專利名稱：：非a非b型肝炎病毒顆粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及非A非B型肝炎病毒顆粒和它們的制備方法。具體地說，本發(fā)明涉及通過表達(dá)選自非A、非B型肝炎病毒基因組的整個(gè)區(qū)域、其ORF的整個(gè)區(qū)域以及從ORF上切掉NS4和/或NS5所得到的ORF區(qū)域之一的核苷酸序列而獲得的非A非B型肝炎病毒顆粒，并且還涉及有效地產(chǎn)生它們的方法。本發(fā)明的非A、非B肝炎病毒顆?？捎糜谔峁└髯砸苑茿、非B型肝炎病毒顆粒作為活性成分的一種非A、非B型肝炎疫苗，一種非A、非B型肝炎診斷試劑以及一種用于篩選輸血血液以防止輸血后肝炎的試劑。并用于提供用非A、非B型肝病毒顆粒所制備的多克隆或單克隆抗體。因此，本發(fā)明的非A、非B型肝炎病毒顆粒用于提供一種疫苗、一種免疫球蛋白、一種免疫診斷試劑，一種用于親合性柱層析以從輸血液中除去非A、非B型肝炎病毒的試劑。非A、非B型肝炎病毒的定義病毒性肝炎是一種由肝炎病毒感染引起的肝臟疾病。在此之前，A型肝炎病毒、B型肝炎病毒和D(δ)型肝炎病毒已經(jīng)分離和鑒定。D型肝炎病毒(δ-肝炎病毒)是一種有缺陷的病毒，它不能夠自身增殖，它的增殖需要B型肝炎病毒作為輔助病毒共存。因此，D型肝炎病毒病只存在于B型肝炎患者身上。在1974年，報(bào)導(dǎo)了許多肝炎患者是由A型肝炎病毒或B型肝炎病毒之外的一種因子引起的。這種肝炎稱為“非A、非B型肝炎”，并且對非A、非B型肝炎病毒已經(jīng)在世界各地進(jìn)行了很廣泛的研究。此后，已發(fā)現(xiàn)存在許多類型的非A、非B型肝炎病毒。到目前為止的研究結(jié)果表明，按照感染途徑，非A、非B型肝炎病毒被分為兩種類型流行性肝炎病毒，即一種腸道傳染的非A、非B型肝炎病毒，它是通過水和食物傳播的;和一種通過輸血等經(jīng)血液傳染的非A非B型肝炎病毒。其中只對傳播于非洲、印度以及南亞地區(qū)的腸道傳染性非A、非B型肝炎病毒作了病毒學(xué)鑒定，但對血液傳播的非A、非B型肝炎病毒仍然未鑒定。下文中將血液傳染的非A、非B型肝炎簡寫為“NANB肝炎”，血液傳染的非A、非B型肝炎病毒簡寫為“NANBV”。有關(guān)NANB肝炎研究的情況和問題以診斷學(xué)、組織病理學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等方面的知識[“JapanMedicalJournal”，No.3320，pp3-10，1987;“Igaku-noAyumi(Progressofmedicine)”，151(13)，pp.735-923，1989;“KanTanSui(Liver，Gallbladder，Pancreas)”，21(1)，pp.5-113，1990;“JikkenIgaku(ExperimentalMedicine)”，8(3)，pp.201-233，1990]為基礎(chǔ)，通過NANBV與其他肝炎病毒的比較，已經(jīng)在世界各地展開了關(guān)于NANB肝炎的流行病學(xué)、臨床檢查、診斷、治療和預(yù)防及病毒學(xué)的研究。關(guān)于NANB肝炎，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了下列的發(fā)現(xiàn)(1)流行病學(xué)在日本，按照原生省的估計(jì)，大約60%的慢性肝炎患者(即約72萬患者)，約40%的肝硬化患者(即約10萬患者)和大約40%的肝癌患者(即約7千患者)是NANB肝炎。在美國每年輸血后肝炎患者的數(shù)量達(dá)到15萬至30萬人，并且90%的輸后肝炎患者是NANB肝炎患者。進(jìn)一步地說，據(jù)推測，有1至6%的供血者是NANBV攜帶者。據(jù)進(jìn)一步估計(jì)在其他國家也是如此，它們的NANB肝炎發(fā)病率和NANBV攜帶者與美國和日本相同或高于美國和日本。因此，NANB肝炎的預(yù)防、早期診斷和早期治療成為具有全球性重要性的問題。(2)病毒學(xué)此前，有人報(bào)導(dǎo)NANBV是由一個(gè)被膜和推測直徑為50nm的球形病毒顆粒組成的，分類學(xué)研究表明已知的NANBV是一種與披蓋病毒或黃色病毒相似的病毒，或是一種與披蓋病毒或黃色病毒不同的新病毒。對注射NANBV肝炎患者血清之黑猩猩的許多肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的病理學(xué)觀察結(jié)果表明，在某些黑猩猩的肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中有管狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，但在其他黑猩猩肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中則沒有，并且在某些黑猩猩的肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中形成細(xì)胞核內(nèi)顆粒。這些結(jié)果和流行病學(xué)研究研果，在氯仿敏感性存在或不存在下試驗(yàn)以及免疫學(xué)診斷都表明存在多種類型的NANBV(如參見“Science”，205，197-200，1979，“JournalofInfectiousDisease”，148，254-265，1983，and“Biseibutsu”(Microorganism)，5(5)463-475，1989)。存在于NANB肝炎患者血液中之NANBV的數(shù)量與其存在于A型肝炎患者糞便中之A型肝炎病毒的數(shù)量或存在于B型肝炎患者血液中之B型肝炎病毒的數(shù)量相比是極小的。例如，根據(jù)黑猩猩感染劑量(CID)，肝炎患者血液中B型肝炎病毒的數(shù)量為每毫升108到109個(gè)，而根據(jù)CID，患者血液中的NANBV數(shù)量僅是每毫升104-105個(gè)(Bradley，D.W.Researchperspectivesinpost-transfusionnon-A，non-Bhepatitis，in“Infection，ImmunityandBloodTransfusion”，editedbyDodd，R.Y.&Barker，L.F.，publishedbyAlanR.Liss，Inc.，NewYork(1985)pp.81-97)。進(jìn)一步說，已知除去人類外，除了黑猩猩沒有任何動(dòng)物對NANBV敏感，并且會(huì)通過NANBV感染，在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中偶然地形成一種典型的管狀結(jié)構(gòu)。因?yàn)橹挥泻谛尚赡鼙蛔鳛橛糜贜ANBV感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此需要大量的黑猩猩用于NANBV研究。但是，黑猩猩不易獲得并且很貴，因此，NANBV的研究，如由NANBV的感染實(shí)驗(yàn)，NANBV的鑒定和尋找用于NANBV的標(biāo)記物，都需要受到限制和推延。為了解決這些問題，已對NANBV的研究作了各種嘗試。如在一個(gè)嘗試中，從患NANB肝炎的黑猩猩的血漿中克隆NANBV基因組cDNA[所謂″C型肝炎病毒，“hepatitisCVirus(HCV)”](Science，244，359-362，1989)，并進(jìn)一步證實(shí)通過表達(dá)cDNA所獲得的抗原(稱為“C-100”)可與NANB肝炎患者血液中的抗體產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)(Science，244，362-364，1989)，另外，在另一個(gè)不使用黑猩猩的嘗試中，從NANB肝炎患者的血漿中克隆NANBV基因組cDNA，并已確認(rèn)通過表達(dá)的cDNA所得到的抗原可與NANB肝炎患者血清中的抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)(Gastroenter-ologiaJapanica，24，540-544和545-548，1989)。再者，關(guān)于克隆NANBV基因組cDNA和其核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸順序的確定，由于下列機(jī)構(gòu)提供的克隆是已知的MitsubishiKaseiCorp，Japan(歐洲專利申請公開號293274)，ChironCorporation，U.S.A(歐洲專利申請公開號318216，388232和398748)，ResearchFoundationforMicrobialDiseasesofOsakaUniversity，Japan(歐洲專利申請公開號363025和JournalofVirology，65，1105-1113，1991)，SanwaKagakuKenkyuskoCo.，Ltd.，Japan(日本專利申請公開說明書No.1-186990)，NationalCancerCenterResearchInstitute，Japan[ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences(U.S.A)，87，9524-9528，1990]，JichiMedicalSchool(JapaneseJournalofExperimentalMedicine，60，167-177，1990)，NationalInstituteofHealth，Japan[NucleicAcidResearch，17(24)，10367-10372，1989;同一文獻(xiàn)，18(15)，4626，1990;Gene，91，287-291，1990;和JournalofGeneralVirology，71，3027-3033，1990)等。此外，關(guān)于NANBV基因的結(jié)構(gòu)已有報(bào)道NANBV基因組的全長約10kb;該基因是由5′未端的非編碼區(qū)，一個(gè)開放讀碼(ORF)區(qū)和3′未端的非編碼區(qū)組成;在ORF區(qū)，基因編碼病毒的核心抗原(蛋白質(zhì))(C抗原)、基質(zhì)抗原(蛋白質(zhì))(M抗原)，被膜抗原(蛋白質(zhì))(E抗原)、和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS蛋白質(zhì))，這一順序按從5′未端到3′未端方向排列;且NS蛋白質(zhì)基因按5′到3′排列，包括NS1，NS2，NS3，NS4a、NS4b和NS5。關(guān)于這些抗原(蛋白質(zhì))的功能，據(jù)信C抗原負(fù)責(zé)基因的保護(hù)，E抗原負(fù)責(zé)感染，M抗原負(fù)責(zé)E抗原結(jié)構(gòu)的保持，NS1作為補(bǔ)體固定抗原，NS3作為蛋白酶，NS5作為聚合酶且非編碼區(qū)負(fù)責(zé)基因組結(jié)構(gòu)的保持和基因組的復(fù)制。NS2和NS4的功能尚不明僚。(3)臨床觀察按照肝突的發(fā)生人數(shù)和頻率，一般將肝炎分為流行性肝炎和散發(fā)性肝炎，或者按照肝炎病人的嚴(yán)重程度和階段分為急性肝炎，暴發(fā)性肝炎，亞急性肝炎，遷延續(xù)肝炎和慢性肝炎。NANB肝炎的潛伏期是2至26周。NANB肝炎的癥狀在早期與B型肝炎相比較輕微。例如NANB肝炎患者僅有發(fā)燒及疲倦的主訴。另外，70%的患者沒有黃疸征象。因此，NANB肝炎常常被忽略。但NANB肝炎是很危險(xiǎn)的，因NANB肝炎很可能變成慢性的，然后發(fā)展成肝硬變。數(shù)字表明，40%至50%血清轉(zhuǎn)氨酶活性升高的NANB患者發(fā)展成慢性肝炎。10%至20%的慢性肝炎病例成為肝硬化。另外，每年有0.5%至1%的接受輸血者成為沒有自覺征兆的肝硬變患者。但嚴(yán)重地是，肝硬變能進(jìn)一步發(fā)展成為肝癌或肝細(xì)胞瘤。因此，為了防止由輸血和出血引起的生物危險(xiǎn)性，根除NANB肝炎是一件著眼于公共健康事業(yè)的全球性重要的問題。(4)診斷如上面提到的，NANBV(血液傳播型)尚未被鑒定，而且病毒標(biāo)記，如用于NANB肝炎診斷的NANBV抗原仍未被發(fā)現(xiàn)。因此，NANB型肝炎的診斷已通過檢測患者血清中的抗體滴度來進(jìn)行，這種檢測對各種已知病原性病毒都是特異的，如甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒，EB病毒、水痘病毒及單純性皰疹病毒，以及將其血清中對于上述病毒的抗體特異性反應(yīng)均為陰性的病人診斷為NANB肝炎病人，或通過作肝臟活組織病理組織學(xué)檢查診斷NANB肝炎〔“DiseaseoftheLiverandbiliarySystem”，8thedition，S.Shenlock，pp.326-333，1989，BlackwellScientificPublications)。同時(shí)，也已使用另一診斷方法。例如，采用這樣一種方法，即測定酶在血清如GPT〔谷丙轉(zhuǎn)氨酶，亦稱“ALT”(alanineaminotransa-minase)〕.GOT〔谷草乙轉(zhuǎn)氨酶，亦稱“AST”(aspartateaminotransferase)〕和鳥嘌呤脫氨基酶(亦稱“Guanase”)的活性(“KanTanSui(Liver，Gallbladder，Pancreas)”，Vol.14，pp.519-522，1987)。就上述血清中的GPT或GOT而言，日本是采用NANB肝炎診斷的標(biāo)準(zhǔn)，其中持效和變態(tài)高活性GPT和GOT用作診斷NANB肝炎的判據(jù)(“JournalofBloodTransfusionSocietyinJapan”，31(4)，316-320，1985;和“NipponRinsho”，46，2635-2638，1988)。至于免疫診斷，在上述難以分離和鑒別NANBV的目前形勢下，是采用由NANBVcDNA克隆表達(dá)得到的抗原(用遺傳工程技術(shù)和免疫學(xué)知識分離出)跟NANB肝炎患者的血清之間的抗原-抗體反應(yīng)作為判據(jù)。已知抗原的例子有由NANB肝炎患者的血漿制取的NANBVcDNA的表達(dá)產(chǎn)物(歐洲專利申請公開號363025)，由具有NANB肝炎癥狀的黑猩猩的血漿制取的“HCV”cDNA的表達(dá)產(chǎn)物(歐洲專利申請公開號318216和日本專利申請公開未決說明書2-500880)，由感染了NANBV的黑猩猩的肝臟得到的NANBVcDNA的表達(dá)產(chǎn)物(歐洲專利申請公開號293274，日本專利告說明書64-2576和日本專利申請公開未決說明書1-124387)。對于測定抗原抗體反應(yīng)的方法，一般采用RIA法(放射免疫測定法)和EIA法(酶免疫測定法)。但是，這些表達(dá)產(chǎn)物的抗原性不同。以HCVcDNA的表達(dá)產(chǎn)物作為抗原(即，提到的C-100抗原)可以是診斷由HCV感染造成的慢性肝炎的判據(jù)或檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。盡管如此，由于抗原(C-100)顯示其抗原性的區(qū)域有限，抗體的檢測比不利地低達(dá)約70%〔“Biseibutsu(Microorganism)”，5，463-475，1989;”Kantansui(Liver，Gallbladder，Pancreas)”，2047-51，1990;和“Igaku-noAyumi(ProgressofMedicine)”，151，871，1989〕，從NANB肝炎和NANBV感染的精確診斷以及對慢性肝炎患者病情發(fā)展的精確確定和急性肝炎病人的治療角度來看，這種抗原是不能令人滿意的。因此，期望得到一種可靠的診斷和預(yù)測NANB肝炎進(jìn)展的方法。(5)治療和預(yù)防最近，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了使用α-和β-干擾素治療慢性NANB肝炎[“KanTanSui(Liver，Gallbladder，Panceras)”Vol.20，pp.59-64，1990;“Igaku-noAyumi(progressofMedicine)”Vol.151，pp.871-876，1989]。但是仍未確定α-和β-干擾素的適宜治療劑量和適宜治療期限。另一方面，為了NANB肝炎的預(yù)防，已使用了各種疫苗，其中包括以NANBVcDNA(歐洲專利申請公開號363025)或HCVcDNA(歐洲專利申請公開號318216)之常規(guī)表達(dá)產(chǎn)物作為抗原的疫苗。但正如從事實(shí)所見的，在本發(fā)明完成之前，NANBV本身仍未被分離和鑒定，不可能詳細(xì)說明用于NANBV疫苗、來自上述各有一種抗原決定基(抗原決定部位)之表達(dá)產(chǎn)物的抗原，并確定這種抗原的有效性和安全性以便將其用于臨床。因此，尚沒有能在實(shí)際中使用的NANBV疫苗。(6)NANBV顆粒的生產(chǎn)和其重要性雖然如(2)中所描述的各種NANBVcDNA克隆都是已知的，但仍未見報(bào)導(dǎo)使用已知的克隆成功地生產(chǎn)NANBV顆粒。這意味著建立一個(gè)約10kb的覆蓋NANBV基因組全部區(qū)域的cDNA是極困難的，而cDNA對于生產(chǎn)NANBV顆粒又是必需的。即是說，使用選擇用于提取NANBV基因組RNA之材料的現(xiàn)有技術(shù)和有關(guān)提取和純化RNA的現(xiàn)有技術(shù)，只能分離最多幾百個(gè)核苷酸的短RNA片段和其cDNA克隆。當(dāng)打算使用這種短的cDNA片段構(gòu)建一個(gè)含NANBV基因組整個(gè)區(qū)域的cDNA時(shí)，需要在組合中選擇多于幾十個(gè)不同類型的cDNA片段，以使cDNA片段的ORF形成NANBV基因組的整個(gè)區(qū)域，并按順序沒有差錯(cuò)地準(zhǔn)確將它們連接起來。無疑如此嚴(yán)格要求地按順序成功地連接cDNA片段是極麻煩和困難的，應(yīng)該提到的是，在連接cDNA片段的操作中，發(fā)生致命錯(cuò)誤的幾率將隨連接數(shù)目的增加而增加。因此，為了精確地構(gòu)建NANBV基因組整個(gè)區(qū)域的cDNA，需要使用盡可能長的cDNA片段來減少連接步驟的數(shù)目。還應(yīng)注意的是，就大約2kb至5kb長NANBV基因組RNA片段的提取制備和克隆其cDNA來說，需要有高水平學(xué)術(shù)知識和經(jīng)驗(yàn)以及非凡的操作技術(shù)。