專利名稱：用于核磁共振成像的顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及當(dāng)在混懸液中時能注入患者血流的氧化鐵顆粒。該種顆?？鼓姆€(wěn)定性增強，它們對于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)是相對覺察不出的，它們對巨噬細胞的清除作用抵抗力增加。該種顆粒對制備血池造影對比劑是有用的。
氧化鈦顆粒以可注射水懸液的形式用于診斷目的，過去已引起人們很大興趣。鐵磁性物質(zhì)或超順磁性鐵礦微晶已被用作肝脾核磁共振成像(MRI)的對比劑。它們在這些器官用作對比劑是基于這些顆粒注射后很快被RES識別并迅速被捕獲的觀點。這些顆粒然后從血流中清除，貯存于肝臟和脾臟，隨后被消除。已作了很多努力以改進已知劑型，目的在于使超順磁性顆粒從體內(nèi)消除之前在靶器官如肝、脾或骨髓中的攝取增加，使它們的應(yīng)用更有實效。
隨著核磁共振(NMR)分析的發(fā)展，人們認識到，如果能提供一種對比劑，其性質(zhì)能使NMR分析用于整體而非僅僅某些部位，技術(shù)將會有相當(dāng)大的改進，現(xiàn)有技術(shù)可獲得重要的進展。但是，為此目的，必須提供一種介質(zhì)，其磁性至少與迄今已知的氧化鐵顆粒的磁性一樣好，而其在血流中的保留時間比現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何其他顆粒均長。因此，在這方面要解決的問題是找到一種顆粒，它在給定時間內(nèi)不被RES識別。據(jù)報導(dǎo)，通過使用各種涂層材料于氧化鐵顆粒上，可得到改進的氧化鐵顆粒，可提高保留時間，或有助于顆粒向動物或人體其他特定部位的輸送。
EP-A-0272091(VESTAR)揭示了在活性成分即磁性氧化鐵(和其他診斷劑或藥物)的固體顆粒上(所述活性成分構(gòu)成顆粒的芯核)，涂覆以第一層單分子兩親物層，該兩親物可與芯核成分結(jié)合;該系統(tǒng)還包括第二層即外層，它可包括包裹著兩親物的磷脂雙分子層(即脂質(zhì)體膜類似物)。在實施例中，涂有棕櫚酸作為表面活性劑的磁性氧化鐵顆粒包裹在由膽固醇和二硬脂酰膦脂酰膽堿構(gòu)成的脂質(zhì)體中。這種安排的一個目的是使活性成分在循環(huán)中具有抗清除的穩(wěn)定性。
EP-A-0275285(ADVANCEDMAGNETICS)揭示了有涂層和無涂層的磁性氧化鐵顆粒用作NMR成像的對比劑。當(dāng)有涂層時，顆粒被聚合物包裹，生物活性分子可連接于其上。在涂層顆粒的情況下，生物分子可選擇得以特定的器官或組織為目標。所公開的聚合物涂層可由蛋白質(zhì)如白蛋白、多糖類如葡萄糖、多肽類如聚谷氨酸酯或聚賴氨酸、或有機硅烷類如N-2-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷所制成?？晒矁r結(jié)合于涂層的生物分子為抗體、碳水化合物或激素，它們可增加顆粒對生物體特定部位的特異性和生物分布。
EP-A-0354855(TERUMO)公開了脂質(zhì)體作為藥物載體泡囊，在泡囊脂質(zhì)層含有與聚乙二醇結(jié)合的磷酯。磷脂的疏水部分陷入構(gòu)成膜的脂質(zhì)或結(jié)合于其上，而聚乙二醇的親水部分從成膜脂質(zhì)上伸出并延伸到周圍介質(zhì)中。據(jù)說脂質(zhì)體泡囊可用來將血紅蛋白包在其中以制備人造紅細胞。
US-A-4，904，479(ILLUM)公開了用同時有親水性和疏水性片段的兩親嵌段共聚物(如Poloxamer
和Poloxamine
)涂覆聚苯乙烯顆粒。該涂層目的在于使注射后的調(diào)理素作用減為最小，使顆粒導(dǎo)向胃髓而不是肝臟或脾臟。Poloxamer
和Poloxamine
是相繼地包含聚氧丙烯疏水片和聚氧乙烯親水片段的兩親嵌段共聚物。據(jù)信，為了防止被肝臟攝取，親水片段從顆粒外涂層表面伸出，從而使調(diào)理素沉積其上有了空間阻礙，并使顆粒不易被巨噬細胞識別。
雖然現(xiàn)有技術(shù)的方法有長處，它們只涉及顆粒的一個特定問題，這些顆?？杀贿x擇性地導(dǎo)向不同的特定部位(例如肝、脾、肺、淋巴結(jié)、骨髓等)，而本發(fā)明則是解決顆粒的制備問題，這些顆粒不能被RES所識別，它們在血液中維持時間延長，可用來制備長效血池試劑。
現(xiàn)有技術(shù)的顆粒需昂貴的制造技術(shù)，制得的顆粒注射后就被RES識別，容易被從血液中清除。這樣的顆粒及由此制成的對比劑不能被用于需相對長生物半衰期的應(yīng)用情況。
