專利名稱：：改進的佐劑和疫苗的制作方法
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：本發(fā)明涉及疫苗佐劑和用佐劑改進疫苗?？梢栽O計一定佐劑使免疫應答主要為所需同型的抗體，例如鼠的IgG2或IgG3同型或者人和其他動物的相應同型抗體，因此改進了疫苗的保護作用。另外，本發(fā)明改進的疫苗和佐劑提供了長期持久的保護作用。術語“抗原”是指任何可用作免疫應答目標的物質。免疫應答可以是細胞的，也可以是體液的。術語“疫苗”在本文中是指抗原部分的懸浮液或溶液，通常它含有感染劑或感染劑的某些部分，將其注射進體內產生自動免疫。制備疫苗的抗原部分可以是微生物，也可以是從微生物提純的天然產物、合成產物或者遺傳工程蛋白質、肽、多糖或者類似的產物。術語“細胞介導的免疫”是指免疫應答是由細胞而不是抗體介導的。它包括(但不限于)遲發(fā)型超敏反應和細胞毒性T細胞。本文所用術語“佐劑”是指與所注射的免疫原混合能夠增加或者修飾免疫應答的任何物質?！鞍肟乖痹诒疚闹惺侵概c合適的抗體或T細胞選擇性反應的物質，但是半抗原本身通常不是致免疫的。大多數(shù)半抗原是小分子或者大分子的小部分，但是一些大分子也可以具有半抗原的功能。本文所用術語“共軛作用”是指以共價或者其他形式連接兩個或多個分子。它可以通過化學方法或者通過體內生物學方法例如遺傳工程來實現(xiàn)。術語“同型”是指任何抗體的亞型。術語“脂多糖”(LPS)是從革蘭陰性細菌的外膜獲得的兩親糖磷脂，它具有被稱作類脂A的疏水部分和糖部分(多糖或者寡糖)。術語“無毒的LPS”是指具有很低毒性的LPS，該毒性是以根據(jù)對動物50%致死劑量(LD50)、50%雞胚致死劑量(CELD50)、兔子的致熱性或者皮膚的施瓦茨曼反應進行一項或多項測量來確定的，也可以通過體外測量由巨噬細胞誘導的組織壞死因子和/或IL-1，來測定LPS毒性。術語“去毒LPS”是指通過將類脂A部分的結構化學改性，從而降低了毒性的LPS，化學改性即除去一個磷酸根基團，除去一至三個脂肪酰基，引入新的官能團(例如甲基、乙酰基和醇等)，或者部分還原或氧化。有效的疫苗對于正確的一種抗原或多種必需引起合適的應答。有幾種獨特的免疫應答類型，它們具有不同的保護能力，以抵抗特殊的疾病。例如，抗體具有抗細菌感染的保護作用，但是對于排除身體很多病毒感染和腫瘤來說則需要細胞介導的免疫。有多種獨特的抗體與細胞介導免疫應答類型。細胞間介的應答分為兩個基本組1)遲發(fā)型超敏性反應，其中T細胞通過巨噬細胞和其他細胞或者細胞產物間接發(fā)揮作用，和2)細胞毒性反應，其中特化T細胞專門和直接進攻感染的細胞，并殺死感染的細胞。有五類主要的抗體IgM、IgG、IgE、IgA和IgD。這幾類抗體具有獨特的免疫應答功能。IgG，在血液中占優(yōu)勢的一類抗體，細分為幾個不同的亞類或者同型。在鼠中，這些同型是IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。在人體中，這些同型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。1在已經研究的很多其他哺乳動物種中已經定義了相似的同型。在不同種中，IgG同型的命名不同，因為這些名稱是在抗原同型的結構和功能被認識到之前就給定的。盡管許多IgG同型還需進一步了解，但是已表明IgG同型在哺乳動物種中是高度地守恒。IgG同型具有不同的抗特殊感染的保護能力。鼠的IgG2a和IgG2b能激活補體、介導抗體介導的和細胞介導的細胞毒性及其他功能。它們對于抵抗很多細菌、病毒和寄生蟲感染尤其具有有效的保護作用。人的相似同型以IgG1和IgG3表示。與此形成對照，鼠IgG3對于抵抗具有多糖膜的細菌例如肺炎球菌尤其具有有效的保護作用。人的相似同型似乎是IgG4。象鼠IgG1這樣的同型不結合補體、不能有效地中和毒素，而它們對于很多細菌和病毒感染的作用明顯很低。由于不同的IgG同型明顯地具有不同的免疫能力，因此對于特定的感染用疫苗誘導最適合同型是重要的。