專利名稱：抗?jié)儎┖陀拈T(mén)螺旋菌粘連抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于用于預(yù)防和治療胃粘膜潰瘍和腫瘤以及其他疾病的藥物。
作為治療胃粘膜潰瘍的抗?jié)儎?，現(xiàn)已應(yīng)用的有抑制胃酸分泌的H2阻斷劑和質(zhì)子泵抑制劑。但是在中斷服用所述抑制分泌的藥物之后胃潰瘍經(jīng)常復(fù)發(fā)。
近年來(lái)，已經(jīng)鑒定確定的細(xì)菌幽門(mén)螺旋菌參與胃粘膜發(fā)生的潰瘍。據(jù)信該細(xì)菌粘連在胃粘膜上，在該處它產(chǎn)生氨引起胃炎而胃炎又會(huì)發(fā)展為胃潰瘍或癌。請(qǐng)參見(jiàn)Anti-InfectiousAgentandDiseases，1993，pp.294～309。
由于細(xì)菌幽門(mén)螺旋菌粘連在胃粘膜下的組織上，因此通過(guò)服用藥物(如抗菌素)消除該細(xì)菌是很困難的。雖然曾試圖通過(guò)并用幾種抗菌素和質(zhì)子泵抑制劑來(lái)消除幽門(mén)螺旋菌，但是該療法需長(zhǎng)期服用大量的抗菌素。在該療法中，導(dǎo)致出現(xiàn)不良的伴有抗菌素耐藥株的各種問(wèn)題。
幽門(mén)螺旋菌識(shí)別胃粘膜上的膽固醇、糖脂、硫酸化糖脂、昆布氨酸、巖藻糖基化的糖鏈和唾液酸，并且粘連在胃粘膜上。因此，試圖用干擾幽門(mén)螺旋菌識(shí)別上述化合物的方法來(lái)預(yù)防幽門(mén)螺旋菌引起的胃粘膜炎癥和該細(xì)菌粘連到胃粘膜上。抑制該細(xì)菌粘連的物質(zhì)已有報(bào)道，它們是幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑，它包括胎球蛋白(它抑制經(jīng)由唾液酸的粘連)和分泌型免疫球蛋白A(它抑制經(jīng)由巖藻糖基化的糖鏈的粘連)。但是，上述物質(zhì)不能實(shí)際應(yīng)用作為幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑，因?yàn)樗鼈儾荒艽罅康毓?yīng)。
另一方面，本發(fā)明人以前曾發(fā)現(xiàn)屬于雙岐桿菌屬或乳酸細(xì)菌屬的細(xì)菌細(xì)胞，并且從它們中萃取的多糖類不僅能有效地預(yù)防胃潰瘍，而且還可促進(jìn)愈合，因此可用作為抗?jié)儎?JPA-4-5236;這里所用的專業(yè)名詞“JPA”是指未經(jīng)審查公開(kāi)的日本專利申請(qǐng))。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于某些海藻的鼠李糖富集的多糖類6-脫氧α-L-甘露聚糖和鼠李糖低聚糖具有類似的作用(JPA-5-61447)。但是，上述多糖類顯示的抗?jié)儥C(jī)理以前是不清楚的。
本發(fā)明的目的是提供治療和預(yù)防潰瘍有效的新的抗?jié)儎?br> 本發(fā)明的另一目的是提供抑制幽門(mén)螺旋菌粘連胃粘膜并能預(yù)防和治療由該細(xì)菌所引起的胃炎、胃潰瘍、胃癌和其他疾病的藥物。
本發(fā)明成功地提供的新的抗?jié)儎┖陀拈T(mén)螺旋菌粘連抑制劑(下面稱為“本發(fā)明藥物”，并意指包括上述抗?jié)儎┖驼尺B抑制劑兩者)含有巖藻依聚糖(即主要含有巖藻糖的多糖類)作為有效成分。
巖藻依聚糖市場(chǎng)上以試劑和純化制劑的形式銷售。使用這些市場(chǎng)上買得到的產(chǎn)品作為制備本發(fā)明藥物的起始物質(zhì)是最方便的。另外，巖藻依聚糖可以從巖藻依聚糖富集的紅藻或褐藻用熱水或稀酸水溶液容易地萃取出來(lái)。該萃取物和純化產(chǎn)品均可用于本發(fā)明藥物。從紅藻或褐藻萃取的巖藻依聚糖的分子量通常為約100，000，并且含有約50～60%巖藻糖(按重量計(jì))，并帶有小量的糖醛酸。組成巖藻依聚糖的一些糖已被硫酸化。