在血中存在時間長(即對RES攝取有好的抗御力，向組織或血管外部位擴散度較低)的對比劑在本領(lǐng)域中被認為是特別有用的“血池”試劑。如果想產(chǎn)生有意義的分析結(jié)果而避免反復(fù)注射和使用大量對比介質(zhì)，有時就需要血池試劑有長的生物半衰期。為了得到長效血池試劑，可能需要制備“隱秘”(stealth)顆粒，它在一個時期內(nèi)不會被RES識別，它還提供足夠的磁性弛豫響應(yīng)(magneticrelaxationresponse)。有了真正的“隱秘”氧化鐵顆粒，就會使整個人體的NMR分析成為可能，而不象迄今已知的對比劑那樣只能作局部或特定器官的分析。因而，隱秘顆?？墒共捎脽o傷害技術(shù)測量各種器官(包括腦)的血容量和血流量成為可能。例如，監(jiān)測腦皮質(zhì)在激活時血液氧合作用的變化將成為可能。
能在血流中保留長時間的顆粒還會提供在各種生理條件下關(guān)于細胞狀況和營養(yǎng)物在各器官分布的很有價值的信息。用這樣的顆粒制成的對比劑能直接洞察體內(nèi)血液微循環(huán)和細胞的代謝循環(huán)，為更好地了解生命體過程開創(chuàng)新的途徑，從而導(dǎo)致更好地檢測異常情況如腫瘤的生長。但是，現(xiàn)有技術(shù)尚未成功地提供長效磁性顆粒及由此制成的血池對比劑，這種對比劑能使這些分析技術(shù)進行這樣的測量并產(chǎn)生滿意的資料。
簡言之，本發(fā)明涉及用于人或動物體診斷圖像分析，特別是MRI分析的血池對比劑，它們在血流中保留時間長，從而能測量各器官的血容量和血流量。本發(fā)明更具體地涉及對RES快速攝取的抗御力特別強的對比劑，當(dāng)注射后，它比迄今已知的血池對比劑在血流中存在時間長得多。本發(fā)明的血池對比劑包括由含兩親化合物分子和非離子表面活性劑的三維殼層穩(wěn)定的氧化鐵顆粒。該兩親化合物具有一個帶負電的親水性含磷頭部，聯(lián)結(jié)于疏水性尾部上，它以呈膠粒狀為特征。三維殼層的非離子表面活性劑使兩親化合物呈所述膠粒狀，兩親物的親水性含磷(以磷酰基為佳)的頭部至少帶兩個負電荷。三維殼由兩親化合物分子組成，兩親化合物的負電性磷?；^部指向氧化鐵芯核，其疏水性尾部向外伸出，形成刺猬樣結(jié)構(gòu)。該刺猬樣結(jié)構(gòu)成為構(gòu)成三維殼的基礎(chǔ)，非離子表面活性劑固定于其上。當(dāng)兩親化合物為單烷基或鏈烯基磷酸酯或甘油磷脂時，外層包括一非離子表面活性劑，其疏水基團與酯或甘油磷脂的烷基或鏈烯基交織或相互盤繞，進一步使結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在任一情況下，都利用了非離子表面活性劑使這些化合物膠?；奶烊荒芰?。
較佳的甘油磷脂由取代或部分取代的多元醇的單磷酸酯組成，所述多元醇的至少另一個醇官能團被飽和或不飽和長鏈脂肪酸酯化，或被飽和或不飽和長鏈醇醚化，磷酸的另兩個酸官能團可是游離的，也可與堿金屬或堿土金屬成鹽。更具體地，甘油磷脂可為選自二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸的脂肪酸甘油酯的單膦酸酯。
較佳的非離子表面活性劑是帶有至少一種含聚氧乙烯和聚氧丙烯片段的嵌段共聚物或聚乙二醇十六烷基醚的生理學(xué)上可接受的表面活性劑。這種表面活性劑市場上可購到的有如下商標的產(chǎn)品Pluronic
、Poloxamer
、Poloxamine
、Synperonic
或BRIJ
。
本發(fā)明的顆粒在制備后可經(jīng)滅菌、然后冷凍干燥，得到可長期貯存的滅菌粉劑。在這種情況下，將粉劑分散于生理學(xué)上可接受的液體載體中，即從冷凍干燥的粉末狀制劑重新制得本發(fā)明的對比劑。所得的懸浮液即可注射。
本發(fā)明進一步涉及作為人或動物體NMR成像對比劑的顆粒的制備方法及其使用。


圖1a是本發(fā)明顆粒的氧化鐵刺猬樣結(jié)構(gòu)的橫截面示意圖，在顆粒周圍有非離子表面活性劑形成三維殼。
圖1b是本發(fā)明顆粒的氧化鐵刺猬樣結(jié)構(gòu)三維視圖的一部分。
圖2是本發(fā)明氧化鐵顆粒和現(xiàn)有技術(shù)顆粒的保留時間或“活性”(表示為曲線下面積(AUC))比較的示意圖。