雖然命名不同，但是有效證據(jù)和現(xiàn)代理論表明，在哺乳動物各個種之間，那些決定所產生抗體同型的免疫原的性質是相似的。換句話說，在一個種內能刺激延發(fā)型超敏IgG和補體結合的IgG抗體的免疫原，在其他的種內一般也能刺激相似的應答。利用生物合成和重組DNA技術可以發(fā)展從前不可能生產的具有抗原表位的疫苗。目前候選的疫苗實際上包括所有感染劑、變應原以及宿主成分，例如激素和與自身免疫疾病、癌癥和其他疾病有關的分子。感染劑包括(但不限于)病毒、細菌、寄生蟲、立克次體和真菌。對作為疫苗、用于不同目的(例如避孕和治療疾病)激素進行評估。治療癌癥例如黑瘤的疫苗在動物和人體中進行評估。對于每個患例，疫苗的最適作用取決于刺激合適的類型、免疫應答的強度以及持續(xù)的時間。對寄生蟲病瘧疾所進行的研究尤為重要。為種疾病每年在全世界范圍內要侵襲2億多人，并且從發(fā)病率和工作損失來說，它在全世界都是最重要的疾病?，F(xiàn)在利用遺傳工程技術已經識別并且大量生產出了幾種與瘧疾寄生蟲有關的肽和蛋白質。特別是已經測定出子孢子期的一個12氨基酸肽運載了一個重要的抗原位點。在注射了抗該特定肽的抗體后可以立即殺死寄生蟲。遺憾的是，這種肽本身不能產生足夠的免疫應答。每種瘧疾有不同的肽，但是發(fā)現(xiàn)所有這些肽都具有特定的結構和重復單元。為了對子孢子肽產生有效的免疫應答，使肽與載體共軛，并且與佐劑一起施用。但是至今為止，與肽或者肽共軛物一起使用的佐劑還不能產生令人滿意的結果。在瘧疾寄生蟲的嗜血期已識別出同樣重要的抗原，但是市售的疫苗制劑還不能產生保護性免疫。人免疫缺陷病毒(HIV)引起了艾滋病(AIDS)。從HIV已經制備出了很多重組體和肽抗原。有證據(jù)表明抗這些抗原的抗體能夠使病毒失去作用，并且體免疫應答能夠防止和控制感染。但是通常能產生抗HIV保護性免疫應答的有效的疫苗仍然難以實現(xiàn)該目的。流感嗜血桿菌(Hemophilusinfluenza)和肺炎球菌(PneumococcalPneumonia)提供了進一步的例子。這些細菌的重要抗原是多糖，它在嬰兒和老年人中所引起的保護性免疫應答很弱，而這些人正是這些感染最危險的人群。除腫瘤和其它能通過免疫應答調節(jié)的疾病外，很多其它病毒、細菌和寄生蟲感染也存在同樣的狀況。現(xiàn)代科學提供了識別和產生很多由免疫應答影響的疾病抗原的方法，許多引起最佳保護作用的新抗原的不足顯著地表明需要增加一些方法，從而對疫苗所產生的免疫應答的類型、強度和持續(xù)時間產生影響。因此，增加了人們發(fā)展有效的無毒佐劑，以提高、以及或許更重要的是調節(jié)半抗原表位的致免疫力的優(yōu)點。另外，需要將佐劑與常規(guī)疫苗一起使用，以產生較早的、更有效的或者更長期的合適類型的應答。這種佐劑對于抗原供給有限或者造價昂貴的情況也是有益的。直到目前為止，佐劑的發(fā)展仍然是經驗性的。已經發(fā)現(xiàn)了大量可調節(jié)免疫應答的化合物。值得注意的是，這些化合物的本質和功能均不同，而實際上進行了多種嘗試以發(fā)現(xiàn)佐劑的一致作用機理。對這些機理的解釋已經落后于目前對免疫系統(tǒng)的了解方面的進展。佐劑的這種多樣性已經使對其分類產生了困難。有時將佐劑按照其來源分礦物、細菌、植物、合成的或者宿主產物。這種分類的第一組是礦物佐劑，例如鋁化合物。首先將鋁化合物作為佐劑使用記載于1926年。從那時起，用鋁鹽沉淀抗原或者將抗原與鋁化合物混合或者用鋁化合物吸附抗原就已被廣泛使用，以增強動物和人的免疫應答。鋁化合物及相似的佐劑呈現(xiàn)了下面的工作原理鋁和抗原物理結合成顆粒，經注射后，這些顆粒在組織中形成抗原的積存，抗原緩慢排泄，因此延長了抗原與呈現(xiàn)于抗原的細胞(例如巨噬細胞或囊狀樹突細胞)之間相互作用的時間。另外，免疫活性細胞被吸引至注射區(qū)域，并且被激活。已經證實在免疫接種第7天后，在兔的局部淋巴結中有鋁顆粒，并且它可能有另一個重要的功能，就是將抗原引入淋巴結所在區(qū)域中的T細胞中。已經表明，佐劑的效能與衰竭淋巴結的炎癥有關。