專利名稱：一種微生物及其生產(chǎn)生物殺線蟲制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種微生物及其生產(chǎn)生物殺線蟲制劑的方法。
根結(jié)線蟲在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，已知種類達70多種，其中南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲占全球農(nóng)地根結(jié)線蟲的95％，為害3000多種植物，每年造成的損失極為嚴重。在我國，根結(jié)線蟲造成煙草、花卉、蕃茄、棉花、花生、大豆等作物的嚴重損失，成為發(fā)展這些作物的重要限制因子。
目前線蟲防治主要采用化學農(nóng)藥，但隨著科學技術(shù)的進步，人們發(fā)現(xiàn)眾多的化學殺線劑均有副作用，尤其是使用不當，造成環(huán)境染，相繼有不少化學殺線蟲劑已經(jīng)禁用，有的即將禁用。如在美國溴甲烷允許使用到2000年，二溴甲烷允許使用到2005年。目前生產(chǎn)上常用的鐵滅克對根結(jié)線蟲的防治效果雖然較好，但成本高，且巨毒、大量使用會破壞土壤微生物區(qū)系，污染水源，使其使用受到一定限制。輪作、抗線蟲品種等在根結(jié)線蟲防治中亦起到了一定的作用，但均有局限性，且到目前為止，生產(chǎn)上還沒有可供大面積推廣的抗線蟲品種。鑒于此，人們除了繼續(xù)開發(fā)高效低毒、低殘留、高選擇性的化學殺線蟲劑外，并開始從生物防治角度另覓新法。線蟲生防就成為研究的熱點問題，引起各國的高度重視和大規(guī)模投資，目前已有3個線蟲生防商品制劑問世1、粗狀節(jié)叢孢(Arthrobotrys robusta)，商品名為Royal 300，在法國用于防治雙孢蘑菇線蟲，使蘑菇產(chǎn)量比未施用該制劑的對照提高25％(Cayrol,et al.,1978)；2、不規(guī)則節(jié)叢孢(A.irregalaris)，商品名為Royal 350，以麥粒作基物生產(chǎn)，大田施用對蕃茄根結(jié)線蟲有一定的防效，由于防效不穩(wěn)定，使用量過大未能廣泛推廣，僅在法國少量使用；3、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)，在菲律濱已大量生產(chǎn)，商品名為Bioact，該制劑已大面積用于植物病原線蟲的大田生防，取得了大田防治的顯著效果(Davide and Zorilla,1983;Jatala,1984;Canto-Saenz,1984)。盡管這3個商品生防制劑已在很大范圍內(nèi)取得了成功，但在不同國家施用的最大問題是防效不穩(wěn)定。
本發(fā)明的目的是培養(yǎng)出一種對根結(jié)線蟲防效顯著，性能穩(wěn)定，綜合性狀好，且易于規(guī)模化生產(chǎn)制備的微生物，并用其制成殺蟲效果良好的生物殺線蟲制劑。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的殺線蟲制劑是將一種真菌通過大量繁殖后用載體吸附等復(fù)合方法進行制備。其步聚是(1)先培養(yǎng)出微生物種子；(2)將微生物種子進入固態(tài)條件下大量繁殖；(3)將微生物種子進入液態(tài)條件下的深層發(fā)酵生產(chǎn)大量孢子和菌絲體；(4)將培養(yǎng)獲得大量生物體制作成不同類生物殺蟲制劑。
本發(fā)明的微生物是厚垣孢輪枝孢(Verticillium chlamdosporium)，其保藏登記號為CGMCC N0.0481。
