專利名稱：蛇毒抗癌藥物及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用眼鏡蛇毒，蝮蛇毒及免疫藥物制作抗癌藥物的配方和方法。
多年來，全世界許多國家都進行過蛇毒抗癌的研究。1933年法國學者采用眼鏡蛇毒治療腫瘤，發(fā)現(xiàn)了蛇毒不僅有止痛作用，而且有殺癌細胞的作用。1967年印度從眼鏡蛇毒中分離純化細胞毒，證明體內(nèi)能完全抑制吉田肉瘤生長。以后許多學者相繼證明蛇毒對KB細胞，S180，EAC腹水癌，乳腺癌，白血病等癌細胞均有明顯殺細胞作用。隨著科學研究的進展，各國學者相繼從眼鏡蛇毒中純化神經(jīng)毒組份，用于治療各種疼痛，臺灣學者證明純化的金環(huán)蛇毒細胞毒對S180，EAC，腹水肝癌，KB細胞體外具有顯著的殺細胞作用。日本，美國學者等證明對白血病L1210有明顯殺癌細胞作用。另外，也有用眼鏡蛇毒，蝮蛇毒初毒進行抗癌研究的，以上研究有的是對蛇毒中個別成份加以提純并研究，有的是用蛇毒初毒進行研究，都有止痛和殺癌細胞的功能，國內(nèi)目前也有幾種蛇毒抗癌藥物，但由于使用的是蛇毒粗毒，其用毒量較大，毒副作用較高。都為醫(yī)院自己使用的院制劑。
本發(fā)明的目的是要研制一種用毒量小，毒副作用低，能對一些癌病患者血小板、白細胞、紅細胞、血色素有不同程度的增加，能夠具有較好的殺癌細胞的作用，并且還能對患者起到減輕疼痛或者鎮(zhèn)痛和促進免疫作用的，蛇毒抗癌藥物。
本發(fā)明的內(nèi)容的一種方法是由眼鏡蛇科蛇毒精毒及蝮亞科蛇毒精毒組成，其中兩種蛇蛇毒比例分別為，眼鏡蛇科蛇毒精毒為5-30%，蝮亞科蛇毒精毒為70-95%，其中眼鏡蛇毒精毒和蝮蛇毒精毒的比例在10∶90左右時效果很好。本發(fā)明的另一種方案是由眼鏡蛇科蛇蛇毒精毒、蝮亞科蛇蛇毒精毒及免疫藥物組成，其中眼鏡蛇科蛇毒精毒為5-20%，蝮亞科蛇蛇毒精毒為30-50%，免疫藥物為30-65%。其中的眼鏡蛇科蛇毒精毒可以為眼鏡王蛇蛇毒精毒、眼鏡蛇蛇毒精毒或金環(huán)蛇蛇毒精毒。還可以是銀環(huán)蛇蛇毒精毒。蝮亞科蛇蛇毒精毒為蝮蛇蛇毒精毒或五步蛇蛇毒精毒。還可以是竹葉青蛇蛇毒精毒或烙鐵頭蛇蛇毒精毒。免疫藥物為白細胞介素Ⅱ或干擾素。所述的蛇毒抗癌藥物的制備方法是，將眼鏡蛇科蛇毒及蝮亞科蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。在每200克藥物中除免疫藥物外包含神經(jīng)毒100毫克-200毫克，細胞毒150毫克-600毫克，磷脂酶A20微克-40微克，血小板聚集抑制組分50微克-100微克，精氨酸酯酶30單位-60單位，蛋白水解酶10單位-40單位，5’-核苷酸酶500毫國際單位-1000毫國際單位，不溶物質3%-6%。本發(fā)明藥物可以加入不同的制藥載體后制成不同類形的成藥，如按規(guī)定的使用比例和葡萄糖混合制成膠囊。
本發(fā)明主要是用于治療癌癥，能明顯有效的殺死癌細胞。
本發(fā)明的有效成份或有效部位的化學、物理性質及功能是這樣的，眼鏡蛇毒神經(jīng)毒是由61個氨基酸殘基組成的堿性蛋白，有四對二硫鍵，分子量6940道爾頓，等電點9以上，最適溫度37℃，在酸性基質中對熱極穩(wěn)定(PH4、100℃、30分活性不喪失)，無酶活性。不易被胃蛋白酶破壞，需共同孵化三小時毒性才被破壞50-90%，其氨基酸組成見(表1)。可阻斷神經(jīng)肌肉受體，減少Ach(乙酰膽堿)釋放，對KCL效應無影響，終板電位(EPPS)和微終板電位(MEPPS)研究表明對神經(jīng)末梢傳導及肌膜上被動電位無影響，其作用與α-筒箭毒相同。通過外周阻斷神經(jīng)傳入中樞，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，眼鏡蛇毒細胞毒由60個左右的氨基酸殘基組成，其中包括15-17種氨基酸，分子量6000-7000的肽，PI12以上，是一個強堿性肽，在酸性介質中，具有明顯的熱穩(wěn)定性，加熱100℃活性不喪失。對酶不敏感，與胰蛋白酶、胃蛋白酶等共同孵化3小時活性降低1/4以下，甚至無降低，致死毒性僅為粗毒的1/7，但含量占粗毒50%以上，其氨基酸組成見(表1)。