很多研究證實了將抗原與鋁鹽一起施用導致體液免疫提高，同時細胞介導的免疫只有很小的提高，正如遲發(fā)型超敏測量的結果。氫氧化鋁作為激活補體的途徑也已經被描述。該機理可以對局部炎性應答以及免疫球蛋白產生和B細胞記憶起作用。主要因為其良好的安全記錄，鋁化合物至今是僅有的人用佐劑。但是它們并非不存在問題。含有鋁的疫苗有時引起局部反應。雖然變應原反應通常不表現(xiàn)出臨床問題，但是據(jù)說鋁鹽通過T細胞依賴機理將嗜酸性細胞吸引至注射區(qū)域，如果在抗原起動后注射會誘導IgE應答，并且產生具有促進IgE應答功能的載體特異性細胞群。此外，含鋁的疫苗不能凍干，必須冷卻運輸和貯存。因此具有污染危險。最后，也是最重要的，鋁化合物并非總是成功地引起持久的對疾病的保護作用。這是部分地因為它們不能誘導最適的抗體同型或者細胞介導的免疫的最佳類型。因此對于只需要抗體應答從而產生保護作用的強免疫原，鋁鹽是足夠的佐劑，而當其與弱免疫原(例如合成的瘧疾肽)一起使用或者用于引入細胞介導的免疫應答或需要對抗感染類型的IgG同型時，它們是無效的。另一個大組的佐劑是那些細菌源。最近已經純化并且合成了具有細菌源的佐劑(例如muramyl二肽，類脂A)并且已經克隆了宿主介體(白細胞介素1和2)，它們提供了具有化學特性的研究用產物。近十年來，在化學純化三種細菌源活性成分的佐劑方面已取得了顯著的進展，這三種佐劑是百日咳桿菌(Borde-tellapertussis)、脂多糖和弗氏完全佐劑(FCA)。百日咳桿菌是重要的，因為它能夠通過在T淋巴細胞群上的作用調節(jié)細胞介導的免疫。對于脂多糖和弗氏完全佐劑，已經識別并且合成了佐劑活性部分，對此可以進行有關的結構-功能研究。已經發(fā)現(xiàn)，脂多糖及其各種衍生物，包括類脂A，與脂質體或其他脂質乳劑結合時，是高效的佐劑。還不能確定能否生產用于人類的具有顯著低毒性的衍生物。弗氏完全佐劑在多數(shù)實驗研究中是標準的。但是它產生嚴重的局部和全身性炎性反應，其嚴重程度足以使宿主殘缺或殺死宿主。它不能用于人類并且可能禁止用于動物。在很多時候，許多其他類型的物質也被用作佐劑。這些物質包括植物產物，例如皂素、動物產物，例如幾丁質和許多合成的化學試劑。還沒有證實這些類型中的佐劑源對于預言其生物學性質特別有用。佐劑還根據(jù)其建議的作用機理進行分類。這種類型的分類帶有一點任意性，因為多數(shù)佐劑通過一種以上機理表現(xiàn)其功能。佐劑可以通過抗原定位或傳送發(fā)生作用，或者直接作用于細胞，例如巨噬細胞和淋巴細胞修補免疫系統(tǒng)，佐劑提高免疫應答的另一種機理是通過產生抗原積存。鋁化合物、油乳膠、脂質體和合成聚合物的佐劑活性屬這種類型。已表明，脂多糖和muramyl二肽的佐劑活性主要是通過巨噬細胞活化介導的，而百日咳桿菌對巨噬細胞和淋巴細胞都有影響，新近的和推測的免疫強化方法，例如利用單因子(monokines)和淋巴因子，以及抗原、載體和佐劑的手法，以加強免疫應答，是當前流行的方法。小免疫原例如合成的瘧疾肽，可以連接到較大的蛋白質或者其他載體上，以增強免疫應答。與致免疫力有關的抗原的分子大小與復雜性之間的關系反映出了分子上抗原決定簇的有效性。這種關系是Landsteiner在證明需要將小基團與較大(載體)分子配合以刺激免疫應答時首先注意到的。但是這種機理的基礎還有待實驗，以證明載體的作用和最少需要一分子上有兩種抗原決定簇以表達致免疫力。這些決定簇分別代表了與T和B淋巴細胞相互作用的載體和半抗原決定簇。但是，在T依賴性體液應答中載體部分的影響超出了通過T細胞活化所產生的簡單抗原性。在抗原分子上決定簇的結合可以通過各種類型的輔助基因T細胞和抑制基團T細脆的不同活化作用影響免疫應答。演示這種作用的模型系統(tǒng)是應答者(C57B1/6)和非應答者(DBA/1)鼠對合成三元共聚物1-谷氨酸60-L-丙氨酸30-L-酪氨酸(GAT)的遺傳控制體液應答，當C57B1/6鼠對該多肽有應答時，而僅僅假如GAT與甲基化牛血清白蛋白(MBSA)偶合，那么DBA/1鼠才有應答。