上述微生物種子的培養(yǎng)方法是(以下均為重量百分比)以斜面固態(tài)培養(yǎng)種子，培養(yǎng)物為100毫升PDA基質(zhì)添加1-7克的蔗糖和0.1-1.5克的甘油制成，培養(yǎng)溫度26-30℃，培養(yǎng)時間3-7天；微生物種子固態(tài)條件下的大量繁殖方法以豆餅粉、麩皮、和蟹殼粉或蝦殼粉或幾丁質(zhì)等組成原料，在原料中加入水，原料和水的比例為1∶0.6-1,26-32℃下培養(yǎng)7-15天，得含生物體的混合物。
微生物種子進入液態(tài)條件下深層發(fā)酵生產(chǎn)大量孢子和菌絲體的方法液體培養(yǎng)基的組成成份為(重量體積比，即克/100毫升水)硫酸銨〔(NH4)2SO4〕0.5-1.5，氯化鈉(NaCl)0.5-1.5，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.01-0.07，硼酸(H3BO3)0.001-0.005，檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)0.3-0.7，硫酸鎂(MgSO4)0.01-1，氯化鈣(CaCl2)0.1-1，硫酸鋅(ZnSO4)0.01-0.1，硫酸錳(MnSO4)0.01-0.1，硫酸銅(CuSO4)0.0005-0.007，葡萄糖(C6H12O6)0.5-3，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)0.01-0.1，硫酸亞鐵(FeSO4)0.01-0.1，蔗糖(C12H22O11)1-7，甘油(C3H8O3)1-3，PH調(diào)為2.5-7.5，培養(yǎng)溫度26-37℃，培養(yǎng)時間為24-200小時。
上述優(yōu)選溫度為30-34℃，10噸容積以上發(fā)酵優(yōu)選時間為72-100小時。
微生物制備殺線蟲制劑的方法是
濃縮或添加輔料和承載物后，在溫度為40-45℃條件下烘干即得。
上述的輔料是活性炭，蟹殼粉，蝦殼粉，幾丁質(zhì)等，承載物是農(nóng)作物秸桿糠，草碳，鋸木屑，硅藻土等。
以下是本發(fā)明的生物殺線蟲劑在農(nóng)作物上試驗應(yīng)用情況。
對煙草根結(jié)線蟲病的防治效果進行了試驗，結(jié)果如下1、試驗藥劑供試藥劑生物殺線蟲劑粉劑(含孢量2.5×108/克)對照藥劑5％涕滅威顆粒劑(山東寧陽化工廠生產(chǎn))2、試驗處理(1)生物殺線蟲粉劑0.5千克/畝(2)生物殺線蟲粉劑1千克/畝(3)生物殺線蟲粉劑2千克/畝(4)5％涕滅威顆粒劑3千克/畝(5)空白對照3、試驗方法供試作物為煙草(Nicotiana tabacum)，品種為感病品種NC82，試驗地點在山東安丘，棕壤土，移栽作物，田間管理按生產(chǎn)規(guī)范進行。試驗設(shè)三行區(qū)，四次重復(fù)，小區(qū)面積為30平方米。移栽時生物殺線蟲劑可與有機肥等混合一次施入穴中，但涕滅威要注意不要離根部太近。旺長期在煙株附近開穴施入生物殺線蟲劑。
4、調(diào)查方法第一次用藥調(diào)查根結(jié)病情基數(shù)，生長中期及采完最后一片葉后立即調(diào)查各處理根結(jié)病情指數(shù)、病株率及土壤中幼蟲數(shù)量，計算防治效果及增產(chǎn)、增值效果。同時注意藥害調(diào)查。分級標準按全國煙草行業(yè)煙病害調(diào)查分級標準Yc/T39-1996進行。病情指數(shù)和防治效果按煙草病害藥效試驗方法Yc/T40-1996計算。
5、試驗結(jié)果表1 各處理病情指數(shù)變化及防效*處理病情指數(shù) 防效 二齡幼蟲數(shù)量 防效(％) (個/200cm3)(％)殺線靈0.5kg 5.18 50.2 17.579.8殺線靈1kg 7.9 24.0 35.558.9殺線靈2kg 7.95 23.6 22.074.6涕滅威3kg 5.1 50.9 15.582.1空白10.4 - 86.5-*表中數(shù)據(jù)為7月8日調(diào)查結(jié)果，病情指數(shù)為四次重復(fù)平均數(shù)，幼蟲數(shù)量為混樣二次觀察數(shù)據(jù)平均數(shù)。