本發(fā)明顆粒主要由氧化鐵芯核和兩親化合物與非離子表面活性劑分子構(gòu)成的外層所組成。兩親化合物具有粘在氧化鐵表面的帶有相當(dāng)強電荷的親水部分，它可以是單烷基或環(huán)烷基或鏈烯基的磷酸酯或帶負電荷的磷脂。此處所用的術(shù)語“環(huán)”指分子的環(huán)狀部分可以是5-7元的，可以是飽和或不飽和的(芳香族的)或可含雜原子(雜環(huán))。在任一情況，具有三維殼形狀的外層均含有非離子表面活性劑，其疏水部分與酯的烷基或鏈烯基鏈交織或相互盤繞，進一步穩(wěn)定了三維結(jié)構(gòu)。非離子表面活性劑還必須能使磷酸單酯或磷脂膠粒化，因為只有當(dāng)呈膠粒狀時，這些化合物才會對氧化鐵芯核顯示足夠的親和力，因而可用作磁性氧化鐵顆粒的穩(wěn)定劑。磷?；^和Fe3O4之間的親和力必須是這樣的，以致于在非離子表面活性劑存在和聲處理下，膠粒狀的磷脂或單酯形成刺猬樣前體，繼而成為構(gòu)建三維外殼的模板，該三維外殼是通過表面活性劑的疏水片段和兩親化合物的疏水部分相互作用而構(gòu)成的。然后該三維結(jié)構(gòu)則提供“RES不能識別的”顆粒。因此，在本發(fā)明的血池試劑中，重要的是形成外層的兩親化合物(以甘油磷脂為佳)不形成圍繞氧化鐵芯核的脂質(zhì)體泡囊或脂質(zhì)體樣薄膜，因為從磷脂分子形成了三維殼，磷脂分子的帶負電的磷?；^部指向氧化鐵芯核，其疏水性尾部向外伸出，形成刺猬樣前體結(jié)構(gòu)。該刺猬樣結(jié)構(gòu)總是作為構(gòu)建三維殼或?qū)拥幕A(chǔ)，不管起始兩親化合物是單烷基或單鏈烯基的磷酸酯或膠粒狀的甘油磷脂。在任一情況下，得到的顆粒的抗清除穩(wěn)定性增加，并將顯示良好的對比劑性能。應(yīng)當(dāng)記住的是，參與脂質(zhì)體樣薄膜的兩親分子是以尾對尾倒序排列的，其親水頭端向外伸出。
當(dāng)使用甘油磷脂以獲得圍繞氧化鐵顆粒的刺猬樣基質(zhì)，由此構(gòu)建完整的三維殼時，重要的是(a)在甘油磷脂和非離子表面活性劑同時存在下使氧化鐵顆粒活化，或(b)制備帶有甘油磷脂的氧化鐵顆粒懸浮液，使此懸浮液活化，加表面活性劑，然后可選擇地重復(fù)活化步驟?；罨沁@樣進行的將氧化鐵顆粒均勻地分散或均化分散體系，這加速膠?；?或破壞早先形成的脂質(zhì)體或薄片?？捎酶鞣N方法包括攪拌來實施活化過程;但是較可取的是聲波處理、微流化處理，在適度加熱(30-50℃)下處理更為有利。
我們假定，穩(wěn)定顆粒的三維殼是通過在氧化鐵和膠粒狀甘油磷脂之間形成的刺猬樣基本結(jié)構(gòu)而進行構(gòu)建的。首先在表面活性劑的存在下經(jīng)聲波或微流化處理使磷脂膠粒化，然后膠粒中兩親分子的負電荷與氧化鐵芯核相互作用，而它們的電中性疏水端被表面活性劑吸引。
實驗證明，在三維殼的形成過程中，表面活性劑起幾種作用。它使兩親分子膠?；?，它幫助芯核周圍膠粒的定位和構(gòu)建(促進刺猬樣前體的形成)，最后將其本身固定在兩親分子的疏水片段以提供圍繞顆粒的三維殼。
顯然，形成如圖1(a和b)所示的中間體刺猬樣結(jié)構(gòu)是特別重要的，因為已發(fā)現(xiàn)單靠非離子表面活性劑不足以保護磁性氧化鐵顆粒不被RES快速攝取。我們發(fā)現(xiàn)，除非按本發(fā)明進行制備，單用磷脂或與非離子表面活性劑合用均不能得到實際有用的長效血池對比劑介質(zhì)顆粒。因此，只有當(dāng)通常存在于現(xiàn)有技術(shù)制劑顆粒周圍的磷脂脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)被破壞時，通過使用磷脂才可成功地穩(wěn)定氧化鐵顆粒，使其免于過早地從血流中清除。甚至在使用除磷脂外還含聚氧乙烯(POE)/聚氧丙烯(POP)表面活性劑的磁性氧化鐵懸浮液時，也是如此。因此，嵌段共聚物只有當(dāng)它適當(dāng)?shù)胤€(wěn)定化在圍繞磁性氧化鐵芯核的殼的外部位置時，才會如期望的那樣起作用。它在懸浮液中的簡單存在是不夠的;即使含有用磷脂穩(wěn)定化的磁性氧化鐵的同樣懸浮液也是如此，即若磁性顆粒先以磷脂包裹(它然后在Fe3O4表面擴展成一薄層)，然后加入表面活性劑而不活化，也是不夠的。上述結(jié)論得到如下觀察的支持，即只有用膠粒狀磷脂形成的三維的即刺猬樣的結(jié)構(gòu)才能捕捉和固定足夠的表面活性劑以提供穩(wěn)定的RES穩(wěn)秘氧化鐵顆粒。
表面活性劑(圖1(3)的固定可能經(jīng)其疏水性聚氧丙烯(POP)片段與甘油磷脂或磷酸單酯(圖1(2))的疏水部分相互作用而完成。如圖1(a和b)所示，疏水部分通過范德華引力與聚氧丙烯(POP)片段固定，而親水性的聚氧乙烯(POE)片段向外伸展到溶液中，這樣可能抑制磁性氧化鐵顆粒(圖1(1))的調(diào)理作用和凝聚作用。
在磷酸的烷酯或鏈烯酯的情況下，刺猬樣結(jié)構(gòu)的形成基本同上，非離子表面活性劑的疏水部分與磷酸酯的烷基或鏈烯基鏈交織或相互盤繞，其親水部分伸向溶液。