但是，如果在用GAT-MSBA免疫之前給鼠注射GAT，則不能產生可測量出的對GAT的抗體應答。對這些現(xiàn)象的解釋是GAT刺激了應答鼠中的輔助基因T細胞，但是優(yōu)先激活了非應答鼠中的抑制基團T細胞。這種抑制基團的優(yōu)勢阻止了對GAT、甚至與MBSA偶合的GAT的應答。但是，如果主要是用GAT-MBSA免疫，那么通過載體部分活化輔助因子T細胞有助于壓倒任何GAT活化抑制因子細胞的作用。已證實聯(lián)合陰性蛋白分子的決定簇也表現(xiàn)出具有不同的輔助和抑制作用。致免疫載體對抗原的共軛作用能夠改變對該抗原的應答產生的抗體的同型。從很多膠囊包著的細菌中純化的多糖是非胸腺依賴性的抗原，這歸因于它們具有多種重復抗原決定簇的高聚物性質。當它們代表這些細菌的保護性抗原時，所產生的IgM抗體對于預防疾病只有有限的效力。這主要歸因于，處于高度感染危險的非常年幼和年老的個體中，它們不能刺激免疫記憶或者足夠的免疫應答。因此，已將腦膜炎奈瑟菌(Neis-seriameningitidis)和b型流感嗜血桿菌的多糖與蛋白質，例如破傷風類毒素共軛。這些共軛制劑起到胸腺依賴性抗原的作用，并且引起IgG對多糖部分的應答以及免疫記憶。它們也在年幼和年老的個體中引起應答。同樣地，非胸腺依賴性多糖載體對于提高肽(例如那些包括需要胸腺依賴性IgG免疫應答的瘧疾肽)的致免疫力具有很小的效力。Feldmann和Lee以及其他作者的出版物說明了沙門菌屬(Salmonella)生物體的鞭毛抗原是典型的非胸腺依賴性抗原，它刺激強的IgM抗體應答。2，3它們只刺激晚成熟的B細胞，而B細胞在嬰兒中是不存在的。這些免疫原還趨于在嬰兒中產生耐藥力，而在成年人中不容易產生記憶或者由胸腺依賴性抗原引起的其他方面的復雜免疫應答。這些公開的資料使人們確信，它們作為瘧疾肽或者其他需要胸腺依賴性IgG抗體應答的小抗原的佐劑或者載體沒有什么效力。或許沒有精確的區(qū)分點，以區(qū)別佐劑和載體。載體部分是有助于抗原的性質的，這被稱作固有的輔佐性。某些材料將耐受原轉化為免疫原的能力被稱作外源輔佐性。通過增加抗原的大小可以提高輔佐性，通過蛋白質的凝聚反應或者吸附在致免疫的或惰性載體上可增加抗原的大小。于是，能吸附抗原并增強免疫應答的材料，例如氫氧化鋁、乳膠顆粒、膨潤土或脂質體，被稱作佐劑。但是，所觀察到的這種抗原凝聚反應的作用只代表有限的佐劑作用，而目前這種作用認為是極復雜的。在不使用佐劑的情況下，小肽和其他半抗原不能引起強的免疫應答。目前能得到的很多佐劑是有毒性的和/或不能引起免疫應答，以有效地保護動物和人抗感染劑的感染。因此，需要一種疫苗，該疫苗能夠施用于動物或人，并且引起免疫系統(tǒng)增強持久的和有效力的、對合適抗原的正確類型的免疫應答。已表明，大量疏水性非離子嵌段共聚物表面活性劑是能適用于人的有效的致免疫佐劑。4，5，6它們具有粘結劑的作用，能夠以促進抗原出現(xiàn)的方式將蛋白抗原結合到油滴和/或細胞的表面上。以前的研究已經證明了這些共聚物能引起高滴度、持久的抗體應答。有趣的是，密切相關的共聚物卻有很弱的活性，不是佐劑，或者引起不合適的應答或引起耐藥性。這就造成了佐劑活性的預言復雜化和不精確性。有人可能預言，其主要活性是細胞刺激或免疫調節(jié)的佐劑，與粘性共聚物佐劑結合可能很好地發(fā)揮作用。已有報導，共聚物PLURONICRL121與MDP的蘇氨酰衍生物結合比起L121自身產生更好的應答，特別是細胞介導的免疫應答7。眾所周知，脂多糖作為B細胞分裂素對巨噬細胞具有顯著的作用。8很多年以來，其佐劑活性就是已知的，但是其應用受到毒性和效力不穩(wěn)定的限定。在幾篇論文和綜述中已經報導了脂多糖的生物學活性存在于脂多糖分子的類脂A部分中。9已經發(fā)展了幾種方法，以降低LPD制劑的毒性，同時保留其佐劑活性。這些方法包括除去類脂A上的磷酸基從而產生一磷酰基類脂A(MPL)，或者除去類脂A部分的一個或多個脂肪酸鏈。有些類型的LPS，特別是球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonassphaeroides)，有不同的類脂A并且本身是無毒的。