另一方面，如在(4)中描述的，因?yàn)橛糜贜ANB肝炎的商業(yè)上可獲得之診斷劑的抗原是一種NANBV基因組cDNA片段的部分表達(dá)產(chǎn)物，因此，其抗原譜很窄，抗原主要與慢性肝炎患者的血清反應(yīng)，并且顯出的抗原檢測率低達(dá)不能令人滿意的70%左右。因此，特別需要有一種不僅與慢性NANB肝炎患者的血清，而且與急性NANB肝炎患者的血清在抗原-抗體反應(yīng)上能顯示出極好特異性，并且其抗體檢測率高的診斷試劑。為了滿足這一需要，很早就期望發(fā)展一種診斷試劑，作為抗原，例如，一種有廣泛抗原譜并能對抗體顯示出高檢測率的NANBV顆粒。進(jìn)一步說，NANBV顆粒的生產(chǎn)被認(rèn)為有助于解決(5)中所述的問題，以便得到一種在實(shí)踐中特別適用的NANB肝炎疫苗。從上述可見，構(gòu)建NANBV基因組整個(gè)區(qū)域的cDNA并通過表達(dá)該cDNA以實(shí)現(xiàn)NANBV的大量生產(chǎn)，已成了一個(gè)全球性亟待解決的問題。本發(fā)明人作了大量的研究工作，通過發(fā)展典型的分離的NANBV顆粒而解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)成功地構(gòu)建了一個(gè)從NANBV基因組cDNA的c抗原基因到NS3的ORF(開放讀碼)區(qū)域，一個(gè)比上述ORF區(qū)域更長的NANBV基因cDNA的整個(gè)ORF區(qū)域，以及由上述整個(gè)ORF區(qū)域組成的完整的NANBV區(qū)域，而且通過熟練地連接10個(gè)以上各至少包含1000個(gè)核苷酸的不同NANBVcDNA克隆，使5′端和3′端的非編碼區(qū)連接到其5′端和3′端上，從而構(gòu)建了在3′和5′端有或沒有非編碼區(qū)的所需之ORF。此外，本發(fā)明人通過將上述NANBV基因組的各個(gè)區(qū)域單獨(dú)地引入或插入到一表達(dá)載體中，并表達(dá)這個(gè)區(qū)域而得以成功地大量生產(chǎn)NANBV顆粒。在本發(fā)明中，術(shù)語“非A、非B型肝類病毒顆?！笔侵窷ANBV基因組之上述區(qū)域的表達(dá)產(chǎn)物并含有至少一個(gè)選自非A、非B肝類病毒之核心抗原，基質(zhì)抗原和包膜抗原中的抗原。非A、非B型肝類病毒顆粒的實(shí)例包括有下列結(jié)構(gòu)者一個(gè)完整的NANBV顆粒，其為主要由c(核心)抗原、M(基質(zhì))抗原和E(包膜)抗原組成的NANBV抗原集合體，并且該病毒顆料中有核酸;一個(gè)不完整的包括c抗原、M抗原和E抗原之NANBV抗原集合體，但其中沒有核酸的NANBV顆粒;一個(gè)主要由c抗原組成的NANBV抗原集合體并在核心中有核酸的NANBV核心;一個(gè)不完整的NANBV核心，其為主要由c抗原組成的NANBV抗原集合體，但核心中沒有核酸;以及一個(gè)主要由E抗原組成的NANBV表面抗原集合體。這種成功歸功于本發(fā)明人獨(dú)特的技術(shù)，以便獲得一個(gè)可靠的NANBV基因組，直接從NANBV顆粒中提取NANBVRNA，所說的NANBV顆粒包含在NANB肝炎患者的全血中或包含在NANB肝類合并肝癌的患者的切除的肝中，而沒有在有被認(rèn)為增加NANBV分離難度之未知因子的黑猩猩中增殖，雖然在血液或切除肝中NANBV的數(shù)量極少，即少于A型肝類病毒和B型肝類病毒的1/10，000，但在操作過程中謹(jǐn)慎小心，便可使NANBV和其基因組在NANBV基因組的新鮮材料儲(chǔ)存期間不被體液作用或血液酶切割和/或分解，從而得到一個(gè)有2kb或5kb長的完整的NANBV基因組RNA或RNA片段。從人的新鮮材料中制備的RNA，然后即可借助反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成cDNA，以獲得一個(gè)cDNA文庫。為了從cDNA文庫中篩選的1000到5000個(gè)核苷酸的NANBV基因組cDNA，cDNAs被分別地插入到入gtll噬菌體載體中，并在高濃度的噬菌體噬斑上表達(dá)，然后使用恢復(fù)期急性NANB肝炎患者和慢性NANB肝炎患者的血清反復(fù)進(jìn)行酶免疫分析(E1A)來篩選NANBV基因組ODNA。因此，以高純度低成品大批量生產(chǎn)沒有生物危害的NANBV顆料或NANBV抗原集合體，已第一次通過DNA重組技術(shù)表達(dá)NANBV基因組cDNA的全部區(qū)域或NANBV基因組cDNA的全部ORF區(qū)域而得以實(shí)現(xiàn)。NANBV基因組cDNA的全部區(qū)域或全部ORF區(qū)域是通過篩選覆蓋NANBV基因組cDNA之全部區(qū)域或全部ORF區(qū)域的cDNA克隆，從cDNA克隆中切掉任何重疊部分并按順序連接CDNA克隆而構(gòu)建的。另外，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物與短的NANBV基因組cDNA片段的常規(guī)表達(dá)產(chǎn)物相比有極廣的抗原譜，并且與慢性NANB肝炎患者和急性NANB肝炎患者的血清顯示特異性抗原-抗體反應(yīng)，從而使檢測率達(dá)到95%或更高，并解決了(6)中所提到的問題。即通過提供了增強(qiáng)抗體檢測率的診斷劑和對抗體制備的改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的表達(dá)產(chǎn)物大大有利于NANB肝炎的預(yù)防，診斷和治療?；谝陨纤?，本發(fā)明已經(jīng)完成。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用為NANB肝炎診斷試劑和疫苗之活性成分的分離的NANB肝炎病毒顆粒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)分離的NANBV顆料的方法。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種NANB肝炎的診斷試劑。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種NANB肝炎疫苗。本發(fā)明前述的和其他的目的、特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)可從下列詳細(xì)描述和權(quán)利要求及相關(guān)附圖看出。附圖圖1(1)和圖1(2)顯示用于本發(fā)明NANBV基因之cDNA克隆間的關(guān)系，表明與NANBV基因組的整個(gè)區(qū)域相關(guān)。圖2(1)到圖2(16)顯示用于本發(fā)明之NANBV基因組cDNA整個(gè)區(qū)域的核苷酸順序及由該核苷酸順序編碼的氨基酸順序。圖3顯示本發(fā)明的NANBV和日本腦類病毒(JEV)的疏水性曲線，其中是NANBV的疏水指數(shù)與JEV的相比，且其中橫坐標(biāo)表示氨基酸數(shù)目，縱坐標(biāo)表示疏水指數(shù)，空白三角表示糖基化位點(diǎn)，星號表示與RNA多聚酶所共有之氨基酸順序的位點(diǎn)(Gly-Asp-Asp)，并且C、M、E、和NS各代表核心抗原、基質(zhì)抗原、包膜抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白。圖4是顯示在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)NANBV基因組cDNA之質(zhì)粒pMAN-neo10的構(gòu)建步驟圖。圖5是在酵母菌中表達(dá)NANBV基因組cDNA之質(zhì)粒pYHC5的構(gòu)建步驟圖。圖6是用于制備重組牛痘病毒之pXX-49，pXX-51和pXE-39的構(gòu)建步驟圖。圖7是顯示蔗糖密度梯度離心重組牛痘病毒VXX39的培養(yǎng)物上清液所得各部分的蔗糖濃度和抗原活性的關(guān)系圖。圖8是用重組牛痘病毒VXX39感染之培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的NANBV顆粒的電子顯微鏡照片。本發(fā)明主要是提供分離的含有至少一個(gè)選自非A、非B肝炎病毒的核心抗原、基質(zhì)抗原和包膜抗原中之抗原的非A、非B肝炎病毒顆粒。在本發(fā)明NANBV顆粒的優(yōu)選實(shí)施方案中，核心抗原、基質(zhì)抗原和包膜抗原分別由表示在圖2(1)到圖2(16)中的非A非B肝炎病毒的從第1到第9426位全部核苷酸的順序中的從第333到667位、第678到905位和第906到第1499位苷酸順序編碼。本發(fā)明的另一方面，提供了具有與圖2(1)到圖2(16)所示核苷酸順序的至少一部分相應(yīng)之核糖核酸的非A非B肝炎病毒顆粒。在本發(fā)明中，除非另外說明，脫氧核糖核酸的左末端和右末端分別為5′末端和3′末端。另外，除非另有說明，本發(fā)明氨基酸順序的左末端和右末端分別代表N末端和C末端?？砂聪铝?Ⅰ)至(Ⅸ)步驟制備和鑒定本發(fā)明的分離的NANBV顆粒。步驟(Ⅰ)用于提取NANBV基因組RNA之實(shí)驗(yàn)材料的選擇和收集可以用作提取NANBVRNA的實(shí)驗(yàn)材料包括血液、淋巴液、腹水和作為NANBV載體的肝細(xì)胞，或者是患有NANB肝炎的人或大猩猩的肝細(xì)胞，以及患有NANB型肝炎和肝癌或合并有肝腫瘤病人的肝細(xì)胞。與來源于人類的材料相比來源于大猩猩的材料含有相對小量的NANBV，并且，在大猩猩中還未弄清楚一些被認(rèn)為會(huì)給NANBV的分離帶來困難的因素，因此，最好是來源于人類的材料。在來源于人類的血液、淋巴液、腹水和肝細(xì)胞這些材料之中，血液最易于大量獲得。例如，可以大量地從血庫獲得不能接受為輸血之用的血液。這種血液益于用作提取NANBVRNA的材料。當(dāng)以血液作為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，血液將被分成血漿和紅細(xì)胞兩部分，檢驗(yàn)如此獲得的血漿以決定該血漿是否為B型肝炎病毒表面抗原陽性(WHOexpertcommitteeonviralhepatitisAdvanceeinviralhepatitis，WHOTechnicalReportSeries，60228-33，1977)和B型肝炎病毒基因組RNA陰性(Brechot，C.，Hadchouel，M.，Scotto，J.，Degos，F(xiàn).，Charnay，P.Trepo，C.Tiollais，P.DetectionofhepatitisBvirusDNAinliverandserumadirectappraisalofthechroniccarrierstate.LancetZ765-768，1981)。此外，還要對血漿的酶活性方面進(jìn)行檢驗(yàn)，如GPT(Wroblewski，F(xiàn).&Ladue，J.S.Serumglutamic-pyruvictransaminaseincardiacandhepaticdisease，Pooc.Soc.Exp.Biol.Med.，91，569，1956)，GOT、烏嘌呤酶等等，這些酶通常作為NANB型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)。上文提及的將血液分離成血漿和紅細(xì)胞的過程以及對所得血漿的檢驗(yàn)過程是針對血液的多種不同方面進(jìn)行的?？墒占疊型肝炎表面抗原和基因組cDNA兩者均為陰性并且上文提及的各利酶顯示出了極高活性，如GPT活性為35IU/ml或更高的血漿。與前文提及的B型肝炎病毒顆粒數(shù)目相比，血液中存在極少數(shù)量的NANB肝炎病毒顆粒。從感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，估計(jì)血液中NANB型肝炎病毒數(shù)目約為B型肝炎病毒顆粒的1/10，000(Bradley，D.W.，(1985)Researchperspectivesinpost-transfusionnon-A，non-Bhepatitis，in“Infection，ImmunityandBloodTransfusion”，editedbyDodd，R.Y.&Barker，L.F.，publishedbyAlanR.Liss，Inc.，NewYork，pp.81-97)。因此，對于提取RNA而言，優(yōu)選大量的血液為材料，例如，用多達(dá)3-10升的血液。用于從NANBV顆粒中提取NANBRNA的新鮮全血材料儲(chǔ)存于1-5℃以防止在酶的作用下NANB及其基因變性和NANB基因裂解或分解。從收集新鮮全血到利用步驟(Ⅱ)完成NANBVRNA的制備要求在48-72小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行。當(dāng)以肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，可以選用1-3g從慢性NANB型肝炎并發(fā)肝癌的患者肝臟切除的非癌性或癌性肝組織。所用的肝細(xì)胞材料凍存于-70℃下。步驟(Ⅱ)NANBVRNA的制備從步驟(Ⅰ)獲取的材料中經(jīng)常規(guī)方法提取和純化RNA。例如，當(dāng)用新鮮全血作材料時(shí)，取約3-10升新鮮全血經(jīng)低速離心收集上清，得血漿部分?？刹捎迷谙挛奶崛『图兓疪NA過程中用到的純化技術(shù)從血漿中得到病毒部分。另一方面，當(dāng)以肝細(xì)胞作為提取NANBVRNA的材料時(shí)，將5-30倍體積的含核糖核酸酶抑制劑的稀釋液加到肝組織中。然后，按常規(guī)技術(shù)，用一個(gè)勻漿器或類似物將肝組織壓碎或破裂，獲得肝細(xì)胞勻漿。所用的稀釋液可以是10-50mM的常規(guī)緩沖液。然后，組織勻漿經(jīng)低速離心后收集上清液。所收集的上清液即為提取和純化NANBVRNA的原液。用常規(guī)方法提取和純化NANBVRNA，如應(yīng)用核糖核酸酶抑制劑混合物的提取方法，其中的酶抑制劑混合物包括如肝素、焦碳酸二乙酯、硫氰酸胍以及一種表面活性劑、一種螯合劑，或者一種能增強(qiáng)蛋白變性作用的還原劑;密度梯度離心的分離方法，如可選用蔗糖、氯化銫、三氯乙酸銫、Ficoll(PharmaciaFinceChemicalsAB，Sweden)等作為梯度溶液;利用mRNA特有的3′末端polyA鏈經(jīng)親和柱層析技術(shù)進(jìn)行的分離方法;利用對根據(jù)多聚體上合成的蛋白質(zhì)有特異性的抗體經(jīng)免疫沉淀技術(shù)獲得mRNA結(jié)合之多聚體的分離方法;基于兩相分離原則進(jìn)行的苯酚提取法;利用聚乙烯乙二醇、硫酸葡萄糖、醇或類似物進(jìn)行的沉淀法。上述方法可以單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。上述NANBVRNA的提取和純化過程最好在pH值為3-10的范圍進(jìn)行，以防RNA發(fā)生不可逆的變性。至此，得到NANBVRNAs。步驟(Ⅲ)從NANBVRNA制備雙鏈cDNA將從步驟(Ⅱ)獲得的每一種NANBVRNA作為模板，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法制備cDNA。這就是說，用寡脫氧胸苷和隨機(jī)六核苷酸引物作為合成體系的引物，并使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以NANBVRNA作模板合成一段與NANBVRNA互補(bǔ)的cDNA，即所得含有彼此互補(bǔ)結(jié)合之cDNA和NANBVRNA的雙鏈，然后，使如此所得的雙鏈與核糖核酸酶H反應(yīng)，從而使NANBVRNA分解而得到cDNA。如此即得到了單鏈cDNA。用得到的單鏈RNA作模板，借助于DNA聚合酶的作用可以合成雙鏈cDNA。應(yīng)用市售的cDNA合成試劑盒，可以容易地進(jìn)行雙鏈cDNA的合成。這類試劑盒如cDNASynthesisSystemPlue(Amersham，England;BRLInc.，U.S.A生產(chǎn)并銷售)、cDNASystem試劑盒(PharmaciaLKB，Sweden生產(chǎn)并銷售)、cDNASynthesis試劑盒(BoehringerMannheimGmbH，Germany生產(chǎn)并銷售)等。當(dāng)合成的cDNA的量很少時(shí)，可用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法(“PCRTechnology”，editedbyA.A.Erlich，publishedbyStocktonPress，1989)等常規(guī)方法擴(kuò)增cDNA，所用的PCR試劑盒如AmpliTaq(PerkioElmerCetus，U.S.A生產(chǎn)并銷售)。至此，得到了雙鏈cDNA。步驟(Ⅳ)cDNA文庫的制備用步驟(Ⅲ)制得的cDNA經(jīng)常規(guī)方法制備cDNA文庫。這就是說，將步驟(Ⅲ)制得的cDNA單個(gè)地連接到可復(fù)制的克隆載體上而獲得cDNA文庫。作為可復(fù)制的克隆載體，可以是任何已知的或市售的載體，如噬菌體，粘性質(zhì)粒、質(zhì)料和動(dòng)物病毒。當(dāng)用噬菌體或粘性質(zhì)粒作為可復(fù)制性載體時(shí)，為了使每一cDNA片段單個(gè)插入到載體中后載體還能獲得高度穩(wěn)定性和高轉(zhuǎn)化能力，按常規(guī)方法體外包裝每個(gè)插入了cDNA的載體。因此，可以重組噬菌體顆粒的形式得到插入了cDNA克隆的cDNA文庫。另一方面，當(dāng)以質(zhì)粒作為可復(fù)制性載體時(shí)，上述cDNA片段被單個(gè)插入到質(zhì)粒載體中，然后按常規(guī)方法將所得到的插入cDNA的載體單個(gè)地導(dǎo)入敏感的宿主細(xì)胞中，如大腸桿菌，枯草桿菌、酵母等。如此獲得的轉(zhuǎn)化體作為用于cDNA克隆的cDNA文庫。此外，當(dāng)以動(dòng)物病毒基因作為可復(fù)制性載體時(shí)，將上述的cDNA片段單個(gè)地插入病毒載體中，然后用所得的重組病毒按標(biāo)準(zhǔn)方法感染敏感的動(dòng)物細(xì)胞，并使之在細(xì)胞中增殖。在這種情況下，便可使用所得到的重組病毒作為cDNA文庫?？捎檬惺鄣脑噭┖泻苋菀椎剡M(jìn)行cDNA文庫的制備，這類試劑盒如cDNA克隆系統(tǒng)λgt10和λgt11(Amersham，England;BRLInc.，U.S.A生產(chǎn)并銷售)，及體外包裝系統(tǒng)(Amersham，England;BRLInc.，U.S.A;StratageneInc.，U.S.A生產(chǎn)并銷售)等。步驟(Ⅴ)從cDNA文庫中克隆含有NANBV基因的cDNA克隆在這一步驟中，將獲得含有NANBV基因的cDNA克隆。