其主要作用是溶解細胞膜。5’-核苷酸酶能專一性水解5’-單核苷酸上的磷酸，生成核苷。蛇毒中5’-核苷酸酶能迅速水解5’-AMP和5’-UMP，而對3’-AMP無作用。蛇毒中5’-核苷酸酶大都是糖蛋白，由15-17種氨基酸組成，門冬氨酸(酰胺)和谷氨酸(酰胺)較從其它動物組織中獲得同類酶含量高。其分子量在74000-10000道爾頓，部份蛇毒中5’-核苷酸酶還同時具有ADP酶活性，等電點pI6.5-7，活性可被Mg2+、Mn2+、Co2+、Ca2+激活而被En+1、Ni+1抑制。最適pH6-9之間，最適溫度40-60℃，對熱穩(wěn)定60℃加熱30分鐘活性不喪失，氨基酸組成見表1。其作用是這樣的，5’-核苷酸酶是一種膜結合酶，特異定位于膜上，目前有報導在慢性粒細胞白血病中外周白細胞5’-核苷酸酶較正常降低3-30倍，蛇毒5’-核苷酸酶明顯抑制血小板聚集，作用機制除明顯抑制環(huán)氧化酶生成(ADP)途徑和TXB2生成(AA)途徑外，5’-NT瑩光測定結果表明5’-NT釋放明顯被抑制。而血小板與腫瘤轉移密切相關，因此，5’-核苷酸酶對癌癥治療是有意義的。蛋白水解酶包括凝血酶樣酶，纖溶酶以及出血毒，主要裂解酯肪疏水氨基酸，用于溶解和消耗纖維蛋白和纖維蛋白原，消除壞死組織溶解物。主要水解組織蛋白導致癌細胞破壞。蛋白水解酶分子量50000-95000，pI4，等電點6，最適PH10，最適溫度40-45℃，已純化三個蛋白水解酶，其氨基酸組成見表1。磷酯酶A，分子量13000-30000，等電點10.5，能被Ba2+，Ca2+，En2+，Pn2+所激活，主要增加血管通透性和5’-HT釋放及組織胺釋放，促進藥物吸收與5’-HT相反，比組織胺強3倍。
本發(fā)明藥物的動物試驗的試驗數(shù)據(jù)是這樣的，首先用本發(fā)明的第一種配藥方案。體外試驗，以生理鹽水稀釋本發(fā)明藥物240毫克/毫升，以生理鹽水為對照，各取0.1毫升，加入剛抽取的小白鼠接種后7天含量為107-108/0.5毫升S180、EAC腹水癌細胞，37℃溫育15分鐘，1%臺酚蘭溶液染色，相差顯微鏡計數(shù)，各組死細胞數(shù)以%表示，然后涂片以瑞士染色，觀察細胞形態(tài)變化。實驗結果是這樣的，臺酚蘭染色后，相關顯微鏡計數(shù)每次計數(shù)6個樣品，每塊板計數(shù)100個細胞，實驗三次，取各組死細胞平均數(shù)， 表明本發(fā)明藥物體外能明顯殺死腫瘤細胞，與對照相比P＜0.001，各組死亡細胞數(shù)達85%以上，而對照組死亡率少于20%，見表2。體內(nèi)試驗，按常規(guī)腹腔或皮下接種含107-108個癌細胞的生理鹽水稀釋液0.2毫升，接種后立即分別給動物皮下注射或口服本發(fā)明藥物溶液，間日一次連服7天，每組10只動物，對照組給10%葡萄糖液，實驗重復3次，統(tǒng)計實驗動物死亡數(shù)，死亡時間，用K2求出差異顯著性，第一次給藥后每三天抽腹水涂片瑞士染色下觀察細胞形態(tài)變化。接種率按常規(guī)接種方法和接種時間抽取7天的給藥組和對照組腹水，用生理鹽水稀釋至107-108個癌細胞，給小鼠腹腔接種，接種7天后觀察有無腹水產(chǎn)生，統(tǒng)計接種率和兩組存活時間存活率。實驗結果是這樣的，1、S180實體瘤療效試驗小白鼠每組30只，后肢腋下、皮下接種S180實體瘤，接種后7天待小白鼠出現(xiàn)瘤塊時，實驗組分為口服組和腫塊上注射組，每日給本發(fā)明藥130+10mg/0.5ml，連續(xù)給藥7天，對照不給藥，以后分別于14天、21天、28天、處死10只稱重，結果實驗組與對照組相比有明顯的差異，尤以腫塊上注射組療效最好，實驗重復三次，見表3。2、S180、EAC腹水癌、腹水肝癌療效試驗小白鼠腹腔接種S180、EAC腹水癌、腹水肝癌后，按表中劑量分別皮下注射或口服本發(fā)明藥物溶液，間日一次，連續(xù)給藥一周，對照組給同量葡萄糖溶液，觀察統(tǒng)計25天動物存活數(shù)，分別統(tǒng)計各組動物存活時間后算出平均存活時間，結果表明，實驗組不僅存活率有一定增加，而存活率明顯高于對照組，見表4。