抗體的同型對于抗很多感染是非常重要的，但是關于如何產生特定的同型應答卻知道的很少。已將IgG2a與作為抗各種病原體，包括克氏錐蟲、10，11T.musculi12和PLasmodiumYoelii(瘧病)以及布魯桿菌(bacteriumBrucella的保護性同型聯(lián)合。IgE抗體對于鼠寄生蟲是特別有毒的，許多寄生蟲包括蠕蟲、血吸蟲和幼線蟲天然主要刺激IgG1和IgE抗體。IgG1和IgE的產生表明是相互關聯(lián)的。每種適用于中和特定感染劑的同型都有功能優(yōu)點。IgG2a最容易與叵噬細胞結合，它能影響抗體依賴性細胞介導的細胞毒性和吞噬作用，并且能活化補體。鼠IgG3同型對于抗膠囊包裹的細菌(例如肺炎雙球菌(S.pneumoniae))感染的保護是特別有效的。最后，由肺炎雙球菌引起的疾病是最重要的嬰兒和兒童的細菌感染之一。含有23種肺炎球菌的膠囊多糖的多價疫苗目前已廣為使用。幾項研究表明，該疫苗在預防菌血病方面的效力是2-10歲兒童為0%，大于10歲的人為49%。沒有令人信服的證報表明該疫苗對慢性病有效，而且研究表明該疫苗對老年患者和長期患病的(institutionalized)患者沒有作用。膠囊多糖自身是非胸腺依賴性2型(TI-2)抗原，它們對于非常年幼和年老的人沒有致免疫作用。TI-2抗原只誘導有限量的同型，主要是IgM。它們只引起弱的記憶應答，或者不引起記憶應答，而且容易引起耐藥性。因此，在疫苗領域中需要一種組合物和施用疫苗的方法，以誘導最有效的和保護性抗體同型。該疫苗還應該能誘導長期持久的、高滴度的抗體。本發(fā)明包括疫苗佐劑，當該疫苗佐劑與抗原混合并施用于人或動物時，能引起比單獨施用抗原時更強的對抗原的免疫應答。在很多情況下，本發(fā)明所述佐劑將增加對疫苗抗原抗體特異性的總滴度。例如，當用常規(guī)的抗原實施本發(fā)明時，所誘導的同型從主要的IgG1同型轉變?yōu)楦弑Ｗo性的IgG2同型，而且在有些情況下，轉變?yōu)镮gG3同型或者其他種的相應同型。因此，通過實施本發(fā)明，人們能夠改進常規(guī)疫苗的總體保護作用。另外，本發(fā)明對于誘導抗肽抗原的保護性抗體特別有效。肽抗原包括(但不限于)(天冬酰胺-丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸)5-酪氨酸[(NAGG)5]瘧疾抗原。它對于很寬范圍的抗原和各種類型的抗原都是有效的，這些抗原包括多糖例如肺炎球菌多糖、寡糖、蛋白、肽和天然的或合成的半抗原，或者這些物質的結合物。本發(fā)明包括佐劑和由抗原與改進的佐劑組成的疫苗。在本發(fā)明一個具體例子中，將抗原與有效量的具有下列通式的表面活性共聚物混合其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4500-9000，而親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%。本發(fā)明改進的疫苗還包括抗原和佐劑，其中佐劑包括具有下列通式的表面活性共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，而親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%，該共聚物配制成油包水型乳劑。該共聚物對常用的油包水型疫苗乳劑不穩(wěn)定，但是如果去掉通常的乳化劑，則意外地增加了其效力和穩(wěn)定性。含有無毒脂多糖的佐劑也將作為本發(fā)明的一部分。無毒脂多糖可以是天然產生的脂多糖，例如從球形紅極毛桿菌得到的脂多糖，或者去毒的脂多糖。期望從有毒的脂多糖制備佐劑，其中分子的糖部分不動，分子的脂A部分被改性，從而使脂多糖具有非常低的毒性。本發(fā)明的改進疫苗還包括抗原和佐劑，其中佐劑含有具有下列通式的表面活性共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%，還含有脂多糖(LPS)衍生物。