當(dāng)cDNA文庫含有轉(zhuǎn)化體時(shí)，在一準(zhǔn)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以形成克隆。另一方面，當(dāng)cDNA文庫由重組噬菌體顆?；蛑亟M病毒組成時(shí)，用這些噬菌體顆粒或重組病毒來感染已知的敏感宿主細(xì)胞，如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物等，并進(jìn)行培養(yǎng)以形成噬菌斑，或增殖被感染的細(xì)胞。對如上獲得的轉(zhuǎn)化體克隆、噬菌斑或被感染細(xì)胞要至少以一種標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)，其中將分別使用急性NANB型肝炎病人的恢復(fù)期血清、慢性NANB型肝炎病人的血清、感染了NANBV之大猩猩的血清(不論NANBV是否為在大猩猩肝細(xì)胞漿中引起管狀結(jié)構(gòu)形成的類型)，從而可篩選并分離產(chǎn)生了與上述血清之一發(fā)生特異性反應(yīng)之NANBV抗原的菌落、噬菌斑或被感染細(xì)胞。對菌落、噬菌斑和被感染細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)格的篩選最好是重復(fù)上述過程。根據(jù)T.Maniatis等人描述的標(biāo)準(zhǔn)方法(T.Maniatisetal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，PublishedbyColdSpringHarborLaboratory，U.S.A，pp.309-433，1982)從上述篩選和分離出的各菌落、噬菌斑或被感染細(xì)胞中分離含NANBV基因的cDNA克隆?？捎孟率黾夹g(shù)進(jìn)行免疫學(xué)試驗(yàn)，如酶標(biāo)抗體技術(shù)，其中用諸如過氧化物酶和堿性磷酸酶這樣的酶標(biāo)記抗體;熒光抗體技術(shù)，其中用異硫氰酸鹽熒光素、銪標(biāo)記抗體。以上述技術(shù)進(jìn)行的免疫學(xué)試驗(yàn)最好按間接方法完成，因?yàn)樵陂g接方法中，即使只用極小量的病人血清也能進(jìn)行高敏感度的免疫學(xué)試驗(yàn)。用于間接方法中的第一抗體，最好使用來自NANB型肝類病人的血清或來自NANB型肝炎大猩猩的血清，因?yàn)檫@些血清含有相對大量的、對NANBV抗原特異的抗體。作為用于間接方法中的第二抗體，可使用市售的、用酶、熒光素物質(zhì)等標(biāo)記的抗人Ig(免疫球蛋白)抗體。用于免疫學(xué)試驗(yàn)的樣品可按常規(guī)方法制備，例如印跡方法，使菌落、噬菌斑和感染細(xì)胞中的核酸和蛋白質(zhì)吸附到濾膜上;為便于顯微鏡觀察可使用微量培養(yǎng)板或載玻片的方法等。當(dāng)印跡方法與一種間接酶標(biāo)抗體技術(shù)聯(lián)合使用時(shí)，從極大量的原始菌落、原始噬菌斑或原始感染細(xì)胞中篩選想要的菌落、噬菌斑或感染細(xì)胞的工作就可容易而快速地進(jìn)行。在這種情況下，印跡法是將市售硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、尼龍膜等濾膜與菌落、噬菌斑或感染之細(xì)胞接觸而進(jìn)行的。上面得到的cDNA克隆是NANBV基因的一部分。因此，為了得到包括NANBV基因全部區(qū)域的cDNA克隆，還需要通過一種用cDNA克隆的3′末端和5′末端作探針將與cDNA克隆相鄰之cDNA片段分離出來的方法來延伸cDNA克隆。在這種情況下，可以使用被稱為“基因行走”(也稱為“基因組行走”或“染色體行走”)的技術(shù)(“DNACloningVolumeⅢ”，editedbyD.M.Glover，PP.37-39，IRLPress，1987;“MolecularCloning-alaboratoryManual”2ndedit.，T.Maniatisetal.，3.12-3.23，1989)。借助于反復(fù)進(jìn)行的克隆程序和基因行走技術(shù)，便可以cDNA克隆形式得到NANBV基因的全部區(qū)域。此外，還要確定所獲得的各cDNA克隆的核苷酸順序。可以按常規(guī)方法測定cDNA克隆的核苷酸順序，如Maxam-Gilbert法、二脫氧鏈終止法(AnalyticalBiochemistry，152，232-283，1986)等?？稍跍y定的核苷酸順序的基礎(chǔ)上，推測出氨基酸順序。氨基酸的順序是從起始密碼子(cDNA上為ATG或mRNA上為AUG)的位置開始的?？梢杂孟率龇椒ㄨb定氨基酸順序的重要部分，如被認(rèn)為是構(gòu)成抗原決定簇的親水部分合成相當(dāng)于各親水部分的段肽，經(jīng)HPLC(高效液相層析法)純化合成的多肽，然后對純化的肽進(jìn)行E1A(酶免疫試驗(yàn))或R1A(放射免疫試驗(yàn))。最好按由cDNA克隆編碼的NANBV抗原的各自性質(zhì)將cDNA克隆分成幾組，以使各克隆彼此區(qū)分開來。在這一關(guān)系中，可用各cDNA克隆在NANBV基因之限制性圖譜上的定位作分類[見圖1(1)和圖1(2)]的尺碼。另外，已發(fā)現(xiàn)某些NANBV具有在大猩猩肝細(xì)胞漿中形成管狀結(jié)構(gòu)的能力，而有的NANBV則沒有這種能力(Science，205，pp.197-200，1979)。因此，可以通過檢驗(yàn)每一cDNA克隆的血清學(xué)反應(yīng)來進(jìn)行鑒定和分類cDNA克隆，即分別檢測各cDNA克隆與感染了能在大猩猩肝細(xì)胞漿中形成管狀結(jié)構(gòu)之NANBV和感染了不具備這種能力的NANBV之大猩猩血清的血清學(xué)反應(yīng)性。有關(guān)的血清學(xué)反應(yīng)的檢驗(yàn)可以按照前文介紹的免疫學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行。在本發(fā)明中，如圖1(1)和圖1(2)所示，將用于本發(fā)明的NANBV基因之cDNA克隆均以前綴“BK”標(biāo)示。圖1(1)是以圖解方式顯示用于本發(fā)明的NANBV基因之cDNA克隆間的相互關(guān)系，顯示了它們與NANBV基因完整區(qū)域的比例;圖1(2)是圖解顯示通過基因行走技術(shù)獲得的cDNA克隆間的相互關(guān)系，顯示了它們與NANBV基因完整區(qū)域的比例。這些BKNANBVcDNA克隆包括，如大腸桿菌BK108(保藏于FermentationResearchInstitute，Japan，保藏登記號FERMBP-2971)、大腸桿菌BK129(保藏于FermentationResearchInstitute，Japan，保藏登記號FERMBP-2972)、大腸桿菌BK138(保藏于FermetationResearchInstitute，Japan，保藏登記號FERMBP-2973)、大腸桿菌BK153(保藏于FermentationResearchInstitute，Japan，保藏登記號FERMB-2974)、大腸桿菌BK157(保藏于FermentationResearchInstitute，Japan，保藏登記號FERMBP-3243)、大腸桿菌BK166(保藏于FermentationResearchInstitute，Japan，保藏登記號FERMBP-2975)和大腸桿菌BK172(保藏于FermentationResearchInstitute，Japan，保藏登記號FERMBP-2976)。這7個(gè)BKNANBVcDNA克隆被認(rèn)為至少包括了NANBV基因開放讀碼的完整區(qū)域并可能包括了NANBV基因的完整區(qū)域(見圖1(1)和圖1(2))。另外，除了上述cDNA克隆外，下面的5個(gè)克隆作為BKNANBVcDNA克隆的代表保藏于FermentationResearchInstitute，Japan大腸桿菌BK102(保藏登記號FERMBP-3384)、大腸桿菌BK106(保藏登記號FERMBP-3385)、大腸桿菌BK112(保藏登記號FERMBP-3386)、大腸桿菌BK146(保藏登記號FERMBP-3387)和大腸桿菌BK147(保藏登記號FERMBP-3388)。被上述BKNANBVcDNA克隆復(fù)蓋的NANBV基因的完整區(qū)域的核苷酸順序和由這些核苷酸順序編碼的氨基酸順序示于圖2(1)到圖2(16)中。基于圖2(1)到圖2(16)中列出的完整的NANBV核苷酸順序和完整的NANBV氨基酸順序，可以進(jìn)行有關(guān)的各種研究和觀察，如研究NANBV基因的核苷酸順序和氨基酸順序與其它病毒基因相應(yīng)順序的同源性，示于圖3(疏水性/親水性分布圖)中的親水性指數(shù)、NANBV基因的結(jié)構(gòu)以及抗原決定基的區(qū)域等。關(guān)于同源性的研究，可以通過將NANBV基因的核苷酸順序和氨基酸順序與已經(jīng)了解得很清楚的多種病毒(日本專利申請公開說明書No.62-286930和“Virology”，Vol.161，pp.497-510，1987)以及諸如牛痘病毒性腹瀉-粘膜病病毒(“Virology”，Vol.165，pp.497-510，1988)、豬霍亂病毒(“Virology”，Vol.171.pp.555-567，1989)、煙草葉脈斑駁病病毒(“NucleicAcidResearch，Vol.165，pp.5417-5430，1986)等其它病毒的相應(yīng)順序進(jìn)行比較來完成。疏水性指數(shù)的分析研究，可以應(yīng)用下列技術(shù)完成如遺傳信息加工程序系統(tǒng)、SDC-Genetyx(SDCSoftwareCo.，Ltd.，Japan生產(chǎn)并銷售)、Doolittle′s程序(JourralofMolecularBiology，Vol.157，pp.105-132，1982)等。NANBV基因中編碼NANB病毒顆粒之不同抗原(蛋白質(zhì))的區(qū)域，可以通過該基因編碼的肽與已知的黃色病毒在疏水指數(shù)方面進(jìn)行比較，并比較該肽的氨基酸順序與通過來源于宿主細(xì)胞的信號肽酶(JournalofMoleculcrBiology，167，391-409，1983)以及來源于已知的黃色病毒的絲氨酸蛋白酶(Vivology，171，637-639，1989)發(fā)揮作用的肽連接位點(diǎn)來確定。其中所說的多種抗原是指三種結(jié)構(gòu)蛋白，亦即病毒核心抗原(蛋白質(zhì))(C抗原)、基質(zhì)抗原(蛋白質(zhì))(M抗原)和包膜抗原(蛋白質(zhì))(E抗原)，以及六種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS蛋白)。就本發(fā)明的NANBV顆粒而言，這些抗原(蛋白質(zhì))分別由示于圖2(1)到(16)中的下列核苷酸順序編碼C抗原從第333到第677位核苷酸M抗原從第678到第905位核苷酸E抗原從第906到第1499位核苷酸NS1蛋白從第1500到第2519位核苷酸NS2蛋白從第2520到第3350位核苷酸NS3蛋白從第3551到第5177位核苷酸NS4a蛋白從第5178到第5918位核苷酸NS4b蛋白從第5919到第6371位核苷酸NS5蛋白從第6372到第9362位核苷酸這些核苷酸順序?qū)τ贜ANB肝炎的診斷是有用的。由這些核苷酸順序分別編碼的抗原不僅可在疫苗中用作抗原，而且也可在NANB肝炎的診斷試劑中用作抗原。此外，還發(fā)現(xiàn)由于本發(fā)明的NANBV顆粒具有不同類型的抗原決定簇，使用本發(fā)明的NANBV顆?；騈ANBV抗原集合體作為抗原的診斷試劑具有廣泛的抗原-抗體反應(yīng)譜，因此，與只含有單個(gè)抗原決定簇的抗原相比，這種診斷試劑可以與感染NANB肝炎病毒后所產(chǎn)生的各種抗體發(fā)生反應(yīng)，從而正如在后面的實(shí)施例中所描述的那樣，它在檢測NANB肝炎中具高度敏感性。步驟(Ⅵ)NANBV基因組cDNA及其ORF完整區(qū)域的表達(dá)和NANBV抗原集合體、不完整NANBV顆粒及感染性、完整NANBV顆粒的大量生產(chǎn)為了表達(dá)在步驟(Ⅴ)中所克隆的NANBV基因組cDNA和以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)NANBV顆粒，將存在于cDNA克隆中的部分或全部克隆的cDNA從可復(fù)制的克隆的載體中切下取出，然后與可復(fù)制的表達(dá)載體重組。具體地說，經(jīng)限制性酶切割取出各cDNA克隆的部分或全部cDNA以獲得含有NANBV抗原范圍(以下稱作“NANBVDNA片段”)的cDNA片段。將NANBVDNA片段按順序連接起來以構(gòu)建NANBV基因的完整區(qū)域或其ORF的完整區(qū)域，然后再插入到可復(fù)制的表達(dá)載體中。為簡化克隆載體中。為了簡化克隆的NANBVDNA片段的連接步驟并防止在連接中發(fā)生差錯(cuò)，用于構(gòu)建NANBV基因組cDNA完整區(qū)域或其ORF完整區(qū)域或其ORF完整區(qū)域的不同的NANBVDNA片段不超過10個(gè)，最好不超過5個(gè)。為了達(dá)到這一要求，對包含NANBV基因完整區(qū)域或其ORF完整區(qū)域的NANBVDNA片段及每一個(gè)至少具有1000個(gè)核苷酸，最好是1500個(gè)核苷酸的片段要嚴(yán)格地篩選，并去掉每一個(gè)出現(xiàn)在兩片段間的重迭部分，然后將NANBVDNA片段按順序連接，以構(gòu)建NANBV基因的完整區(qū)域或其ORF的完整區(qū)域。也就是說，需要提供少于10個(gè)的不同cDNA克隆，它們分別含有至少1000個(gè)核苷酸，并從至少含1000個(gè)核苷酸的NANBV基因組RNA片段制得。這些不同的cDNA克隆含有其各自的克隆化cDNA片段，它們基本上包括了非A非B肝炎病毒從第1到第9416位核苷酸這一完整核苷酸順序(見圖2(1)到(16))中至少是從第333到第5177位核苷酸的區(qū)域。從cDNA克隆中切下cDNA片段以使其各自具有預(yù)定的核苷酸順序，當(dāng)按順序排列這些預(yù)定的核苷酸順序后，所得的核苷酸順序?qū)⒅辽侔ㄒ粋€(gè)與第333到第5177位核苷酸區(qū)相一致的區(qū)域?？梢允褂眠x自公開于圖1(1)和圖1(2)中的NANBVcDNA片段，如BK112、BK146、BK147、BK157和BK166來構(gòu)建上述預(yù)期的NANBV基因區(qū)域。按順序連接分別含有上述預(yù)定核苷酸順序的cDNA片段以構(gòu)建含有一段至少包括非A非B肝炎病毒從第1到第9416位核苷酸這一完整核苷酸順序(見圖2(1)到(16))中第333到第5177位核苷酸的核苷酸順序的第一脫氧核糖核酸。在本步驟中應(yīng)用的可復(fù)制性表達(dá)載體可以是已知的或市售的表達(dá)載體。表達(dá)載體的例子包括適用于腸細(xì)菌的質(zhì)粒載體pSN508(U.S.PatentNo.4，703，005)、適用于酵母的質(zhì)粒載體pBH103及其系列(日本專利申請公開說明書No.63-220987)、質(zhì)粒載體pJM105(日本專利申請公開說明書No.62-286930)、牛痘病毒W(wǎng)R株(ATCCVR-119)及牛痘病毒LC16m8株(日本專利申請公告55-23252)、減毒水痘病毒OKa株(U.S.PatentNo.3，985，615)，減毒Marek′s病病毒(TheJournalofJapaneseSocietyofVeterinary，27，20-24，1984，andGanMonographonCancerReseareh，10，91-107，1971)、質(zhì)粒載體pTTQ系列(AmershamEngland生產(chǎn)并銷售)、質(zhì)粒載體pSLV系列(PharmaciaLKB，Sweden生產(chǎn)并銷售)等。按常規(guī)方法將插入了NANBVDNA的表達(dá)質(zhì)粒載體分別導(dǎo)入或轉(zhuǎn)染到對載體敏感的宿主細(xì)胞中，獲得能產(chǎn)生NANBV顆粒的轉(zhuǎn)化體。然后篩選能產(chǎn)生NANBV顆粒的轉(zhuǎn)化體。可以用在步驟(Ⅴ)中所介紹的免疫學(xué)檢測法檢測NANBV顆粒的產(chǎn)生。另外，可按下列常規(guī)方法征實(shí)或檢測NANBV顆粒的產(chǎn)生，如電子顯微鏡檢法、免疫電鏡檢法、密度梯度離心法、光散射測光法等。如前文所述，當(dāng)以質(zhì)粒作為表達(dá)載體時(shí)，可以獲得有產(chǎn)生NANBV顆粒能力的轉(zhuǎn)化體。另一方面，當(dāng)以動(dòng)物病毒基因作表達(dá)載體時(shí)，可以獲得能產(chǎn)生NANBV顆粒的重組體病毒。按照常規(guī)方法培養(yǎng)上面所得的轉(zhuǎn)化體或重組病毒，即可在其培養(yǎng)物中獲得商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的NANBV顆粒。有關(guān)用動(dòng)物病毒基因作表達(dá)載體的詳細(xì)方法，可參見歐洲專利0334530A1號。因此，本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供一種生產(chǎn)分立的非A非B型肝炎病毒顆粒的方法，它包括(a)提供少于10個(gè)不同的cDNA克隆，每個(gè)克隆至少含有1000個(gè)核苷酸，并由至少有1000個(gè)核苷酸的非A非B型肝炎病毒基因組RNA片段制備之。所說的少于10個(gè)不同cDNA克隆分別含有基本上復(fù)蓋了非A非B型肝炎病毒從第1至第9416位核苷酸完整區(qū)域(見圖2(1)到(16))中至少從第333到第5177位核苷酸區(qū)域的克隆化cDNA片段。(b)從所說的cDNA克隆中切取分別具有預(yù)定之核苷酸順序的cDNA片段，以便當(dāng)按順序排列這些預(yù)定核苷酸順序時(shí)，所得的核苷酸順序至少含有一段與第333到第5177位核苷酸區(qū)域相一致的區(qū)域;(c)按順序連接分別含有預(yù)定之核苷酸順序的上述的cDNA片段，以構(gòu)建含有非A非B型肝炎病毒從第1到第9416位核苷酸完整區(qū)域(見圖2(1)到(16))中至少從第333到5177位核苷酸之核苷酸順序第一脫氧核糖核酸;(d)將從所說的第一脫氧核糖核酸以及根據(jù)遺傳密碼的簡性對第一脫氧核糖核酸的核苷酸順序中至少一種核苷酸進(jìn)行取代所得到的第二脫氧核糖核酸中選出的至少一種脫氧核糖核酸導(dǎo)入到從質(zhì)粒和動(dòng)物病毒基因中選出的可復(fù)制性表達(dá)載體中，當(dāng)所說的可復(fù)制性載體是質(zhì)粒時(shí)，可得到含有所說載體質(zhì)粒和插入其中之至少一種脫氧核糖核酸的可復(fù)制性重組DNA，當(dāng)所說的可復(fù)制性表達(dá)載體是動(dòng)物病毒基因時(shí)，則得到含有所說的動(dòng)物病毒載體和所說導(dǎo)入其中之至少一種脫氧核糖核酸的重組病毒。