol)。在氫氣大氣壓下攪拌12小時。濾出催化劑，用乙醇洗滌，并真空濃縮，得到標(biāo)題的脫保護(hù)的胺(0.5g)。
步驟E4-(N-苯基丙?；?L-纈氨酰)氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-芐基戊酰胺向在無水乙腈(15ml)中的氫肉桂酰-Val-OH(3-苯基丙?；?Val-OH)(0.199g，0.80mmol)的溶液中加入N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(0.165g，0.80mol)。在0℃攪拌1小時。向反應(yīng)物中加入上述制備的胺(0.210g，0.80mmol)，并在25℃攪拌12小時。過濾該混合物，用乙酸乙酯洗滌，并真空濃縮濾液，得到油狀粗品的酰胺。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，2∶8乙酸乙酯∶環(huán)己烷)，得到標(biāo)題化合物(0.16g)。
步驟F4-(N-苯基丙酰-L-纈氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-芐基戊酰胺將在二氯甲烷(10ml)和叔丁醇(0.055g，0.75mmol)中的上述制備的醇(0.145g，0.25mmol)加入Dess-Martin試劑(0.318g，0.75mmol)在二氯甲烷中的懸浮液中。在室溫下攪拌12小時，真空濃縮該混合物。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，3∶7乙酸乙酯∶環(huán)己烷)，得到標(biāo)題化合物(0.063g)。C32H35N3O4F2的分析計算值C，68.19；H，6.26；N，7.45。實(shí)測值C，67.90；H，6.30；N，7.33。
實(shí)施例8
制備4-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-4-苯基-N-(三甲基甲硅烷基甲基)戊酰胺如實(shí)施例7步驟B所述制備4-芐氧羰基氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基戊酸乙酯。
步驟A4-芐氧羰基氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-三甲基甲硅烷基甲基戊酰胺向在THF(2.5ml)中的三甲基甲硅烷基甲胺(0.81ml，6.10mmol)中加入上述制備的二氟醇(0.25g，0.61mmol)。攪拌并加熱回流12小時。真空濃縮。用硫酸氫鉀水溶液(5ml)稀釋，用乙醚(3×5ml)萃取。用水(2×15ml)洗滌有機(jī)相。用硫酸鈉干燥。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，25∶75乙酸乙酯∶環(huán)己烷)，得到標(biāo)題化合物(0.212g)。
步驟B4-氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-(三甲基甲硅烷基甲基)戊酰胺向在無水乙醇(10ml)中的10％披鈀炭(0.10g)的懸浮液中加入上述制備的酰胺(0.10g，0.22mmol)。在氫氣大氣壓下攪拌12小時。濾出催化劑，用乙醇洗滌并真空濃縮，得到標(biāo)題的脫保護(hù)的胺(0.71g)。
步驟C4-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-(三甲基甲硅烷基甲基)戊酰胺向在二甲基甲酰胺(10ml)中的CBz(L)-Val-OH(0.055g，0.22mmol)和羥基苯并三唑(0.03g，0.22mmol)的溶液中加入N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(0.045g，0.22mol)。在0℃攪拌30分鐘。向反應(yīng)物中加入上述制備的胺(0.073g，0.22mmol)，并在25℃攪拌12小時。加入水和鹽水。用乙酸乙酯萃取，用水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮。用乙腈(5ml)稀釋，并沉淀DCU。過濾并真空濃縮濾液，得到粗品的酰胺。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，35∶65乙酸乙酯∶石油醚)，得到標(biāo)題化合物(0.40g)。
步驟D4-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-(三甲基甲硅烷基甲基)戊酰胺在-60℃，向在二氯甲烷(1ml)中的草酰氯(0.02ml，0.22mmol)溶液中加入在無水二氯甲烷(1ml)中的二甲基亞砜(0.031g，0.44mmol)。在-60℃攪拌5分鐘，加入在二氯甲烷(2ml)中的上述制備的醇(0.041g，0.07mmol)。在此溫度下攪拌反應(yīng)物1小時。加入三乙胺(0.09ml，0.65mmol)，使反應(yīng)物溫?zé)嶂潦覝?。再攪拌該混合物幾分鐘。用二氯甲?10ml)稀釋。用硫酸氫鉀(3×10ml，1N)和水(2×10ml)洗滌有機(jī)相。用硫酸鈉干燥有機(jī)相，過濾并真空濃縮，得到粗品化合物。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(乙酸乙酯∶石油醚25∶75，Rf0.2)，得到標(biāo)題化合物(0.015g)。C31H33N3O5F2，0.25H2O的分析計算值C，58.93；H，6.71；N,7.36。實(shí)測值C，58.74；H，6.72；N，7.16。
實(shí)施例9 制備3-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-1，1，1-三氟-2-氧代-4-苯基丁烷按照實(shí)施例6所述的偶連反應(yīng)方法，由CBz(L)-Val-OH(0.128g，0.5mmol)和1，1，1-三氟-3-氨基-4-苯基-2-丁醇(0.112g，0.5mmol，J.Med.Chem.1990，33，394-407)制備3-[芐氧羰基-L-纈氨酰]氨基-1，1，1-三氟-2-羥基-4-苯基丁烷。
如實(shí)施例8所述，使用草酰氯氧化上述制備的醇(0.71g，0.16mmol)，得到標(biāo)題化合物(0.60g)。C23H25F2N2O4F2，0.5H2O的分析計算值C，60.12；H，5.70；N，6.10。實(shí)測值C，60.08；H，5.81；N，5.89。
實(shí)施例10
制備1-N-芐氧羰基纈氨酰氨基-2-苯基乙烷硼酸在0℃，用甲醇將(+)蒎烷二醇-1-N，N-二(三甲基甲硅烷基)氨基-2-苯基乙烷硼酸酯脫去甲硅烷基(J.Am.Chem.Soc.(1981)103，5241)。真空濃縮，并用乙醚洗滌，得到粗品脫保護(hù)的氨基硼酸酯。
向上述制備的粗品脫保護(hù)的氨基硼酸酯在無水THF中的溶液中加入N-芐氧羰基纈氨酸酐，得到偶連的化合物。
按照J(rèn).Am.Chem.Soc.(1980)，102，7590的方法，使用三氯化硼將上述制備的偶連化合物的蒎烷二醇裂解。
通過離子交換柱或者采用Biochemistry(1987)，26，7609(該文獻(xiàn)引入本文作為參考)的方法純化標(biāo)題化合物。'實(shí)施例11 制備N-[2-[4-(氨基亞氨基甲基)氨基]苯基]-1-三氟乙酰乙基]苯甲酰胺。鹽酸鹽水合物該化合物的合成描述于Liebigs Ann.Chem.1990，1-6中，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
實(shí)施例12 制備2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-三甲基甲硅烷基丙醛步驟A2-芐氧羰基氨基-3-三甲基甲硅烷基-丙酸甲酯在氮?dú)夥障?，向?78℃的二異丙基氨基鋰(8.76ml，62.5mmol)和四甲基乙二胺(9.43ml，62.5mmol)在無水THF(100ml)中的溶液中滴加5.58g(25mmol)N-芐氧羰基甘氨酸甲酯在無水THF(70ml)中的溶液。添加完成后，在-78℃攪拌該溶液2小時，然后在-30℃攪拌15分鐘，并冷卻至-78℃。向所得到的漿狀混合物中滴加5.36g(25mmol)碘甲基三甲基甲硅烷在無水六甲基磷酰胺(39ml)中的溶液。添加完成后，將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂?50℃，在此溫度下保持1小時并在水解前冷卻至-78℃。通過加入水和氯化銨使反應(yīng)混合物終止反應(yīng)，用乙醚稀釋。用1N硫酸氫鉀洗滌有機(jī)層，用水洗滌兩次，并用硫酸鈉干燥。蒸發(fā)溶劑，所得殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，乙酸乙酯/石油醚2/8)。得到4.30g標(biāo)題化合物(產(chǎn)率56％)(無色油狀)。Rf0.51(乙酸乙酯/石油醚2/8)。
步驟B2-氨基-3-三甲基甲硅烷基丙酸甲酯鹽酸鹽在室溫下和氫氣氛下，在10％披鈀炭(0.03g)存在下，將實(shí)施例12步驟A制得的衍生物(0.309g，1mmol)在乙醇(30ml)中和在用氯化氫飽和的無水乙醚(1.5ml)中的溶液攪拌24小時。將氫氣氛改為氮?dú)夥?，濾出催化劑。真空濃縮后，得到固體狀的標(biāo)題化合物，該化合物直接用于下一反應(yīng)步驟。
步驟C2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-三甲基甲硅烷基丙酸甲酯在0℃，向攪拌過的N-芐氧羰基-L-纈氨酸(0.311g，1.24mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(0.167g，1.24mmol)和N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(0.255g，1.24mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中依次加入實(shí)施例12步驟B的胺(0.262g，1.24mmol)和N-甲基嗎啉(0.136ml，1.24mmol)。移去冷浴，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌17小時。過濾反應(yīng)混合物，真空濃縮濾液。殘余物(0.476克)經(jīng)快速層析純化(硅膠，石油醚/乙酸乙酯8/2；Rf0.14)，得到標(biāo)題化合物(0.316g，兩步的產(chǎn)率為77％)。
步驟D2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-三甲基甲硅烷基丙醛在氮?dú)夥障?，?78℃實(shí)施例12步驟C的酯(0.316g，0.77mmol)在無水乙醚(7.5ml)和無水甲苯(3.5ml)中的溶液中滴加在己烷(1.55ml)中的1M氫化二異丁基鋁溶液。在-78℃攪拌該溶液45分鐘，用飽和氯化銨水溶液緩緩水解。水相用乙醚(2×20ml)萃取兩次，有機(jī)相依次用1N硫酸氫鉀(10ml)和水(20ml)洗滌。合并的有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過濾并真空除去溶劑，得到固體殘余物(0.260g)，該殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，石油醚/乙酸乙酯75/25；Rf0.25)，得到標(biāo)題化合物(0.15g，產(chǎn)率為53％)。從二氯甲烷/戊烷中結(jié)晶，得到0.077g白色絮狀固體。C19H30N2O4Si的分析計算值C，60.29；H，7.99；N，7.40。實(shí)測值C，60.23；H，8.10；N，7.42。