氧化鐵芯核和磷?；^部之間相互作用的精確本質(zhì)尚未被確切了解。但是，我們發(fā)現(xiàn)，對于本發(fā)明的“隱秘”氧化鐵顆粒在血中的良好耐久性，重要的是磷?；鶊F上兩個氧原子的負電荷都可用于與芯核相互作用。因此，當(dāng)只有一個負氧部位可用時，所產(chǎn)生的顆粒沒有同樣的穩(wěn)定性，較易從循環(huán)中清除。至今，這種相互作用的重要性和穩(wěn)定性沒有在現(xiàn)有技術(shù)中被認識，因而可解釋為何以往制備長效磁性氧化鐵血池顆粒的努力均告失敗。
我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用負電荷被中和的磷脂時，例如在用二棕櫚酰磷酯酰膽堿(DPPC)或二肉豆蔻酰磷酯酰膽堿(DMPC)時，形成的相應(yīng)顆粒結(jié)構(gòu)防護性差，用這些化合物制成的對比劑對于肝脾造影可能是有用的，但不能作長效血池試劑，因為這樣的顆粒不能被保護以免從血流中過早地被清除。這同樣適用于其磷?；^部只有一個負電荷可用于和磁性體芯核相互作用的磷脂。例如，二棕櫚酰磷酯酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)或聯(lián)十六烷基磷酸酯(DCP)是這樣的兩親物，它們產(chǎn)生的顆粒結(jié)構(gòu)不足以防止從血中被快速清除。因而這樣制成的對比劑不能用作血池試劑，因為它們在血流中的保留時間相當(dāng)短。另一方面，當(dāng)使用其磷酰基部分兩個氧原子的負電荷均可用于和芯核相互作用的磷脂時，所得到的結(jié)構(gòu)極穩(wěn)定，用這些化合物制得的氧化鐵顆粒能很好地受保護以免從血流中被清除。這些化合物的例子有二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)和二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)。
為了確保顆粒有好的穩(wěn)秘特性，緊靠顆粒的化合物除了在磷?；^端兩個氧原子上負電荷都可利用外，還應(yīng)有相當(dāng)長的烷基或鏈烯基鏈或疏水性環(huán)烷基直接地或經(jīng)亞烷基或氧橋中介，連接于磷原子上。因此，為了獲得穩(wěn)定的隱秘顆粒并由此得到本發(fā)明的對比劑，緊靠磁性氧化鐵芯核的化合物必須是含單烷基或鏈烯基或環(huán)烷基的磷酸酯、單烷基膦酸酯或甘油磷脂，其烷基或鏈烯基鏈有相當(dāng)強的疏水性。實驗表明，只有足夠長的烷基或鏈烯基鏈才能與另一兩親化合物合適地相互作用，固定足夠量的非離子表面活性劑或嵌段共聚物，以產(chǎn)生圍繞鐵芯核的穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。有至少8個碳原子的、較好有至少10個、更好有至少12個碳原子的烷基或鏈烯基鏈是特別令人滿意的。短的疏水性烷基或鏈烯基鏈或大環(huán)配位體不能提供穩(wěn)定的顆粒，表明必須在中間層和表面活性劑之間有牢固的相互作用，或有足量固定的表面活性劑可供利用，才能獲得滿意的結(jié)果。對此特征缺乏正確評價可能是為何至今未能得到RES覺察不出的或穩(wěn)秘的氧化鐵顆粒作為實際有用的長效血池試劑的另一原因。在適用于本發(fā)明的一磷酸酯中，可舉出C8-C18烷基或鏈烯基磷酸酯、膽甾烯基-磷酸酯、環(huán)己基-癸基-磷酸酯、十六烷基磷酸酯、枯基磷酸酯及類似化合物。
從而，按照本發(fā)明，如果緊靠顆粒的基層包含具有相當(dāng)強烈離子化的負功能團和相當(dāng)長和有效的疏水性有機鏈的兩親物質(zhì)，與其交織或相互盤繞的另一層是由相繼具有親水性和疏水性片段的嵌段共聚物構(gòu)成，例如Poloxamer
、Synperonic
或Pluronic
型表面活性劑，就能使顆粒獲得有效的保護，使它不被從循環(huán)中清除。限定為單烷基或鏈烯基磷酸酯或膦酸酯的基層物質(zhì)的作用是完全意料不到和使人驚訝的，特別是由于現(xiàn)有技術(shù)(見WO91/09629第17頁第1段)提出，脂質(zhì)體膜上帶負電荷的磷脂的存在會增加所述脂質(zhì)體被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取。