對存活時間的統(tǒng)計表明，對照組S180平均存活22.7天，給藥實驗組平均存活41.3天，幾乎延長一倍。EAC對照組平均存活25.3天，實驗組為44天，亦明顯延長。腹水肝癌對照組平均存活19.7天，實驗組為37.9天，同樣有明顯延長(P＜0.01-0.001)。3、接種率分別在第7天接種時，將上述對照組和實驗組抽出腹水，按常規(guī)接種方法，分別給20只小鼠接種，觀察各組腹水生成情況，結果表明對照組100%接種成功，實驗組則明顯下降，僅有15-20%的小鼠接上種，其余小鼠均未接上種，接種率分別下降80-85%。未接上種小鼠生長至25天，對照組小鼠全部死亡時也未出現(xiàn)腹水。4、腫瘤細胞形態(tài)學變化分別在接種后7天，抽取實驗給與對照組的腹水進行涂片，Geamsa瑞士染色液染色進行細胞形態(tài)學檢查，結果觀察到實驗組細胞形態(tài)學上有明顯改變。
以下是本發(fā)明藥物的蛇毒和白細胞介素-Ⅱ復合配方抗癌作用的觀察。1、體外實驗將人體二倍體細胞(KMB)Hala，Hep2，CEM(T白血病細胞)等細胞分別稀釋為106/毫升，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1毫升，37℃二氧化碳孵箱培養(yǎng)，細胞形成單層后，換入含不同濃度蛇毒的1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時鏡下觀察細胞病變，然后吸棄培養(yǎng)液，加入1∶1000濃度的中性紅，室溫15分鐘，自來水沖洗，肉眼觀察，細胞全部脫落(不著色)的最高稀釋度為蛇毒的殺傷濃度，細胞著色表明存活。蛇毒加入細胞48小時后，可見明顯的CPE(細胞病變)，蛇毒濃度在6.25微克/毫升時所有細胞(包括正常細胞和癌細胞)均出現(xiàn)明顯的病變(表5)。2、體內(nèi)抑瘤試驗無菌取出Lews肺癌包塊，除去包膜和結締組織，制備細胞懸液(1.0×107/毫升)，0.2毫升注射于C37BL/6小鼠腋窩皮下，隨意分組，每組5-10只，次日分別給藥，蛇毒劑量為12.5-50微克/只，皮下注射;白細胞介素-Ⅱ(IL-2)1000單位/只，腹腔注射;對照組腹腔注射0.2毫升生理鹽水，連續(xù)10天，取出瘤塊稱重，按抑瘤率%＝ (對照組平均瘤重-試驗組平均瘤重)/(對照組平均瘤重) ×100計算抑瘤率，共作4次試驗，結果見表6，單獨使用蛇毒和IL-2，均有一定的抑瘤作用，二者無顯著性差異(P＞0.05)，使用高濃度蛇毒時，腫瘤生長未抑制。蛇毒與IL-2聯(lián)合使用，抑瘤率明顯提高，特別是蛇毒濃度較低時(12.5微克/毫升)，抑瘤率可達88.4%，與單獨使用蛇毒或IL-2相比，差別顯著(P＜0.001)。3、應用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒測定法用自動生化分析儀測定各組LDH釋放量，按NK細胞活性%＝ (U-B)/(M-B) ×100計算NK細胞活性，U＝試驗組LDH單位，M＝靶細胞最大釋放LDH單位，B＝靶細胞自然釋放LDH單位，實驗結果見表7，在分別用蛇毒和IL-2治療后，NK細胞活性均有一定的提高(分別為23.2%和29.2%)，二者無顯著差別(P＞0.005);二者聯(lián)合使用后，NK細胞活性顯著提高(48.6%)，與單獨使用蛇毒和IL-2相比，具有極顯著的差異(P＜0.001)。
根據(jù)上述分析和實驗，蛇毒細胞毒可破壞細胞膜，導致癌細胞萎縮、壞死。所提組份尚可抑制癌組織核酸形成，直接殺死癌細胞。用本發(fā)明蛇毒抗癌藥物進行動物毒性試驗，動物口服人有效劑量的30、60、120倍劑量，一日三次，連續(xù)取用90天，結果表明對動物體重，外周血象，骨髓象，肝腎功能，血壓，心電圖等無明顯影響，病理切片無明顯病變。動物實驗表明該藥不會導致動物染色體畸變和微核率增加，對生殖無影響。用該藥在體外對S180、EAC腹水癌、Raji細胞、KB細胞、乳腺癌、肝癌等細胞均有明顯的殺細胞作用，在有效用藥劑量下100%殺死癌細胞，殺死癌細胞作用與劑量成正比相關，殺癌細胞的LD50劑量為13.3+3.1微克/毫升。細胞培養(yǎng)試驗證明在全數(shù)殺死癌細胞劑量下，對血細胞僅有15-25%的殺傷和致腫脹作用。