實(shí)施例13 制備2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-苯基二甲基甲硅烷基丙醛步驟A2-叔丁氧羰基氨基-3-苯基二甲基甲硅烷基丙酸甲酯按照實(shí)施例12步驟A所述的方法，由N-叔丁氧羰基甘氨酸甲酯和碘甲基苯基二甲基甲硅烷(由市售氯甲基苯基二甲基甲硅烷制備，產(chǎn)率81％)制備產(chǎn)率為28％的標(biāo)題的酯。Rf0.23(硅膠，乙酸乙酯/石油醚1/9)。
步驟B2-氨基-3-苯基二甲基甲硅烷丙酸甲酯將在甲酸(30ml)中的實(shí)施例13步驟A的衍生物(0.92g，2.73mmol)的溶液在室溫下保持2小時。真空除去甲酸后，將殘余物溶于乙酸乙酯(20ml)中，用1M碳酸鈉(20ml)萃取，并用水洗滌兩次，再用乙酸乙酯(20ml)萃取水相1次。用硫酸鈉干燥合并的有機(jī)層之后，蒸發(fā)溶劑，得到標(biāo)題化合物，產(chǎn)率98％(0.64g)。
步驟C2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-苯基二甲基甲硅烷基丙酸甲酯采用實(shí)施例12步驟C的偶連方法，由實(shí)施例13步驟B的胺和N-芐氧羰基-L-纈氨酸得到標(biāo)題化合物，不同是用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽代替N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(產(chǎn)率74％)。Rf0.19(硅膠，乙酸乙酯/石油醚2/8)。
步驟D2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-苯基二甲基甲硅烷基丙醛采用實(shí)施例12步驟D所述的還原方法，由實(shí)施例13步驟C的酯制備標(biāo)題的醛，產(chǎn)率33％。Rf0.17(硅膠，乙酸乙酯/石油醚2/8)。C24H32N2O4Si的分析計算值C，65.42；H，7.32；N，6.36。實(shí)測值C，65.33；H，7.10；N，6.26。
實(shí)施例14
制備2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-乙烯基二甲基甲硅烷基丙醛步驟A2-叔丁氧羰基氨基-3-乙烯基二甲基甲硅烷基丙酸甲酯按照實(shí)施例12步驟A所述的方法，由N-叔丁氧羰基甘氨酸甲酯和碘甲基乙烯基二甲基甲硅烷制備產(chǎn)率為51％的標(biāo)題的酯。Rf0.35(硅膠，乙酸乙酯/石油醚1/9)。
步驟B2-氨基-3-乙烯基二甲基甲硅烷丙酸甲酯按照實(shí)施例13步驟B所述的脫保護(hù)方法，由實(shí)施例14步驟A的衍生物得到標(biāo)題的胺(定量產(chǎn)率)。
步驟C2-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-乙烯基二甲基甲硅烷基丙酸甲酯采用實(shí)施例13步驟C的偶連方法，由實(shí)施例14步驟B的胺和N-芐氧羰基-L-纈氨酸制備標(biāo)題化合物，產(chǎn)率68％。Rf0.22(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚2∶8)。MSMH+＝421，MNH4+＝438步驟D3-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-3-乙烯基二甲基甲硅烷基丙醛采用實(shí)施例12步驟D所述的還原方法，由實(shí)施例14步驟C的酯制備標(biāo)題的醛。

制備N-芐氧羰基-L-纈氨酰-(O-甲基)-L-酪氨醛步驟AN-芐氧羰基-L-纈氨酰-O-甲基-L-酪氨酸芐酯向N-芐氧羰基-L-纈氨酸酐(0.339g，0.7mmol)在無水二氯甲烷(15ml)中的溶液中加入O-甲基-L-酪氨酸芐酯甲苯-4-磺酸鹽(0.330g，0.7mmol)和N-甲基嗎啉(0.081g，0.8mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)物過夜。真空除去溶劑，殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，2∶8乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到白色固體的標(biāo)題化合物。
步驟BN-芐氧羰基-L-纈氨酰-(O-甲基)-L-酪氨醛向在-78℃無水甲苯(5ml)和乙醚(5ml)中的N-芐氧羰基-L-纈氨酰-O-甲基-L-酪氨酸芐酯(0.250g，0.48mmol)的溶液中加入1.2M氫化二異丁基鋁在己烷中的溶液(1.6ml，2mmol)。在-78℃攪拌該反應(yīng)物1小時，然后用飽和酒石酸鉀鈉溶液(5ml)水解。然后使溫度升至室溫。該混合物用1M硫酸氫鉀溶液酸化至pH～3，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取3次。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空取出溶劑，得到殘余物，該殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，3∶7乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到白色固體的標(biāo)題化合物。
實(shí)施例16 制備N-芐氧羰基-L-纈氨酰-O-芐基-L-酪氨醛步驟AN-叔丁氧羰基-O-芐基-L-酪氨酸，氧肟酸N，O-二甲酯向0℃叔丁氧羰基氨基-O-(L)芐基酪氨酸(23g，61.9mmol)在無水二氯甲烷(250ml)中的溶液中加入N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(12.75g，61.9mmol)和羥基苯并三唑(9.47g，61.9mmol)。在0℃攪拌該混合物10分鐘，然后加入N，O-二甲基羥胺·HCl(6.04g，61.9mmol)和N-甲基嗎啉(6.25g，61.9mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)物12小時。然后過濾該混合物并濃縮濾液。粗品混合物經(jīng)快速層析純化(硅膠，2∶8乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到白色固體的標(biāo)題化合物(22.60g，產(chǎn)率88％)。Rf約等于0.36(乙酸乙酯/環(huán)己烷)。
步驟BO-芐基-L-酪氨酸，氧肟酸N，O-二甲酯在0℃，將N-叔丁氧羰基-O-芐基(L)酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯(8.28g，20mmol)在三氟乙酸(100ml)中的溶液攪拌1小時。真空除去溶劑。殘余物溶于乙醚(250ml)中，用飽和碳酸鈉溶液(3×50ml)洗滌3次。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空除去溶劑，得到淡黃色油狀的標(biāo)題化合物(6.00g，產(chǎn)率90％)，該產(chǎn)物不需純化即可用于下一步反應(yīng)。
步驟CN-芐氧羰基-L-纈氨酰-O-芐基-L-酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯向Z-L纈氨酸酐(8.47g，17.5mmol)在無水二氯甲烷(150ml)中的溶液中加入O-芐基-L-酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯(5.50g，17.5mmol)。在室溫下攪拌該混合物過夜。真空除去溶劑，粗品混合物經(jīng)快速層析純化(硅膠，2∶7乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到白色固體的標(biāo)題化合物(8.90g，產(chǎn)率93％)。Rf約等于0.18(乙酸乙酯/環(huán)己烷)。
步驟DN-芐氧羰基-L-纈氨酰-O-芐基-L-酪氨醛在0℃，向N-芐氧羰基-L-纈氨酰-O-芐基-L-酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯(8.90g，16.2mmol)在無水乙醚(150ml)和無水THF(20ml)中的溶液中加入氫化鋰鋁(0.67g，17.7mmol)。在0℃攪拌該混合物1小時。然后小心地加入1M硫酸氫鉀溶液(25ml)。分離有機(jī)層，水相用乙酸乙酯(2×100ml)萃取兩次。然后用3N鹽酸溶液(30ml)、水(30ml)和鹽水(30ml)洗滌合并的有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空蒸發(fā)溶劑，得到白色固體，該固體在乙酸乙酯/戊烷中重結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物(5.40g，產(chǎn)率60％)。Rf約等于0.33(乙酸乙酯/環(huán)己烷)。熔點(diǎn)160-162℃C29H32N2O5的分析計算計算值C，71.29；H，6.60；N，5.73。實(shí)測值C，71.18；H，6.94；N，6.30。
實(shí)施例17 制備N-芐氧羰基-2-環(huán)戊基甘氨酸-O-芐基-L-酪氨醛步驟AN-芐氧羰基-2-環(huán)戊基甘氨酸-O-芐基-L-酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯向在無水乙腈(20ml)中的外消旋N-芐氧羰基-2-環(huán)戊基甘氨酸(0.831g，3mmol)溶液中加入N-甲基嗎啉(0.323g，3.2mmol)。在氮?dú)夥障拢瑢⒃摶旌衔锢鋮s至-20℃，加入氯甲酸異丁酯(0.410g，3mmol)。在-20℃攪拌10分鐘后，加入在無水乙腈(10ml)中的O-芐基-L-酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯(1.00g，3.1mmol)。在-20℃和氮?dú)夥障聰嚢柙摶旌衔?小時，然后使溫度升至室溫過夜。蒸發(fā)粗品混合物，殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠3∶7乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到白色固體標(biāo)題化合物(1.60g，產(chǎn)率93％)。Rf約等于0.26(乙酸乙酯/環(huán)己烷1∶1)。
步驟BN-芐氧羰基-2-環(huán)戊基甘氨酸-O-芐基-L-酪氨醛在0℃，向N-芐氧羰基-2-環(huán)戊基甘氨酸-O-芐基-L-酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯(1.60g，2.8mmol)在無水乙醚(20ml)和無水THF(20ml)中的溶液中加入氫化鋰鋁(0.121g，3.2mmol)。在0℃攪拌該混合物1小時。加入1M硫酸氫鉀水溶液(25ml)。該混合物用乙酸乙酯(3×50ml)萃取3次。用3N鹽酸、水和鹽水洗滌合并的有機(jī)層，然后用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空蒸發(fā)溶劑，得到白色固體，該固體經(jīng)重結(jié)晶(在乙酸乙酯/戊烷中)純化，得到標(biāo)題化合物(0.96g，產(chǎn)率67％)。Rf約等于0.34(乙酸乙酯/環(huán)己烷1∶1)。MS[MH]+＝515，[MNH4]+＝532C31H34N2O5的分析計算計算值C，72.35；H，6.66；N，5.44。實(shí)測值C，72.38；H，6.64；N，5.52。