我們發(fā)現(xiàn)，對于本發(fā)明的顆粒，單烷基磷酸酯或甘油磷脂與嵌段共聚物之間相對量應(yīng)當(dāng)不太懸殊，即前者與后者的重量比應(yīng)在1∶100至10∶1的范圍內(nèi)，較佳為1∶30至5∶1，更佳為1∶10至1∶1。而且，單烷基磷酸酯與氧化鐵芯核的重量比應(yīng)在1∶5和100∶1之間，較佳的為20∶1和1∶1之間。一些實驗資料也揭示，表面活性劑與膠粒狀磷脂或磷酸單酯的比例應(yīng)保持在一定限度內(nèi)，因為太多的表面活性劑會使磷脂或單酯過于分散，使它們對磁性氧化鐵顆粒的親和力減小，刺猬樣結(jié)構(gòu)的形成受阻。同理，用太少表面活性劑制成的顆粒會凝聚，不足以防止調(diào)理作用。
現(xiàn)確定，從兩種或兩種以上化合物可制備RES不可覺察的穩(wěn)定顆粒，這些化合物選自離子化和中性磷脂、磷脂的單烷基或鏈烯基酯和/或其它非磷脂化合物，制備方法是將氧化鐵顆粒與帶負電荷的兩親化合物或帶負電荷的磷脂和其他非磷脂的混合物和表面活性劑一起懸浮在生理學(xué)上可接受的水相中，或在其中混合。將形成的混合物作聲波處理或微流化處理以使兩親化合物膠?；?，建立刺猬樣結(jié)構(gòu)，并從該結(jié)構(gòu)上形成圍繞氧化鐵顆粒的三維殼。得到的顆粒被很好地保護，不被從循環(huán)中過早地清除，并被發(fā)現(xiàn)作為好的血池成像劑是非常有用的?？捎糜诒景l(fā)明的穩(wěn)定的磁性氧化鐵顆粒的非磷脂化合物的例子為諸如膽固醇，麥角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚等化合物。
在聲波處理或微流化處理后，可將混合物進一步滅菌和/或冷凍干燥以制備具有長貯藏壽命的干燥粉劑。
在另一種方法中，可在聲波處理或微流化處理后將表面活性劑加到氧化鐵和兩親化合物混合物中。但是在這種情況下，所有成分加在一起后可任選重復(fù)聲波處理、微流化處理或加熱步驟。
本發(fā)明的懸浮液也可從含氧化鐵顆粒的粉末制劑加以制備。粉末狀制劑通常是將新鮮制備的含氧化鐵顆粒、磷脂和非離子表面活性劑的溶液凍干或干燥而成。在凍干或干燥前，將這些溶液滅菌?？捎萌魏我阎夹g(shù)即加熱、過濾、γ-射線等進行滅菌?；蛘撸部蓪⒂瞄L期貯存的凍干粉末制得的懸浮液進行滅菌。
我們發(fā)現(xiàn)，按本發(fā)明制備的顆?？捎米魅嘶騽游矬w器官體內(nèi)NMR成像的血池對比劑。成像是這樣進行的通常將本發(fā)明所述磁性氧化鐵顆粒在生理學(xué)可接受的水性載體中的懸浮液經(jīng)靜脈注射給與病人，并分析在NMR分析儀產(chǎn)生的磁場中被研究的器官鄰近處水的質(zhì)子自旋磁性弛豫(magnetic relaxation)(T1和T2成分)的變化。
下面的實施例進一步闡明本發(fā)明。
實施例1在40ml水中，溶解81.1mg(0.3mmol)FeCl3·6H2O和25.8mg(0.13mmol)FeCl2·4H2O(總Fe＝0.43mmol或24.01mg)。向其中加入FeCl3形式的0.1mCi59Fe(示蹤物數(shù)量)。將混合物攪拌，滴加7.5%氨水溶液直至pH達到穩(wěn)定值8.6。將形成的黑色顆粒懸浮液在75℃下加熱5分鐘，然后在室溫下放置使顆粒沉淀。沉淀以100ml水用傾析法洗滌三次。洗滌后，將顆粒再在攪拌下懸浮于45ml水中，懸浮液中鐵濃度為0.533mg/ml。
向10ml此種懸浮液(5.33mg Fe)中加入成分(a)100mg二棕櫚酰磷酯酸-鈉鹽(DPPA Na)，進行20分鐘聲波處理(BRANSON 250 Sonifier，1/8″微探針，輸出20(15-20W))。使聲波處理時升至68℃的溫度降到室溫，加入成分(b)100mg Synperonic -F-108(ICI制)或Poloxamer -338。然后在同樣條件下再繼續(xù)作15分鐘聲波處理以確保完全分散并破壞脂質(zhì)體囊，在氧化鐵顆粒周圍提供膠粒狀磷脂層。
按本發(fā)明所述得到的顆粒懸浮液(樣品1A)每ml含0.5mg鐵，10mg DPPA和10mg Synperonic 表面活性劑((a)和(b)的重量比＝1∶1)。用COULTER Nanosizer計數(shù)儀測量結(jié)果表明，平均顆粒大小為120nm，多分散指數(shù)為3。
在類似條件下，但用DPPC取代部分DPPA，制得其他樣品，得到以下樣品(DPPC/DPPA摩爾比)1C(9∶1);1D(7.5/2.5);1E(5∶5);1F(2.5/7.5)最后，制得只含DPPC的對照樣品(1B)。
＝DPPC/DPPA摩爾比另外用現(xiàn)有技術(shù)文獻EP-A-0271091的方法制對照樣品。重復(fù)該文件實施例1的步驟，制得樣品1V1。先用單分子數(shù)量的棕櫚酸覆蓋磁性氧化鐵顆粒，然后用二硬脂酰磷脂酰膽堿和膽固醇(DSPC/CHOL)2∶1混合物制成的脂質(zhì)薄膜包裹。樣品1V2是用一層Synperonic