富集巖藻依聚糖并可有利地用作為本發(fā)明藥物起始物質(zhì)的海藻的實(shí)例包括紅藻和褐藻，如褐藻門(mén)索藻目海蘊(yùn)屬(PhaeophyceaeChordarialesnemacystus)以及樹(shù)脂狀團(tuán)扇藻、裙帶菜、枯墨角藻、海條藻(Himanthulia)、雙叉藻屬和墨角藻。
從含巖藻依聚糖的海藻萃取巖藻依聚糖方法的典型實(shí)施例如下。
(1)熱水萃取法將含巖藻依聚糖的海藻懸浮于約2～3倍(按濕重計(jì))的水中，并加熱至約100℃保持約10分鐘～1小時(shí)。離心除去沉淀后，加入氯化鈣或乙酸鋇到上清液中，得到濃度為0.5～1.0g/1的溶液，并將析出的藻酸除去。低分子量物質(zhì)用10倍蒸餾水進(jìn)行3次滲析或以超濾法除去，或?qū)堄辔锢鋬龈稍铮玫綆r藻依聚糖。
(2)酸萃取法將含巖藻依聚糖的海藻懸浮于約3倍(按濕重計(jì))調(diào)至pH4的乙酸水溶液中，或懸浮于稀鹽酸(pH2.0)中，得到濃度為0.01mol的溶液，并于約室溫～100℃萃取。離心除去沉淀之后，加入苛性蘇打溶液將上清液中和。然后加入氯化鈣溶液，得到濃度為0.5～1.0g/1的溶液，并將析出的藻酸除去。然后，用超濾法或滲析法除去低分子量的物質(zhì)，并將殘余物冷凍干燥，得到巖藻依聚糖。
用帶有分級(jí)分子量5，000的超濾膜進(jìn)行超濾，以便將所得的上清液濃縮到十分之一。所得的濃縮液于帶有分級(jí)分子量6，000～8，000的滲析管中用10倍蒸餾水進(jìn)行3次滲析(滲析時(shí)間為20小時(shí))。
從上述2個(gè)萃取法中任何一個(gè)方法得到的萃取物可以用例如凝膠過(guò)濾法或離子交換層析法進(jìn)行進(jìn)一步純化，以便提高巖藻依聚糖的含量。
按上述2個(gè)萃取法中任何一個(gè)方法從海藻中萃取的高分子量巖藻依聚糖可以用例如Smith降解法降解至平均分子量約10，000，Smith降解法包括用高碘酸進(jìn)行處理，參見(jiàn)SeikagakuJikkenKoza,4"ToshitsunoKagaku"(生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講義4“糖化學(xué)”)最新一卷，TokyoKagakuDojin。也可參見(jiàn)下面實(shí)施例3。以下式表示的降解后的巖藻依聚糖可用于本發(fā)明的藥物。
其中R1為巖藻糖，R2為H或SO3，n為整數(shù)。降解有利于降低溶液的粘滯性，因而使該溶液易于使用而不會(huì)引起效果降低。
在抗?jié)冃Ч矫?，巖藻依聚糖與從雙岐桿菌如海藻中萃取的多糖類至少是類似的，并且在某些方面優(yōu)于它們。
本發(fā)明的抗?jié)儎┖陀拈T(mén)螺旋菌粘連抑制劑為口服給藥。巖藻依聚糖進(jìn)入消化道并到達(dá)受損部位，在此處巖藻依聚糖發(fā)揮治療潰瘍的作用。
巖藻依聚糖通過(guò)抑制幽門(mén)螺旋菌粘連胃粘膜還可預(yù)防胃粘膜炎癥(見(jiàn)下面試驗(yàn)實(shí)施例2表4)，該炎癥可發(fā)展為胃潰瘍或癌。
本發(fā)明藥物含有巖藻依聚糖，即從可食用海藻中得到的多糖類，因此本發(fā)明藥物是非常安全的。因此，可以任意地選用劑型和劑量。一般來(lái)講，可以將本發(fā)明的藥物與藥學(xué)上可接受的液體或固體載體(如溶液、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、填充劑、粘合劑、崩解劑和潤(rùn)滑劑)一起任意地混合，并且可以制成例如片劑、顆粒劑、粉劑、散劑和膠囊劑。
對(duì)大多數(shù)成人來(lái)說(shuō)，本發(fā)明藥物合適的劑量范圍為約1～500mg/kg/天，以5～50mg/kg/天較好。