實(shí)施例18 制備N-芐氧羰基-2-環(huán)己基甘氨酸-O-芐基-L-酪氨醛步驟AN-芐氧羰基-2-環(huán)己基甘氨酸-O-芐基-L-酪氨酸，氧肟酸N，O-二甲酯向在無水乙腈(25ml)中的外消旋N-芐氧羰基-2-環(huán)己基甘氨酸(0.873g，3mmol)溶液中加入N-甲基嗎啉(0.323g，3.2mmol)。將該混合物冷卻至-20℃，加入氯甲酸異丁酯(0.410g，3mmol)。在-20℃和氮?dú)夥障聰嚢?0分鐘后，加入在無水乙腈(10ml)中的O-芐基-L-酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯(1.00g，3.1mmol)。在-20℃和氮?dú)夥障聰嚢柙摶旌衔?小時，然后使溫度升至室溫過夜。真空除去溶劑，殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠3∶7乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到白色固體標(biāo)題化合物(1.00g，產(chǎn)率57％)。Rf約等于0.35(乙酸乙酯/環(huán)己烷)。
步驟BN-芐氧羰基-2-環(huán)己基甘氨酸-O-芐基-L-酪氨醛在0℃，向N-芐氧羰基-2-環(huán)己基甘氨酸-O-芐基-L-酪氨酸氧肟酸N，O-二甲酯(0.96g，1.6mmol)在無水乙醚(20ml)和無水THF(20ml)中的溶液中加入氫化鋰鋁(0.068g，1.8mmol)。在0℃攪拌該混合物1小時。加入1M硫酸氫鉀水溶液(25ml)。該混合物用乙酸乙酯(3×50ml)萃取3次。用3N鹽酸、水和鹽水洗滌合并的有機(jī)層，然后用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空蒸發(fā)溶劑，得到白色固體，該固體經(jīng)重結(jié)晶(在乙酸乙酯/戊烷中)純化，得到標(biāo)題化合物(0.56g，產(chǎn)率67％)。MS[MH]+＝529，[MNH4]+＝546C32H36N2O5的分析計算計算值C，72.71；H，6.86；N，5.30。實(shí)測值C，72.43；H，6.92；N，5.43。
實(shí)施例19 制備N-芐氧羰基-L-纈氨酰-3-(1-萘基)-L-丙氨醛步驟AN-叔丁氧羰基-[3-(1-萘基)-L-丙氨酸]-氧肟酸N，O-二甲酯在0℃，向N-叔丁氧羰基-[3-(1-萘基)-L-丙氨酸](0.65g，2mmol)在無水二氯甲烷(20ml)中的溶液中加入N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(0.412g，2mmol)和羥基苯并三唑(0.306g，2mmol)。攪拌10分鐘后，加入N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽(chlorohydrate)(0.195g，2mmol)和N-甲基嗎啉(0.202g，2mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)物12小時。然后過濾該混合物并濃縮濾液。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，4∶6乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到無色油狀的標(biāo)題化合物(0.56g，產(chǎn)率78％)。Rf約等于0.36(乙酸乙酯/環(huán)己烷1∶1)。
步驟B3-(1-萘基)-L-丙氨酸-氧肟酸N，O-二甲酯在室溫下，將N-叔丁氧羰基-[3-(1-萘基)-L-丙氨酸]-氧肟酸N，O-二甲酯(0.560g，1.5mmol)在甲酸(20ml)中的溶液攪拌4小時。真空除去溶劑。殘余物溶于乙酸乙酯(50ml)中，用飽和碳酸鈉溶液(3×10ml)洗滌3次，用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空蒸發(fā)溶劑，得到無色的油(0.330g，產(chǎn)率85％)，該產(chǎn)物不需純化即可用于下一步反應(yīng)。
步驟CN-芐氧羰基-L-纈氨酰-3-(1-萘基)-L-丙氨酸-氧肟酸N，O-二甲酯向Z-L-纈氨酸酐(0.581g，1.2mmol)在無水二氯甲烷(10ml)中的溶液中加入3-(1-萘基)-L-丙氨酸-氧肟酸N，O-二甲酯(0.320g，1.2mmol)。在室溫下攪拌該混合物過夜。真空除去溶劑，殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，3∶7乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到白色固體的標(biāo)題化合物(0.470g，產(chǎn)率80％)。Rf約等于0.23(乙酸乙酯/環(huán)己烷)。
步驟DN-芐氧羰基-L-纈氨酰-3-(1-萘基)-L-丙氨酸在0℃，向N-芐氧羰基-L-纈氨酰-3-(1-萘基)-L-丙氨酸-氧肟酸N，O-二甲酯(0.470g，0.96mmol)在無水乙醚(10ml)和無水THF(10ml)中的溶液中加入氫化鋰鋁(0.042g，1.1mmol)。在0℃攪拌該反應(yīng)物1小時。然后加入1M硫酸氫鉀溶液(5ml)。該混合物用乙酸乙酯(3×30ml)萃取3次。用1N鹽酸、水和鹽水洗滌有機(jī)層，用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空蒸發(fā)溶劑，得到白色固體，該固體在乙酸乙酯/戊烷中重結(jié)晶進(jìn)行純化，得到標(biāo)題化合物(0.260g，產(chǎn)率63％)。Rf約等于0.36(乙酸乙酯/環(huán)己烷1∶1)。MS[MH]+＝433，[MNH4]+＝450C26H28N2O4的分析計算計算值C，72.20；H，6.52；N，6.48。實(shí)測值C，71.87；H，6.50；N，6.48。
實(shí)施例20 制備N-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-(苯基羰基氨基)-L-苯丙氨醛步驟AN-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-硝基-L-苯丙氨酸甲酯向Z-L-纈氨酸酐(4.80g，10mmol)在無水二氯甲烷(50ml)中的溶液中加入4-硝基-L-苯丙氨酸甲酯(2.24g，10mmol)。在室溫下攪拌該混合物過夜。真空除去溶劑，殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，4∶6乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到標(biāo)題化合物(2.10g，產(chǎn)率56％)。Rf約等于0.32(乙酸乙酯/環(huán)己烷1∶1)。
步驟BN-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-(苯基羰基氨基)-L-苯丙氨酸甲酯將N-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-硝基-L-苯丙氨酸甲酯(0.91g，2mmol)和二水合氯化錫(II)(1.56g，7mmol)在無水乙醇(50ml)和N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中的溶液加熱回流4小時。將該混合物冷卻，用水稀釋，用碳酸氫鈉中和，用乙酸乙酯(3×50ml)萃取3次。有機(jī)層用硫酸鎂干燥。過濾并蒸發(fā)溶劑后，將殘余物溶于無水二氯甲烷(20ml)中，并冷卻至0℃。加入三乙胺(0.202g，2mmol)，然后加入苯甲酰氯(0.281g，2mmol)。在室溫下攪拌該混合物過夜。真空除去溶劑，殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，98∶2二氯甲烷/甲醇)，得到標(biāo)題化合物(0.500g，產(chǎn)率50％)。
步驟CN-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-(苯基羰基氨基)-L-苯丙氨酸向N-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-(苯基羰基氨基)-L-苯丙氨酸甲酯(0.500g，0.94mmol)在二噁烷(30ml)中的溶液中加入在水(10ml)中的氫氧化鋰一水合物(0.084g，2mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)物過夜。將混合物溶于水(20ml)中，用乙酸乙酯(2×20ml)洗滌2次。用1N鹽酸酸化水相至pH～2，并用乙酸乙酯(3×20ml)萃取3次。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空除去溶劑后，得到白色固體的標(biāo)題化合物(0.400g，產(chǎn)率82％)。MS[MH]+＝518，[MNH4]+＝535。
步驟DN-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-(苯基羰基氨基)-L-苯丙氨酸-氧肟酸N，O-二甲酯在0℃，向N-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-(苯基羰基氨基)-L-苯丙氨酸(0.390g，0.75mmol)在無水N，N-二甲基甲酰胺(5ml)和無水二氯甲烷(15ml)中的溶液中加入N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(0.155g，0.75mmol)和羥基苯并三唑(0.115g，0.75mmol)。攪拌10分鐘后，加入氧肟酸N，O-二甲酯鹽酸鹽(chlorohydrate)(0.073g，0.75mmol)和N-甲基嗎啉(0.076g，0.75mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)物過夜，真空除去溶劑，將殘余物溶于乙酸乙酯中并過濾。濃縮濾液，殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，98∶2二氯甲烷/甲醇)，得到標(biāo)題化合物(0.230g，產(chǎn)率53％)。Rf約等于0.59(二氯甲烷/甲醇9∶1)。MS[MH]+＝561，[MNH4]+＝578。
步驟EN-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-(苯基羰基氨基)-L-苯丙氨醛在0℃，向N-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-(苯基羰基氨基)-L-苯丙氨酸-氧肟酸N，O-二甲酯(0.230g，0.41mmol)在無水乙醚(10ml)和無水THF(5ml)中的溶液中加入氫化鋰鋁(0.017g，0.45mmol)。在0℃攪拌該反應(yīng)物1小時。加入1M硫酸氫鉀溶液(5ml)，用乙酸乙酯(3×15ml)萃取該混合物3次。有機(jī)層用1N鹽酸、水和鹽水洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥。真空除去溶劑后，殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，98∶2二氯甲烷/甲醇)，得到標(biāo)題化合物(0.050g，產(chǎn)率25％)。Rf約等于0.43(二氯甲烷/甲醇9∶1)。MS[MH]+＝502，[MNH4]+＝519。
實(shí)施例21 制備2(D)-[3-(4-芐氧基苯基)-2-甲?；０被鵠-3-甲基-N-基乙基丁酰胺步驟A4-芐氧基芐基丙二酸叔丁酯乙酯在氮?dú)夥障拢?5％氫化鈉(6.40g，0.12mmol)在無水四氫呋喃(100ml)中的懸浮液中加入在無水四氫呋喃(100ml)中的丙二酸叔丁酯乙酯(20.7g，0.11mmol)。在室溫下攪拌該混合物2小時。然后加入在無水THF(50ml)中的4-芐氧基芐基溴(29.60g，0.11mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)物過夜，用水水解并濃縮。該混合物用乙酸乙酯(3×200ml)萃取3次。殘余物經(jīng)快速層析(硅膠，9∶1甲苯/乙醚)和重結(jié)晶(乙醚∶戊烷)純化，得到標(biāo)題化合物(20.0g，產(chǎn)率47％)。Rf＝0.65(甲苯∶乙醚9∶1)。