F-108進一步保護1V1的結(jié)果。
各種懸浮液樣品是這樣作試驗的注射1ml樣品到Sprague-Dawley實驗室大鼠的尾靜脈中，然后以指定的時間間隔取出血樣;用γ-計數(shù)分析血樣中殘留鐵，結(jié)果用原始注入鐵(ID)的百分數(shù)表示，計為時間的函數(shù)。通過測定注射后時間O和120分鐘之間%ID-時間曲線的曲線下面積(AUC)來表示一定制劑在血中保留的特性。結(jié)果列于表1。
結(jié)果表明，缺乏DPPA的所有樣品(1B、1V1、1V2)均迅速消除，相反，含DPPA的樣品消除得慢得多，作用隨帶負電磷脂的量而變。當(dāng)DPPA對總磷脂的摩爾比或重量比為1∶4或更多時，這個作用變得特別明顯實用。
從表中結(jié)果還可看出，對于保護顆粒不被從循環(huán)中清除，DPPA的重量對應(yīng)于芯核最好為5∶1或更多。
在上述實驗中，如果一鈉鹽形式的DPPA被游離酸或被其他水溶性鹽(從其它金屬得到)取代，也得到類似的結(jié)果。此外，如果DPPA被其他磷脂酸如二硬脂酰一、二肉豆蔻酰一、二月桂酰-類似物及更高級同親物(C20-26酸)取代，結(jié)果并無明顯不同。還應(yīng)注意到，在缺乏成分(b)時，單有成分(a)，磁性氧化鐵顆粒仍得到一定程度的保護。但是，對于用于診斷目的的顆粒，這保護是不足的，如上面表1A的結(jié)果所示。除略去Synperonic外，樣品1D2、1E2和1F2分別與相應(yīng)的樣品1D、1E和1F相同。表1A所給的結(jié)果表示為在以分鐘計的不同時間后保留的原始鐵劑量的百分數(shù)。
表2中結(jié)果(得自與表1所報告同樣進行的實驗)顯示，當(dāng)DPPA(成分(a))被在磷酸酯基團上只有一個離子功能團的類似化合物即二棕櫚酰磷酯酰甘油(DPPG)取代時(樣品1G)，所得到的層實際上無保護作用。甚至當(dāng)加Synperonic
時(樣品1H)，也是如此。作為對照(樣品1J)，表2也提供了用葡聚糖包裹的磁性氧化鐵樣品(按Advanced Magnetics，Inc的EP-A-0274 285制備的AMI-25)得到的結(jié)果。
實施例2在實施例1所述條件下進行的實驗和圖2及表3所給出的說明進一步支持了實施例1結(jié)果討論中所報告的現(xiàn)象觀察。b)、c)、d)和f)組的代表性樣品分別是按EP-A-0272091和EP-A-0274285的方法制備的，而其他樣品都是按實施例1中所描述的本發(fā)明的方法制備。結(jié)果清楚地證明，只用非離子表面活性劑制得的磁性氧化鐵顆粒(a組)只能在循環(huán)中停留短時間。有或無非離子表面活性劑的DSPC/膽固醇脂質(zhì)體囊的使用并不改善血池試劑的特性(b組)。各種磷脂被稱作制備穩(wěn)定的氧化鐵顆粒的有用材料。但是，事實上如果采用負電荷被中和的磷脂如二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)或二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)的情況下(C組)，所形成的相應(yīng)結(jié)構(gòu)受保護差，制成的對比劑對肝、脾或骨髓成像可能是有用的，但不能作為長效血池試劑。對于其磷?；^部只有一個負電荷可用來與磁性氧化鐵芯核相互作用的磷脂而言，結(jié)果幾乎相同。例如，二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)或聯(lián)十六烷基磷酸酯(DCP)就是這樣的磷脂，它們制成的結(jié)構(gòu)不足以防止從血中被快速清除(d組)。進一步確定，在無非離子表面活性劑存在時，即使采用其磷酰部分上兩個氧原子的負電荷均可用來與芯核相互作用的磷脂，所得到的結(jié)構(gòu)仍然不能用作本發(fā)明的長效血池試劑。這表明，即使使用二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)或二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)，除非它們呈膠粒狀，所制成的氧化鐵顆粒也不能很好地防止從血流中被清除(e組)。
但是，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，用葡聚糖比用現(xiàn)有技術(shù)的磷脂制劑能更好地達到對磁性氧化鐵的保護(f組)。即使當(dāng)這些典型的脂質(zhì)體制劑含非離子表面活性劑時也是如此。葡聚糖包裹的磁性氧化鐵顆粒通常用作為肝脾成像特殊設(shè)計的對比劑，并為從血流中快速清除而設(shè)計。