(e)當(dāng)用于步驟(d)中的可復(fù)制表達(dá)載體是質(zhì)粒時(shí)，用所說的重組DNA轉(zhuǎn)染原核或真核細(xì)胞以形成轉(zhuǎn)化體，然后從真核或原核細(xì)胞培養(yǎng)物的親代細(xì)胞中篩選所說的轉(zhuǎn)化體;(f)培養(yǎng)步驟(e)中從原核或真核細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體以生產(chǎn)非A非B型類病毒顆粒，或者培養(yǎng)步驟(d)中從真核細(xì)胞獲得的重組病毒以與動(dòng)物細(xì)胞一起生產(chǎn)非A非B型肝炎病毒顆粒;(g)分離所說的非A非B型肝炎病毒顆粒。在上述方法中，脫氧核糖核酸最好含有下列核苷酸順序第333列第5918位核苷酸的順序，從第333到6371位核苷酸的順序，第333到第9362位核苷酸的順序或從第1到第9416位核苷酸的順序。應(yīng)該注意到，為了生產(chǎn)本發(fā)明的NANBV顆粒，要求待表達(dá)的NANBVcDNA區(qū)域除了包括分別編碼NANBV核心抗原、基質(zhì)抗原和包膜抗原的全部核苷酸順序外，還應(yīng)包括分別編碼NANBV中NS1蛋白、NS2蛋白和NS3蛋白的全部核苷酸順序。步驟(Ⅶ)NANBV顆粒的純化可適當(dāng)合用常規(guī)技術(shù)純化培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體或重組病毒所生產(chǎn)的NANBV顆粒，這些技術(shù)包括鹽析、用硅膠或活性碳等吸附和解吸附、經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀、經(jīng)超離心分離、經(jīng)離子交換層析或親和柱層析分離、經(jīng)高效液相層析或電泳等方法分離。當(dāng)從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體或酵母轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中純化NANBV顆粒時(shí)，考慮到有效去除來自大腸桿菌和酵母并引起NANBV顆粒產(chǎn)量明降低的變應(yīng)原，最好按下述步驟進(jìn)行純化例如，(1)用硅膠吸附和洗脫，經(jīng)活性碳吸附去掉雜質(zhì);(2)經(jīng)密度梯度離心分離(日本專利申請公開說明書No.63-297)。當(dāng)從重組病毒培養(yǎng)物，如重組病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中純化NANBV顆粒時(shí)，可將含有病毒顆粒的粗溶液經(jīng)反復(fù)超離心和密度梯度離心純化，得到高純度的NANBV顆粒。而且，為了滅活培養(yǎng)物中的NANBV顆粒以保證安全操作并且固定病毒顆粒以穩(wěn)定其免疫原性和抗原性，最好向轉(zhuǎn)化體或重組病毒感染之細(xì)胞的培養(yǎng)物中，或在除去轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或重組病毒感染之細(xì)胞后所得到的培養(yǎng)液中加入常規(guī)滅活劑。例如，以0.0001(V/V)%至0.001(V/V)%的終濃度加入滅活劑福爾馬林，然后在4-37℃下保溫5-90天以滅活NANBV顆粒。應(yīng)該注意到，當(dāng)用減毒病毒作表達(dá)載體時(shí)，從重組病毒獲得的NANBV顆?？刹唤?jīng)滅活步驟而直接用作活減毒疫苗的活性成分?？捎萌绱双@得的高純度的NANBV顆粒懸液作為制備疫苗和診斷試劑的原始NANBV顆粒溶液(一種原始NANBV疫苗溶液)。本發(fā)明還提供了一種含有可復(fù)制性表達(dá)載體和脫氧核糖核酸的重組體，其中的載體選自質(zhì)粒和動(dòng)物病毒，脫氧核糖核酸至少包含一種來自下列一組順序的核苷酸順序非A非B型肝炎病毒第1到第9416位核苷酸完整核苷酸順序(見圖2(1)到(16)中之第333到第5177位核苷酸的第一核苷酸順序，以及根據(jù)遺傳密碼簡性對上述第一核苷酸順序的至少一個(gè)核苷酸進(jìn)行置換所得的第二核苷酸順序。在上述重組體中，第一核苷酸順序最好含有下列序列第333到第5918位核苷酸的序列，第333到6371位核苷酸的序列，第333到第9362位核苷酸的序列，第1到第9416位核苷酸的序列?？蓮?fù)制性重組體不僅可用于生產(chǎn)本發(fā)明的NANBV顆粒，而且可通過復(fù)制來擴(kuò)增用于本發(fā)明的NANBV基因組cDNA。本發(fā)明的純化之NANBV顆粒可用作檢測非A非B型肝炎的診斷試劑?？砂聪率龇椒▽⒈景l(fā)明的NANBV顆粒配制成診斷試劑。將上述步驟(Ⅶ)中得到的純化之NANBV顆粒分散到一個(gè)容器如小瓶或安瓿中并密封之。在進(jìn)行上述同樣操作時(shí)，可在密封前凍干容器中的NANBV顆粒溶液。容器中NANBV顆粒的量通常為1μg到10mg。此外，也可使NANBV顆粒吸附到常用的支持物表面，如微量培養(yǎng)板、聚苯乙烯珠、濾紙或膜上。可按與步驟(Ⅴ)所述者基本相同的方式確定血清與NANBV顆粒的反應(yīng)活性。也就是說，可用常規(guī)免疫學(xué)方法，如放射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免般吸附試驗(yàn)(ELISA)、熒光素抗體技術(shù)(FA)、被動(dòng)血凝試驗(yàn)(PHA)、反相被動(dòng)血凝試驗(yàn)(rPHA)等方法來確定反應(yīng)性。用于上述免疫學(xué)試驗(yàn)中的NANBV顆粒的量一般為每毫升血清0.1-100mg。具體地說，用于RIA、ELISA、FA、PHA和rPHA中NANBV的量分別為0.1-1mg/ml、0.1-1mg/ml、1-100mg/ml、1-50mg/ml和1-50mg/ml。本發(fā)明NANBV顆粒還可以用于篩選輸血用血液。篩選方法包括a)從全血中分離血清;b)使未知血液的血清與分離的NANBV顆粒接觸;c)確定血清是否與NANBV顆粒發(fā)生反應(yīng);d)根據(jù)反應(yīng)特性將血清分成非A非B型肝炎陽性或陰性兩類;e)根據(jù)上述鑒定結(jié)果有效地分離血液。未知血液的血清與本發(fā)明NANBV顆粒的接觸，血清與NANBV顆粒反應(yīng)性的確定均可按照前文介紹的有關(guān)診斷非A非B型肝炎的相同方式進(jìn)行?？山?jīng)上述方法選擇無NANBV的輸血用血液?？捎脤Ρ景l(fā)明的NANBV顆粒具特異性的多克隆抗體和單克隆抗體作為從輸血用血液中去除NANBV的因子。這就是說，通過NANBV與多克隆抗體或單克隆抗體的抗原-抗體反應(yīng)可有效地去除存在于血液中的NANBV。另外，本發(fā)明的NANBV顆粒益于用作非A非B型肝炎疫苗的活性成分。按下述方法制備非A非B型肝炎疫苗按照前文介紹的相同方式培養(yǎng)攜帶編碼NANBV顆粒cDNA之重組噬菌體或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，或培養(yǎng)用帶有編碼NANBV顆粒cDNA之重組病毒感染的細(xì)胞，以生產(chǎn)NANBV顆粒。為了滅活培養(yǎng)物中的NANBV顆粒以保證安全和為了固定NANBV顆粒以穩(wěn)定其免疫原性和抗原性，最好在轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)物或重組病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入一種常規(guī)滅活劑，或在除去轉(zhuǎn)化細(xì)胞或重組病毒感染之細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入滅活劑。例如，可以加入滅活劑如0.0001-0.001V/V%的福爾馬林，然后在4-37℃下保溫5-90天。再按上述方法純化所得培養(yǎng)物或培養(yǎng)基。因此而獲得含有純化之NANBV顆粒的原始非A非B型肝炎疫苗溶液。以標(biāo)準(zhǔn)的微過濾方法過濾原始NANBV肝炎疫苗溶液以使該溶液除菌。用生理鹽水稀釋濾液使得用Lowry法測得的蛋白濃度為大約1-500μg/ml。另外，可加入至少一種穩(wěn)定劑。任何市售的穩(wěn)定劑都可以用。穩(wěn)定劑的例子包括明膠及其水解產(chǎn)物、人白蛋白、糖類如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖和乳糖、氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸和谷氨酰胺。還可以使用佐劑以制得一種被吸附的疫苗。在這種情況下，在加入穩(wěn)定劑之前將佐劑如氫氧化鋁凝膠加到溶液中使所所加凝膠的濃度約為0.1-1.0mg/ml，然后進(jìn)行混合，從而將NANBV顆粒吸附到佐劑上。作為佐劑，還可以選用沉淀儲(chǔ)存佐劑如磷酸鈣凝膠、磷酸鋁凝膠、硫酸鋁、鋁和皂土以及能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的佐劑如胞壁酰酞衍生物、多核苷酸、Krestin(KurehaChemiealIndustryCo.，Ltd.，Japan生產(chǎn)并銷售)和picibanil(二者均為抗腫瘤劑)。然后，將如此獲得的含有凝膠吸附的或非吸附的NANBV顆粒的非A非B型肝炎疫苗溶液分散于一小容器中如安瓿或小瓶中并密封之。這樣便得到了含有(吸附或非吸附的)NANBV顆粒的純化之(吸附或非吸附的)NANBV型肝炎疫苗?？蓪⑷绱双@得的NANBV肝炎疫苗溶液凍干，得到干燥狀態(tài)的NANB肝炎疫苗，使得該產(chǎn)品能夠運(yùn)輸?shù)讲?chǔ)存于氣候惡劣的地方，如熱帶地區(qū)?？稍趯⒁后w(吸附或未吸附的)NANB肝炎疫苗分散于小瓶和安瓿瓶等容器中后按常規(guī)方法凍干。凍干后，向含干燥疫苗的容器內(nèi)通入氮?dú)猓缓竺芊?。有時(shí)順按日本厚生省關(guān)于“生物產(chǎn)品最低要求”(“MinimumRequirementsforBiologicalProducts”)的159號通知中，“提供的有關(guān)”吸附的B型肝炎疫苗”、“干燥的日本腦類疫苗”和“吸附的百日咳疫苗”的檢測方法測定所產(chǎn)生之疫苗的量。可以將NANB肝炎疫苗制成含有一種上述可吸附NANBV顆粒和至少一種除本發(fā)明NANBV顆粒以外之抗原的混合疫苗。作為本發(fā)明NANBV顆粒之外的其他抗原，可以使用任何常規(guī)用作相應(yīng)疫苗活性成份的抗原，只要這些其他抗原與NANBV顆粒聯(lián)合使用不會(huì)對這些抗原和NANBV顆粒引起的不利影響和副作用產(chǎn)生額外和協(xié)同加強(qiáng)作用，并且不會(huì)因?yàn)镹ANBV顆粒引起的不利影響而降低NANBV顆粒與這些其他抗原的抗原性和免疫原性。在如上所述的這種NANBV顆粒和抗原的副作用和有害反應(yīng)不額外或協(xié)同加強(qiáng)以及其抗原性和免疫原性不被降低的情況下，可與NANBV顆?；旌系目乖瓟?shù)量和類型不限。一般，有2到6種類型的抗原可以與本發(fā)明NANBV顆?；旌?，如包括從日本腦類病毒，HFRS(有腎病綜合癥的出血熱)病毒、流感病毒、副流感病毒、乙肝病毒、登革熱病毒、艾滋病病毒;百日咳桿菌、白喉?xiàng)U菌、破傷風(fēng)桿菌、腦膜炎雙球菌、肺炎球菌等衍生的去毒性抗原、滅活抗原或類毒素。一般情況下，含有本發(fā)明NANBV顆粒的疫苗可以存放于密封的小瓶、安瓿或類似容器中。本發(fā)明疫苗一般是以液體或懸浮液的形式給藥。如果疫苗是干燥形式的，可在給藥前要將疫苗溶于或懸浮于無苗蒸餾水中，所加蒸餾水的量要達(dá)到凍干前的原始體積。一般該疫苗是皮下給藥。該疫苗的給藥劑量一般為大約0.5ml。通常情況下，該疫苗的兒童用量為成人的一半。這種疫苗一般是從一周到一個(gè)月的時(shí)間間隔給藥兩次，然后半年以后再給藥一次。另外，還可以用NANBV顆粒來制備NANBV顆粒特異性抗體，如多克隆抗體和單克隆抗體。例如，可以按照下述常規(guī)方法制備對NANBV顆粒有特異性的多克隆抗體。將本發(fā)明的純化之NANBV顆粒給一種動(dòng)物，如小鼠、豚鼠、和兔，作皮下、肌肉、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)接種。NANBV顆粒的接種一般按1至4周的時(shí)間間隔進(jìn)行幾次，以使該動(dòng)物完全免疫。為了加強(qiáng)免疫作用，可以使用一種常規(guī)的商業(yè)上可得到的佐劑。然后，從被免疫的動(dòng)物中收集血清，并且按常規(guī)方法從血清中分離和純化抗NANBV顆粒多克隆抗體。另一方面，可以按已述的常規(guī)方法，例如CellTechnology，1.23-29(1982)一書中所述方法來制備對NANBV顆粒特異的單克隆抗體。例如，可使從用純化NANBV顆粒免疫的小鼠中得到的脾細(xì)胞與商業(yè)上可得到的小鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞融合技術(shù)融合，以得到雜交瘤。對雜交瘤進(jìn)行篩選以獲得能夠產(chǎn)生與NANBV顆粒反應(yīng)之抗體的雜交瘤。按常規(guī)方法培養(yǎng)所得到的雜交瘤并按常規(guī)方法從培養(yǎng)物上清中分離和純化抗NANBV顆粒單克隆抗體。上述的多克隆和單克隆抗體也可以用作診斷NANB肝炎的診斷試劑?？梢酝ㄟ^與上述用NANBV顆粒診斷NANB肝炎基本相同的免疫測定方法，使用該抗體診斷NANB肝炎。使用多克隆抗體或單克隆抗體，可對存在于肝組織和血液中的NANBV顆粒進(jìn)行識別和定量。本發(fā)明的NANBV顆粒具有非常廣譜的抗原性，并且不僅能與慢性NANBV病人，還可以與急性NANBV病人的血清發(fā)生特異性反應(yīng)。因此，NANBV顆粒能夠提供一種有高度可靠性的診斷試劑，它不僅對抗體有高的檢出率，而且這種檢測具有高度的精確度。此外，當(dāng)用本發(fā)明的NANBV顆粒來篩選輸血血液時(shí)，可以高度可靠而且容易地檢測出被NANBV感染的血清，并且將其從未被NANBV感染的血清中去除。因此，可以預(yù)防輸血后NANB肝炎。再者，還可以用本發(fā)明的NANBV顆粒作為疫苗的活性成份來預(yù)防NANB肝炎，其具有極其明顯的免疫原性。另外，可用重組病毒，如向牛痘病毒中插入NANBV基因組cDNA而制備的重組牛痘病毒作為疫苗的活性成分。而且，使用本發(fā)明的NANBV顆粒，可以容易地制備對NANBV具有特異性的抗體，尤其是單克隆抗體。這種對NANBV有特異性的抗體的優(yōu)點(diǎn)是，它不僅可以用作診斷試劑來檢查NANB肝炎，而且也可以用作從輸血血液中去除NANBV的試劑。再者，應(yīng)當(dāng)指出的是本發(fā)明的NANBV顆粒不是用病毒感染動(dòng)物耐制備的，而是通過在宿主細(xì)胞中對編碼本發(fā)明NANBV顆粒的DNA進(jìn)行基因表達(dá)而以分離形式制備的。因此，在制備本發(fā)明NANBV顆粒的過程中基本上消除了感染的可能性，其生產(chǎn)成本也降低了。而且，由于制備過程中所用的所有物質(zhì)，如保溫系統(tǒng)的培養(yǎng)基組成是公知的，故純化是容易做到的，而且可以獲得高純度的NANBV顆粒產(chǎn)物。借助本發(fā)明，能夠制備出分離的NANBV顆粒及其自然界中不存在的高純度基因。所制備的NANBV顆粒及其基因?qū)τ贜ANB肝炎、肝腫瘤、肝癌等的研究具有重要的意義。下列實(shí)施例及參考實(shí)施例將對本發(fā)明作詳細(xì)的描述，這些實(shí)施例不對本發(fā)明的范圍有所限制。實(shí)施例1分為第Ⅰ部分和第Ⅱ部分，中間插入?yún)⒖紝?shí)施例1-3。實(shí)施例1(部分Ⅰ)步驟1(制備從血漿中得到的用于產(chǎn)生cDNA而且與NANBV基因RNA互補(bǔ)的RNA)為了從血漿中得到NANBV，將4.8升具有35IU/升或更高谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性(用Wrobleuski，F(xiàn)&J.S.LaDue的方法測定Serumglutamic-pyruvictransaminaseincardiacandhepaticdisease.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，91569，1965)的人血漿加入到30%(W/W)蔗糖水溶液中，在4℃下以48，000xg離心13小時(shí)得到沉淀物。將沉淀物懸浮于含有50mMTris·HCl(pH8.0)和1mMEDTA的水溶液中，在40℃下以250，000xg再次離心3小時(shí)得到沉淀物。將得到的沉淀物溶于75ml含有5.5M硫氰酸胍、20mM檸檬酸鈉(pH7.0)、0.05%sarkosyl(十二烷基肌氨酸鈉)和0.1M2-巰基乙醇的5.5MGTC溶液中。將所得溶液加入到16ml的CsTEA-0.1MEDTA溶液中(ρ＝1.51)，并在15℃下以140，000xg離心20小時(shí)，得到RNA的沉淀物。抽吸除去含有蛋白和DNA的上清并將沉淀物溶解于200μl含有10mMTris·Hcl(pH8.0)和1mMEDTA的緩沖液中。向該溶液中加入20μl3M氯化鈉和乙醇，并于-70℃下靜置90分鐘。將該混合液在4℃下以12，000xg離心30分鐘得到沉淀物。將沉淀物溶于TF中，并以上述同樣的方式加入氯化鈉和乙醇。-70℃下靜置該混合物得到沉淀物。將沉淀物溶于10μlTE中即得到純化的RNA。步驟2(從肝細(xì)胞制備用以產(chǎn)生cDNA的與NANBV基因組RNA互補(bǔ)的RNA)按OKayama等人的方法從NANBV肝炎病人的肝組織中制備NANBV基因組RNA(見H·OKayama，M·Kawaichi，M·Brownstain，F(xiàn)·Lce，T·Yokota，andK·AraiHigh-EfficiencyCloningofFull-LengthcDNA;ConstructionandScreeningofcDNAExpressionLibrariesforMammalianCells，MehtodsinEnzymology154.3-28，1987)。更具體地說，將1g肝組織切成小碎塊。