步驟B4-芐氧基芐基丙二酸乙酯將4-芐氧基芐基丙二酸叔丁酯乙酯(19.0g，49.5mmol)在三氟乙酸(200ml)中的溶液在0℃攪拌1小時。真空除去溶劑。殘余物在乙醚/戊烷中重結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物(8.50g；產(chǎn)率53％)。
步驟C2(D)-[3-(4-芐氧基苯基)-2-羧基二甲酯-丙酰氨基]-3-甲基-N-苯乙基丁酰胺在0℃，向4-芐氧基芐基丙二酸乙酯(8.50g，25.9mmol)在無水二氯甲烷(150ml)中的溶液中加入N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(5.33g，25.9mmol)、羥基苯并三唑(3.96g，25.9mmol)和(D)纈氨酸苯乙酰胺(5.70g，25.9mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)物過夜。過濾沉淀，并濃縮濾液。殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，3∶7乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到標(biāo)題化合物(7.0g，產(chǎn)率51％)，為白色固體。Rf約等于0.33(乙酸乙酯/環(huán)己烷1∶1)。MS[MH]+＝531，C32H38N2O5的分析計算計算值C，72.43；H，7.22；N，5.28。實(shí)測值C，72.15；H，7.36；N，5.39。
步驟D2(D)-[3-(4-芐氧基苯基)-2-羧基丙酰氨基]-3-甲基-N-苯乙基丁酰胺向2(D)-[3-(4-芐氧基苯基)-2-羧基二乙酯-丙酰氨基]-3-甲基-N-苯乙基丁酰胺(7.0g，13.2mmol)在2-甲氧基乙醇(100ml)中的溶液中加入氫氧化鋰(0.84g，20mmol)的水(50ml)溶液。使反應(yīng)物回流12小時。真空除去溶劑，將殘余物溶于水(100ml)中，用乙酸乙酯(2×30ml)洗滌2次。用3N鹽酸酸化水相至pH～2，用氯化鈉飽和，并用乙酸乙酯(3×50ml)萃取3次。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空除去溶劑后，殘余物經(jīng)重結(jié)晶純化(乙酸乙酯/戊烷)，得到標(biāo)題化合物(4.0g，產(chǎn)率60％)。MS[MH]+＝503。步驟E2(D)-[3-(4-芐氧基苯基)-2-甲氧肟酸N，O-二甲酯-丙酰氨基]-3-甲基-N-苯乙基丁酰胺在0℃，向2(D)-[3-(4-芐氧基苯基)-2-羧基丙酰氨基]-3-甲基-N-苯乙基丁酰胺(4.00g，8mmol)在無水二氯甲烷(100ml)和N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中的溶液中加入氧肟酸N，O-二甲酯鹽酸鹽(0.78g，8mmol)、N-甲基嗎啉(0.81g，8mmol)和N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺(1.65g，8mmol)。在室溫下攪拌該反應(yīng)物過夜。過濾該混合物，真空濃縮濾液。殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，1∶1乙酸乙酯/環(huán)己烷)，得到標(biāo)題化合物(3.20g，產(chǎn)率74％)，為白色固體。Rf約等于0.45(乙酸乙酯)。MS[MH]+＝546，[MNH4]+＝563。C32H39N3O5的分析計算計算值C，70.44；H，7.20；N，7.70。實(shí)測值C，70.22；H，7.02；N，7.65。
步驟F2(D)-[3-(4-芐氧基苯基)-2-甲?；?丙酰氨基]-3-甲基-N-苯乙基丁酰胺向2(D)-[3-(4-芐氧基苯基)-2-甲氧肟酸N，O-二甲酯-丙酰氨基]-3-甲基-N-苯乙基丁酰胺(3.0g，5.5mmol)在無水四氫呋喃(50ml)中的溶液中加入氫化鋰鋁(0.240g，6.3mmol)。在0℃攪拌該反應(yīng)物1小時，然后用1M硫酸氫鉀溶液(20ml)水解，并用乙酸乙酯(3×50ml)萃取3次。有機(jī)層用1N鹽酸、水和鹽水洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空除去溶劑，得到白色固體，該固體在乙酸乙酯/戊烷中重結(jié)晶，得到標(biāo)題化合物(2.30g，產(chǎn)率86％)。MS[MH]+＝487，[MNH4]+＝504。C30H34N2O4，0.5H2O的分析計算計算值C，72.70；H，7.12；N，5.65。實(shí)測值C，72.90；H，7.03；N，5.89。
實(shí)施例22 制備N-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-硝基-L-苯丙氨醛在-78℃和氮?dú)夥障?，向N-芐氧羰基-L-纈氨酰-4-硝基-L-苯丙氨酸甲酯(0.375g，0.8mmol)在無水甲苯(10ml)中的溶液中加入在己烷中的1.2M氫化二異丁基鋁溶液(3ml，3.5mmol)。在-78℃攪拌該反應(yīng)物1小時，然后用飽和酒石酸鉀鈉溶液水解。使溫度升至室溫。用1M硫酸氫鉀溶液酸化該混合物至pH～3，并用乙酸乙酯(3×20ml)萃取3次。有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空除去溶劑，得到殘余物，該殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，1∶1乙酸乙酯/環(huán)己烷)。得到標(biāo)題化合物，產(chǎn)率20％(70mg)。Rf約等于0.50(乙酸乙酯)。
實(shí)施例23 制備4-D-(N-芐氧羰基)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-芐基戊酰胺步驟A4-芐氧羰基-D-苯丙氨酸-氧肟酸N，O-二甲酯在0℃，向Z(D)Phe-OH(31g，0.103mol)在無水二氯甲烷(300ml)中的溶液中加入N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(21.21g，0.103mol)和羥基苯并三唑水合物(15.76g，0.103mol)。在0℃攪拌10分鐘，向反應(yīng)物中加入N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽(10.04g，0.103mol)和N-甲基嗎啉(10.40g，0.103mol)，并在25℃攪拌12小時。過濾該混合物，用二氯甲烷洗滌，并真空濃縮濾液，得到油狀的粗品氧肟酸酯。該粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，乙酸乙酯/環(huán)己烷4∶6)，得到無色油狀的標(biāo)題化合物(29.8g，產(chǎn)率85％)。Rf約等于0.37(乙酸乙酯∶環(huán)己烷1∶1)。
步驟BN-芐氧羰基-D-苯丙氨醛在0℃和惰性氣氛下，向氧肟酸酯(29g，0.084mol)在無水乙醚(500ml)中的溶液中加入氫化鋰鋁(3.8g，0.1mol)。攪拌1小時。小心地加入1M硫酸氫鉀溶液(150ml)。分離各相，用乙醚(2×150ml)萃取水層2次。用3N鹽酸水溶液(50ml)、水(50ml)和鹽水(50ml)洗滌合并的有機(jī)層。用無水硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮，得到標(biāo)題化合物。在乙酸乙酯/戊烷中重結(jié)晶進(jìn)行純化(10.9g，產(chǎn)率46％)。Rf約等于0.41(乙酸乙酯∶環(huán)己烷1∶1)。
步驟C4-D-N-芐氧羰基氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基戊酸乙酯在氮?dú)夥障?，向在無水四氫呋喃(15ml)中的鋅(2.30g，35.2mAtg)懸浮液中加入溴二氟乙酸乙酯(7.14g，35.2mmol)和N-芐氧羰基-(D)-苯丙氨醛(4.75g，16.8mmol)在無水四氫呋喃(30ml)中的混合物。再加入2ml該溶液后，在攪拌下將該懸浮液加熱回流。通過緩緩加入(滴加)剩余的醛和溴酯溶液保持適度地回流。添加完成后，在室溫下攪拌該混合物4小時。通過加入1N硫酸氫鉀(30ml)進(jìn)行水解。用乙酸乙酯萃取(3×30ml)該溶液。用鹽水洗滌合并的有機(jī)層，并用無水硫酸鎂干燥。過濾并真空濃縮濾液。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，乙酸乙酯∶環(huán)己烷1∶9)，得到白色固體的標(biāo)題化合物(2.95g，產(chǎn)率43％)。Rf約等于0.50(乙酸乙酯∶環(huán)己烷1∶1)。C21H23NO5F2的分析計算值C，61.91；H，5.69；N，3.44。實(shí)測值C，62.19；H，5.75；N，3.55。步驟D4-D-N-芐氧羰基氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-芐基戊酰胺將實(shí)施例23步驟C的酯(1.42g，3.5mmol)和芐胺(1.93g，18mmol)在無水四氫呋喃(10ml)中的溶液在25℃攪拌12小時。用乙酸乙酯(100ml)萃取，并用1N鹽酸水溶液(3×15ml)、水(15ml)和鹽水(15ml)洗滌。用無水硫酸鎂干燥，過濾并濃縮濾液。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，乙酸乙酯∶環(huán)己烷3∶7至乙酸乙酯梯度洗脫)。得到白色固體標(biāo)題化合物(1.16g，產(chǎn)率71％)。Rf約等于0.40(乙酸乙酯∶環(huán)己烷1∶1)。MSMH+＝469。
步驟E4-D-(N-芐氧羰基)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-芐基戊酰胺向在無水二氯甲烷中的Dess-Martin全碘烷(periodinane)試劑(0.36g，0.85mmol)的混合物中加入實(shí)施例23步驟D的醇(0.11g，0.23mmol)在二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(2ml，1ml)中的溶液，并在25℃攪拌3小時。真空蒸發(fā)溶劑，粗品殘余物經(jīng)快速層析(硅膠，乙酸乙酯∶環(huán)己烷3∶7)，然后經(jīng)重結(jié)晶(乙酸乙酯/戊烷)純化。得到白色固體標(biāo)題化合物(0.074g，產(chǎn)率69％)。Rf約等于0.45(乙酸乙酯∶環(huán)己烷1∶1)。C26H24N2O4F2.0.5H2O的分析計算值C，65.68；H，5.30；N，5.89。實(shí)測值C，66.05；H，5.22；N，5.97。MSMH+＝467。熔點(diǎn)130℃。
實(shí)施例24 制備4-(N-芐氧羰基-L-正纈氨酰)氨基-2.2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-芐基戊酰胺步驟A4-(N-芐氧羰基-L-正纈氨酰)氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-芐基戊酰胺按照實(shí)施例8步驟C所述的偶連方法，由實(shí)施例7步驟D所述的胺得到標(biāo)題化合物(產(chǎn)率65％)。Rf約等于0.40(乙酸乙酯∶環(huán)己烷1∶1)。MSMH+＝568。
步驟B4-(N-芐氧基-L-正纈氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-芐基戊酰胺向在二氯甲烷(5ml)中的Dess-Martin全碘烷(periodinane)試劑(0.271g，0.64mmol)的混合物中加入實(shí)施例23步驟A所述的醇(0.09g，0.16mmol)在5ml二氯甲烷中的溶液。在25℃攪拌4小時。真空濃縮，粗品殘余物經(jīng)快速層析(硅膠，乙酸乙酯∶環(huán)己烷2∶8)，然后經(jīng)重結(jié)晶(乙酸乙酯/戊烷)純化。得到白色固體標(biāo)題化合物(0.04g，產(chǎn)率45％)。Rf約等于0.41(乙酸乙酯∶環(huán)己烷1∶1)。MSMH+＝566。C31H33N3O5F2.0.5H2O的分析計算值C，64.80；H，5.96；N，7.31。實(shí)測值C，64.82；H，5.92；N，7.16。