當(dāng)使用其磷酰部分上兩個氧原子的負電荷均可用來與芯核相互作用的磷脂時，如果磷脂是膠粒狀的，則所得磁性氧化鐵顆粒在血循環(huán)中極其穩(wěn)定。因此，使用本發(fā)明的方法，用諸如膠粒狀二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)和Synperonic
F108制得的氧化鐵顆粒會受到很好的保護，不被從血流中清除。當(dāng)DPPA被DMPA、DSPA或鯨蠟醇磷酸酯或被卵磷脂和磷脂酸混合物取代時(g組)，結(jié)果也相同。
表 3
<p><
>圖表說明表面活性劑Pluronic＝Poloxamer 338＝Synperonic F108＝具有(氧乙烯)n-(氧丙烯)m-(氧乙烯)n共聚物序列的嵌段共聚物磷脂酸類DLPA＝1，2-二月硅酰-甘油基-3-磷脂酸(飽和脂肪酸C12)DMPA＝1，2-二肉豆蔻酰-甘油基-3-磷脂酸(飽和脂肪酸C14)
DPPA＝1，2-二棕櫚酰-甘油基-3-磷脂酸(飽和脂肪酸C16)DSPA＝1，2-二硬脂酰-甘油基-3-磷脂酸(飽和脂肪酸C18)SPA-3＝1，2-二烷酰基-甘油基-3-磷脂酸(從大豆中加氫得到;脂肪酸C16和C18混合物)膽堿磷酸(卵磷脂)類DMPC＝1，2-二肉豆蔻酰-甘油基-3-膽堿磷酸DPPC＝1，2-二棕櫚酰-甘油基-3-膽堿磷酸DSPC＝1，2-二硬脂酰-甘油基-3-膽堿磷酸DAPC＝1，2-二花生酰-甘油基-3-膽堿磷酸P90H＝1，2-二烷?；?甘油基-3-膽堿磷酸-加氫大豆卵磷脂(脂肪酸C16和C18混合物＝同DPPC)磷酸甘油類DMPG＝1，2-二肉豆蔻酰-甘油基-3-磷酸甘油DPPG＝1，2-二棕櫚酰-甘油基-3-磷酸甘油其他CHOL＝膽固醇CETYL PHOSPHATE＝鯨蠟醇(C16)的磷酸單酯TWEEN＝多乙氧基醚＝聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯BRIJ＝聚乙二醇十六烷基醚MAG(V)＝按EP-A-0272091制備的有脂質(zhì)體的磁性氧化鐵AMI25＝按EP-A-0275285制備的葡聚糖包裹的磁性氧化鐵DPPC/DPPA2＝DPPC與DPPA重量比為7.5/2.5DPPC/DPPA3＝DPPC與DPPA重量比為5.0/5.0DPPC/DPPA4＝DPPC與DPPA重量比為2.5/7.5
在結(jié)果分析中明顯地看到，血流中物質(zhì)的穩(wěn)定性可用一種模型加以合理的說明，在這種模型中，在起始階段，帶有足夠長疏水鏈的磷脂的磷?；^部與磁性氧化鐵芯核相互作用，形成刺猬樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為非離子表面活性劑提供固定層，從而構(gòu)建成圍繞芯核的三維層。不同的實驗還證明，使用不同來源的表面活性劑對最終結(jié)果只有次要影響。
所假設(shè)的這種模型被以下發(fā)現(xiàn)進一步支持，即磷脂與非離子表面活性劑的比例雖然不很嚴格，但應(yīng)維持在0.01-10之間，以0.1-1為佳，如表4所示，實驗證明，對于恒定的氧化鐵濃度，用過量非離子表面活性劑(與DPPA的數(shù)量比較)制備的磁性氧化鐵顆粒不足以防止它被從血中快速清除。
另一方面，實驗也表明，在同樣條件下但表面活性劑用量低得多而制備的顆粒顯示同樣差的防護過早被清除的作用。在這些結(jié)果后面的基本原理表明，表面活性劑太多會使磷脂或單酯過于分散，使其對磁性顆粒的親和力受損，同時破壞了形成刺猬樣結(jié)構(gòu)的適當(dāng)條件。同理，用太少表面活性劑制備的顆粒易凝聚，不能防止從血液中快速清除。
權(quán)利要求
1.用于患病的人或動物NMR成像的顆粒，包括氧化鐵芯核和由至少一種具有結(jié)合于疏水性尾部的帶負電荷含磷頭部的兩親化合物及一種或一種以上表面活性劑組成的外層，其特征在于兩親化合物是膠粒狀的，該層是三維殼形態(tài)的，包括至少一種表面活性劑，它使兩親化合物呈膠粒狀。
2.按權(quán)利要求1所述的顆粒，其中兩親化合物分子是相對于氧化鐵芯核排列的，以使兩親化合物的含磷頭部指向氧化鐵芯核，而疏水性尾部向外伸出，形成刺猬樣結(jié)構(gòu)。
3.按權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中頭部是磷?；^部，其上兩個氧原子的負電荷均用于和芯核相互作用。