將這些小碎塊懸浮于100ml如步驟1中所用的5.5MGTC溶液中，用特氟隆玻璃勻漿器勻漿。接著將勻漿液移入一個(gè)帶有18號針頭的注射器中，使勻漿液從注射器中通過針頭反復(fù)噴出從而機(jī)械分裂DNA。將所得到的勻漿液于4℃以1，500xg(低離心力)離心15分鐘得到上清液。把上清液加到CsTFA溶液上并以步驟1中所述的基本相同方法離心得到作為RNA部分的沉淀物。然后將所得到的沉淀物懸浮于0.4ml4MGTC溶液中。向懸浮液中加入10μl1M乙酸和300μl乙醇，并使之于-20℃下靜置至少3小時(shí)，以得到RNA沉淀物。4℃下以12，000xg離心10分鐘分離該沉淀物，并將其溶于1mlTE溶液中。向該溶液中加入100ml2M氯化鈉溶液和3ml乙醇溶液，并將混合液于-20℃下靜置3小時(shí)。離心收集所得到的沉淀物，并將其溶解于10μlTE中，從而得到純化的肝臟細(xì)胞衍生的RNA。步驟3(用cDNA合成藥盒制備雙鏈cDNA)使用商業(yè)上可得到的cDNA合成藥盒(由AmershamIntermational，England生產(chǎn)和出售)制備雙鏈cDNA。更詳細(xì)地說，將0.75μg從步驟1得到的純化RNA和2μl隨機(jī)六核苷酸引物以及2μl藥盒中所含有的反轉(zhuǎn)錄酶加入到反應(yīng)試管中。然后，加入蒸餾水使混合物終體積為20μl。將混合液在42℃下保溫40分鐘，制備第一股cDNA。接著，按照下述方法在冰水上冷卻反應(yīng)混合物合成第二股cDNA。向20μl反應(yīng)混合液中加入37.5μl用于第二條鏈合成反應(yīng)的緩沖液、1μl大腸桿菌核糖核酸酶H和6.6μlDNA聚合酶Ⅰ(這些試劑均可從藥盒中得到)，接自加入34.9μl蒸餾水。將混合物于12℃保溫60分鐘，在22℃下保溫60分鐘，再在70℃下保溫10分鐘。然后，再將混合物液在冰水中冷卻一次。加入1μlT4DNA聚合酶，于37℃下保溫10分鐘，再加入4μl0.25MEDTA(pH8.0)以終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物與酚和氯仿充分混合，并以12，000xg離心1分鐘，以分離含水層。按照上述方法再次提取含水層，并加入等體積氯仿。充分?jǐn)嚢杌旌衔锊㈦x合水層。接著，向該水層中加入等體積4M乙酸銨和兩倍量的乙醇，并將混合液冷卻至-70℃，從而得到純化之雙股cDNA的沉淀物。將沉淀物溶于50μl2M乙酸銨中。向該混合液中加入100μl乙醇，并將所得到的混合液冷卻于-70℃以得到沉淀物。以12，000xg離心10分鐘收集該沉淀物。干燥收集的沉淀物，并溶解于20μlTE中。步驟4(以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法制備雙股cDNA)以PCR方法(參見Saiki，R.K.，Gelfand，D.H.，Stoffer，S.，Scharf，S.J.，Higuchi，R.，Horn，G.T.，Mullis，K.B.，andErlich，H.A.，Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNAPolymerase，Science239487-491，1988)，對使用步驟1和2中制備RNAs作為模板，借助反轉(zhuǎn)錄酶制備的cDNAs分別進(jìn)行擴(kuò)增。將5到1，000ngRNA在20μl含有50mMTris·HCl(pH8.3)，40mMKCl，6mMMgCl2，1μM3′引物[含有圖2(14)所示第7949至第7973位之25個(gè)核苷酸的合成的寡核苷酸]，10mMdNTP和0.5單位反轉(zhuǎn)錄酶(NewEnglandBioLab.，USA的產(chǎn)品)的反轉(zhuǎn)錄酶溶液中于37℃保溫30分鐘。向所得混合液中加入80μl含有18mMTris·HCl(pH8.3)48mMKCl、1.5mMMgCl2、各0.6μM、5′引物[包含圖2(13)所示第7612至7636位之25個(gè)核苷酸的合成的寡聚核苷酸]和上述3′引物、10mMdNTP和2.5單位TaqDNA聚合酶(由PerkinElmerCetusCo.，Ltd.，U.S.A生產(chǎn)并出售)的PCR反應(yīng)溶液。將混合物在94℃下保溫1分鐘，50℃下保溫2分鐘并在72℃下保溫3分鐘。此保溫過程反復(fù)進(jìn)行40次。對所得混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從而得到擴(kuò)增的cDNA。將此擴(kuò)增的cDNA用苯酚處理，乙醇沉淀并干燥。將干燥的cDNA溶解于10μlTE中。步驟5(使用λgt11制備cDNA庫)可使用商業(yè)上可得到的cDNA克隆藥盒(AmershamInternational，England生產(chǎn)并出售)制備cDNA庫。即向步驟3中制備的130ngcDNA內(nèi)加入2μlL/K緩沖液，2μlEcoRⅠ銜接子和2μl的T4DNA連接酶(這些試劑均可以克隆藥盒中取得)。向該溶液內(nèi)加入蒸餾水使所得到的混合物總體積達(dá)到20μl。將混合物于15℃下保溫16至20小時(shí)，再向其中加入2μl0.25MEDTA以終止該反應(yīng)。接著，使混合液通過一個(gè)藥盒中帶有的分級分離層析柱，以除掉沒有連接到cDNA上的EcoRⅠ接頭片段。向700μl已連接上EooRⅠ接頭的cDNA中加入83μlL/K緩沖液和8μlT4多核苷酸激酶。混合液在37℃下保溫30分鐘。用苯酚將所得混合物提取兩次，借助丁醇濃縮至350到400μl，然后用乙醇沉淀得到沉淀物。將沉淀物溶于5μlTE中。然后，為了將已連接了EcoRⅠ接頭的cDNA插入到克隆載體λgt11的EcoRⅠ位點(diǎn)中，向1μl(10ng)上述已連接了EcoRⅠ接頭的cDNA中加入1μlL/K緩沖液、2μl(1μg)的λgt11臂DNA和2μlT4DNA連接酶。向混合物中加入一定量的蒸餾水使其總體積達(dá)到10μl。將混合物在15℃下保溫16至20小時(shí)。從而制得重組λgt11DNA溶液。然后使用商業(yè)上可得到的含有Gigapack11Gold溶液A和B，SM緩沖液和氯仿的體外包裹藥盒(由stratageneCo.Ltd.，U.S.A.生產(chǎn)和出售)經(jīng)體外包裹得到重組λ噬菌體。即向4μl上述重組λgt11DNA溶液中加10μlGigapackⅡGold溶液A和15μlGigapackⅡGold溶液B。將混合物于22℃下保溫2小時(shí)以得到重組噬菌體。保溫之后，加入470μlSM緩沖液和10μl氯仿，并將該重組噬菌體存放在4℃下。步驟6(用大腸桿菌質(zhì)粒pUC19克隆cDNA)使用一種商業(yè)上可得到的含有溶液A和B的DNA連接藥盒(由日本TakaraShuzo有限公司生產(chǎn)和出售)，將cDNA插入到大腸桿菌質(zhì)粒PUC19(C.Yanishi-Perron，J.Vieira，J.Messing，Gene33，103，1985)中，并在大腸桿菌中克隆。也即將40μl溶液A和10μl溶液B加入到5μl步驟4中經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制得的cDNA和5μl(50ng)已經(jīng)被限制酶SamⅠ消化并去磷酸化的質(zhì)粒PUC19DNA中。將混合液在15℃下保溫16小時(shí)。按照氯化鈣方法(見Mandel，M.和A.Higa，J.Mol.Biol.，53，154，1970)用所得到的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109(見Messing，J.，Crea，R.，andSeeburg，P.H.，NuclelcAcidsRes.9，309，1981)。從而得到含有已連接了cDNA之質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化大腸桿菌。步驟7(從cDNA庫中篩選具有NANBV基因的克隆)在50ml含有1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物、1%氯化鈉、50μg/ml氯芐青霉素和0.4%麥芽糖的LBM培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)大腸桿菌菌株Y1090(見RichardA.YoungandRonaldW.Davis，Science，222，778，1983)。將處于對數(shù)生長期的大腸桿菌細(xì)胞懸浮于15ml用冰冷卻的10mM硫酸鎂中。用含有0.1M氯化鈉、8mM硫酸鎂、50mMTris·HCl(pH7.5)和0.01%白明膠的SM緩沖液稀釋步驟5中得到的噬菌體溶液。將0.1ml稀釋的噬菌體溶液與等體積上述大腸桿菌細(xì)胞懸浮液混合，并將混合液于37℃下保溫15分鐘。向混合物中加入4ml含有1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取液，0.5%氯化鈉，0.25%硫酸鎂和0.7%瓊脂(pH7.0)并加熱到45℃的軟瓊脂培養(yǎng)基。將該混合液鋪敷在含有1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取液，1%氯化鈉，1.5%瓊脂和100μg/ml氨芐青毒素(pH7.0)的L-瓊脂平皿上，并在42℃下保溫3小時(shí)。然后，使10mMIPTG(異丙基β-D硫代吡喃半乳糖苷)滲透到硝化纖維素濾紙中，并干燥該硝化纖維素濾紙，然后使之與平皿緊密接觸。將與濾紙接觸的平皿于37℃保溫3小時(shí)。取出濾紙，并用TBS緩沖液洗三次。將洗過的濾紙浸沒于2%牛血清白蛋白溶液中，并于室溫下保溫1小時(shí)。將包含在商業(yè)可得到的免疫篩選藥盒(由英國AmershamInternational生產(chǎn)并出售)中的1/20體積的大腸桿菌溶胞產(chǎn)物溶液加到從NANB肝炎病人收集的血清中，室溫下保溫30分鐘。之后，用加有0.2%牛血清白蛋白的TBS緩沖液將該血清稀釋至50倍，并將濾紙浸泡于稀釋的血清溶液中，于室溫下保溫1小時(shí)。用含有0.05%吐溫20的TBS緩沖液將所得到的濾紙沖洗4次。將洗過的濾紙置于經(jīng)1000倍稀釋之過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG(德國Cappel有限公司生產(chǎn)和出售)而制備的抗體溶液中浸泡1小時(shí)。用上述的吐溫-TBS緩沖液沖洗該濾紙，然后再將其浸泡于通過向50mlTBS緩沖液中加入0.4mlDAB(四氫氯化-3，3′-二氨基聯(lián)苯胺)和15μl30%過氧化氫水溶液所制成的溶液中，于室溫下保溫5至30分鐘使之顯色。用蒸餾水徹底沖洗所得到的濾紙以終止該反應(yīng)。按上述步驟純化所得到的噬斑。結(jié)果分離出9個(gè)陽性克隆，分別命名為BK102，BK103，BK105，BK106，BK108，BK109，BK110，BK111和BK112。所有這些克隆都不與從健康人體中采集的血清反應(yīng)，但是能與從患有NANB肝炎的病人體內(nèi)采集的血清發(fā)生反應(yīng)。參見表1。表1得自NANB肝炎病人的血清與重組λgt11噬菌體克隆間的反應(yīng)性克隆健康人血清NANB肝炎病人的血清BK1020/10＊10/11BK1030/109/11BK1050/1011/11BK1060/1011/11BK1080/109/11BK1090/109/11BK1100/109/11BK1110/109/11BK1120/1010/11＊陽性樣品數(shù)/樣品數(shù)步驟8(測定所得克隆的核苷酸順序)純化克隆BK102到BK112的重組噬菌體DNA，并且用限制酶EcoRⅠ消化之。然后，分離NANBV的cDNA片段，并將分離的cDNA分別插入到質(zhì)粒PUC19的EcoRⅠ位點(diǎn)上。按照與步驟6中基本上相同的方法用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109。從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中獲得質(zhì)粒DNA并純化之。使用7-DEAZA順序測定藥盒(日本TakaraShuzo有限公司生產(chǎn)和出售;參見Mizusawa，S.，Nishimura，S.andSeela，F(xiàn).，NucleicAcidsRes.，141319，1986)測定各NANBVcDNA的核苷酸順序。所獲得cDNA克隆的核苷酸順序間的關(guān)系如圖1(1)所示。步驟9(通過基因組行走克隆cDNA庫中的NANBVcDNA克隆)經(jīng)用32p-dCTP標(biāo)記步驟8中所獲得的克隆BK102，克隆BK106和克隆BK112的cDNA片段來制備探針。使用這些探針，可以從步驟5制得的克隆載體λgt11的cDNA庫中經(jīng)雜交反應(yīng)得到含有NANBVcDNA的噬菌體克隆。即借助堿方法(參見T.Maniatis，E.F.Fritsch，andJ.SambrookIsolationofBacteriophageλandPlasmidDNA“MolecularCloning”，ColdSpringHarborLab.，pp75-96)。由步驟8所得到的克隆BK102，克隆BK106和克隆BK112轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中制備質(zhì)粒DNA。用限制酶NcoⅠ和HincⅡ消化克隆BK102的質(zhì)粒DNA，并對所得到的位于DNA5′端的0.7kb片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并收集之。用限制酶NcoⅠ消化克隆BK106和克隆BK112的質(zhì)粒DNA。按照上述的相同方法，從克隆BK106中制備1.1kbDNA片段，并從克隆BK112中制備位于3′端的0.7kb片段。使用商業(yè)上可得到的DNA標(biāo)記藥盒(NipponGeneCo.，Ltd.生產(chǎn))，將25ng至1μg的DNA片段與[α-32p]dCTP(3000Ci/mmol;AmershamCo.，Ltd.，Emgland生產(chǎn))在37℃下保溫3到5小時(shí)。這樣便制得了用于雜交反應(yīng)的探針。接著，如步驟7中所述，將步驟5中所得到cDNA庫噬菌體于42℃下在L-瓊脂培養(yǎng)基中保溫3小時(shí)。然后再將噬菌體于37℃下繼續(xù)保溫3小時(shí)并冷卻之。將硝化纖維素濾紙與噬菌斑接觸，并放置30到60秒鐘。從而使噬菌斑被吸附到濾紙上。用一種含有0.5N氫氧化鈉和1.5M氯化鈉的水溶液對濾紙進(jìn)行堿變性1至5分鐘，再用含有1.5M氯化鈉的0.5MTris·HCl(pH8.0)中和1至5分鐘。用含有0.3M氯化鈉和0.03M檸檬酸鈉的2XSSC溶液沖洗該濾紙、干燥、并在80℃下烘烤2小時(shí)。將該濾紙置于含有50%甲酰胺、5XSSC、5XDenhart溶液，50mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液(pH6.5)，100μg/ml鮭魚精子DNA和0.1%SDS的雜交溶液中42℃保溫6小時(shí)。然后，將該濾紙浸泡于300ml加有1ml大約4×108cpm/ml上述探針的雜交溶液中，并在42℃下保溫16至20小時(shí)。用含有0.1%(W/W)SDS的2XSSC溶液將該濾液紙洗4次，再用含有0.1%(W/W)SDS的0.1XSSC溶液洗兩次。沖洗之后，干燥該濾紙，并進(jìn)行放射自顯影。從而分離出雜交陽性克隆。結(jié)果獲得27個(gè)與從克隆BK102衍生之探針發(fā)生反應(yīng)的克隆;14個(gè)與衍生于克隆BK106之探針發(fā)生反應(yīng)的克隆和13個(gè)與衍生于克隆BK112的探針發(fā)生反應(yīng)的克隆，這些克隆分別被命名為BK114至BK169。按照步驟8中所述的方法測定BK114至BK169各個(gè)克隆的核苷酸順序，然后繪制各個(gè)克隆的酶切圖。結(jié)果得到被認(rèn)為是NANBV基因組之總長度的長約9.5kb的核苷酸序列。[見圖1(2)]。用限制酶KpnⅠ消化位于5′端的克隆BK157以分離位于5′端上的0.55kb的片段。另外用限制酶HpaⅠ和EcoRⅠ消化位于3′末端的克隆BK116，以分離位于3′端的0.55kb片段。用上述相同的方法制備32p標(biāo)記的探針，并與步驟5中所得到的cDNA庫噬菌體進(jìn)行噬斑雜交。結(jié)果利用衍生于克隆BK157的探針分離出三個(gè)另外的新克隆。這些新克隆分別被命名為克隆BK170，BK171和BK172。步驟10(分析cDNA的核苷酸順序)從步驟8和9中所得克隆的核苷酸順序可以測知NANBV基因的完整核苷酸順序，并如圖2(1)至2(16)所示。從這些圖中可以推知克隆的NANBV基因組cDNAs是由9416個(gè)核苷酸組成的，其中有一個(gè)編碼含3010個(gè)氨基酸殘基之蛋白質(zhì)的由9030個(gè)核苷酸組成的開放讀碼。該蛋白蛋的親水/疏水形型式與已經(jīng)報(bào)道的黃熱病病毒相似(參見H.Sumiyoshi，C.Mori，I.Fukeetal.，CompleteNucleotideSequenceoftheJapaneseEncephalitisVirusGenomeRNA.Virology，161，497-510，1987)。克隆BK157復(fù)蓋了圖2(1)到2(16)中的第1至1962位核苷酸?？寺K172覆蓋了第5至366位核苷酸，克隆BK153覆蓋了第338至1802位核苷酸，克隆BK138覆蓋了第1755至5124位核苷酸，克隆BK129覆蓋了第4104至6973位核苷酸，克隆BK108復(fù)蓋了第6886至8344位核苷酸，克隆166復(fù)蓋了8082至9416位核苷酸。這些克隆分別作為大腸桿菌BK108(保藏于日本發(fā)酵研究所，登記號為FERMBP-2971)、BK129(保藏于日本發(fā)酵研究所，登記號為FERMBP-2972)、BK138(保藏于日本發(fā)酵研究所，登記號為FERMBP-2973)、BK153(保藏于日本發(fā)酵研究所，登記號為FERMBP-2974)、BK157(保藏于日本發(fā)酵研究所，登記號為FERMBP-3243)、BK166(保藏于日本發(fā)酵研究所，登記號為FERMBP-2975)，和BK172(保藏于日本發(fā)酵研究所，登記號為FERMBP-2976)保藏。參考實(shí)施例1(在大腸桿菌中制備NANBV相關(guān)抗原，這些抗原與NANBV感染所伴隨的抗體反應(yīng)有關(guān))。將實(shí)施例1(部分1)中步驟8所制得的克隆BK106、克隆BK111和克隆BK112的自各(cDNA和實(shí)施例1(部分1)中步驟9所制得的克隆BK147的cDNA分別插入到質(zhì)粒中，并按常規(guī)堿性方法收集如此獲得的質(zhì)粒DNA。