實(shí)施例25 制備4-(N-芐氧羰基-L-叔亮氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-三甲基甲硅烷基甲基戊酰胺步驟A4-(N-芐氧羰基-L-叔亮氨酰)氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-三甲基甲硅烷基甲基戊酰胺在室溫下，將實(shí)施例8步驟B所述的胺[制備成其三氟乙酸鹽(0.222g，0.5mmol)]、N-甲基嗎啉(115μl，1.05mmol)和芐氧羰基-L-叔亮氨酸酐[預(yù)先由酸和N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺在3ml二甲基甲酰胺中就地制備(0.556g，1.1mmol)]的混合物攪拌過夜。該混合物用乙酸乙酯稀釋，用水洗滌2次，并真空濃縮水層。粗品殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚3∶7)，得到標(biāo)題的醇，產(chǎn)率52％(0.15g)。Rf約等于0.69(乙酸乙酯∶石油醚4∶6)。
步驟B4-(N-芐氧羰基-L-叔亮氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-三甲基甲硅烷基甲基戊酰胺采用實(shí)施例8步驟D所述的Swern氧化方法，由實(shí)施例25步驟A所述的醇制備標(biāo)題的酮，產(chǎn)率69％。Rf約等于0.30(乙酸乙酯∶石油醚3∶7)。C29H39F2N3O5Si，0.5H2O的分析計算值C，59.57；H，6.90；N.7.19。實(shí)測值C，59.65；H，6.89；N，7.00。
實(shí)施例26 制備6-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-4，4-二氟-1-苯基-7-甲基-3，5-二氧代辛烷步驟A芐氧羰基-L-纈氨酰纈氨醛采用實(shí)施例12步驟D的還原方法，由N-芐氧羰基-L-纈氨酰-L-纈氨酸乙酯制備標(biāo)題的醛，產(chǎn)率43％。Rf約等于0.25(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚3∶7)。MSMH+＝335，MNH4+＝352。
步驟B6-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-4，4-二氟-1-苯基-7-甲基-5-羥基-3-氧代辛烷按照實(shí)施例6步驟C的方法，由實(shí)施例26步驟A的醛和1-氯-1，1-二氟-2-氧代-4-苯基丁烷制備標(biāo)題的二氟醇，產(chǎn)率39％。Rf約等于0.43(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚3∶7)。MSMH+＝519，MNH4+＝536。C28H36F2N2O5的分析計算值C，64.85；H，7.00；N，5.40。實(shí)測值C，65.11；H，7.25；N，5.22。
步驟C6-(N-芐氧羰基-L-纈氨酰)氨基-4，4-二氟-1-苯基-7-甲基-3，5-二氧代辛烷采用實(shí)施例8步驟D所述的Swern氧化方法，由實(shí)施例26步驟C的醇制備標(biāo)題的酮，產(chǎn)率34％。Rf約等于0.31(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚2∶8)。MSMH+＝517，MNH4+＝534。C28H34F2N2O5的分析計算值C，65.10；H，6.63；N，5.42。實(shí)測值C，65.22；H，6.90；N，5.05。
實(shí)施例27 制備(1-苯乙基-2-氧基)羰基-L-纈氨酰-苯丙氨醛步驟A(1-苯乙基-2-氧)羰基-L-纈氨酸甲酯用注射器(用3分鐘)向羰基二咪唑(4.02g，24.8mmol)在無水二氯甲烷(10ml)中的懸浮液中滴加在二氯甲烷(3ml)中的纈氨酸甲酯(1.63g，12.4mmol)。將反應(yīng)混合物均化，并在室溫下繼續(xù)攪拌15分鐘。然后將該混合物真空濃縮，得到白色固體。將該固體懸浮于無水甲苯(10ml)中，并滴加2-苯乙醇(7.4ml，62.0mmol)。反應(yīng)混合物變得澄清，將其在68℃(油浴)加熱3小時。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將殘余物溶于二氯甲烷中，用水洗滌2次，并用鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮。粗產(chǎn)物在硅膠上用己烷∶石油醚(80∶20至60∶40)作為洗脫劑進(jìn)行純化，得到2.51g(72％)所需的產(chǎn)物。
步驟B(1-苯乙基-2-氧)羰基-L-纈氨酸向?qū)嵤├?7步驟A的氨基甲酸酯(0.43g，1.54mmol)在5ml甲醇和1ml水中的混合物中加入氫氧化鋰(1.0M，1.4ml，1.4mmol)。將反應(yīng)物加熱回流(80℃)3小時，在室溫下攪拌過夜。加入更多的氫氧化鋰(1M，0.5ml)，在室溫下繼續(xù)攪拌該反應(yīng)物3小時。真空濃縮反應(yīng)混合物。加入二氯甲烷和水。分離兩層，用鹽酸(1M)酸化水層至pH1，用二氯甲烷萃取2次。合并的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾，真空濃縮，得到0.33g(81％)所需的酸。
步驟C(1-苯乙基-2-氧)羰基-L-纈氨酰-L-苯丙氨醇向?qū)嵤├?7步驟C的酸(0.33g，0.88mmol)、苯丙氨醇(0.3g，1.24mmol)、1-羥基苯并三唑(0.27g，1.24mmol)、N-甲基嗎啉(0.22ml，1.24mmol)在二氯甲烷(10ml)中的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺(0.33g，1.24mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)混合物過夜，用二氯甲烷稀釋，用1N鹽酸、水、飽和碳酸氫鈉、水和鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，過濾并真空濃縮。剩余的白色松散固體從己烷/乙酸乙酯中結(jié)晶，得到白色固體標(biāo)題化合物(0.35g，71％)。
步驟D(1-苯乙基-2-氧)羰基-L-纈氨酰-苯丙氨醛采用實(shí)施例8步驟D所述的氧化方法，由實(shí)施例27步驟C的醇制備標(biāo)題化合物，產(chǎn)率54％。C23H28N2O4的分析計算值C，69.67；H，7.1 2；N，7.07。實(shí)測值C，69.61；H，7.22；N，6.77。
實(shí)施例28 制備4-(N-芐氧羰基-L-叔亮氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-芐基戊酰胺步驟A4-(N-芐氧羰基-L-叔亮氨酰)氨基-2，2-二氟-3-羥基-5-苯基-N-芐基戊酰胺采用實(shí)施例25步驟A所述的偶連方法，由實(shí)施例7步驟D所述的胺制備標(biāo)題化合物，產(chǎn)率77％。Rf約等于0.37(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚4∶6)。
步驟B4-(N-芐氧羰基-L-叔亮氨酰)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-N-芐基戊酰胺采用實(shí)施例8步驟D所述的Swern氧化方法，由實(shí)施例28步驟A的醇制備標(biāo)題的最終化合物，產(chǎn)率85％。Rf約等于0.24(硅膠，乙酸乙酯∶石油醚3∶7)。C32H35F2N3O5的分析計算值C，66.31；H，6.03；N，7.25。實(shí)測值C，65.99；H，6.15；N，7.13。
實(shí)施例29通過各種β-淀粉樣蛋白斑形成的體外和體內(nèi)模型可以證明本發(fā)明化合物在防止或減少β-淀粉樣蛋白斑的聚積方面的活性以及因此適用于治療阿爾茨海默型的老年性癡呆和已知與β-淀粉樣蛋白斑形成有關(guān)的其它疾病例如唐氏綜合征。例如，可以通過下列分析1-3所述的幾種細(xì)胞和無細(xì)胞體外方法證明本發(fā)明的化合物防止或減少β-淀粉樣蛋白斑聚積的能力。這些分析利用的是天然β-APP被所有細(xì)胞表達(dá)，并且經(jīng)加工產(chǎn)生11-12KDa C端片段和β-淀粉樣蛋白。如果需要，可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法，通過轉(zhuǎn)染β-APP cDNA序列(例如β-APP(751))至細(xì)胞中提高內(nèi)源性β-APP的表達(dá)水平。
體外分析分析#1免疫沉淀細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)大量βAPP-695的CHO-K1(中國蒼鼠卵巢；得自ATCC)細(xì)胞系，也稱作“CP-6-36”，用于篩選抑制劑。也可以使用并且已經(jīng)使用了其它哺乳動物的培養(yǎng)細(xì)胞系。例如，在同樣的分析條件下，人神經(jīng)元細(xì)胞系SK-N-MC(得自ATCC)顯示了好的結(jié)果。產(chǎn)生βA4不需要用βAPP-695轉(zhuǎn)染；這僅僅加強(qiáng)βA4的信號。在實(shí)驗的準(zhǔn)備中，將CP-6-36細(xì)胞以低密度接種于10cm盤中，并在37℃/5％CO2培養(yǎng)器中生長2-4天，得到融合單層(每盤～1.5×107個細(xì)胞)；生長介質(zhì)由DMEM21/Coon F12(1∶1)＋10％FBS(胎牛血清)＋50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素組成。處理首先在CP-6-36細(xì)胞上，以200μM的劑量對所有化合物進(jìn)行篩選。在試驗開始前，用細(xì)胞培養(yǎng)級的DMSO作溶劑，制備每種試驗化合物的20mM儲液。然后在無血清、缺少半胱氨酸和蛋氨酸的EMEM基質(zhì)(“Cys-/Met-EMEM”)中將各20mM的化合物儲液稀釋100倍，得到在該基質(zhì)中200μM的化合物最終濃度。在開始實(shí)驗之前，通過用3ml/盤的Cys-/Met-EMEM洗滌各細(xì)胞單層3次，然后用3ml/盤的同樣的培養(yǎng)基培養(yǎng)(37℃/5％CO2)培養(yǎng)15分鐘，使細(xì)胞對半胱氨酸和蛋氨酸“饑餓”。從各盤中吸出培養(yǎng)基，然后以3ml/盤的量加入含200μM化合物的培養(yǎng)基。如上所述將這些板和“對照”盤(含1％DMSO且不含化合物的3ml/盤Cys-/Met-EMEM)培養(yǎng)15分鐘。吸出培養(yǎng)基，然后向每盤中加入～150μCi/ml的3ml前一步驟的現(xiàn)含35S-反式標(biāo)記物的培養(yǎng)基，即含35-S標(biāo)記的半胱氨酸和蛋氨酸)。如上所述將細(xì)胞培養(yǎng)4小時。收集在4小時標(biāo)記結(jié)束時，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的總體外觀，并檢查化合物的總毒性作用，然后將培養(yǎng)盤置于冰上。將每盤中條件培養(yǎng)基移入15ml錐形螺帽管中，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，并移入一套相似的管中，留下細(xì)胞團(tuán)塊。