體內(nèi)試驗表明對S180、EAC腹水癌、腹水肝癌、肺癌均有較好的作用(P＜0.01-0.001)，能延緩或減少腹水出現(xiàn)時間和數(shù)量，延長存活期一倍左右，并且?guī)缀跄?00%降低接種率。在有效劑量下與療效呈正相關，接近半數(shù)致死量后則顯示出毒性反映，不宜增加。與國內(nèi)外治療肝癌的藥物氟脲嘧啶及抗癌藥更生霉素相比，在安全劑量和殺癌細胞作用以及療效上更安全可靠(表9，10，11，12)。藥理作用表明，該藥主要是以控制血小板功能方面來控制癌細胞轉移，同時亦對癌細胞有明顯殺細胞作用，臨床觀察表明，該藥總有效率為84.3%，患者服藥后顯效者腫塊明顯縮小，轉移被控制，給藥前后肝功、腎功、血象、心電等檢查無明顯毒付作用，肝、腎功能正常，外周血象無變化，部分患者血小板、白細胞、紅細胞、血色素呈不同程度增加，無一出血，大部分患者疼痛減輕或消失，免疫功能、食欲、體重均有所增加，可避免目前癌癥治療藥物和放療因毒副作用大導致血小板、白細胞、紅細胞減少而至使患者被迫停藥，因而表明該藥安全系數(shù)大、無明顯毒副作用，并能增加血小板、白細胞、改善患者狀況，從血液化驗中未發(fā)現(xiàn)血象(WBC)減少，多數(shù)患者反而血小板計數(shù)進行性緩慢地增加，肝、腎功能均較用藥前穩(wěn)定，說明此藥比化療安全(化療WBC及全身惡液質加重)。比化療有更大優(yōu)越性，有利于配合放療和其它治療方法，是一個有效無毒藥物。該藥服藥后有明顯的止痛作用，在服藥一周后疼痛減輕或消失，可替代嗎啡。另外，目前雖有一些蛇毒抗癌方面的藥物，如“江西延齡膠囊”、“海南益壽膠囊”、“上海787”、“876抗癌膠囊”、空軍總醫(yī)院“蛇毒抗癌膠囊”等雖都有作用，但由于上述藥物均系使用蛇毒粗毒，并均為醫(yī)院制劑，其使用劑量300-1000mg/每粒，無有關實驗及研究報導，其用量超過本發(fā)明藥物約100mg/每粒的數(shù)倍至10倍。本發(fā)明藥物減少了上述藥物因使用初毒而存在的毒副及無效成份，該藥毒性為純化神經(jīng)毒的1/100以下。并且在效能上優(yōu)于上述藥物。該藥與國際公認的抗癌白細胞介素Ⅱ相比，具有同等療效。但二者合用制成的藥物在動物體內(nèi)抑癌率達70-87%。近于單獨用白細胞介素Ⅱ的兩倍以上。
動物急性毒性試驗給小鼠口服劑量，皮下注射劑量均高于人有效劑量的700倍以上，均未出現(xiàn)明顯的中毒反應。
表8為小鼠接種腹水肝癌后不同劑量下的體內(nèi)量效關系比較，在有效劑量下，療效和劑量成正比，超過一定劑量，療效無明顯增加。表9、表10、表11、表12為與更生霉素、氟尿嘧啶的療效比較。表13為本發(fā)明抗癌藥物臨床試用初步結果，表14為用組織培養(yǎng)法測定不同蛇毒對Raji細胞培養(yǎng)三天后的半數(shù)致死劑量和最小致死劑量。
本發(fā)明藥物的成人有效劑量為500-700微克/次，膠囊為2-3粒/次。每日為2-4次。使用方法為可口服膠囊或注射針劑。
綜上所述，本發(fā)明不但比現(xiàn)有蛇毒抗癌藥物所用蛇毒用毒量明顯減少，而且提高了藥效，能很好的起到殺癌，止痛的作用。
本發(fā)明的實施例是這樣的
實施例1、由眼鏡蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒95%組成。其制備方法是，將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。按規(guī)定的使用劑量和葡萄糖混合制成膠囊。
實施例2、由眼鏡蛇蛇毒精毒9%，蝮蛇蛇毒精毒91%組成，其制作方法是將這兩種蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后按比例混合后制成。并可按規(guī)定的使用劑量制成注射劑。
實施例3、由眼鏡蛇毒精毒10%，蝮蛇毒精毒90%組成。其制備方法是，將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。