本發(fā)明藥物可以口服。另外，也可以將其加到每天攝取的食物或飲料中。
實(shí)施例1將褐藻門(mén)索藻目海蘊(yùn)屬(PhaeophyceaeChordarialesnemacystus)用蒸餾水洗滌，按每1g海藻(按濕重計(jì))加入3ml水。然后將溶液加熱至100℃保持1小時(shí)，以萃取可溶于熱水中的成分。得到的萃取液通過(guò)尼龍布濾器過(guò)濾。濾液以9，000rpm離心60分鐘。將所得的上清液用帶有分級(jí)分子量為30，000的超濾膜濃縮。向濃縮液中加入乙醇，以使?jié)舛葹?0-50體積%。然后將該混合物離心以除去不溶物質(zhì)。
得到的上清液以蒸餾水進(jìn)行滲析并冷凍干燥。得到巖藻依聚糖(純度90%或90%以上)。產(chǎn)率0.5%(按重量計(jì)，以濕海藻計(jì))。
用NMR測(cè)定純度，通過(guò)酚-硫酸法測(cè)定中性糖類的量，并通過(guò)MicroBCA法測(cè)定蛋白質(zhì)的量。
所得該巖藻依聚糖的成分用氣相色譜法分析。巖藻依聚糖含有70-80%巖藻糖作為主要成分，以及0-5%糖醛酸。用Sephaeryl S-200進(jìn)行凝膠過(guò)濾，測(cè)定巖藻依聚糖的分子量為約100，000。13C-NMR的數(shù)據(jù)表明，這些多糖類含有70-80%6-脫氧糖聚合物作為主要成分，以及0-5%糖醛酸。
實(shí)施例2重復(fù)上面實(shí)施例1的方法，但褐藻門(mén)索藻目海蘊(yùn)屬的巖藻依聚糖萃取液是用0.01N鹽酸于100℃萃取30分鐘得到的，最終得到的巖藻依聚糖產(chǎn)率為1.5%(按濕海藻的重量計(jì))。
上述得到的巖藻依聚糖純度為90%或90%以上，并含有3377nmol/mg巖藻糖和1442nmol/mg硫酸鹽基團(tuán)。
實(shí)施例3將上面實(shí)施例1中得到的7g巖藻依聚糖溶于500ml的0.2M高碘酸(在10mM乙酸鹽緩沖液中，pH5.0)溶液中，并使其在暗處?kù)o置3天。然后加入1ml乙二醇以分解過(guò)量的高碘酸。該反應(yīng)混合物用1M硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至pH8.0，得到最后濃度為0.4M，然后加入4g硼氫化鈉進(jìn)行還原。該反應(yīng)完成后，該混合物用冰醋酸中和、濃縮并經(jīng)超濾脫鹽。接著，加入鹽酸使該混合物的pH值調(diào)至2.0，再進(jìn)行脫縮醛作用。該反應(yīng)混合物用分級(jí)分子量為1，000的滲透膜進(jìn)行滲析。將所得的內(nèi)部液體進(jìn)行冷凍干燥。由此得到降解的巖藻依聚糖(平均分子量約為10，000，產(chǎn)量3.44g)。
試驗(yàn)實(shí)施例1將實(shí)施例1和2制得的巖藻依聚糖和市場(chǎng)上買到的巖藻依聚糖對(duì)乙酸引起的潰瘍進(jìn)行抗?jié)冏饔玫脑囼?yàn)。
將10只8周齡的SD大白鼠(體重250-300g)在戊巴比妥麻醉下進(jìn)行剖腹。露出胃，將0.03ml120%乙酸注入胃的粘膜下層以引起潰瘍。從手術(shù)的第2天～第9天按下表1-3所示的每天劑量給予動(dòng)物口服試驗(yàn)物質(zhì)。在試驗(yàn)期間，動(dòng)物任意進(jìn)食和飲水。在第10天，切開(kāi)胃，測(cè)量潰瘍部分的面積(長(zhǎng)的直徑X短的直徑)并作為潰瘍指數(shù)。按照下面等式從潰瘍指數(shù)計(jì)算“治愈百分率”治愈百分率(%)=(1- (試驗(yàn)組的潰瘍指數(shù))/(對(duì)照組的潰瘍指數(shù)) )×100得到的結(jié)果列于表1-3。表中的潰瘍指數(shù)以每組10只動(dòng)物的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