接著，用限制酶EcoRⅠ和ClaⅠ消化，收集克隆BK106的DNA，得到0.5μg長度為0.34Kb的DNA片段。將如此得到的DNA片段在含有67mMTris·HCl(pH8.8)、6.7mM氯化鎂、16.6mM硫酸銨、10mM2-巰基乙醇、6.7μMEDTA、0.02%牛血清白蛋白、0.3mMdNTP和2-5單位T4DNA聚合酶的T4DNA聚合酶溶液中37℃保溫60分鐘，從而使兩個(gè)末端變成平端。用限制酶BamHⅠ消化克隆BK102的DNA，以得到0.5μg長度為0.7kb的DNA片段，并基本上按上述相同方法用T4DNA聚合酶處理，使DNA片段的末端變成平端。用限制酶Sau3AⅠ消化克隆BK147的DNA，以得到0.5μg長度為1kb的DNA片段，并且以上述相同的方法使該DNA片段的末端變成平端。另外還用限制酶EcoRⅠ消化克隆BK111的DNA，以得到0.5μg長度為1kb的DNA片段。并且以與上述者基本相同的方法使該DNA片段的末端變成平端。然后，用限制酶HindⅢ消化表達(dá)載體pKK233-2(Amann，E.andJ.Brosius.ATGVectorforregulatedhigh-LevelexpressionofclonedgenesinEscherichiacoli.，Gene，Vol.40，183，1985)的DNA。所得2μgDNA在含有0.3M氯化鈉、50mM乙酸鈉(pH4.5)、1mM硫酸鋅和100-200單位S1核酸酶的S1核酸酶溶液中于37℃保溫20分鐘，然后分別加于1/10體積的0.12MEDTA和1MTris·HCl溶液(pH9.0)終止該反應(yīng)。之后，進(jìn)行苯酚提取，用乙醇沉淀具有鈍性末端的載體DNA并收集之。另一方面，用限制酶PstⅠ消化載體pKK233-2的DNA，再用苯酚提取并用乙醇沉淀以純化被消化的DNA。利用上述的T4DNA聚合酶反應(yīng)使限制酶PstⅠ切割的2μg純化之載體DNA的末端變成平端。用限制酶HindⅢ分別切割如此得到的衍生于克隆BK106和克隆BK111的DNA片段。將各0.5μg已切割的DNA片段與0.5μg具有鈍性末端的載體DNA混合。加入2μl含有500mMTris·HCl(pH7.5)、100mM氯化鎂、100mMDTT和10mMATP、300-400單位T4DNA連接酶和蒸餾水的10X連接溶液將各混合物的體積調(diào)至20μl。將混合物在14℃下保溫12-18小時(shí)，從而得到分別命名為pCE-06，pE-11，pB-02和pS-09的質(zhì)粒。使用其中的每種質(zhì)粒DNA，以實(shí)施例1(部分1)步驟6中所述的基本相同的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109，得到轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在含有1(w/w)%胰蛋白胨，0.5(w/v)%酵母提取物和1(w/v)%氯化鈉的LB培養(yǎng)基(pH7.5)中于37℃下培養(yǎng)，當(dāng)處于對數(shù)生長期時(shí)，向培養(yǎng)基中加入1mMIPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。然后離心(10，000xg離心15分鐘)收集大腸桿菌細(xì)胞，并將收集的細(xì)胞在50mMTrisHCL(pH8.0)中溶解。對混合物進(jìn)行超聲處理(20KHZ，600W，5分鐘)并以10，000xg離心15分鐘以得到上清部分和沉淀部分。將各部分溶于含有20(v/v)%甘油、0.1MTris·HCL(pH6.8)，2(w/v)%SDS，2(v/v)%2-巰基乙醇和0.02%BPB的樣本緩沖液中，在100℃下加熱3分鐘，并用0.1%SDS-7.5%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳以分離蛋白質(zhì)。電泳之后，通過轉(zhuǎn)印跡小室(transboltCell)(由美國BIO.RADCo.，Ltd.，生產(chǎn)和出售)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素濾紙上。把濾紙浸于3%的明膠溶液中靜置60分鐘。該濾紙與從NANB肝炎病人采集的已稀釋100倍的血清在室溫下一起保溫2到3小時(shí)。先用蒸餾水沖洗濾紙，再用含有0.02MTris·HCL(pH7.5)、0.5M氯代鈉和0.05(v/v)%吐溫20的TTBS溶液沖洗。接著將洗過的濾紙浸泡于2000倍稀釋的過氧化物酶標(biāo)記之抗人IgG抗體溶液中，于室溫下保溫90分鐘。先用蒸餾水，再用TTBS溶液沖洗該濾紙。將洗過的濾紙浸泡于如實(shí)施例1(部分1)步驟7所述的含有顯色劑DAB和30%(基于底物)過氧化氫的緩沖液中5至30分鐘，然后用水洗以終止反應(yīng)。結(jié)果如表2中所示，所有由質(zhì)粒產(chǎn)生的抗原都與NANB肝炎病人的血清發(fā)生特異性反應(yīng)，從而表明由插入到質(zhì)粒中的cDNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在臨床具有重要意義。表2用Weetern印跡方法評價(jià)各種質(zhì)粒所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與來源于NANB肝炎病人的血清的反應(yīng)活性質(zhì)粒cDNA來源提取物NANB肝炎健康人病人血清的血清pCE-066BK106S±-P+-pE-11-89BK111S±-P+-pB-02-07BK102S+-P--pS-09-07BK109S±-P+-pKK233-3-S--P--S離心所得上清;P離心所得沉淀物+陽性;±輕度陽性;-陰性參考實(shí)施例2(由大腸桿菌產(chǎn)生之NANBV相關(guān)抗原的純化及其與肝炎病人血清的反應(yīng)活性)由被插入到表達(dá)載體中的cDNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的用途，可以經(jīng)純化該蛋白質(zhì)并使用該純化的蛋白質(zhì)作為ELISA或放射免疫測定的抗原而得以證明。也就是，將參考實(shí)施例1中制得的已轉(zhuǎn)化大腸桿菌的細(xì)胞溶解產(chǎn)物以10，000xg離心15分鐘，得到上清和沉淀物。例如，把從轉(zhuǎn)化體JM109/pCE066得到的沉淀物懸浮于含有100mMTris·HCL(PH8.0)和0.1%TristonX-100的溶液中，并將該懸浮液以20KHZ(600W)的頻率超聲處理1分鐘，然后以21，000xg離心15分鐘，得到沉淀物。把該沉淀物重新懸浮于含有100mMTris·HCL(PH8.0)和6M尿素的溶液中，然后進(jìn)行超聲處理和離心。所得到的上清液對含有10mM磷酸鹽緩沖液(PH7.5)和6M尿素的溶液透析得到抗原溶液。使20ml該抗原溶液通過一個(gè)裝有羥基磷灰石，并已用上述緩沖液平衡過的柱子(21.5×250mm)，使抗原吸附到填柱材料上。對該柱進(jìn)行高速液相層析(HPLC)，其中用上述的含有氯化鈉的緩沖液進(jìn)行洗脫，其濃度為0到2M變化的線性濃度梯度，從而得到一個(gè)含有抗原的部分。使所得到的部分在50mM含有0.05%十二烷基硫酸鈉(SDS)的碳酸鹽緩沖液(PH9.6)中進(jìn)行透析。另外，用35%飽和的硫酸銨處理離心轉(zhuǎn)化體JM109/pB-02-10之溶解產(chǎn)物(以10，000g離心15分鐘)所得到的上清液，并將所得到的沉淀物溶于50mM含有100mM2-巰基乙醇的Tris·HCl(PH8.5)緩沖液中。將所得到的溶液對上述的緩沖液透析。然后，使100mM透析過的溶液通過一個(gè)裝有DEAE纖維素，并用上述緩沖液平衡過的柱子(22.0×200mm)，使抗原吸附到裝柱材料上。對該柱進(jìn)行高速液相層析，其中用含有100mM2-巰基乙醇，并加有氯化鈉的50mMTris.HCL(PH8.5)緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫液濃度為0到2M變化的線性濃度梯度，然后收集含有抗原的部分。將該部分對含有10mM磷酸鹽緩沖液和100mM2-巰基乙醇的溶液透析，使透析過的溶液通過已用上述緩沖液平衡過的羥磷石柱進(jìn)行高速液相層析，使抗原吸附到裝柱材料上。該柱作高速液相層析時(shí)，用濃度由10到400mM變化的磷酸線性濃度梯度進(jìn)行洗脫并收集含有抗原的部分。將所得到的部分對含有0.05%SDS的50mM碳酸鹽緩沖液(PH9.6)透析。將離心轉(zhuǎn)化體JM109/pE-11-89之溶解產(chǎn)物所得到的沉淀物懸浮于10mM磷酸鹽緩沖液(PH5.5)中。對懸浮液進(jìn)行上述的超聲處理1分鐘，然后以21，000xg離心15分鐘。將所得沉淀物懸浮于100mM含有500mM氯化鈉和10mMEDTA的碳酸鹽緩沖液中。對所得懸浮液再次超聲處理1分鐘，然后離心。將所得上清液對含有6M尿素的30mM磷酸鹽緩沖液透析。然后使20ml透析過的溶液通過一個(gè)已用上述透析中使用的相同緩沖液平衡過的CM纖維素柱(22×200mm)進(jìn)行高速液相層析(HPLC)，以使抗原吸附到裝柱材料上。對該柱進(jìn)行高速液相層析，其中用上述含有濃度為0到1.5M之氯化鈉線性濃度梯度的緩沖液進(jìn)行洗脫，得到含有抗原的部分。將該部分對含有0.05%SDS的50mM碳酸鹽緩沖液(PH9.6)透析，得到含有抗原的溶液。用上面制備的抗原作為ELISA的抗原對非A非B肝炎病毒感染進(jìn)行臨床診斷。也即，將上述每種純化抗原的蛋白濃度調(diào)節(jié)至1μg/ml，并以100μl量加入Microplatelmmulone600(德國GrerinerCo.，Ltd，生產(chǎn)和出售)之用于ELISA的各孔中，并于40℃下靜止過夜。用含有10mM磷酸鹽緩沖液(PH7.2)、0.8%氯化鈉和0.05%吐溫20的PBS-T緩沖液充分沖洗各孔內(nèi)容物，并且以100μl/孔的量向孔內(nèi)加入用PBS-T緩沖液稀釋過的樣本血清，然后在37℃下反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-T緩沖液將各孔內(nèi)容物沖洗三次，然后再以100μl/孔的量向每孔內(nèi)加入用含有1%胎牛血清的PBS-T緩沖液稀釋8000倍的過氧化物酶標(biāo)記之抗人IgG抗體(德國CappelCo.，Ltd，生產(chǎn)和出售)。使各孔內(nèi)容物在37℃下反應(yīng)1小時(shí)，并用PBS-T緩沖液沖洗四次。以100μl/孔的量向各孔內(nèi)加入含有9ml的0.05M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、0.5μg鄰苯二胺和20μl過氧化氫水溶液的底物顯色劑溶液。使平板避光于室溫下放置60分鐘。向各孔內(nèi)加入75μl4N硫酸，測定其在490nm波長下的吸收率。結(jié)果如表3所示。從表中可以明顯地看出，所有來源于轉(zhuǎn)化體的抗原都與NANB肝炎病人的血清發(fā)生特異性反應(yīng)，從而證明了由轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的抗原在臨床診斷中的用途。表3在ELISA中得自各種轉(zhuǎn)化大腸桿菌的純化抗原與NANB肝炎病人血清間的反應(yīng)性來源于輸血性肝炎病人的血清抗原來源(轉(zhuǎn)化的大腸桿菌)急性慢性肝硬變肝癌健康人血清JM109/pCE-0662/3＊7/83/43/30/10JM109/pB-02-102/38/84/43/30/10JM109/pE-11-892/38/82/43/30/10＊陽性樣本數(shù)/檢查之樣本數(shù)用上述抗原通過放射免疫測定所得結(jié)果與表3中所示者相同。也就是說，將直徑為1/4英寸的聚苯乙烯小珠(德國PeselCo.，Ltd，生產(chǎn)和出售)放入0.2ml濃度為1μg/ml的上述各純化之抗原溶液中，并于4℃下放置過夜。然后，用上述ELISA中所用的相同PBS-T緩沖液沖洗聚苯乙烯小珠5次，并以200μl/小珠的量加入用PBS-T緩沖液稀釋20至2500倍的樣本血清。使之于37℃下反應(yīng)60分鐘并用PBS-T緩沖液沖洗聚苯乙烯小珠5次，再以200μl/小珠的量加入125I-標(biāo)記的抗人IgG抗體。使之于37℃下反應(yīng)1小時(shí)，并用PBS-T緩沖液沖洗小珠5次。測定結(jié)合到聚苯乙烯小珠上的125I的cpm值，所得結(jié)果與表3中所示相同。因此，證明了上面得到的純化的抗原在NANB肝炎病毒感染之臨床診斷中的用途。參考實(shí)施例3[根據(jù)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法檢測NANBV核酸]為了防止輸血引起的NANBV肝炎，檢測用于輸血的血液中是否存在任何NANB病毒感染是很重要的。而且，為了診斷肝炎，研究肝組織內(nèi)是否存在任何NANB病毒感染具有極其重要的臨床價(jià)值。根據(jù)本發(fā)明方法得到的NANBVcDNA可用于制備聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物，以便于檢查NANB肝炎。即如實(shí)施例1(部分1)步驟1所述，從各1ml病人和健康人的血清中純化RNA。同樣，也可以如實(shí)施例1(部分1)步驟2所述從肝細(xì)胞中制備RNA。然后，如實(shí)施例1(部分1)步驟4所述，以PCR和電泳方法制備cDNA。按照常規(guī)，使用32P-標(biāo)記的NABVcDNA克隆BK108衍生的cDNA制備的探針，經(jīng)Sorthern雜交來研究擴(kuò)增的cDNA是否衍生于NANBV。結(jié)果如表4中所示。從表中可以明顯地看出，使用本發(fā)明得到的NABVcDNA的核苷酸順序所制備的引物并以克隆NANBVcDNA的片段做為探針，可以測定出血清中的NANBV核酸，并且能診斷出血清中NANB病毒的感染。表4經(jīng)PCR檢測NANB病毒核酸樣品抗NANBV抗體PCR慢性肝炎病人的血清NANB1++2++HBV攜帶者1--2--健康人1--2--從NANB肝癌-1切除的肝臟+癌部位+非癌部位+從NANB肝癌-2切除的肝臟+癌部位+非癌部位+實(shí)施例1(部分Ⅱ)步驟1(構(gòu)建用于在大腸桿菌中表達(dá)NANBV基因組cDNA之完整編碼區(qū)的質(zhì)粒)從圖1(1)和圖1(2)中所示的克隆BK112、BK146、BK147、BK157和BK166中分離cDNA，并按照下述方法制備用于在大腸桿菌中表達(dá)NANBV基因之完整編碼區(qū)的質(zhì)粒。用限制酶BamHⅠ消化克隆BK157的質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以得到一個(gè)長度為1.3kb的DNA片段。將該DNA片段插入到質(zhì)粒pUC19(日本，TakarashugoCo.，Ltd.，生產(chǎn)和出售)的BamHⅠ位點(diǎn)上得到質(zhì)粒pBm157。用限制酶XbaⅠ和NcoⅠ消化質(zhì)粒pBm157得到一個(gè)長度約為3.9kb的DNA片段。另外，將帶有XbaⅠ人工接頭順序的噬菌體T7RNA聚合酶的20bP啟動(dòng)子區(qū)順序(TAATACGACTCACTATAGGG)連接到圖2(1)中所示的帶有NcoⅠ人工接頭順序的核苷酸1至73順序上，以合成一個(gè)93bp的寡核苷酸(在3′側(cè)有4個(gè)核苷酸缺失)。將如此得到的寡核苷酸連接到上述的3.9kbDNA片段上，從而得到質(zhì)粒pDM-16。然后，用限制酶ClaⅠ和EcoRⅠ消化pDM-16，得到一個(gè)大約3.5kb的DNA片段，另外，用限制酶ClaⅠ和EcoRⅠ消化克隆BK146的DNA得到長度為4，1kb的DNA片段。將上述的大約3.5kb的DNA片段連接到如此獲得的4.1kb的DNA片段上，以得到質(zhì)粒pDM-9。然后，用SacⅡ消化質(zhì)粒pDM-9，從而得到2.7kb的DNA片段和4.9kb的DNA片段。將4.9kb的DNA片段用T4DNA連接酶連接到其SacⅡ位點(diǎn)上，然后用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，得到一個(gè)大約7.5kb的DNA片段。另外，用BamHⅠ和EcoRⅠ消化克隆BK147的DNA，得到一個(gè)大約2kb的DNA片段。將如此得到的DNA片段連接到上述7.5kb的DNA片段上以得到質(zhì)粒pBE147。用SacⅡ消化質(zhì)粒pBE147。將上述來源于pDM-9r2.7kbDNA片段插入到SacⅡ消化的pBE147中，得到質(zhì)粒pDM-B3。用XbaⅠ和EcoRⅠ消化質(zhì)粒pDM-B3以得到6.7kb的DNA片段。用BamHⅠ消化克隆BK166的DNA得到一個(gè)1.3kb的DNA片段。將該片段插入到PUC19的BamHⅠ位點(diǎn)上以得到pBam166。用NdeⅠ和HindⅢ消化pBam166得到一個(gè)2.8kb的DNA片段。用EcoRⅠ和NdeⅠ消化克隆BK112的DNA得到一個(gè)大約1.6kb的DNA片段。用EcoRⅠ和HindⅢ消化PUC19得到一個(gè)大約2.6kb的DNA片段?；旌仙鲜鋈齻€(gè)類型的DNA片段，并且與T4DNA連接酶反應(yīng)，得到一個(gè)這些片段以它們的EcoRⅠ、NdeⅠ和HindⅢ位點(diǎn)連接在一起的質(zhì)粒pEN112。用EcoRⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒pEN112得到2.7kb的DNA片段。用EcoEⅠ和XbaⅠ消化PEM-B3得到6.7kb的片段。將上述2.7kb的片段連接到6.7kb的片段上，并將已連接的DNA片段插入到pUC19的XbaⅠ位點(diǎn)上，得到質(zhì)粒pDM-22和pDM-18。用質(zhì)粒pDM-18可以轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞等，以使該細(xì)胞能夠產(chǎn)生NANB病毒顆粒。也可以使用借助體外轉(zhuǎn)錄藥盒(日本，BoehringerMannheimYamanouchi生產(chǎn)和出售)轉(zhuǎn)錄pDM-18而制備的RNA來進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用HindⅢ和ClaⅠ消化其中cDNA插入方向與pDM-18相反的質(zhì)粒pDM-22，得到大約9kb的DNA片段。用BamHⅠ消化克隆BK106的DNA，得到一個(gè)大約1.0kb的DNA片段。