含有LPS和表面活性共聚物的結合物的佐劑在滴度峰值、達到峰值的時間和應答時間長度方面產生了協(xié)同作用。此外，這種結合導致增加了保護性IgG2同型。這種類脂共軛的多糖與共聚物和免疫調節(jié)劑例如一磷?；愔珹的結合引起強IgG3應答的產生，該應答中存在所有的IgG亞類。特別是，具有抗肺炎球菌感染保護性的IgG2和IgG3占優(yōu)勢。這是意外的發(fā)現(xiàn)，因為在免疫原制劑中不含蛋白質或者肽。人們相信，對于刺激產生這些同型需要的T細胞來說，肽部分是必需的。其他人曾經報導，多糖不能刺激T細胞。然而，共聚物、類脂共軛的多糖和免疫調節(jié)劑的結合能產生這種應答。本發(fā)明還包括一種疫苗，該疫苗對于抗蛋白質、小肽、多糖或半抗原使動物或人免疫特別有用。按照本發(fā)明，將蛋白質、小肽、多糖或半抗原與從微生物得到的鞭毛共軛。鞭毛可以從任何具有鞭毛的微生物得到;但是優(yōu)選從沙門菌種(Salmonellaspecies)得到的。此外，可以通過遺傳工程得到鞭毛。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種疫苗，該疫苗對于小致免疫決定簇提供延長的和強力的免疫應答特別有效。當共軛的鞭毛加上抗原與具有下列通式的共聚物和脂多糖(LPS)衍生物混合時更為有效其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%。含有LPS和表面活性共聚物的結合物的該佐劑在滴度峰值和達到峰值的時間方面產生協(xié)同作用。此外，該結合導致保護性IgG2同型增加。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種與抗原一起施用的改進的佐劑，該佐劑能對該抗原引起更強的免疫應答。本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗，該疫苗在嬰兒和少兒以及對常規(guī)疫苗產生不良應答的成年人中引起較強的對抗原的抗體應答。本發(fā)明的另一個目的是提供一種能誘導所需抗體同型的佐劑。本發(fā)明的另一個目的是提供一種佐劑和疫苗，它們能在對常規(guī)疫苗產生不良應答的非常年幼和年老個體中引起保護性免疫應答。本發(fā)明的另一個目的是提供一種佐劑和疫苗，它們能夠引起適當平衡的抗體和細胞介導的免疫，從而提供抗特定疾病的最大保護作用。本發(fā)明另一個目的是提供一種能誘導較長期持久的抗體群的佐劑。本發(fā)明的另一個目的是提供一種有效的疫苗，該設苗能夠使用重組蛋白或合成肽，以產生持久的能保護個體不被瘧寄生蟲感染的免疫應答。本發(fā)明的另一個目的是提供一種有效的疫苗，該疫苗能夠使用艾滋(AIDS)病毒的合成肽，以產生有效予防該疾病的免疫應答。本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗，該疫苗能夠刺激動物或人的免疫系統(tǒng)，從而對小的致免疫決定簇(例如肽、半抗原或多糖)或者大分子(例如蛋白質或多糖)產生有效的和延長的IgG應答。本發(fā)明的另一個目的是提供一種對人或動物具有很低毒性的疫苗。本發(fā)明的另一個目的是提供一種疫苗，該疫苗很少或者不引起局部過敏反應。本發(fā)明的再一個目的是提供一種能凍干的疫苗。本發(fā)明的另一個目的是提供一種弗氏完全佐劑的替代物，以在動物體中產生抗體。本發(fā)明的再一個目的是提供能誘導所需抗體同型的佐劑。本發(fā)明的另一個目的是提供一種可與常規(guī)疫苗制劑一起使用的佐劑。在回顧了下面所公開的具體例子和附加的權利要求的詳細說明之后，本發(fā)明的這些和其他目的、特征與優(yōu)點將變得顯而易見。圖1是說明在用與沙門菌屬的鞭毛蛋白共軛的三硝基苯酚(TNP)免疫的鼠中抗體滴度的圖解。圖2是說明用與沙門菌屬的鞭毛蛋白共軛的TNP免疫的鼠的劑量應答的圖解。圖3是比較用與雞卵白蛋白(HEA)共軛的TNP免疫的和用與沙門菌屬的鞭毛蛋白共軛的TNP免疫的鼠的免疫應答的圖解。