實施例4、由眼鏡蛇毒精毒15%，蝮蛇毒精毒85%組成。其制備方法是，將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。按規(guī)定的使用劑量制成片劑。
實施例5、由眼鏡蛇毒精毒25%，蝮蛇毒精毒75%組成。制備方法是，將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。
實施例6、由眼鏡蛇毒精毒30%，蝮蛇毒精毒70%組成。制備方法是，將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。
實施例7、由眼鏡王蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒95%組成。制備方法是，將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。
實施例8、由眼鏡王蛇毒精毒10%，五步蛇毒精毒90%組成。制備方法是，將眼鏡王蛇毒及五步蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。
實施例9、由金環(huán)蛇毒精毒20%，蝮蛇毒精毒80%組成。其制備方法是，將金環(huán)蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。
實施例10、由金環(huán)蛇毒精毒30%，五步蛇毒精毒70%組成。制備方法是將金環(huán)蛇毒及五步蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例混合后制成。
實施例11、由眼鏡蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒50%，白細胞介素Ⅱ45%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。按規(guī)定的使用劑量和葡萄糖混合制成膠囊。
實施例12、由眼鏡蛇毒精毒10%，蝮蛇毒精毒40%，白細胞介素Ⅱ50%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例13、由眼鏡蛇毒精毒15%，蝮蛇毒精毒40%，白細胞介素Ⅱ45%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例14、由眼鏡蛇毒精毒20%，蝮蛇毒精毒50%，白細胞介素Ⅱ30%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。按規(guī)定的使用劑量制成注射劑。
實施例15、由眼鏡蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒30%，白細胞介素Ⅱ65%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例16、由眼鏡蛇毒精毒10%，蝮蛇毒精毒30%，白細胞介素Ⅱ60%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例17、由眼鏡蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒40%，白細胞介素Ⅱ55%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例18、由眼鏡蛇毒精毒10%，蝮蛇毒精毒50%，白細胞介素Ⅱ40%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例19、由眼鏡蛇毒精毒15%，蝮蛇毒精毒30%，白細胞介素Ⅱ55%組成。將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例20、由眼鏡王蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒50%，白細胞介素Ⅱ45%組成。制備方法是將眼鏡王蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例21、由眼鏡王蛇毒精毒15%，五步蛇毒精毒50%，白細胞介素Ⅱ35%組成。