將該片段插入到質(zhì)粒pUC19的BamHⅠ位點(diǎn)上，得到質(zhì)粒pBam106。用NcoⅠ消化如此得到的質(zhì)粒DNA，并且用MangBean核酸酶(日本，TakaraShuzoCo.，Ltd.，生產(chǎn)和出售)將其粘性末端切成平頭。進(jìn)一步用XbaⅠ消化所得到的質(zhì)粒，得到一個(gè)大約3.6kb的片段。將通過把圖2(11)中所示的核苷酸333在372的順序連接以XbaⅠ人工接頭的下游所制得的合成寡聚核苷酸連接到該片段上，得到質(zhì)粒pXb106。用HindⅢ和ClaⅠ消化質(zhì)粒pXb106得到0.4kb的DNA片段。將該片段連接到上述衍生于質(zhì)粒pDM-22的大約9kb的片段上得到質(zhì)粒pORF-24。用XbaⅠ消化質(zhì)粒pORF-24得到一個(gè)大約9.0kb的DNA片段。將該片段連接到一個(gè)連接有T7RNA聚合酶基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體(參見F.WilliamStudierandB.A.Moffatt，J.Mol.Biol.，189，113，1986)上，得到表達(dá)質(zhì)粒pJF-22。步驟2(制備轉(zhuǎn)化體大腸桿菌及其培養(yǎng)物)使用步驟1中構(gòu)建的表面質(zhì)粒pJF-22，以氧化鈣方法(JournalofMolecularBiology，53，154，1970)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109(DE3)(Promega，U.S.A.生產(chǎn)并銷售)，得到轉(zhuǎn)化體JM109(DM3)/pJE-2Z。之后按參考實(shí)施例1所述方法處理轉(zhuǎn)化體大腸桿菌JM109(DE3)/pJE-2Z。也就是，在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)該大腸桿菌，然后加入0.5mMIPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。之后，收集培養(yǎng)過的細(xì)胞，并在含有2%SDS和2%2-巰基乙醇的緩沖液中于100℃加熱3分鐘，用含有0.1(w/v)%SDS和12.5(w/v)%丙烯酰胺的凝膠對所得到的細(xì)胞進(jìn)行電泳分離。使用轉(zhuǎn)印跡裝置(日本NipponEidoCo.，Ltd.，生產(chǎn)和出售)將在凝膠上分離得到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝化纖維素膜上，并進(jìn)行Western印跡分析，以鑒定所得到的蛋白質(zhì)。在Western印跡分析中，使用了經(jīng)純化由參考實(shí)施例1得到的轉(zhuǎn)化體中制備的NANBV相關(guān)抗原及用其免疫豚鼠而獲得的特異性抗血清。從Western印跡分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由轉(zhuǎn)化體JM109(PE3)/pJF-22產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可與所有抗血清發(fā)生反應(yīng)(見表5)。表5轉(zhuǎn)化體大腸桿菌JM109(DE3)/pJF-22中所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與NANBV相關(guān)抗體的反應(yīng)活性NANB肝炎豚鼠抗血清病人的血清細(xì)胞收集的急性慢性抗-抗-抗-提取物血清核心NS3NS5JM109(DE3)+＊+++++/pJF22JM109(DE3)------＊′經(jīng)Western印跡分析測定的反應(yīng)活性因此，結(jié)果表明在該轉(zhuǎn)化體中，可以表達(dá)出從編碼核心核原之基因組的5′端到編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS5之基因組的3′端的NANB病毒基因完整編碼區(qū)。從這一結(jié)果可以明顯地看出，該種轉(zhuǎn)化體能夠提供一種極為有用的抗原，這種抗原不僅可以用于制備診斷NANB病毒感染的試劑，而且還可用于制備NANB病毒病苗。步驟3(通過在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)NANB病毒基因組cDNA來制備NANB病毒顆粒)用XbaⅠ部分消化步驟1得到的質(zhì)粒pORF-24，并進(jìn)行低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳以得到一個(gè)大約9kb長的DNA片段。將如此得到的DNA片段插入到已經(jīng)用NheⅠ切割過的質(zhì)粒pMAM-neo(可以從Clontech.U.S.A得到)中，以構(gòu)經(jīng)建表達(dá)質(zhì)粒pMAM-neo10。以磷酸鈣方法(“MolecularLaboratory，1989)將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人肝細(xì)胞ChangLiver(ACTTCCL13)和黑猩猩肝細(xì)胞(從日本DainipponPbarmaceuticalCompanyLtd.，購得)中。使已經(jīng)導(dǎo)入了質(zhì)粒pMAM-neo10的肝細(xì)胞對氨基苷抗生素G418具有抗性，從而使該細(xì)胞能夠在600μg/ml之G418存在下形成菌落。用這種抗生性作為標(biāo)準(zhǔn)，選擇轉(zhuǎn)化體，然后進(jìn)行克隆。按照下文參考實(shí)施例4中所述的相同方法，將人肝細(xì)胞中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體克隆HL-A1和HL-A2以及黑猩猩肝細(xì)胞中產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體克隆CL-B11和CL-B14分別加在含有5(v/v)%胎牛血清的Eagle氏MEM培養(yǎng)基中，在置于佩特里培養(yǎng)皿中的蓋玻璃上37℃培養(yǎng)4天。對于由培養(yǎng)上述各克隆而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，均以間接熒光抗體技術(shù)使用步驟2中所述的特異性抗血清檢測NANBV抗原性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)G418抗性細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可與用參考實(shí)施例1中制得的NANBV相關(guān)抗原免疫之豚鼠的所有抗血清發(fā)生反應(yīng)(見表6)。表6以熒光抗體技術(shù)檢測人或黑猩猩肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化體中產(chǎn)生的NANBV相關(guān)抗原細(xì)胞NANB肝類提取物病人的血清豚鼠抗血清收集的急性慢性抗-抗-抗-提取物血清核心NS3NS5來源于人肝細(xì)胞的HL-A1++++++HL-A2++++++正常changLiver------來源于黑猩猩肝細(xì)胞的CL-B11++++++CL-B14++++++正常ChimpLiver------這一事實(shí)說明已經(jīng)表達(dá)出了復(fù)蓋核心抗原編碼區(qū)到NS5編碼區(qū)的NANBV基因的完整編碼區(qū)。步驟4(對由人肝細(xì)胞和黑猩猩肝細(xì)胞衍生之轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆HL-A1和C-B11產(chǎn)生的NANBV相關(guān)抗原進(jìn)行蔗糖密度梯度離心)按步驟3所述的相同方法，將克隆HL-A1和CL-B11分別在直徑為9cm的佩特里培養(yǎng)皿上于CO2保溫箱中37℃培養(yǎng)4天。用橡膠淀帚刮除細(xì)胞并用培養(yǎng)液將其合并在一起，在20KHZ(200W)條件下超聲處理2分鐘，并以5000xg轉(zhuǎn)速于4℃下離心15分鐘。將所得到的上清液再以48000xg轉(zhuǎn)速在4℃下離心14小時(shí)，得到沉淀物。將沉淀物懸浮于1mlM/75PBS中，并超聲處理2分鐘，再以160000xg于4℃下進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，然后分級分離。對每部分進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺電泳，并以步驟2中所述的相同方法進(jìn)行Westem印跡分析，以檢查核心抗原和包膜抗原。結(jié)果在40(w/v)%至50(w/v)%蔗糖密度處檢出兩種抗原，表明已得到NANB病毒顆粒。實(shí)施例2步驟1(構(gòu)建能夠在酵母中表達(dá)NANBV基因組cDNA之完整編碼區(qū)的質(zhì)粒并制備轉(zhuǎn)化體酵母)按照實(shí)施例1(部分2)步驟1所述的相同方法用XbaⅠ消化實(shí)施例1(部分2)步驟1制得的質(zhì)粒pORF24，得到約9kb的NANBVcDNA片段。將0.5μg該cDNA片段溶解于含有67mMTris·HCL(PH8.8)、6.7mM氯化鎂、16.6mM硫酸銨、10mM2-ME、6.7mMEDTA-2Na、0.02(w/v)%牛血清白蛋白和0.3mMdNTP并加有2到5單位T4DNA聚合酶(TakarashuzoCo.，Ltd.，Japan)的T4DNA聚合酶溶液中，將所得混合物在37℃下保溫60分鐘，以使該片段的兩個(gè)末端變成平頭。然后，用T4DNA連接酶在其上連接XhoⅠ人工接頭(CCTCGAGG)。具體地說，將0.3μgDNA溶于20μl含有500mMTris-HCL(PH7.5)，100mM氯化鎂，100mMDTT和10mMATP的10x連接溶液中。向該混合液中加入300至400單位T4DNA連接酶(TakeraShuzoCo.，Ltd.，Japan)并加入一定量的蒸餾水使總體積為210μl，然后在14℃下保溫18小時(shí)。將如此制備的cDNA片段插入到可用于酵母YEp133pCT(美國專利NO.4，810，492中所述)中之表達(dá)載體的XhoⅠ位點(diǎn)上，得到表達(dá)質(zhì)粒pYHC5。以堿性陽離子方法(Ito，H.etal，J.Bacteriol.，153163-168，1983)用該表達(dá)質(zhì)粒pYHC5轉(zhuǎn)化啤酒酵母(ATCCNO.44772)，得到轉(zhuǎn)化體酵母YHC5-1。對這種轉(zhuǎn)化體進(jìn)行設(shè)計(jì)以便當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏磷酸鹽離子時(shí)，可以激活抑制性酸性磷酸酶基因以引起連接到其下游的NABVcDNA的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生NANBV相關(guān)抗原。步驟2(由酵母產(chǎn)生NANBV相關(guān)抗原并使其特征化)將步驟1中得到的轉(zhuǎn)化體酵母YHC5-1接種到經(jīng)向含有1.5g/lh磷酸二氫鉀的完全合成培養(yǎng)基Burkholder氏培養(yǎng)基(參見Barkholder.P.R.etal，Am.J.Botang，30，206-211，1943)中各加入20μg/ml尿嘧啶、L-色氨酸、和L-組氨酸而制備的100ml培養(yǎng)基中。在30℃下振蕩培養(yǎng)已接種的培養(yǎng)基24小時(shí)。用生理鹽水洗培養(yǎng)的酵母，并將其接種到除用1.5g/l氯化鉀代替磷酸二氫鉀外其他均與上述培養(yǎng)基相同的1000ml新鮮培養(yǎng)基中。在30℃下培養(yǎng)接種培養(yǎng)基24小時(shí)，并收集所得到的細(xì)胞。將收集的細(xì)胞懸浮于M/75PBS中并向其中加入玻璃珠(直徑0.45-0.55mm)，使懸浮液經(jīng)過珠攪拌器(美國，BiospecProducts生產(chǎn)和出售)處理，以破壞細(xì)胞，然后以10000xg于40℃下離心10分鐘得到上清液。按照實(shí)施例1(部分Ⅱ)步驟2中所述的相同方法對如此得到上清液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western印跡分析，從檢查是否產(chǎn)生了NANB相關(guān)抗原。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化體酵母YHC5-1的提取物可與對核心抗原、包膜抗原、NS3蛋白和NS5蛋白特異性的所有抗體發(fā)生反應(yīng)。這一事實(shí)表明已經(jīng)表達(dá)出了以核心抗原到NS5區(qū)的NANBV基因的完整編碼區(qū)(見表7)。表7轉(zhuǎn)化體酵母YHC5-1產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與NANBV相關(guān)抗體的反應(yīng)活性NANB肝炎病人血清豚鼠血清細(xì)胞提取物收集的血清急性慢性抗-核心抗-NS3抗-NS5YHC5-1+＊+++++正常啤酒酵母------＊用Western印跡分析法測定的反應(yīng)活性再以實(shí)施例1(部分Ⅱ)步驟4中所述的相同方法對細(xì)胞提取物進(jìn)行蔗糖密度離心。結(jié)果在40(w/v)%到50(w/v)%蔗糖密度部分中檢查出了核心抗原和包膜抗原，表明已經(jīng)得到了NANBV顆粒。實(shí)施例3步驟1(構(gòu)建要可引入到牛痘病毒中的質(zhì)粒)用限制酶EcoRⅠ消化質(zhì)粒pUVI(FalkoG.Falkner，SekharChakrabartiandBernardMoss;NucleicAcidRes.，15(17)，7192，1987)并進(jìn)行苯酚提取和乙醇沉淀，得到DNA。按照參考實(shí)施例1中所述的相同方法，將0.5μg該DNA溶解于T4DNA聚合酶溶液中，加入2到5單位T4DNA聚合酶(日本TakaraShuzoCo.，Ltd.，生產(chǎn)和出售)，之后在37℃下保溫60分鐘，以使兩個(gè)末端變成平頭。另外，通過一種方法得到帶有可編碼NANBV蛋白的NANBV基因完整核苷酸順序的DNA片段，在該方法中，用XbaⅠ或用XbaⅠ和EcoRⅠ消化實(shí)施例1(部分Ⅱ)步驟1中所述的質(zhì)粒pORF-24，得到大約9kb的DNA片段或6.4kb的DNA片段，用T4DNA聚合酶處理所得到的DNA片段，以使兩末端變成平頭。以參考實(shí)施例1所述的相同方法將0.5μg如此得到的來源于pUVI的DNA和0.5μg來源于pORF-24的DNA溶解于21μl10x連接溶液中，并向其中加入300至400單位T4DNA連接酶(日本TakaraShuzoCo.，Lta.，生產(chǎn)和出售)和一定量的蒸餾水，使總體積達(dá)到210μl，然后在14℃保溫12至18小時(shí)。從而使來源于NANBV的cDNA連接到位于啟動(dòng)于下游的pUV1EcoRⅠ位點(diǎn)上。對連接反應(yīng)混合液進(jìn)行苯酚提取，并對含水層進(jìn)行乙醇沉淀以收集DNA。按實(shí)施例1(部分1)步驟6中所述的氯化鈣方法用DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109，得到分別帶有約9kb之NANBVcDNA片段的質(zhì)粒克隆pXX-49和pXX-51。另外，還得到具有下約6.4kb之NABVcDNA片段和缺乏NANBV之NS5區(qū)域的質(zhì)粒pXE-39。結(jié)果如圖5所示。參考實(shí)施例4(培養(yǎng)牛痘病毒W(wǎng)R株)用常規(guī)方法培養(yǎng)牛痘病毒W(wǎng)K株。具體地說，在直徑6cM的佩特里培養(yǎng)皿中培養(yǎng)單層培養(yǎng)細(xì)胞[如來源于小鼠的胸苷激酶(TK)缺乏性細(xì)胞系L-M(TK-)(ATCCCCL-1.3，DainipponpharmaceuticalCo.，Ltd.，Japan)，來源于猿腎的Vero細(xì)胞和成人肝細(xì)胞ChangLiver(ATCCCCL-13，DainipponPharmaceuticalCo.，Ltd.，Japan)]。用0.5ml牛痘病毒接種所培養(yǎng)的細(xì)胞，并于37℃靜置1至2小時(shí)，然后去除病毒液。之后于37℃下培養(yǎng)含有5(v/v)%胎牛血清和細(xì)胞的5mlEagle′sMEM培養(yǎng)基(日本Missui制藥有限公司生產(chǎn)和出售)24到48小時(shí)，直至出現(xiàn)滿意的細(xì)胞病變效應(yīng)。然后，收集病毒培養(yǎng)液或感染細(xì)胞，并將其懸浮于MEM中，以20KHZ(200W)超聲處理2分鐘，得到病毒液。參考實(shí)施例5(用噬斑方法檢測牛痘病毒的感染性)按常規(guī)步驟實(shí)施噬斑方法。具體地說，用參考實(shí)施例4中所得到的已經(jīng)用M-199(美國Sigma生產(chǎn)和出售)稀釋10倍的病毒液，以0.1ml/皿的量在6cm直徑佩特里培養(yǎng)皿中接種參考實(shí)施例4中所述的細(xì)胞培養(yǎng)物，并于37℃下靜置2小時(shí)，使病毒吸附到細(xì)胞上。然后，去除接種物液體，并以5ml/皿的量加入一種含有瓊脂的培養(yǎng)基(向M-199中加入3(v/v)%胎牛血清，0.14(w/v)%NaHCO3和0.8(w/v)%瓊脂制成)。瓊脂于室溫下凝固之后，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。然后，以2.5ml/皿的量鋪敷一種通過向上述瓊脂中加入大約0.006(w/v)%的中性紅(日本W(wǎng)akoPureChemicalIndustries，Ltd.，生產(chǎn)和出售)而制備的培養(yǎng)基，再于37℃下進(jìn)一步培養(yǎng)之。計(jì)數(shù)所得的噬斑數(shù)以確定其感染性。步驟2(制備重組牛痘病毒)在用于組織培養(yǎng)的直徑9cm佩特里培養(yǎng)皿(美國.Falcon生產(chǎn)和出售)中培養(yǎng)Vero細(xì)胞24小時(shí)。用牛痘病毒W(wǎng)R株(ATCCVR-119)以0.05MOI值(感染多重性)接種培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，并于37℃下靜置2小時(shí)以使病毒吸附到細(xì)胞上。