4.按權(quán)利要求3所述的顆粒，其中兩親化合物是磷酸的烷基，鏈烯基或環(huán)烷基單酯或磷酯。
5.按權(quán)利要求4所述的顆粒，其中烷基或鏈烯基包括至少8個碳原子，較佳地為至少10個碳原子，更佳地為至少12個碳原子。
6.按權(quán)利要求4所述的顆粒，其中膠粒狀的磷脂由取代或部分取代的多元醇的單磷酸酯組成，所述多元醇的其他醇官能團至少有一個被一飽和或不飽和長鏈脂肪酸酯化或被一飽和或不飽和長鏈醇醚化，磷酸的其他兩個酸官能團可以是游離的也可以與堿金屬或堿土金屬成鹽。
7.按權(quán)利要求1、2或3所述的顆粒，其中兩親化合物是選自二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷酯酸或二硬脂酰磷脂酸的脂肪酸甘油酯的單磷酸酯。
8.按權(quán)利要求1、2或3所述的顆粒，其中表面活性劑是與兩親化合物交織在一起的生理學(xué)上可接受的非離子表面活性劑。
9.按權(quán)利要求8所述的顆粒，其中非離子表面活性劑包括至少一種具有聚氧乙烯片段和聚氧丙烯片段的嵌段共聚物或聚乙二醇烷基醚。
10.按權(quán)利要求9所述的顆粒，其中表面活性劑為Pluronic 、Poloxamer 、Poloxamine 、Syneronic 或BRIJ 。
11.按權(quán)利要求1、2或3所述的顆粒，其中兩親化合物為選自離子或中性磷脂、磷酸的單烷基或鏈烯基酯和/或膽固醇，麥角甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇和生育酚的兩種或兩種以上化合物的混合物。
12.按權(quán)利要求1、2或3所述的顆粒，其中磷脂與表面活性劑的重量比為1∶10至10∶1。
13.按權(quán)利要求1、2或3所述的顆粒，其中兩親化合物和外層表面活性劑的重量與芯核的重量之比為小于1∶1。
14.權(quán)利要求1-13的氧化鐵顆粒在人或動物體器官NMR成像上的應(yīng)用。
15.含權(quán)利要求1-13所述的任一種氧化鐵顆粒的粉狀制劑，該制劑分散在生理學(xué)上可接受的液態(tài)載體中時會形成用作NMR成像對比劑的懸浮液。
16.含權(quán)利要求1-13所述的任一種氧化鐵顆粒的可注射水懸浮液，該懸浮液懸浮在生理學(xué)上可接受的液態(tài)載體中，用作人或動物體NMR成像的對比劑。
17.制備權(quán)利要求1所述的顆粒的方法，其特征在于包括以下步驟a)選擇氧化鐵顆粒，將氧化鐵顆粒與兩親化合物及表面活性劑懸浮在水相中，形成混合物，b)用聲波處理，微流化處理或加熱使混合物活化，產(chǎn)生圍繞氧化鐵顆粒的三維殼狀層。
18.按權(quán)利要求17所述的方法，其中在作聲波處理、微流化或加熱后，將混合物滅菌和/或冷凍干燥。
19.按權(quán)利要求17或18所述的方法，其中在所述活化后將表面活性劑加到氧化鐵和二親化合物的混合物中，并可任選地重復(fù)聲波處理、微流化處理或加熱。
20.按權(quán)利要求17或18所述的方法，其中表面活性劑是包括至少一種具有聚氧乙烯片段和聚氧丙烯片段的嵌段共聚物或聚乙二醇烷基醚的生理學(xué)上可接受的非離子表面活性劑。
21.按權(quán)利要求17或18所述的方法，其中兩親化合物是被表面活性劑轉(zhuǎn)變成膠粒狀的磷脂。
22.按權(quán)利要求21所述的方法，其中膠粒狀磷脂包括取代或部分取代的多元醇的有機單磷酸酯;所述多元醇的至少另一個醇官能團被飽和或不飽和的長鏈脂肪酸酯化，或被飽和或不飽和的長鏈醇醚化，磷酸的另兩個酸官能團可為游離的或與堿金屬或堿土金屬成鹽。
23.按權(quán)利要求22所述的方法，其中磷脂為選自二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚磷脂酸或二硬脂酰磷脂酸的脂肪酸甘油酯的單磷酸酯。
全文摘要
抗凝集和抗肝脾RES攝取的作用增強的適于注入患者血流的磁性氧化鐵顆粒，包括氧化鐵芯核和圍繞芯核的磷酸單烷基或鏈烯基酯或甘油磷脂/表面活性劑三維殼。芯核和單酯或膠粒狀甘油磷脂形成刺猬樣結(jié)構(gòu)，再與非離子表面活性劑交織或互相盤繞形成保護性的三維殼。該顆粒在血循環(huán)中能長期存在，是極好的長效血池試劑。
文檔編號A61K49/00GK1089470SQ9311650
公開日1994年7月20日 申請日期1993年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月13日
發(fā)明者H·圖尼耶, R·亞森特, M·施奈德 申請人:辛苔蒂加股份有限公司