制備方法是將眼鏡王蛇毒及五步蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例22、由金環(huán)蛇毒精毒20%，蝮蛇毒精毒30%，白細胞介素Ⅱ50%組成。制備方法是將金環(huán)蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例23、由金環(huán)蛇毒精毒20%，五步蛇毒精毒45%，白細胞介素Ⅱ35%。所述的蛇毒抗癌藥物的制備方法是，將金環(huán)蛇毒及五步蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與白細胞介素Ⅱ混合后制成。
實施例24、由眼鏡蛇毒精毒10%，蝮蛇毒精毒45%，干擾素45%組成。制備方法是眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與干擾素混合后制成。
實施例25、由眼鏡王蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒50%，干擾素45%。制備方法是眼鏡王蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與干擾素混合后制成。按規(guī)定的使用劑量制成片劑。
實施例26、由眼鏡蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒50%，干擾素45%組成。制備方法是將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與干擾素混合后制成。
實施例27、由眼鏡王蛇毒精毒5%，五步蛇毒精毒50%，干擾素45%組成。制備方法是將眼鏡王蛇毒及五步蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與干擾素混合后制成。
實施例28、由眼鏡蛇毒精毒5%，蝮蛇毒精毒50%，干擾素45%組成。將眼鏡蛇毒及蝮蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與干擾素混合后制成。
實施例29、由金環(huán)蛇毒精毒9%，五步蛇毒精毒50%，干擾素41%組成。制備方法是將金環(huán)蛇毒及五步蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例與干擾素混合后制成。
表1氨基酸組成眼鏡蛇蝮蛇磷酯酶A名稱神經(jīng)毒細胞毒蛋白水解酶蝮蛇眼鏡蛇賴氨酸Lys396.3675組氨酸His202.0121精氨酸Arg024.7365門冬氨酸Asp86121420蘇氨酸Thr834.8265絲氨酸Ser424.2156谷氨酸Glu708.3268脯氨酸Pro252.7755甘氨酸Gly722.881010丙氨酸Ala023.15511半胱氨酸1/2Cys885.091412纈氨酸Val173.9354甲硫氨酸Met021.6231異亮氨酸Ile213.9675亮氨酸Leu166.0755酪氨酸Tyr234.05189苯丙氨酸Phe023.1854色氨酸Trp101.8423總殘基數(shù)626082.54126119N端亮氨酸亮氨酸天冬酰胺天冬酰胺C端門冬氨酸門冬氨酸谷氨酸谷氨酰胺分子量6949673412500




表8、本發(fā)明抗癌藥物體內(nèi)量效關系比較項目給藥量試驗動物試驗25天25天存平均存活組別mg/次/20g數(shù)(只)次數(shù)存活數(shù)活率%時間(天)110202105036.3220202136541.4330202126039.3440202168044.5550202157541.2660202168039.7葡萄糖對照組3020231522.5表9、本發(fā)明抗癌藥物、更生霉素、氟尿嘧啶對小鼠肺癌實體瘤的療效比較(體內(nèi))項目藥物劑量試驗7天瘤均15天瘤均21天瘤均與對照組別次數(shù)重(克)重(克)重(克)相比P本發(fā)明抗癌藥物40mg/20g11.4±0.21.1±0.31.35±0.5<0.001更生霉素35u/20g12.78±0.32.5±0.22.12±0.35<0.5氟尿嘧啶45mg/20g32.85±0.33.3±0.22.95±0.4<0.5葡萄糖30mg/20g33.37±0.24.1±0.34.32±0.2