用2ml/盤磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌標(biāo)記的單細(xì)胞層3次，然后向每盤中加入1ml促使細(xì)胞溶解的緩沖液(5％Triton X-114；20mMTris，pH7.5；300mM氯化鈉；蛋白酶抑制劑)，之后在冰上培養(yǎng)10分鐘。從盤上刮下細(xì)胞溶解產(chǎn)物并移入1.5ml微離心管中。在冰上將溶胞產(chǎn)物進(jìn)行4分鐘聲處理，在微離心管中高速離心10分鐘，然后移入15ml錐形螺帽管中，留下細(xì)胞碎屑團(tuán)塊。免疫沉淀在免疫沉淀制備中，用5ml的1×RIPA緩沖液(10mM Tris，pH8.0；150mM NaCl；0.125％NaN3；1％Triton X-100；1％脫氧膽酸鹽；0.1 SDS)稀釋在前面收集的溶胞產(chǎn)物；條件培養(yǎng)基樣品不加稀釋就會發(fā)生免疫沉淀。首先通過向每一樣品中加入5μl正常的兔血清、在室溫振搖10分鐘，然后加入100μl在RIPA緩沖液中的10％的蛋白A-Sepharose(PAS)，并在室溫振搖1.5小時，使條件培養(yǎng)基和溶胞產(chǎn)物預(yù)澄清。然后以3000rpm的速度將樣品離心，將上清液移入新的15ml管中。然后通過向各管中加入30μl識別βAPP羧基端的抗體，在室溫振搖10分鐘，然后加入100μl 10％PAS并在室溫振搖1.5小時，使預(yù)澄清的溶胞產(chǎn)物免疫沉淀。使預(yù)澄清的條件培養(yǎng)基樣品同樣免疫沉淀，不同的是使用45μl識別βA4的抗體代替識別羧基端的抗體。然后以3000rpm的轉(zhuǎn)速將所用樣品離心1分鐘，得到PAS-抗體配合物的團(tuán)塊，充分洗滌所得團(tuán)塊；用高鹽緩沖液(50mM Tris，pH7.5；500mM NaCl；5mM EDTA；0.5％Nonidet P-40)洗滌4次，用低鹽緩沖液(50mM Tris，pH7.5；150mM NaCl；5mM EDTA；0.5Nonidet P-40)洗滌3次，并用10mM Tris緩沖液(pH7.5)洗滌2次。凝膠電泳將經(jīng)過洗滌的團(tuán)塊在50μl的2×Laemmli凝膠充填緩沖液中煮沸5分鐘。將這些樣品和分子量標(biāo)記物裝到含有Tris/Tricine儲存緩沖液的16.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。該凝膠在90V電壓下電泳-18-20小時，用20％甲醇/20％乙酸固定，在65℃于濾紙上干燥2小時。采用放射自顯影顯示結(jié)果。分析通過分析放射自顯影得出結(jié)果。陽性作用的化合物相對于對照樣品能夠抑制4kDa βA4蛋白帶，另一些化合物相對于對照樣品則增加9-12kDa C-端蛋白帶的水平。以對照帶為標(biāo)準(zhǔn)，通過對各帶進(jìn)行密度測定掃描，可以將對βA4的抑制和C-端帶的增加定量。相對于對照樣品帶，陰性作用化合物在4kDaβA4或9-12kDa C-端蛋白帶的產(chǎn)量上沒有改變。其它試驗如果發(fā)現(xiàn)某化合物有活性(即，通過凝膠電泳表明，顯著抑制4kDaβA4，同時使C-端片段增加)，則進(jìn)行劑量反應(yīng)實(shí)驗，以測定產(chǎn)生上述影響所需的最小化合物劑量。通常使用的劑量范圍是12.5-300μM，對于除了劑量變化以外，進(jìn)行與上述同樣的實(shí)驗。如果發(fā)現(xiàn)某化合物僅略有活性或者根本沒有活性，則使用更高的劑量，通常是400μM，重復(fù)該實(shí)驗。如果發(fā)現(xiàn)某化合物有毒(即在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不健康，或者在凝膠分析后溶胞產(chǎn)物標(biāo)記得不好)，則在更低的劑量下，例如在25、50和100μM下，對該化合物進(jìn)行試驗，以測定無毒劑量下該化合物的作用。
分析#2放射免疫RIA培養(yǎng)基的制備和Sepak濃縮培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞例如中國蒼鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或人神經(jīng)元SK-N-MC細(xì)胞產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白并將該肽分泌至培養(yǎng)基中。如果用有效的β-淀粉樣蛋白形成抑制劑處理細(xì)胞，在經(jīng)過處理的細(xì)胞的培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)可溶性β-淀粉樣蛋白。與分析#1相同，可以對不同劑量的抑制化合物進(jìn)行試驗，從200μM開始。在所評估化合物存在或不存在條件下，在2ml EMEM(無血清)中，于37℃對野生型和用β-APP695轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞的10cm板進(jìn)行4-6小時的培養(yǎng)。除去培養(yǎng)基，以1500rpm的轉(zhuǎn)速(Sorvall RT6000B)離心10分鐘，以除去細(xì)胞/碎屑。培養(yǎng)基可以直接使用或者在-20℃貯存。進(jìn)行Sepak C18步驟以除去鹽和其它不希望有的污染物并將β-淀粉樣蛋白肽濃縮。使培養(yǎng)基樣品(2ml)通過C18 Sepak柱，用2ml在0.1％TFA中的5％CH3CN洗滌Sepak柱。棄去迅速流出的液體和5％CH3CN洗滌液。用2ml在0.1％TFA中的25％CH3CN洗脫Sepak柱，然后用2ml在0.1％TFA中的50％CH3CN洗脫Sepak柱。收集兩種洗脫液，在高速真空(speedvac)中干燥，并溶于125μl至250μl10％異丙醇的水溶液中，以進(jìn)行RIA分析。25％CH3CN流份含有培養(yǎng)基中大多數(shù)的酚紅，但是不含β-淀粉樣蛋白肽。50％CH3CN流份含有β-淀粉樣蛋白肽。用125I標(biāo)記的β-淀粉樣蛋白1-40的制備和HPLC純化采用氯胺T方法，用125I標(biāo)記合成的β-淀粉樣蛋白1-40(10μg)。該反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。在eppendorf管中，向10μlβ-淀粉樣蛋白1-40(1mg/ml，在20％異丙醇中)和80μl 0.1M磷酸鈉(pH7.4)中加入10μl125I(1mCi，在NAOH溶液中)并混合。通過加入30μl氯胺T(1mg/ml，在0.1M磷酸鈉中，pH7.4)，混合并且培養(yǎng)1分鐘開始反應(yīng)。通過加入150μl焦亞硫酸氫鈉(2mg/ml，0.1M磷酸鈉，pH7.4)終止反應(yīng)。
用等體積的水稀釋反應(yīng)混合物(280μl)，使標(biāo)記的肽通過Sepak C18柱而分離。用5％CH3CN洗滌Sepak柱兩次(各1ml)，用50％CH3CN洗滌3次(各1ml)，再用95％CH3CN洗滌2次(各1ml)。幾乎所有標(biāo)記的肽在第1個50％CH3CN洗脫液中洗脫。該洗脫液在-70℃貯存，根據(jù)RIA的需要經(jīng)HPLC純化。
在C8柱(4.6mm×3cm，Brownlee)上經(jīng)反相HPLC純化標(biāo)記的肽。以0.5ml/分鐘的流速，以在0.1％TFA中的5％至45％CH3CN的梯度洗柱30分鐘。收集流份(0.5ml)并進(jìn)行計數(shù)。將含有標(biāo)記肽的峰值流份在-20℃貯存，并在3天內(nèi)用于RIA。放射免疫分析RIA中所用的緩沖液是1)RIA緩沖液0.1M磷酸鈉，pH7.4，含有0.1％BSA和0.1％Triton-X-100。2)樣品緩沖液10％異丙醇的水溶液。3)示蹤緩沖液0.2M磷酸鈉，pH7.4，含有在0.1％Triton-X-100中的0.1％BSA。如果在競爭配體不存在下約30％標(biāo)記的肽結(jié)合，則使用β-淀粉樣蛋白特異性抗體的稀釋液。抗體的稀釋液在RIA緩沖液中配制。RIA中使用的抗體包括3種抗人β-淀粉樣蛋白1-40合成肽的血清(BA#1，BA#2和6514)。BA#1以最終1/900的稀釋液使用，BA#2以最終1/1600的稀釋液使用，6514以最終1/2500的稀釋液使用。在示蹤緩沖液中稀釋經(jīng)HPLC純化的標(biāo)記肽，達(dá)到在50μl中7000-9000cpm。所有頂替反應(yīng)在高濃度(2.5μM)β-淀粉樣蛋白1-40存在進(jìn)行。在樣品緩沖液中制備β-淀粉樣蛋白1-40標(biāo)準(zhǔn)品。分析體積為200μl。按下列順序加入各成分100μl Ab，在RIA緩沖液中50μl未知的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品或TD，在樣品緩沖液中50μl標(biāo)記的肽(7000-9000pm，在示蹤緩沖液中)將上述樣品混合，并在4℃培養(yǎng)過夜。為了區(qū)分結(jié)合的計數(shù)與游離的計數(shù)，用聚乙二醇(PEG)終止該實(shí)驗。向每一分析管中加入50μl正常的兔血清，然后加入800μl PEG(MW6000-8000，15.8％，在RIA緩沖液中)。在4℃培養(yǎng)各樣品10分鐘，以3200rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘(Sorvall，RT600B)。吸出上清液，在γ計數(shù)器上對沉淀的團(tuán)塊進(jìn)行計數(shù)。分析以標(biāo)記的β-淀粉樣蛋白示蹤物的頂替為依據(jù)解釋抗體結(jié)合的結(jié)果。陽性結(jié)果是沒有觀察到示蹤物頂替，即培養(yǎng)基不含有分泌的β-淀粉樣蛋白，這表明試驗化合物有效地抑制了β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生。陰性結(jié)果是觀察到抗體結(jié)合示蹤物的頂替，并且與未處理的對照細(xì)胞相同。
也可以使用酶聯(lián)免疫分析(ELSIA)對活性化合物進(jìn)行鑒定。如分析#1所述制備產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白的經(jīng)過培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞(例如CHO CP-6或SK-N-MC)并用化合物進(jìn)行處理，不同的是不對細(xì)胞蛋白進(jìn)行放射標(biāo)記。收集處理細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基，通過低速離心消除細(xì)胞碎屑。然后使用β-淀粉樣蛋白特異性抗體，在96孔ELISA培養(yǎng)皿上對條件培養(yǎng)基進(jìn)行分析。一種β-淀粉樣蛋白抗體用作培養(yǎng)基樣品中存在的β-淀粉樣蛋白俘獲劑，識別β-淀粉樣蛋白上不同表位的第二種抗體用作檢測劑復(fù)合物的成分。第二種β-淀粉樣蛋白抗體與生物素偶聯(lián)，該生物素可以被鏈酶抗生物素蛋白檢測到。與辣根過氧化物酶偶連的第三種抗體用于檢測β-淀粉樣蛋白抗體鏈酶抗生物素蛋白復(fù)合物。加入鄰苯二胺基質(zhì)底物和H2O2以及檸檬酸磷酸鹽(pH5)可以使過氧化物酶的活性通過記錄在OD490nm處混合物的比色變化而定量。通常，除了作為標(biāo)準(zhǔn)品的合成β-淀粉樣蛋白1-40之外，在96孔板上制備一系列3倍稀釋的各培養(yǎng)基樣品稀釋液。陽性結(jié)果是很少或沒有反應(yīng)活性，即在OD490nm處無吸收，這表明由于試驗化合物的抑制作用，在培養(yǎng)基樣品中不存在β-淀粉樣蛋白。部分活性抑制劑與未處理細(xì)胞的對照培養(yǎng)基樣品相比，在OD490nm有一定程度、但是不相等的吸收。通過將樣品值與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較可以準(zhǔn)確地定量。