表1實(shí)施例1得到的巖藻依聚糖的抗?jié)冃Ч麆┝繚冎笖?shù)治愈百分率mg/大白鼠(%)011.0±3.2-(對(duì)照)1.5×88.7±3.421.13.0×8 5.6±2.9*49.16.0×8 5.9±1.6*45.9注誤差為5%或小于5%為顯著(下面相同)
表2實(shí)施例2得到的巖藻依聚糖的抗?jié)冃Ч麆┝繚冎笖?shù)治愈百分率mg/大白鼠(%)012.8±3.9-(對(duì)照)1.5×8 7.6±3.6*40.43.0×89.2±5.328.46.0×8 8.7±4.0*32.0表3墨角藻得到的巖藻依聚糖(由SigmaChemical公司制備)的抗?jié)冃Ч麆┝繚冎笖?shù)治愈百分率mg/大白鼠(%)011.7±3.1-(對(duì)照)1.5×8 8.7±1.9*26.13.0×8 7.3±3.7*38.46.0×8 6.3±2.2*46.4
試驗(yàn)實(shí)施例2幽門(mén)螺旋菌置于微量板上。然后將生物素標(biāo)記的BSA(牛血清蛋白)結(jié)合到看來(lái)是幽門(mén)螺旋菌粘連因素的巖藻糖糖鏈上，并將其加到微量板上。結(jié)果BSA與幽門(mén)螺旋菌粘連。用顏色顯色反應(yīng)測(cè)定粘連作用。
加入各巖藻依聚糖作為指示劑，應(yīng)用上面提到的粘連作用抑制的程度來(lái)測(cè)定以上實(shí)施例2得到的巖藻依聚糖和實(shí)施例3得到的降解巖藻依聚糖抑制幽門(mén)螺旋菌粘連的活性。測(cè)定按下述方法進(jìn)行。
將生物素標(biāo)記的巖藻糖糖鏈-鍵聯(lián)的BSA(0～0.04μg/ml)加到微量板(Pyriea板，從Biomerica公司購(gòu)得的產(chǎn)品)的各個(gè)孔中，在各個(gè)孔中置有幽門(mén)螺旋菌，并于37℃反應(yīng)1小時(shí)。用緩沖溶液洗去未結(jié)合的糖鏈-鍵聯(lián)的BSA，將100μl抗生蛋白鏈菌素溶液(濃度0.05mg/ml)加到各孔中，并于室溫反應(yīng)30分鐘?？股鞍祖溇赜羞x擇地與各孔中剩余生物素-糖鏈-鍵聯(lián)的BSA結(jié)合。洗去過(guò)量的抗生蛋白鏈菌素后，加入100μl過(guò)氧化酶標(biāo)記的生物素溶液(2.5μg/mg)，并于室溫反應(yīng)30分鐘。洗去過(guò)量酶標(biāo)記的生物素。酶標(biāo)記的生物素有選擇地與糖鏈-鍵聯(lián)的BSA和抗生物蛋白鏈菌素的復(fù)合物相結(jié)合。加入100μl底物溶液(ABTS過(guò)氧化酶底物系統(tǒng)，從KPL公司購(gòu)買的產(chǎn)品)，并于室溫反應(yīng)10分鐘后，以405nm波長(zhǎng)處的吸光度測(cè)定酶(過(guò)氧化酶)的活性。根據(jù)加到反應(yīng)系統(tǒng)中巖藻糖-鍵聯(lián)的BSA的量，測(cè)定的吸光度增加。
將5～150μl/ml巖藻依聚糖加到按以上所述含有巖藻糖-鍵聯(lián)的BSA和幽門(mén)螺旋菌的反應(yīng)系統(tǒng)中，并按同樣方式測(cè)定吸光度。結(jié)果列于下面表4和5。隨加到反應(yīng)系統(tǒng)中巖藻依聚糖的量增加，測(cè)得的吸光度降低，這表明巖藻依聚糖抑制了幽門(mén)螺旋菌與糖鏈-鍵聯(lián)的BSA的粘連。
表4實(shí)施例2的巖藻依聚糖對(duì)幽門(mén)螺旋菌粘連的抑制作用巖藻依聚糖的濃度(μg/ml)吸光度(405nm)01.21910.9012.50.43050.2977.50.132100.0921000.000表5實(shí)施例3的巖藻依聚糖對(duì)幽門(mén)螺旋菌粘連的抑制作用巖藻依聚糖的濃度(μg/ml)吸光度(405nm)01.284101.254150.895200.725250.501500.2091000.0981500.092