表10、本發(fā)明抗癌藥物、更生霉素、氟尿嘧啶對小鼠腹水肝癌療效比較(體內(nèi))項目給藥量試驗動物試驗存活25天存平均存活組別數(shù)(只)次數(shù)數(shù)活率%時間(天)本發(fā)明藥物40mg/20g3032379.039.7更生霉素35u/20g3031136.828.2氟尿嘧啶45mg/20g3031653.333.3葡萄糖30mg/20g303516.819.6表11、本發(fā)明抗癌藥物、更生霉素、氟尿嘧啶對腹水肝癌細胞比較(體外)項目藥物試驗統(tǒng)計細胞死細胞死細胞與對照組別劑量次數(shù)數(shù)(個)數(shù)(個)%相比P本發(fā)明抗癌藥物120mg390084994.3<0.001更生霉素100u390032235.8<0.5氟尿嘧啶125mg390039343.7<0.5生理鹽水0.5ml390017419.4表12、本發(fā)明抗癌藥物、更生霉素、氟尿嘧啶體外殺肺癌細胞比較項目藥物劑量試驗統(tǒng)計細胞死細胞死細胞與對照組別次數(shù)數(shù)(個)數(shù)(個)%相比P本發(fā)明藥物120mg360057996.5<0.001更生霉素100u360018731.2<0.5氟尿嘧啶125mg360021035.8<0.5生理鹽水0.5ml6009315.5
表13本發(fā)明抗癌膠囊臨床試用初步結果
用組織培養(yǎng)方法測定不同蛇毒對Raji細胞培養(yǎng)三天后的LD50。結果見表14表14不同蛇毒對Raji細胞的半數(shù)致死劑量和最小致死劑量
注本發(fā)明抗癌膠囊系原料重量(除去填充物)
權利要求
1.一種蛇毒抗癌藥物，其特征在于所包含蛇毒為眼鏡蛇科蛇毒精毒及蝮亞科蛇毒精毒，其中兩種蛇蛇毒精毒所含比例分別為，眼鏡蛇科蛇毒精毒5-30%，蝮亞科蛇蛇毒精毒70-95%。
2.一種蛇毒抗癌藥物，其特征在于由下列組份組成，其所含組份及比例為，眼鏡蛇科蛇毒精毒5-20%，蝮亞科蛇蛇毒精毒30-50%，免疫藥物30-65%。
3.如權利要求1、2所述的蛇毒抗癌藥物，其特征在于所述的眼鏡蛇科蛇毒精毒為眼鏡王蛇蛇毒精毒。
4.如權利要求1、2所述的蛇毒抗癌藥物，其特征在于所述的眼鏡蛇科蛇毒精毒為眼鏡蛇蛇毒精毒。
5.如權利要求1、2所述的蛇毒抗癌藥物，其特征在于所述的眼鏡蛇科蛇毒精毒為金環(huán)蛇蛇毒精毒。
6.如權利要求1、2所述的蛇毒抗癌藥物，其特征在于所述的蝮亞蛇科蛇蛇毒精毒為蝮蛇蛇毒精毒。
7.如權利要求1、2所述的蛇毒抗癌藥物，其特征在于所述的蝮亞科蛇蛇毒精毒為五步蛇蛇毒精毒。
8.如權利要求2所述的蛇毒抗癌藥物，其特征在于所述的免疫藥物為白細胞介素Ⅱ。
9.如權利要求2所述的蛇毒抗癌藥物，其特征在于所述的免疫藥物為干擾素。
10.一種如權利要求1、2所述的蛇毒抗癌藥物的制備方法，其特征在于將眼鏡蛇科蛇毒及蝮亞科蛇蛇毒除去出血組份，用冰凍離心的方法除去雜質和與療效無關的組份，制成精毒后，經(jīng)冰凍干燥后，按比例將各種組份相互混合后制成。
全文摘要
本發(fā)明為一種蛇毒抗癌藥物及其制備方法，主要由眼鏡蛇科蛇毒、蝮亞科蛇蛇毒經(jīng)過加工，除去其中毒副組份、無效組份及雜質，制成精毒干燥后按一定比例將所得蛇毒精毒混合后制成或與免疫藥物混合后制成。該藥同現(xiàn)有蛇毒抗癌藥物相比，具有療效高，用毒量小，毒副作用小，單獨使用其效果與白細胞介素II相同，聯(lián)合使用其效果超過白細胞介素II，同時還可提高部分患者的血象。并對癌癥患者有鎮(zhèn)痛的作用，可替代嗎啡，是一類有顯著前景的抗癌藥物。
文檔編號A61P35/00GK1102570SQ9311464
公開日1995年5月17日 申請日期1993年11月12日 優(yōu)先權日1993年11月12日
發(fā)明者熊郁良, 王婉瑜 申請人:中科院昆明動物所動物毒素蛇資源開發(fā)中心