對各處理土壤中二齡幼蟲數(shù)量進行方差分析，結(jié)果如表2表2 方差分析表變異來源 平方和 自由度 均方 F值區(qū)組間3.6000 1 3.6000 0.054處理間7014.40 4 1753.6 26.330**誤差 266.400 4 66.6000總變異7284.4023 45LSR05 22.6823.14 23.2 23.20LSR01 37.5739.24 39.8240.39處理 平均 5％顯著水平 1％顯著水平空白 86.50 a A殺線靈0.5kg 35.50 b B殺線靈1kg 22.0000b B殺線靈2kg 17.5000b B涕滅威3kg 15.5000b B表3各處理對煙草產(chǎn)量及產(chǎn)值的影響處理產(chǎn)量均價 上等煙 中等煙 畝產(chǎn)值(公斤/畝) (元) (％) (％) (元)殺線靈0.5kg 169.35.82 17.1 42.9 994.16殺線靈1kg144.95.94 20.6 39.7 870.55殺線靈2kg155.05.87 21.6 37.4 919.55涕滅威3kg169.76.42 26.4 39.1 1092.05空白 126.44.62 9.534.5 580.05
6、結(jié)果與分析根據(jù)以上田間撥根調(diào)查病情指數(shù)結(jié)果來看，使用三個劑量的生物殺線蟲粉劑都對煙草根結(jié)線蟲病有控制作用，其中以生物殺線蟲粉劑畝用0.5千克效果最好，效果與對照化學藥劑涕滅威相近。
從土壤中幼蟲數(shù)量調(diào)查結(jié)果來看，生物殺線蟲粉劑畝用0.5千克和2千克的土壤中幼蟲數(shù)量與對照藥劑涕滅威相近，與空白對照相比防效為79.8％和74.6％，從統(tǒng)計分析結(jié)果來看，二齡幼蟲數(shù)量在處理間差異顯著，重復(fù)間差異不顯著。三個劑量的生物殺線粉劑與空白對照差異顯著，與對照藥劑涕滅威間差異不顯著。
通過統(tǒng)計不同的處理對煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值的影響表明，生物殺線蟲粉劑畝用0.5千克，產(chǎn)值、產(chǎn)量都與對照藥劑涕滅威相近，其它兩個劑量產(chǎn)值、產(chǎn)量較低，但也顯著好于空白組?？梢钥闯鐾ㄟ^使用生物殺線蟲劑，煙葉畝產(chǎn)可以增加400元。
綜合以上三個方面的研究，生物殺線蟲劑可以在生產(chǎn)上應(yīng)用，雖然綜合防效和增值效果與化學藥劑涕滅威相近，但本發(fā)明的生物殺線蟲劑為純生物制劑，對于作物及環(huán)境無不良影響，而且生產(chǎn)成本低。試驗過程中未發(fā)現(xiàn)生物殺線蟲劑在試驗濃度范圍內(nèi)對煙草有藥害，沒有殘留，比較安全。本發(fā)明還具有性能穩(wěn)定，綜合性狀好，易于規(guī)?；a(chǎn)等特點。
本發(fā)明在溫室試驗中對蕃茄根結(jié)線蟲均有較理想的生防作用。從經(jīng)濟角度考慮，純孢子粉和可濕性粉劑適于遠距離的運輸供應(yīng)使用；復(fù)合粉劑以農(nóng)作物秸桿作為承載體的制劑，成本最低，而且對發(fā)酵液的承載量大，也有利于農(nóng)作物秸桿還田，改良土壤，無需考慮毒性。
實施例1種子和小樣制備及性能檢驗。