該圖還比較了使用和不使用佐劑T150R1的兩種化合物的應用。圖4是說明在使用TNP10-HEA和各種佐劑免疫的應答中，于鼠中產生IgG抗體應答的圖解。圖5是說明具有凍干TNP10-HEA抗原的在2%角鯊烷的水包油型乳劑中的共聚物的佐劑作用的圖解。圖6是說明含有和不含有所選擇共聚物的二氧化硅的油乳膠佐劑作用的圖解。圖7是與可溶性抗原，TNP10HEA一起施用的共聚物佐劑進行比較的圖解。圖8表示POP的分子量對于對TNP10HEA的抗體滴度的影響。圖9表示類脂A衍生物包括類脂X、類脂IVA、一磷?；愔珹和(hexacylMPL)的化學結構。圖10表示腸桿菌科(SR至Re)的大致化學類型脂多糖的結構?？s寫S，糖;Glc，葡萄糖;GlcNAc，N-乙?；咸烟前?Gal，半乳糖;Hep，L-甘油基-D-甘露庚糖;P，磷酸根;EtN，乙醇胺;KDO，2-酮-3-脫氧辛酸鹽;GlcN，葡萄糖胺;R和R2，磷酸乙醇胺或氨基阿拉伯糖(不在大腸桿菌(E.coli中)。SR至Re表示LPS的不完全形式或大致的化學類型。Rc和Rd1化學類型在Hep上不連接磷酸根。圖11表示球形紅假單胞菌LPS的結構。圖12表示去毒RaLPS的結構。圖13表示給鼠施用含有和不含有去毒RaLPS和/或L141共聚物的TNP-HEA第28天時的IgG應答。圖14表示在共聚物存在和不存在下，對由整個有毒的脂多糖和去毒RaLPS引起的對TNP10HEA的同型應答。圖15表示由L141和/或TDM與MPL結合引起的TNP10HEA的IgG同型濃度。圖16表示小LPS衍生物對于TNP10HEA應答的佐劑作用。圖17表示限定鏈長度的較大LPS突變體與共聚體L141結合對TNP10HEA的佐劑作用。圖18表示含有不同量O-多糖的最大LPS的部分與共聚物L141結合對TNP141HEA的佐劑作用。圖19表示強度和IgG同型分布隨不同摩爾比率肽與鞭毛共軛的變化。圖20表示本發(fā)明的佐劑制劑與幾種市售佐劑制劑的比較。圖21表示去毒LPS對免疫應答的影響。圖22表示去毒LPS的劑量應答。圖23表示LPS加L141對免疫應答的影響。圖24表示從膠質紅假單胞菌(R.gelatinosa)分離出的LPS與L141結合對免疫應答的影響。本發(fā)明包括一種改進的佐劑。本發(fā)明的一個具體例子是，將抗原與有效量的佐劑混合，該佐劑含有具有下列通式的表面活性共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4500-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%。該共聚物可以從BASF公司(Parsippany，NewJersey)或從CytRx公司(Atlanta，GA)得到。優(yōu)選的表面活性共聚物是被稱為PLURONICL141的具有下式的共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4600，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。另一種優(yōu)選的表面活性共聚物是被稱為PLURONICL180.5的具有下式的共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為5200，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為5%。另一種優(yōu)選的表面活性共聚物是被稱為PLURONICL181.5的具有下式的共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為5200，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為15%。另一種優(yōu)選的表面活性共聚物是被稱為PLURONICL190.5的具有下列通式的共聚物其中疏水基(C3H4O)的分子量約為8600，親水物(C2H4O)的重量百分數(shù)約為5%。