體內(nèi)分析本發(fā)明化合物防止或減少β-淀粉樣蛋白斑的聚積的活性可以在β-淀粉樣蛋白斑聚積的轉(zhuǎn)基因模型(例如轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)基因大鼠)中以及使用自然遺傳性傾向形成β-淀粉樣蛋白斑的狗的狗模型中進(jìn)行證明。在例如PCT/US91/04447中描述了在神經(jīng)元細(xì)胞中超表達(dá)人β-APP(751)或β-APP(770)、并且顯表現(xiàn)出與阿爾茨海默癥有關(guān)的組織病理學(xué)特征的轉(zhuǎn)基因小鼠。在這些小鼠模型中，與β-淀粉樣蛋白斑形成有關(guān)的組織病理學(xué)和/或綜合征例如記憶喪失，可以用于證實(shí)該化合物能夠治療因β-淀粉樣蛋白斑形成所引起的疾病，例如阿爾茨海默癥和與唐氏綜合征有關(guān)的記憶損害。
由于轉(zhuǎn)基因小鼠的組織病理學(xué)隨著動物年齡的增加更為頻繁，因此2月齡的小鼠是適合需要的。2月齡動物具有最小的病理學(xué)特征，這在抑制藥物不存在下將隨著時間而增加。所有的實(shí)驗動物均為單一的純種血統(tǒng)。一組小鼠(n＝12)僅接受賦形劑；第二組小鼠(n＝12)接受低劑量的藥物；第三組小鼠(n＝12)接受中等劑量的藥物；第四組小鼠(n＝12)接受高劑量的藥物。根據(jù)體重、化合物的半衰期等，由上述分析確定劑量。最好對小鼠進(jìn)行為期幾個月的治療。根據(jù)化合物的情況，通過注射、口服、控制釋放的植入物等投送化合物。采用組織免疫化學(xué)法對治療進(jìn)行評估，由未目擊實(shí)驗治療的研究人員進(jìn)行打分，測定在腦4個冠狀中線區(qū)域中β-淀粉樣蛋白免疫活性沉積的頻率。在研究中所用的所有小鼠采用同樣數(shù)目的腦組織分區(qū)，對另一種病理學(xué)標(biāo)記物Alz50的免疫活性也進(jìn)行出現(xiàn)頻率的打分。藥物作用的陽性結(jié)果應(yīng)該是沒有或者減少了病理學(xué)標(biāo)記物的出現(xiàn)頻率。β-淀粉樣蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠獨(dú)特的病理學(xué)和/或行為聯(lián)系也可以用于證明藥物的作用。
已有報道，某些犬類具有β-淀粉樣蛋白聚積(Giaccone等，Neuroscience Letters Vol.114，第178-183頁(1990))。老年非人類靈長目表現(xiàn)出β-淀粉樣蛋白病理學(xué)特征以及記憶損傷(Cork等，American Journal of Pathology，Vol.137，第1383-1392頁(1990)；Podlisny等，American Journal of Pathology，Vol.138，第1423-1425頁(1991))。按照略微不同的實(shí)驗設(shè)計，用犬類和非人類靈長目進(jìn)行的試驗用藥時間較長。
可以給患者施用有效量的式I化合物或者多于一種的式I化合物的混合物，以防止異常的β-淀粉樣蛋白斑沉積，并且治療與β-淀粉樣蛋白斑異常沉積有關(guān)的疾病，例如阿爾茨海默型的老年癡呆或唐氏綜合征。用于防止異常的β-淀粉樣蛋白斑沉積以及治療阿爾茨海默型的老年癡呆或唐氏綜合征的具體劑量取決于多種因素，例如患者的大小、類型和年齡以及疾病的嚴(yán)重程度，所有這些因素通常是公知的，并且由治療患者的診斷醫(yī)生考慮。通常，該化合物的施用劑量為每公斤體重0.2-20毫克，優(yōu)選為0.5-5mg/Kg。該化合物可以以含有25mg-250mg式I化合物的單次劑量或多單元劑量施用。
對于口服施用，該化合物可以配制成固體或液體制劑，例如膠囊、丸劑、片劑、錠劑、粉末、溶液、懸浮液或乳液。固體單位劑型可以是膠囊，該膠囊可以是普通的明膠膠囊，它含有例如潤滑劑或惰性填充劑例如乳糖、蔗糖或玉米淀粉。另一種實(shí)施方式是，通式I的化合物可以與常規(guī)的片劑基質(zhì)(例如乳糖、蔗糖和玉米淀粉)以及與粘合劑(例如阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠)、崩解劑(例如土豆淀粉或藻酸)和潤滑劑(例如硬脂酸或硬脂酸鎂)一起壓片。
對于非腸道施用，該化合物可以以可注射劑量的、在生理學(xué)可接受的稀釋劑與可藥用載體中的化合物的溶液或懸浮液的形式施用，所述稀釋劑和載體可以是無菌液體例如水、醇、油和其它可接受的有機(jī)溶劑，其中加有或者不加有表面活性劑和其它可藥用的輔劑。在這些制劑中可以使用的油是例如礦物油、動物油。植物油或合成的油，例如花生油、豆油和礦物油。通常，水、鹽水、葡萄糖水溶液和有關(guān)的糖溶液、乙醇和二元醇例如丙二醇或聚乙二醇、或者2-吡咯烷是優(yōu)選的液體載體，特別是注射液的載體。
該化合物可以以儲存注射液或腦植入制劑的的形式施用，該制劑可以配制成持續(xù)釋放活性成分的形式?；钚猿煞挚梢詨嚎s成小丸或者小的圓柱體，并以儲存注射液或植入物的形式植入皮下、肌肉內(nèi)或腦中。植入物可以使用惰性材料例如可生物降解的聚合物或合成聚硅氧烷，例如SilasticR(由Dow-Corning公司生產(chǎn)的聚硅氧烷橡膠)。
本發(fā)明化合物還可以表皮施用。這可以通過簡單地制備所施用化合物的溶液實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選使用已知的促進(jìn)透皮吸收的溶劑例如乙醇或二甲基亞砜(DMSO)制備該溶液，可以含有或者不含其它賦形劑。優(yōu)選使用藥物儲庫和多孔膜性的貼劑或者固體基質(zhì)的貼劑。
某些適合的透皮設(shè)計描述于US 3,742,951、3,797,494、3,996,934和4,013,894中。這些設(shè)計通常包括支撐膜(這是它的正表面)，作為另一表面的活性藥物可滲透粘附層和嵌在兩層表面之間的含活性藥物的至少一個藥物儲庫?；蛘?，活性藥物可以包含在分布于整個可滲透粘附層中的許多微囊中。在任何一種情況下，活性藥物透過膜從藥物儲庫或微囊中連續(xù)地釋放到活性藥物可滲透粘附層上，該粘附層與受體的皮膚或粘膜接觸。如果活性藥物經(jīng)皮膚吸收，則給受體施用控制和預(yù)定流速的活性藥物。如果是微囊，則包囊劑也可起到膜的作用。
在本發(fā)明化合物透皮施用的另一種設(shè)計中，藥物活性化合物包含在以漸進(jìn)、恒定和控制的速度釋放藥物的基質(zhì)中。該基質(zhì)是可透過的、通過擴(kuò)散和微孔流動釋放化合物。不需要膜的這種系統(tǒng)描述于US 3,291,636中。在這些系統(tǒng)中至少可能有兩種類型的釋放。當(dāng)基質(zhì)為非孔基質(zhì)時，經(jīng)擴(kuò)散釋放。藥物活性化合物溶解于基質(zhì)中，并通過基質(zhì)擴(kuò)散。當(dāng)藥物活性化合物通過液相轉(zhuǎn)運(yùn)到基質(zhì)的孔中時，通過微孔流動釋放藥物。
正如許多類型化合物通常適合于任何具有最終治療用途的藥理活性應(yīng)用所證實(shí)的，由于其總的治療指數(shù)和其生物化學(xué)及藥理學(xué)性質(zhì)，某些小組和某些特定類型的化合物是優(yōu)選的。例如優(yōu)選其中P4是一個鍵的化合物。
申請人推薦其中X1是H或CF2C(＝O)W的那些化合物。C1-6亞烷基優(yōu)選為C1-3亞烷基，更優(yōu)選亞甲基或亞乙基，最優(yōu)選支鏈的亞乙基。芳烷基優(yōu)選芐基或苯乙基，芳基優(yōu)選苯基。K-P4-P3-P2部分優(yōu)選保護(hù)基(K)和一種氨基酸，優(yōu)選一個纈氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸殘基。R優(yōu)選芐基、異丙基或具有一個取代基的取代芐基。
序列表(1)一般資料(i)申請人Cordell，BarbaraSchirlin，DanielPeet，NortonHigaki，JeffreyVan Dorsselaer，VivianeAngelastro，Michael R.(ii)發(fā)明題目抑制β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的抑制劑(iii)序列數(shù)5(iv)通信地址(A)地址Marion Merrell Dow Inc.(B)街道P.O.Box 156300 2110 E.Galbraith Rd.(C)城市Cincinnati(D)州Ohio(E)國家美國(F)郵政編碼(ZIP)45215-6300(v)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申請資料(A)申請?zhí)朩O(B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朎P 93402398.7(B)申請日01-OCT-1993(viii)代理人/公司資料(A)姓名Moon，Carolyn D(B)登記號33，022(C)卷號M01714A(ix)通訊資料(A)電話513-948-7960(B)電傳513-948-7961或4681(C)電報214320(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa Xaa Xaa Xaa1(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Xaa Xaa Xaa1(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Xaa Xaa Xaa Xaa1(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Xaa Xaa Xaa Xaa1(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度4個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Xaa Xaa Xaa Xaa權(quán)利要求
1.通式IB的化合物或其水合物、立體異構(gòu)體、等排物或藥物可接受的鹽(相信它們是以前未公開過的式IA化合物)Ka-P4a-P3a-P2a-NH-CH(Ra)-[C(＝O)]n-Xa(肽序列2)IB其中Xa是H、CHF2、CF3、CF2F3、CF2CH2NHC(＝O)R1a、CHFCH2NHC(＝O)R1a、CF2C(＝O)Wa、C(＝O)NHR1a、B(OH)2或C(＝O)R1a，條件是當(dāng)Xa為H時，Ra是CH2Si(C1-C6烷基)2(C1-C6鏈烯基)、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、被苯甲?；鵑HC(＝O)R1a、NHC(＝NH)NH2、鹵素或羥基取代的芐基；當(dāng)Xa為CF3、CHF2、C(＝O)NHR1a或CF2(＝O)NHR1a時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、或被羥基取代的芐基；當(dāng)Xa為CF2CH2NHC(＝O)R1a時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、(CH2)m-萘基或被羥基取代的芐基；當(dāng)Xa是CF2C(＝O)NH-芐基時，Ra不是芐基、叔丁基、CH2Si(CH3)3或(CH2)m-萘基；當(dāng)Xa為CF2C(＝O)NHR1時，Ra不是被C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基、芐氧基或-O-(CH2)m-苯基取代的芐基；以及當(dāng)Xa為C(＝O)Ra時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、C1-C4亞烷基-O-C1-C10烷基或(CH2)m萘基；Ra是C1-C10烷基、芐基、CH2Si(C1-C6烷基)2(Ya)、C1-C4亞烷基-O-R1a、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、(CH2)m-萘基、或取代的芐基，該取代基為獨(dú)立地選自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基、芐氧基、羥基、NHC(＝NH)NH2、NR1aH、NO2、-O-(CH2)m-芳基、NHC(＝O)R1a或鹵素的1、2或3個取代基，其中m為1或2；Ya是C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基、芳基或芳基烷基；除非Xa是B(OH)2，n是1，否則n是0；R1a是H、C1-C6烷基、芳基或芳基烷基；P2a是一個鍵、-HN-CH[CH2Si(C1-C6烷基)2(Ya)]C(＝O) -，或Leu、Ala、Met、Ile、Val、Nva、Nle、Phe、Asp、Ser、Pro、His、環(huán)戊基-甘氨酸、環(huán)己基甘氨酸、或叔亮氨酸的殘基；P3a是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；P4a是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；Ka是氫、脫氨基、甲?