(1)以斜面固態(tài)培養(yǎng)種子，培養(yǎng)物為100毫升PDA基質(zhì)添加4克的蔗糖和1克的甘油制成，培養(yǎng)溫度26-30℃，培養(yǎng)時間3-7天；(2)將菌種貼斜面鏟起約5×5mm接入液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的組成為(克/100毫升水)硫酸銨〔(NH4)2SO4〕0.5，氯化鈉(NaCl)0.8磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.03，硼酸(H3BO3)0.004，檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)0.53，硫酸鎂(MgSO4)0.02，氯化鈣(CaCl2)0.5，硫酸鋅(ZnSO4)0.04，硫酸錳(MnSO4)0.1，硫酸銅(CuSO4)0.001，葡萄糖(C6H12O6)2，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)0.03，硫酸亞鐵(FeSO4)0.04，蔗糖(C12H22O11)3，甘油(C3H8O3)1配制而成，PH調(diào)為7.5，500ml三角瓶裝100ml液體培養(yǎng)基，以轉(zhuǎn)速為150rpm/min旋轉(zhuǎn)搖瓶，30℃培養(yǎng)3天即得液體種子。
(3)上述(1)中得到的液體種子再搖瓶培養(yǎng)6天，得發(fā)酵成熟的真菌生物體，合并后主要計量孢子數(shù)(用血球計數(shù)器)得液體狀生防治菌劑，溫室試驗使根結(jié)線蟲的卵、幼蟲和雌蟲分別比未施菌劑的對照減少76.9％,95.3％和80.3％，使蕃茄增產(chǎn)30％。該菌劑1％濃度使蕃茄種子發(fā)芽率增加20％，對蕃茄種子芽生長有顯著促進作用。苗移花盆育培，蕃茄成活率80％，對照苗成活率60％。
該菌劑除菌的濾液(代謝產(chǎn)物混合物)，0.5％的濃度使蕃茄種子發(fā)芽率提高20％。菌制劑或除菌濾液對蕃茄種子發(fā)芽培養(yǎng)過程中的水份保持有一定作用。對剪枝蕃茄無根苗新生根有顯著的刺激促進作用，在一定濃度下新生根數(shù)量可比自來水對照樣增加1倍以上。
實施例2擴大培養(yǎng)生物體及制劑制備(中試情況)。
用上述(2)中液體種子接入20升或50升全自動發(fā)酵罐，30-31℃恒溫培養(yǎng)48小時成熟，液體培養(yǎng)基的組成與上述(2)中的培養(yǎng)基相同。用雙層濾紙，布氏漏斗抽濾，冰凍干燥，得純孢子粉(包括菌絲體)制劑；加入4％硅藻土混勻，倒于雙層濾紙并撒有1‰碳酸鈣(CaCO3)的布氏漏斗中抽濾，42℃鼓風機干燥，并輔以一定量的硫酸銨((NH4)2SO4)得可溫性粉劑；用3-4千克草炭吸附1000ml發(fā)酵液的比例，或用300-400克農(nóng)作物秸桿糠吸附承載1000ml發(fā)酵液的比例，輔以2％活性炭(等輔料)助劑得復(fù)合制劑。
實施例3用上述微生物制備生物殺線蟲制劑粉。(大規(guī)模生產(chǎn))將(2)中所得液體種子接入4000立升發(fā)酵罐中，30-34℃培養(yǎng)48小時后移接入30000立升的發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)96小時，培養(yǎng)基與(2)中相同投入活性炭、幾丁質(zhì)等輔料復(fù)合，放出，用農(nóng)作物秸桿糠吸附承載并混勻，農(nóng)作物秸桿糠的用量為1立方發(fā)酵液加300-400千克(草糠400千克，豆桿糠350千克，玉米桿糠、甘蔗渣糠300千克)攤曬或42℃烘干即可。
實施例4固態(tài)法直接制備生物殺線蟲制劑。
將上述(1)中所得微生物菌種接入干料100克的瓶或500m三角瓶內(nèi)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為62％麩皮，20％豆餅粉，10％蟹殼粉或蝦殼粉，4％蔗糖，3％木屑，1％蠶蛹粉組成原料，加入與原料等量的水，即原料∶水=1∶1，28℃下培養(yǎng)10天，烘干，以1∶1的配比配入草炭即得產(chǎn)品制劑。此產(chǎn)品耐貯藏，存活率高，殺線蟲能力強，適用于產(chǎn)量較小的生產(chǎn)，小范圍應(yīng)用的情況，不適于大規(guī)模產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種微生物，其特征在于它是厚垣孢輪枝孢(Verticillium chlam-dosporium)，其保藏登記號為CGMCC NO.0481。
