專(zhuān)利名稱(chēng)：獸醫(yī)微生物制劑的制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種獸醫(yī)微生物制劑的制備方法及用途，涉及醫(yī)藥制品技術(shù)領(lǐng)域。
在現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)畜禽，尤其是幼齡畜禽，如仔豬患黃、白痢，羔羊及牛犢下痢，雛雞白痢，雛鴨下痢等的預(yù)防和治療方法，常采用抗菌素，不僅防治效果不好，有時(shí)還會(huì)產(chǎn)生藥物的毒副作用?！督K農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)》1983年4(1)，方定一對(duì)“正常仔豬腸道菌群的初步研究”一文中，提出了仔豬白痢可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)，并用大腸桿菌NY-10制劑口飼新生仔豬，防止黃痢的探討，但均未制備出具有實(shí)用價(jià)值的微生物制劑。
本發(fā)明的目的是為了避免上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種對(duì)畜禽尤其對(duì)幼齡畜禽下痢具有明顯防治效果、無(wú)毒副作用、制備容易，使用方便的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)措施來(lái)達(dá)到將蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereus)SA38原種菌株接種于PH為7-7.2的普通瓊脂斜面上，在35℃-38℃，最好在37℃溫度下，培養(yǎng)18-24小時(shí)，經(jīng)鏡檢鑒定合格后作為生產(chǎn)用菌種。再將生產(chǎn)用菌種接種于PH為7-7，2。含有0.25%的葡萄糖的種子大瓶或種子罐肉湯培養(yǎng)基中，在35℃-38℃，最好在37℃溫度下，培養(yǎng)18-24小時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)證明純粹，即可作為種子菌液，并可保存于0℃-4℃下，限三天內(nèi)使用。將每毫升中含有蠟樣芽孢桿菌活菌10-15億個(gè)的種子菌液接種于大罐培養(yǎng)基中，按每100毫升培養(yǎng)基中加入80-100億個(gè)活菌的菌液比例接種，培養(yǎng)基是由在凈化的自來(lái)水或蒸餾水中加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏。0.3%的葡萄糖和0.5%的食用鹽(按重量%計(jì))組成，PH為7-7.2。在常溫下，最好在30℃-32℃溫度下，采用大罐深層通氣和連續(xù)攪拌，罐內(nèi)通氣壓力為0.2-0.4公斤，攪拌的速度為每分80-130轉(zhuǎn)，以滿(mǎn)足蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中對(duì)氧的需要。連續(xù)培養(yǎng)36-48小時(shí)，當(dāng)菌液中蠟樣芽孢桿菌的芽孢形成數(shù)量達(dá)到9%以上時(shí)，進(jìn)行每分鐘達(dá)15000轉(zhuǎn)以上的高速離心5-10分鐘，去其上層澄清液，留存下層灰白色菌體，然后按菌體與無(wú)水淀粉1∶4的比例(按重量比計(jì))向菌體中加入淀粉，經(jīng)75℃-85℃干燥、粉碎、過(guò)80目篩，即獲得每克混合物中含有蠟樣芽孢桿菌活菌數(shù)至少40億個(gè)的菌粉。再將葡萄糖、菌粉與淀粉按1∶3∶6的比例(按重量比計(jì))混合均勻，即得每克中含有蠟樣芽孢桿菌活菌10-15億個(gè)的粉劑。在粉劑中加入適量的水分，壓制，即得片劑。每片重量為0.3克，每克含活菌10億個(gè)以上。
按上述方法制備的片劑或粉劑，用于畜禽，尤其是對(duì)幼齡畜禽因需氧或兼氧微生物引起的下痢，包括仔豬黃、白痢、羔羊及牛犢下痢，雛雞白痢，雛鴨下痢等的預(yù)防和治療的微生物制劑。
蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereus)SA38菌株，是一種已知的可以通過(guò)商業(yè)渠道獲得的菌種，其商品目錄見(jiàn)《中國(guó)菌種目錄》(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)編著，輕工業(yè)出版社出版，1993年10月)。
一.細(xì)菌學(xué)特征1.形態(tài)與染色為革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀，單個(gè)或呈短鏈狀排列，大小0.9×2.0u，芽孢居中，胞內(nèi)β-羥基丁酸鹽。用蘇丹黑染色，呈黑色顆粒。有鞭毛能運(yùn)動(dòng)，無(wú)莢膜。