經(jīng)過這段時(shí)間之后，除去病毒液并用MEM洗細(xì)胞兩次。然后，以磷酸鈣方法(Graham，F(xiàn).L.，VanderEb，A.J.Virolgy，52，456-467，1973)對實(shí)施例3步驟1中所得到的1μg和5μg質(zhì)粒DNAs分別進(jìn)行DNA磷酸鈣沉淀，每種質(zhì)粒DNA得到1ml的DNA-磷酸鈣沉淀溶液。將如此得到的各1ml的DNA-磷酸鈣沉淀溶液加到上面得到的病毒感染之細(xì)胞中，并于室溫下靜置30分鐘。然后，加入15ml參考實(shí)施例4中所述的病毒培養(yǎng)基，并于37℃下將所得混合物保溫3.5小時(shí)。然后除去病毒培養(yǎng)基，并加入15ml的新鮮病毒培養(yǎng)基，于37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。之后將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，得到一種病毒懸浮液。以參考實(shí)施例5中的相同方法，用該病毒懸浮液接種在培養(yǎng)用6cm直徑佩特里培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的L-M(TK-)細(xì)胞。病毒被吸附到細(xì)胞上之后，以5ml/皿的量加入一種含有25μg/ml5-溴-2′-脫氧尿苷(BUdR，美國Sigma生產(chǎn)和出售)的瓊脂培養(yǎng)基，然后于37℃下培養(yǎng)8小時(shí)，之后，再以2.5ml/皿的量鋪敷一種含有25μg/mlBUdR和25μg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal，TakaraShuzoCo.，Ltd.，Japan)的瓊脂培養(yǎng)基，并于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)2天。與鋪敷的瓊脂培養(yǎng)基一起收集已經(jīng)出現(xiàn)的蘭色噬斑，并將其懸浮于0.5ml的M-199中，再以上述相同的方法將上清接種到L-M(TK-)細(xì)胞中，然后經(jīng)3次噬斑克隆過程純化該克隆。如此得到的牛痘病毒是用帶有NANBVcDNA的質(zhì)粒載體經(jīng)重組而轉(zhuǎn)化的重組體牛痘病毒，其具有β-半乳糖苷酶基因且缺乏胸苷激酶。結(jié)果如表8中所示。表8重組牛痘病毒的特征重組牛痘病毒克隆用于重組NANBV胸苷β-半乳糖酶的質(zhì)?；蚪M激酶活性(kb)活性vUV17pUV1XXOvUV27pUV1XXOVXE17pXD39O(6.4)XOVXE28pXE39O(6.4)XOvXX19pXX49O(9.0)XOvXX29pXX51O(9.0)XOvXX39pXX51O(9.0)XO注)O已觀察到X未觀察到步驟3(以熒光抗體方法檢測和確定由重組牛痘病毒產(chǎn)生的NANBV相關(guān)抗原)通過間接熒光抗體技術(shù)檢測和確定由重組牛痘病毒產(chǎn)生的抗原。在蓋玻璃上培養(yǎng)L-M(TK-)細(xì)胞，并用已經(jīng)稀釋10倍的重組牛痘病毒接種之，再以參考實(shí)施例4中所述的方法培養(yǎng)該細(xì)胞。培養(yǎng)48小時(shí)后，取出蓋玻璃，并用M/75磷酸鹽緩沖鹽水(M/75PBS)(PH7.4)洗三次，然后再用蒸餾水洗一次并進(jìn)行空氣干燥。然后，用丙酮于-20℃下將該細(xì)胞固定5分鐘。按傳統(tǒng)方法用核心抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白抗原NS-3和NS-5免疫BALD/C小鼠，并將從該被免疫BALD/C小鼠中分離的淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合得到雜交瘤，從該雜交瘤中得到可以用作第一抗體的抗NANBV小鼠單克隆抗體。使用將一種16聚體聚肽與牛血清白蛋白結(jié)合所產(chǎn)生的抗原來制備對衣殼蛋白有特異性的單克隆抗體，其中所說的16聚體聚肽包含由衣殼基因推斷的氨基酸順序(N末端方向的第1至第16位氨基酸)。按照常規(guī)方法進(jìn)行間接熒光抗體試驗(yàn)。也就是說，于37℃下使丙酮固定的感染細(xì)胞與第一抗體反應(yīng)1小時(shí)，并用M/75PBS洗三次。然后，使該細(xì)胞與FITC(熒光染料)標(biāo)記的抗人或小鼠IgG抗體(德國CappelCo.，Ltd.，生產(chǎn)和出售)于37℃下反應(yīng)小時(shí)，并用M/75PBS洗三次后用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果如表9所示。表9(1)用熒光抗體技術(shù)檢測由重組牛痘病毒感染之細(xì)胞所產(chǎn)生的NANBV相關(guān)抗原。重組牛痘健康人血清NANB肝炎病人血清病毒＃6＃8＃9收集的血清收集的血清急性慢性＃II-1＃PS-1vUV17-------vUV27-------vXE17---++++vXE18---++++vXX19---++++vXX29---++++vXX39---++++表9(2)(續(xù))重組牛痘病毒單克隆抗體抗-核心抗-EnV抗-NS3抗-NS5＃11＃755＃74-1＃8905vUV17----vUV27----vXE17+++-vXE28+++-vXX19++++vXX29++++vXX39++++缺乏可編碼NANBVNS5區(qū)之部分核苷酸順序的重組牛痘病毒克隆VXE17和VXE28，以及帶有編碼NANBV蛋白之完整ORF的克隆VXX19，VXX29和VXX39都與NANB肝類病人的血清發(fā)生反應(yīng)而不與任何健康人的血清發(fā)生反應(yīng)。如果使用小鼠單克隆抗體，所有克隆VXE7和VXE28以及克隆VXX19，VXX29和VXX39與抗核心抗原單克隆抗體，抗衣殼抗原單克隆抗體和抗NS3單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)。就抗NS5單克隆抗體來說，缺少NANBV之NS5區(qū)的VXE17和VXE28均不與之發(fā)生反應(yīng)，但是VXX19、VXX29和VXX39與之發(fā)生反應(yīng)。這一事實(shí)表明，使用重組牛痘病毒已經(jīng)較好地產(chǎn)生了所需要的表達(dá)產(chǎn)物，并且尤其說明，利用克隆VXX19、VXX29和VXX39，已經(jīng)表達(dá)了從位于NANBV蛋白N末端側(cè)之核心抗原到位于其C末端側(cè)之NS5蛋白的整個(gè)區(qū)域。步驟4(用蔗糖密度梯度離心法分析重組牛痘病毒感染之細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液)如參考實(shí)施例4中所述，將1.0ml(1.2×107PFU)重組牛痘病毒VXX39(1.2×107PFU/ml)接種到人肝細(xì)胞ChangLiver的細(xì)胞培養(yǎng)物中，使之在37℃下經(jīng)2小時(shí)吸附到細(xì)胞上，然后只用M-199于37℃下培養(yǎng)3天。將200ml培養(yǎng)物上清以3000xg離心5分鐘得到上清液，再以48000xg于40℃下離心該上清液14小時(shí)，得到沉淀物。將沉淀物懸浮于2ml的M/75PBS中，并以20KHZ(200W)超聲處理2分鐘，于40℃下以160，000xg對所得產(chǎn)物進(jìn)行蔗糖密度梯度離心15小時(shí)[其中蔗糖密度變化為20(V/v)%到60(w/v)%]，從而得到各部分。每一部分與一種含有終濃度為20(w/v)%甘油，100mM(PH6.8)Tris.HCL，2(w/v)%SDS，2(v/v)%2-巰基乙醇和0.02(w/v)%BPB的樣品緩沖液混合，并于100℃下加熱5分鐘，然后進(jìn)行0.1(w/v)%SDS-12.5聚丙烯酰胺凝膠電泳，以使蛋白質(zhì)彼此分離開。然后用轉(zhuǎn)印跡裝置(日本NipponEido有限公司生產(chǎn)和出售)將凝膠上經(jīng)電泳分離開的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Hybond-ECL膜(Amershan，England生產(chǎn)和出售)上。將Hybond-ECL膜浸泡于由10mMTris.HCL(PH7.2)、15mMNacl、0.05(w/v)%吐溫-20(T-TBS)和5(w/v)%脫脂牛奶組成的溶液中，于室溫下保溫1小時(shí)，以封閉該膜。然后，使已經(jīng)用含1%脫脂牛奶的T-TBS緩沖液稀釋500-倍的抗核心抗原單克隆抗體(克隆29)與Hybond-ECL膜在37℃下反應(yīng)1小時(shí)，并用新鮮的上述含有1%脫脂牛奶的T-TBS緩沖液充分沖洗該膜2次。然后，使該膜與生物素標(biāo)記的抗小鼠IgG(由德國Cappel有限公司生產(chǎn)和出售;已稀釋500倍)在室溫下反應(yīng)1小時(shí)。沖洗該Hybond-ECL膜2次，并用HRPO-標(biāo)記的鏈球菌抗生物素蛋白，Amersham，England生產(chǎn)和出售;已稀釋500倍)與該膜在室溫下反應(yīng)1小時(shí)，用T-TBS充分沖洗4次。利用ECLWestern印跡檢測系統(tǒng)(Amersham，England生產(chǎn)和出售)使該膜發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。用Saranwrap包裹該膜并與X線膠片接觸30秒，之后沖洗該膠片。結(jié)果在蔗糖濃度44至58(w/v)%處觀察到NANBV核心抗原和衣殼抗原活性(如圖7中所示)，這一事實(shí)表明已經(jīng)得到了NANB病毒顆粒。步驟5(在電子顯微鏡下觀察重組牛痘病毒感染的細(xì)胞)以參考實(shí)施4中所述的相同方法在人肝細(xì)胞上培養(yǎng)重組牛痘病毒克隆VXX39和VUX17(后者不具有NANBV基因組)2天。用橡膠淀帚收集感染的細(xì)胞。以常規(guī)方法將收集的細(xì)胞包埋在環(huán)氧樹脂(日本NissinEM有限公司生產(chǎn)和出售)中，并將其切成超薄切片樣品。用2%乙酸鈾和枸櫞酸鉛對樣品進(jìn)行鈾-鉛雙染色，并在電子顯微鏡下檢查之。如圖8所示。結(jié)果在用VXX39感染的細(xì)胞中觀察到了病毒顆粒，但是在用VUV17感染的細(xì)胞中沒有觀察到顆粒，并且胞質(zhì)中沒有NANBV基因組。這些結(jié)果與步驟4的結(jié)果一起說明VXX39已產(chǎn)生了NANBV顆粒。本申請中涉及的大腸桿菌BK102、BK106、BK112、BK146和BK147已于1991年6月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號依次為CCTCCNo.M91044、CCTCCNo.M91045、CCTCCNo.M91046、CCTCCNo.M91047和CCTCCNo.M91048。權(quán)利要求1.含有至少一個(gè)選自非甲非乙型肝炎病毒的核心抗原、基質(zhì)抗原和包膜抗原之抗原的分離的非A、非B型肝炎病毒顆粒。2.根據(jù)權(quán)利要求1的非A非B型肝炎病毒顆粒，其中所述的核心抗原、基質(zhì)抗原和包膜抗原分別由圖2(1)到圖2(16)中所示非A非B型肝炎病毒從第1至第9416位完整核苷酸順序中的第333到第677位核苷酸順序，第678到905位核苷酸順序和第906到1499位核苷酸順序編碼。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的非A非B型肝炎病毒顆粒，其具有與圖2(1)到圖2(16)中所示核苷酸順序的至少一部分相應(yīng)的核糖核酸。4.生產(chǎn)分離之非A非B型肝炎病毒顆粒的方法，其包括(a)提供至多10個(gè)不同的各含有至少1000核苷酸的cDNA克隆并從至少有1000核苷酸的非A非B型肝炎病毒基因組的RNA片段制備之，所述的至多10個(gè)不同的cDNA克隆分別包括復(fù)蓋在圖2(1)到圖2(16)所示的非A非B型肝炎病毒從第1到第9416位核苷酸完整區(qū)域中的至少從第333到第5177位核苷酸區(qū)域的克隆化cDNA片段;(b)為了分別有預(yù)定的核苷酸順序通過切割從所述cDNA中切取分別有預(yù)定之核苷酸順序的cDNA片段，以便當(dāng)預(yù)定的核苷酸順序被按順序安排時(shí)，所得的核苷酸順序至少有一段與第333到第5177位核苷酸順序區(qū)域相一致的區(qū)域。(c)按順序連接具有所說預(yù)定核苷酸序列之所說切取的cDNA片段，以構(gòu)建至少含有圖2(1)到圖2(16)所示的非甲非乙肝炎病毒從第1到第9416位全部核苷酸順序中的第333到第5177位核苷酸順序的第一脫氧核苷酸。(d)把選自所說的第一脫氧核糖核酸和按遺傳密碼的簡異性經(jīng)取代所說的第一脫氧核糖核酸中的至少一個(gè)核苷酸所得到的第二脫氧核糖核的至少一個(gè)脫氧核糖核酸導(dǎo)入到選自質(zhì)粒和動(dòng)物病毒基因的可復(fù)制的表達(dá)型載體中，當(dāng)所說的可復(fù)制表達(dá)型載體是質(zhì)粒時(shí)可得到含有所說質(zhì)粒和導(dǎo)入其中之至少一個(gè)脫氧核糖核酸導(dǎo)入其中的可復(fù)制重組DNA，或當(dāng)所說的可復(fù)制表達(dá)型載體是動(dòng)物病毒基因則得到含有所說之動(dòng)物病毒及所說至少一個(gè)脫氧核糖核酸導(dǎo)入其中的重組病毒。(e)當(dāng)用在步驟(d)中所說的可復(fù)制表達(dá)載體是質(zhì)粒時(shí)，用所說的重組DNA轉(zhuǎn)染原核或真核細(xì)胞，由此形成一個(gè)轉(zhuǎn)化體，然后從原核或真核細(xì)胞培養(yǎng)的親代細(xì)胞中篩選所說的轉(zhuǎn)化體。(f)培養(yǎng)步驟(2)中從原核或真核細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)化體，以產(chǎn)生一個(gè)非甲非乙肝炎病毒顆?；蛘吲囵B(yǎng)步驟(d)中從真核細(xì)胞得到的重組病毒以與動(dòng)物病毒一起產(chǎn)生非A非B型肝炎病毒顆粒，并且(g)分離所說的非A非B型肝炎病毒顆粒。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的第一脫氧核糖核酸含有第333到第5918位核苷酸的核苷酸順序。6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的第一脫氧核糖核酸含有第333到第6371位核苷酸的核苷酸順序。7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的第一脫氧核糖核酸含有第333到第9362位核苷酸的核苷酸順序。8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所說的第一脫氧核糖核酸含有第1到第9416位核苷酸的核苷酸順序。9.重組體，其含有一個(gè)選自質(zhì)粒和動(dòng)物病毒基因的可復(fù)制的表達(dá)型載體和一個(gè)脫氧核糖核酸，脫氧核糖核酸選自至少含有圖2(1)到圖2(16)所示非A非B肝炎病毒第1到第9416位核苷酸完整核苷酸順序中第333到第5177位核苷酸的第一脫氧核糖核酸順序和按遺傳密碼的簡異性取代所說的第一核苷酸順序中至少一個(gè)核苷酸所得到的第二核苷酸順序。10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組體，其中所述的第一核苷酸順序含有第333玻第5918位核苷酸的核苷酸順序。11.根據(jù)權(quán)利要求9的重組體，其中所述的第一核苷酸順序含有第333到第6371位核苷酸的核苷酸順序。12.根據(jù)權(quán)利要求9的重組體，其中所述的第一核苷酸順序含有第333到第9362位核苷酸的核苷酸順序。13.根據(jù)權(quán)利要求9的重組體，其中所述的第一核苷酸順序含有第333到第9416位核苷酸的核苷酸順序。14.通過抗原-抗體反應(yīng)檢測非A非B型肝炎的診斷試劑，其含有有效量的用于抗原-抗體反應(yīng)的根據(jù)權(quán)利要求1或2的非A非B型肝炎病毒顆粒。15.非A非B肝炎疫苗，其含有有效量的根據(jù)權(quán)利要求1或2的非A非B肝炎病毒顆粒，及至少一種藥物學(xué)上可接受的載體，稀釋劑或賦形劑。16.寄存在日本發(fā)酵研究所(FermentationResearchInstitute)，登記號為FERMBP-3384的攜帶非A非B型肝炎病毒基因組cDNA的大腸桿菌菌株BK102(CCTCCNo.M91044)。17.寄存在日本發(fā)酵研究所(FermentationResearchInstitute)，登記號為FERMBP-3385的攜帶非A非B型肝炎病毒基因組cDNA的大腸桿菌菌株BK106(CCTCCNo.M91045)。18.寄存在日本發(fā)酵研究所(FermentationResearchInstitute)，登記號為FERMBP-3386的攜帶非A非B型肝炎病毒基因組cDNA的大腸桿菌菌株BK112(CCTCCNo.M91046)。19.寄存在日本發(fā)酵研究所(FermentationResearchInstitute)，登記號為FERMBP-3387的攜帶非A非B型肝炎病毒基因組cDNA的大腸桿菌菌株BK146(CCTCCNo.M91047)。20.寄存在日本發(fā)酵研究所(FermentationResearchInstitute)，登記號為FERMBP-3388的攜帶非A非B型肝炎病毒基因組cDNA的大腸桿菌菌株BK147(CCTCCNo.M91048)。21.寄存在日本發(fā)酵研究所(FermentationRe-searchLmsitute)，登記號為FERMBP-3243的攜帶非A非B型肝炎病毒基因組cDNA的大腸桿菌菌株BK157。全文摘要本發(fā)明公開了一種分離的至少含有選自非A非B型肝炎病毒之核心抗原、基質(zhì)抗原和包膜抗原中之一個(gè)抗原的非A非B型肝炎病毒顆粒及以基因工程技術(shù)有效地生產(chǎn)該病毒顆粒的方法。非A非B肝炎病毒顆粒不僅可有效地用于生產(chǎn)顯示極高免疫原性的NANBV肝炎疫苗和具有極高抗體檢測率和檢測精確度的診斷試劑，而且也用于肝臟疾病如肝癌的研究。文檔編號A61K39/00GK1059758SQ9110529公開日1992年3月25日申請日期1991年6月25日優(yōu)先權(quán)日1990年6月25日發(fā)明者岡山博人,福家功,森千里,高風(fēng)澤昭久,吉田巖申請人:財(cái)團(tuán)法人阪大微生物病研究會(huì)