2.按權(quán)利要求1所述的微生物種子的培養(yǎng)方法，其特征在于以斜面固態(tài)培養(yǎng)種子，培養(yǎng)物為100毫升PDA基質(zhì)添加1-7克的蔗糖和0.1-1.5克的甘油制成，培養(yǎng)溫度26-30℃，培養(yǎng)時間3-7天。
3.按權(quán)利要求1所述的微生物種子固態(tài)條件下的大量繁殖方法，其特征在于以豆餅粉、麩皮、和蟹殼粉或蝦殼粉或幾丁質(zhì)等組成原料，在原料中加入水，原料和水的比例為1∶0.6-1,26-32℃下培養(yǎng)7-15天，得含生物體的混合物。
4.按權(quán)利要求1所述的微生物種子進入液態(tài)條件下深層發(fā)酵生產(chǎn)大量孢子和菌絲體的方法，其特征在于液體培養(yǎng)基的組成成份為(重量體積比，即克/100毫升水)硫酸銨〔(NH4)2SO4〕0.5-1.5，氯化鈉(NaCl)0.5-1.5，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.01-0.07，硼酸(H3BO3)0.001-0.005，檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)0.3-0.7，硫酸鎂(MgSO4)0.01-1，氯化鈣(CaCl2)0.1-1，硫酸鋅(ZnSO4)0.01-0.1，硫酸錳(MnSO4)0.01-0.1，硫酸銅(CuSO4)0.0005-0.007，葡萄糖(C6H12O6)0.5-3，磷酸二氫鈉(NaH2PO4)0.01-0.1，硫酸亞鐵(FeSO4)0.01-0.1，蔗糖(C12H22O11)1-7，甘油(C3H8O3)1-3，PH調(diào)為2.5-7.5，培養(yǎng)溫度26-37℃，培養(yǎng)時間為24-200小時。
5.按權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于優(yōu)選溫度為30-34℃，10噸容積以上發(fā)酵優(yōu)選時間為72-100小時。
6.一種用權(quán)利要求1所述的微生物制備殺線蟲制劑的方法，其特征在于濃縮或添加輔料和承載物后，在溫度為40-45℃條件下烘干即得。
8.按權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的輔料是活性炭，蟹殼粉，蝦殼粉，幾丁質(zhì)等，承載物是農(nóng)作物秸桿糠，草碳，鋸木屑，硅藻土等。
全文摘要
本發(fā)明是一種微生物及其生產(chǎn)生物殺線蟲制劑的方法。微生物是厚垣孢輪枝孢(Verticillium chlamdosporium),其保藏登記號為CGMCC NO.0481。利用該微生物在一定的培養(yǎng)條件下繁殖,并用其生產(chǎn)生物殺線蟲制劑。本發(fā)明的生物殺線蟲劑為純生物制劑,對于作物及環(huán)境無不良影響,而且生產(chǎn)成本低。試驗過程中未發(fā)現(xiàn)生物殺線蟲劑在試驗濃度范圍內(nèi)對煙草有藥害,沒有殘留,比較安全。本發(fā)明還具有性能穩(wěn)定,綜合性狀好,易于規(guī)?；a(chǎn)等特點。
文檔編號C12N1/14GK1297996SQ9911739
公開日2001年6月6日 申請日期1999年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月25日
發(fā)明者張克勤 申請人:張克勤