2.培養(yǎng)特性普通肉湯培養(yǎng)24小時(shí)，呈混濁生長(zhǎng)，菌膜較薄。在普通瓊脂平皿上培養(yǎng)18-24小時(shí)，菌落園形，邊緣整齊，表面低，呈乳脂樣不透明，大小為4-5mm。在鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24-48小時(shí)，不產(chǎn)生β溶血。
3.生化反應(yīng)對(duì)葡萄糖、蔗糖、麥芽糖產(chǎn)酸，對(duì)乳糖、木糖、甘露醇、阿拉伯膠糖不產(chǎn)酸，硝酸鹽還原試驗(yàn)(+)，枸椽酸試驗(yàn)(-)，明膠液化(-)，氧化酶試驗(yàn)(-)，淀粉水解(+)，接觸酶試驗(yàn)(+)。
4.血清學(xué)鑒定用SA38蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株免疫家兔，制成效價(jià)達(dá)640-1280的高免血清，用此血清與SA38菌種試驗(yàn)應(yīng)產(chǎn)生特異性凝集反應(yīng)。
5.純粹試驗(yàn)用普通瓊脂斜面、沙門(mén)氏斜面、厭氣肉肝湯各2支，每支接種0.2毫升，培養(yǎng)3-5天，作革蘭氏染色鏡檢，觀察結(jié)果應(yīng)純粹。
二.產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)1.成品指標(biāo)
外觀呈白色或淺褐色的粉劑或片劑，無(wú)特殊氣味;水份＜5%;
均勻度變異系數(shù)＜7%;
雜菌數(shù)每克產(chǎn)品含雜菌數(shù)不超過(guò)10，000個(gè);
芽孢數(shù)每克產(chǎn)品中含活菌芽孢10億個(gè)以上。
2.存活期在室溫條件下，菌粉中活菌數(shù)在6個(gè)月內(nèi)無(wú)變化，7-12個(gè)月含活菌90%以上，1-1.5年含活菌80%以上，粉劑或片劑的保存期為1-1.5年。
3.芽孢計(jì)數(shù)每批(組)隨機(jī)抽樣3個(gè)樣品，各次1克，用生理鹽水稀釋100倍，然后10倍遞進(jìn)稀釋至10-8，接種鮮血馬丁瓊脂平皿2個(gè)，各0.1毫升，培養(yǎng)計(jì)算平均菌數(shù)，以3個(gè)樣品中最低芽孢數(shù)為該批(組)制劑的菌數(shù)，每克制劑含活芽孢數(shù)不得少于10億個(gè)。
4.安全性檢驗(yàn)用5-10日齡雛雞10羽，每天每羽投服制劑1克(不少于2億個(gè)活菌)，連服3天。另取同樣條件雛雞10羽，作為對(duì)照。飼養(yǎng)觀察10天，應(yīng)健活;或試驗(yàn)組與對(duì)照組合計(jì)死亡數(shù)不超過(guò)3羽，且試驗(yàn)組不超過(guò)對(duì)照組的死亡數(shù)為合格。
用18-22克小白鼠10只。每只腹注制劑0.1克，觀察10天，應(yīng)健活。
三.用法及用量治療量豬、牛、羊、兔、按每公斤體重0.1-0.15克，雛雞與雛鴨每只30-50毫克，口服，每日一次，連服3日。預(yù)防量減半，連服7日。本品不得與抗菌藥或抗菌藥物添加劑同時(shí)使用。
本發(fā)明的工藝流程是菌種培養(yǎng)→一級(jí)種子罐培養(yǎng)→生產(chǎn)大罐培養(yǎng)→通氣、攪拌→離心→干燥→檢驗(yàn)→粉劑或片劑。
本發(fā)明下面將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述例一將存活的蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereus)SA38原種菌株接種于普通瓊脂斜面上，在37℃溫度，PH為7，培養(yǎng)18小時(shí);再接種于PH為7，含有0.25%葡萄糖的種子罐肉湯培養(yǎng)基中，在37℃溫度，培養(yǎng)18小時(shí)，成為種子菌液;將種子菌液接種于大罐培養(yǎng)基中，按每100毫升培養(yǎng)基中加入含有90億個(gè)活菌的種子菌液的比例接種，培養(yǎng)基是在凈化的自來(lái)水中加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏、0.3%的葡萄糖和0.5%的食用鹽(按重量%計(jì))組成，PH為7，在30℃溫度下，采用大罐深層通氣和連續(xù)攪拌，罐內(nèi)通氣壓力為0.2公斤，攪拌每分鐘80轉(zhuǎn)培養(yǎng)36小時(shí)，當(dāng)菌液中蠟樣芽孢桿菌的芽孢形成數(shù)量達(dá)到90%以上時(shí)，高速離心5分鐘，轉(zhuǎn)速每分鐘15000轉(zhuǎn)，去其上層沉清液，留存下層灰白色菌體，然后按菌體與無(wú)水淀粉1∶4的比例(重量比)向菌體中加入淀粉，75℃干燥后，粉碎、過(guò)80目篩余，得每克混合物中含有蠟樣芽孢桿菌活菌至少40億個(gè)的菌粉，再將葡萄糖、菌粉與淀粉按1∶3∶6的比例(重量比)，均勻混合，即得每克混合物中含有存活蠟樣芽孢桿菌約15億個(gè)的粉劑。
例二重復(fù)例1的微生物粉劑的制備方法，將獲得的粉劑加入適量的水份，壓制，得片劑，每片重量為0.3克，每片含活菌數(shù)約3億個(gè)。