；?、乙?；?、琥珀?；?、苯甲?；⑹宥⊙趸驶?、芐氧羰基、甲苯磺?；⒌；?、異戊酰基、甲氧基琥珀酰基、1-金剛烷基磺酰基、1-金剛烷基乙酰基、2-羧基苯甲?；?、苯基乙?；?、叔丁基乙酰基、雙[(1-萘基)甲基]乙?；?、-Aa-Rza，其中Aa是 ；以及Rza是一種芳基或一種芳基烷基，其中該芳基含有6、10或12個碳、可以被1-3個獨(dú)立選自氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羥基、含有1-6個碳原子的烷基、含有1-6個碳原子的烷氧基、羧基、其中烷基含有1-6個碳的烷基羰基氨基、5-四唑基和含有1-15個碳原子的酰基氨磺酰基(即?；被酋；突酋；被驶?的基團(tuán)適當(dāng)取代，條件是當(dāng)該酰基氨磺?；蟹蓟鶗r，該芳基可以進(jìn)一步地被選自氟、氯、溴、碘和硝基的基團(tuán)取代；和在功能上與它們等價的其它末端氨基保護(hù)基團(tuán)，或 其中Za是N或CH，以及Da是下列通式的一個基團(tuán) 并且其中R′a是H或C1-C6烷基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中Xa是CF2C(＝O)Wa。
3.權(quán)利要求2的化合物，其中Wa是NHCH2Si(CH3)。
4.權(quán)利要求3的化合物，其中Ra是芐基。
5.權(quán)利要求2的化合物，其中Wa是芳基烷基。
6.權(quán)利要求5的化合物，其中Ra是C1-4烷基。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中P4a或P3a均是鍵。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中Ka是芐氧羰基或叔丁氧羰基。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是4-(N-芐氧羰基-L-叔亮氨酰基)氨基-2，2-二氟-3-氧代-5-苯基-三甲基甲硅烷基甲基戊酰胺。
10.權(quán)利要求1的化合物，其中該化合物是2-(芐氧基羰基-L-纈氨?；?氨基-4，4-二氟-1-苯基-7-甲基-3，5-二氧代辛烷。
11.權(quán)利要求1-8的化合物，用作一種藥物活性化合物。
12.一種藥物組合物，它含有任選地與藥物可接受的載體相組合的權(quán)利要求1-8中任意一項所述的化合物。
13.任選地與藥物可接受的載體相組合的通式IA化合物或其水合物、立體異構(gòu)體、等排物或藥物可接受的鹽，用于制備治療阿爾茨海默型老年性癡呆的藥物組合物的用途K-P4-P3-P2-NH-CH(R)-[C(＝O)]n-x(肽序列1)IA其中X是H、CHF2、CF3、CF2F3、CF2CH2NHC(＝O)R1、CHFCH2NHC(＝O)R1、CF2C(＝O)W、C(＝O)NHR1、B(OH)2或C(＝O)R1，其中W為NHCH2Si(C1-C6烷基)2(Y)、NHR1或R1；R是C1-C10烷基、芐基、CH2Si(C1-C6烷基)2(Y)、C1-C4亞烷基-O-R1、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、(CH2)m-萘基、或取代的芐基，該取代基為獨(dú)立地選自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基、芐氧基、羥基、NHC(＝NH)NH2、NR1H、NO2、-O-(CH2)m-芳基、NHC(＝O)R1或鹵素的1、2或3個取代基，其中m為1或2；Y是C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基、芳基或芳基烷基；除非X是B(OH)2，n是1，否則n是0；R1是H、C1-C6烷基、芳基或芳基烷基；P2是一個鍵，-HN-CH[CH2Si(C1-C6烷基)2(B)]C(＝ O)-或Leu、Ala、Met、Ile、Val、Nva、Nle、Phe、Asp、Ser、Pro、His、環(huán)戊基-甘氨酸、環(huán)己基甘氨酸、或叔亮氨酸的殘基；P3是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；P4是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；K是氫、脫氨基、甲酰基、乙酰基、琥珀酰基、苯甲?；?、叔丁氧基羰基、芐氧羰基、甲苯磺酰基、丹酰基、異戊酰基、甲氧基琥珀?；?、1-金剛烷基磺?；?、1-金剛烷基乙酰基、2-羧基苯甲?；⒈交阴；⑹宥』阴；?、雙[(1-萘基)甲基]乙?；?、-A-Rz，其中A是 以及Rz是一種芳基或一種芳基烷基，其中該芳基含有6、10或12個碳、可以被1-3個獨(dú)立選自氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羥基、含有1-6個碳原子的烷基、含有1-6個碳原子的烷氧基、羧基、其中烷基含有1-6個碳的烷基羰基氨基、5-四唑基和含有1-15個碳原子的?；被酋；?即?；被酋；突酋；被驶?的基團(tuán)適當(dāng)取代，條件是當(dāng)該?；被酋；幸粋€芳基時，該芳基可以進(jìn)一步地被選自氟、氯、溴、碘和硝基的基團(tuán)取代；和在功能上與它們等價的其它末端氨基保護(hù)基團(tuán)，或 其中Z是N或CH，以及D是下列通式的一個基團(tuán) 并且其中R′是H或C1-C6烷基，條件是同時X不是H、R不是芐基、P2不是Val、P3不是一個鍵、P4不是一個鍵而且K不是芐氧羰基。
14.制備通式IB的化合物或其水合物、立體異構(gòu)體、等排物或藥物可接受的鹽的方法Ka-P4a-P3a-P2a-NH-CH(Ra)-[C(＝O)]n-xa(肽序列2)IB其中Xa是H、CHF2、CF3、CF2F3、CF2CH2NHC(＝O)R1a、CHFCH2NHC(＝O)R1a、CF2C(＝O)Wa、C(＝O)NHR1a、B(OH)2或C(＝O)R1a，其中W為NHCH2Si(C1-C6烷基)2(Ya)、NHR1或R1；條件是當(dāng)Xa為H時，Ra是CH2Si(C1-C6烷基)2(C1-C6鏈烯基或芳基)、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、被NHC(＝O)R1a或NHC(＝NH)NH2取代的芐基；當(dāng)Xa為CF3、CHF2、或C(＝O)NHR1a時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、CH2OH、CH(OH)CH3或被一個羥基取代的芐基；當(dāng)Xa為CF2CH2NHC(＝O)R1a時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、(CH2)m-萘基或被一個羥基取代的芐基；當(dāng)Xa是CF2C(＝O)NH-芐基時，Ra不是芐基、叔丁基-甲基、或(CH2)m-萘基；當(dāng)Xa為CF2C(＝O)NHR1a時，Ra不是CH2Si(CH3)2(Y)、C1-C10烷基、芐基、CH2OH、CH(OH)CH3或被一個羥基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基、芐氧基或-O- (CH2)m-苯基取代的芐基；當(dāng)Xa為C(＝O)R1a時，Ra不是C1-C10烷基、芐基、C1-C4亞烷基-O-C1-C10烷基或(CH2)m-萘基；當(dāng)Xa是CF2C(＝O)苯乙基時，Ra不是芐基；當(dāng)Ra為CH2Si(C1-C6烷基)2(C1-C6鏈烯基或芳基)、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、或被NHC(＝O)R1a或NHC(＝NH)NH2取代的芐基時，Xa不是C(＝O)H，Ra是C1-C10烷基、芐基、CH2Si(C1-C6烷基)2(Ya)、C1-C4亞烷基-O-R1a、CH2CH(CF3)2、CH2CH(CH3)(CF3)、(CH2)m-萘基、或取代的芐基，該取代基為獨(dú)立地選自C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基烷基、芐氧基、羥基、NHC(＝NH)NH2、NR1aH、NO2、-O-(CH2)m-芳基、NHC(＝O)R1a或鹵素的1、2或3個取代基，其中m為1或2；Ya是C1-C6烷基、C1-C6鏈烯基、芳基或芳基烷基；除非Xa是B(OH)2，n是1，否則n是0；R1a是H、C1-C6烷基、芳基或芳基烷基；P2a是一個鍵、-HN-CH[CH2Si(C1-C6烷基)2(Ya)]C(＝O) -，或Leu、Ala、Met、Ile、Val、Nva、Nle、Phe、Asp、Ser、Pro、His、環(huán)戊基-甘氨酸、環(huán)己基甘氨酸、或叔亮氨酸的殘基；P3a是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；P4a是一個鍵或Val、Leu、Ile或Met的殘基；Ka是氫、脫氨基、甲?；?、乙?；?、琥珀?；?、苯甲?；?、叔丁氧基羰基、芐氧羰基、甲苯磺酰基、丹?；?、異戊?；?、甲氧基琥珀?；?、1-金剛烷基磺?；?-金剛烷基乙?；?、2-羧基苯甲酰基、苯基乙?；⑹宥』阴；?、雙[(1-萘基)甲基]乙?；?Aa-Rza，其中Aa是 ；以及Rza是一種芳基或一種芳基烷基，其中該芳基含有6、10或12個碳、可以被1-3個獨(dú)立選自氟、氯、溴、碘、三氟甲基、羥基、含有1-6個碳原子的烷基、含有1-6個碳原子的烷氧基、羧基、其中烷基含有1-6個碳的烷基羰基氨基、5-四唑基和含有1-15個碳原子的酰基氨磺?；?即?；被酋；突酋；被驶?的基團(tuán)適當(dāng)取代，條件是當(dāng)該?；被酋；幸粋€芳基時，該芳基可以進(jìn)一步地被選自氟、氯、溴、碘和硝基的基團(tuán)取代；和在功能上與它們等價的其它末端氨基保護(hù)基團(tuán)，或 其中Za是N或CH，以及Da是下列通式的一個基團(tuán) 并且其中R′a是H或C1-C6烷基，它包括下列步驟將如本文中所定義的Ka-P4a-P3a-P2a-與如本文中所定義的H2N-CH(Ra)-C(＝O)Xa偶連，并且任選地獲得其藥物可接受的鹽，或者可替換地將如本文中所定義的Ka-P4a-P3a-P2a-與如本文中所定義的H2N-CH(Ra)-C(＝O)Xa偶連，并且將所產(chǎn)生的化合物氧化以獲得Ka-P4a-P3a-P2a-HN-CH(Ra)-C(＝O)Xa(肽序列5)，任選地獲得其藥物可接受的鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制或預(yù)防與阿爾茨海默癥和老年唐氏綜合癥有關(guān)的大腦中淀粉狀蛋白沉積的化合物和藥物組合物以及方法。更進(jìn)一步地說，本發(fā)明涉及阿爾茨海默癥的治療。
文檔編號A61K38/00GK1132504SQ94193598
公開日1996年10月2日 申請日期1994年9月20日 優(yōu)先權(quán)日1993年10月1日
發(fā)明者B·科爾戴爾, D·舍林, N·P·琵特, J·N·海加基, V·萬多塞拉爾, M·R·安格拉斯特羅 申請人:默里爾藥物公司, 斯希奧斯·諾瓦公司