如以上所述，本發(fā)明提供了促進(jìn)潰瘍愈合并抑制幽門(mén)螺旋菌粘連的藥物，本發(fā)明藥物能有效地預(yù)防和治療可能發(fā)展為潰瘍和癌的胃粘膜炎。本發(fā)明藥物用可食用的海藻如褐藻門(mén)索藻目的海蘊(yùn)屬作為起始物質(zhì)制得。因此，本發(fā)明藥物可大量地以低價(jià)格供應(yīng)。此外，本發(fā)明藥物是非常安全的。
雖然本發(fā)明已被詳細(xì)地?cái)⑹霾⒂芯唧w實(shí)施例參考，但是應(yīng)該明白，熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員可以在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下進(jìn)行各種變化和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.含有巖藻依聚糖作為有效成分的抗?jié)儎?br> 2.以含有巖藻依聚糖作為海藻萃取物有效成分的抗?jié)儎渲兴龊Ｔ迨羌t藻或褐藻。
3.以含有巖藻依聚糖作為褐藻門(mén)索藻目海蘊(yùn)屬萃取物有效成分的抗?jié)儎?br> 4.權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)所述的抗?jié)儎?，其中所述的巖藻依聚糖是降解了的。
5.含有巖藻依聚糖作為有效成分的幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑。
6.以含有巖藻依聚糖作為海藻萃取物有效成分的幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑，其中所述海藻為紅藻或褐藻。
7.以含有巖藻依聚糖作為褐藻門(mén)索藻目海蘊(yùn)屬萃取物有效成分的幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑。
8.含有降解的巖藻依聚糖作為有效成分的幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑。
9.以含有降解巖藻依聚糖作為海藻萃取物有效成分的幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑，這里所述的海藻為紅藻或褐藻。
10.以含有降解巖藻依聚糖作為褐藻門(mén)索藻目海蘊(yùn)屬萃取物有效成分的幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑。
11.含有治療有效劑量的巖藻依聚糖作為有效成分的抗?jié)兘M合物。
12.含有治療有效劑量的巖藻依聚糖作為有效成分的幽門(mén)螺旋菌粘連抑制劑組合物。
13.應(yīng)用權(quán)利要求1所要求的抗?jié)儎┲苽漕A(yù)防和治療胃粘膜沖瘍和腫瘤的藥物。
14.應(yīng)用權(quán)利要求5所要求的粘連抑制劑制備抑制幽門(mén)螺旋菌粘連胃粘膜的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了有效地用于治療和預(yù)防胃粘膜潰瘍以及抑制幽門(mén)螺旋菌粘連胃粘膜的新藥，并且該藥是非常安全的?？刮笣儎┖陀拈T(mén)螺旋菌粘連抑制劑含有巖藻依聚糖(即含在紅藻或褐藻萃取物中的多糖類)作為有效成分。
文檔編號(hào)A61K31/737GK1108572SQ9411648
公開(kāi)日1995年9月20日 申請(qǐng)日期1994年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月24日
發(fā)明者木村逸子, 柴田英之, 長(zhǎng)岡正人, 橋本秀介, 澤田治司, 橫倉(cāng)輝男 申請(qǐng)人:株式會(huì)社雅庫(kù)路特本社