例三上述粉劑(或片劑)口服，用于治療豬、牛、羊、兔下痢每公斤體重0.15克;治療雛雞下痢，每只50毫克，每天一次，連服3天。預(yù)防量減半，連服7天。禁止抗菌藥物同時(shí)使用。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是1.療效好。治療仔豬黃、白痢99，588例，治愈率達(dá)94.50%，高于氯霉素等7種抗菌藥物平均77.20%的療效;治療牛犢下痢56頭，治愈率達(dá)96.6%，高于用抗生素治療86.7%的療效;治療雛雞白痢263，196只，治愈率達(dá)92.2%，治療雛鴨下痢106，076只，治愈率為91%，均高于抗菌藥物療效。
2.安全性好。試驗(yàn)6批，用1.5-1.8公斤重的健康家兔作安全試驗(yàn)，結(jié)果無(wú)不良反應(yīng)。對(duì)人、畜、禽均安全。
3.費(fèi)用低。易于制造，生產(chǎn)成本低。
4.使用方便。對(duì)畜禽可口服，也可飼用。
權(quán)利要求
1.一種獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于將存活的蠟樣芽孢桿菌(BacillusCereus)SA38原種菌株接種于普通瓊脂斜面上，在PH為7-7.2，35℃-38℃溫度下，培養(yǎng)18-24小時(shí)，成為生產(chǎn)用菌種；再將生產(chǎn)用菌種接種于含有0.25%葡萄糖的種子大瓶或罐內(nèi)肉湯培養(yǎng)基中，在PH為7-7.2，35℃-38℃溫度下，培養(yǎng)18-24小時(shí)，成為每毫升含有蠟樣芽孢桿菌活菌10-15億個(gè)的種子菌液；將種子菌液接種在大罐培養(yǎng)基中，按每100毫升培養(yǎng)基中加入80-100億個(gè)活菌的種子液比例接種，培養(yǎng)基是由在凈化的自來(lái)水或蒸餾水中，加入2%的蛋白胨、0.5%的牛肉膏、0.3%葡萄糖和0.5%的食鹽(重量%)組成，PH為7-7.2，在常溫下，采用大罐深層通氣和連續(xù)攪拌，培養(yǎng)36-48小時(shí)；當(dāng)菌液中蠟樣芽孢桿菌的芽孢形成數(shù)達(dá)到90%以上時(shí)，通過(guò)高速離心5-10分鐘，去其上層清液，留存下層灰白色菌體，然后按菌體與無(wú)水淀粉1∶4的比例(重量比)向菌體中加入淀粉，經(jīng)75℃-85℃干燥后，粉碎、過(guò)80目篩，獲得每克混合物中含有蠟樣芽孢桿菌活菌至少40億個(gè)的菌粉；再將葡萄糖、菌粉與淀粉按1∶3∶6的比例(重量比)均勻混合，即得每克混合物中含有存活蠟樣芽孢桿菌10-15億個(gè)的粉劑；粉劑加入適量水分，經(jīng)壓制得片劑。
2.如權(quán)利要求1所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于生產(chǎn)用菌種或種子菌液的培養(yǎng)溫度為37℃。
3.如權(quán)利要求1或2所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于大罐內(nèi)培養(yǎng)的溫度為30℃-32℃。
4.如權(quán)利要求1或2所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于大罐內(nèi)深層通氣的壓力為0.2-0.4公斤，攪拌速度為每分鐘80-130轉(zhuǎn)。
5.如權(quán)利要求3所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于大罐內(nèi)深層通氣的壓力為0.2-0.4公斤，攪拌速度為每分鐘80-130轉(zhuǎn)。
6.如權(quán)利要求1所述的獸醫(yī)微生物制劑的制備方法，其特征在于片劑的重量為0.3克，每克中含有蠟樣芽孢桿菌活菌10億個(gè)以上。
7.如權(quán)利要求1所述的獸醫(yī)微生物制劑，其特征在于用于預(yù)防治療畜禽腹瀉，尤其對(duì)需氧或兼氧性微生物引起的幼齡畜禽下痢，包括仔豬黃、白痢羔羊及牛犢下痢，雛雞白痢，雛鴨下痢有良好效果。
全文摘要
本發(fā)明是一種獸醫(yī)微生物制劑的制備方法及用途涉及醫(yī)藥制品技術(shù)領(lǐng)域。它是將蠟樣芽孢桿菌(Bacillus Cereus)SA38菌株，采用菌種培養(yǎng)，一級(jí)種子罐培養(yǎng)、生產(chǎn)大罐培養(yǎng)，然后進(jìn)行高速離心沉淀，獲得灰白色菌體，加入無(wú)水淀粉，經(jīng)干燥、粉碎、過(guò)篩，即得每克混合物中含有存活芽孢桿菌10億個(gè)以上的粉劑。將粉劑加入適量的水分，壓制，即得片劑。每片重0.3g。作為畜禽，尤其對(duì)幼齡畜禽下痢的預(yù)防和治療用生物制劑。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1090202SQ93101239
公開(kāi)日1994年8月3日 申請(qǐng)日期1993年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月19日
發(fā)明者何明清 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)