一種佐劑制劑(該制劑將作為本發(fā)明的一部分)，含油(例如動物油如角鯊烷或角鯊烯、植物油或礦物油)、適于形成油包水乳劑的非離子表面活性劑(例如Span80(一油酸脫水山梨醇酯))、二氧化硅和具有下列通式的表面活性共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%。另外，該表面活性共聚物可以是具有下列通式的八嵌段共聚物其中由(C3H6O)組成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量約為5000-7000道爾頓;a是一個數(shù)，它使得由(C2H4O)所代表的親水部分占該化合物總分子量的約10%-40%;b是一個數(shù)，它使得八嵌段共聚物的(C3H6O)部分占該化合物和脂多糖衍生物的約60%-95%。這些組分優(yōu)選的量是，角鯊烯約為40%-90%(重量)，脫水一油酸山梨醇酯約為2%-50%(重量)，二氧化硅約為0.5%-10%(重量)，表面活性共聚物約為2%-10%(重量)，優(yōu)選表面活性共聚物是PLURONICL141。優(yōu)選的二氧化硅的粒度是直徑約為0.5-20μ。作為本發(fā)明一部分的另一種佐劑是無毒性脂多糖和去毒的毒性脂多糖。這些脂多糖，它們或者是本身無毒性的脂多糖，或者是被化學改性降低了毒性的有毒脂多糖。這包括輕度堿水解的脂肪酸。天然產生的無毒脂多糖包括(但不限于)那些與紅假單胞菌種(Rhodopseudomonas)、包括球形紅假單胞菌(R.spharoides)、嗜酸紅假單胞菌(R.acidophilia)、胚素紅假單胞菌(R.blastica)、膠質紅假單胞菌(R.gelatinosa)、莢膜紅假單胞菌(R.capsulata)、池沼紅假單胞菌(R.palustris)和綠霉紅假單胞菌(R.Viridis)相聯(lián)系的脂多糖。有幾種可行的使毒性脂多糖去毒的方法。這些方法中的一些在實施例中給出。這些方法一般包括分子的類脂A部分化學改性。注意到這一點是重要的，即去毒脂多糖是有毒的脂多糖，其中分子的多糖部分是未變的，分子的類脂A部分通過除去脂肪酸被改性，因此使該脂多糖具有非常低的毒性。本發(fā)明改進的佐劑還含有與具有下列通式的表面活性共聚物結合的脂多糖衍生物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%，本發(fā)明還包括與具有下列通式和八嵌段共聚物結合的脂多糖衍生物其中由(C3H6O)組成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量約為4000-9000道爾頓，優(yōu)選5000-7000道爾頓;a是一個數(shù)，它使得由(C2H4O)所代表的親水部分占該化合物總分子量的約5%-40%;b是一個數(shù)，它使得八嵌段共聚物的(C3H6O)部分占該化合物約60-95%。該共聚物的(C3H6O)部分可以在該化合物中含高達95%之多。該共聚物的(C2H4O)部分可以在該化合物中含低至5%。含有LPS與表面活性共聚物結合的該佐劑，在滴度峰值和達到峰值的時間方面，產生協(xié)同作用。在一些情況下，特別是使用低分子量脂多糖時，初始滴度較高，然后隨時間緩緩降低。使用高分子量脂多糖時，初始滴度較高，而且一直保持高水平的應答。使用所有這些脂多糖時，它們的結合將增加保護性IgG2a和IgG2b同型。這是出人意料的，因為已有報導，LPS本身作為佐劑主要引起IgG1免疫應答。這種改進的佐劑還含有具有下列通式的表面活性共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%;以及含具有下列通式的反八嵌段共聚物其中由(C3H6O)組成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量約為5000-7000道爾頓;a是一個數(shù)，即它使得由(C2H4O)代表的親水部分構成該化合物總分子量的約10%-40%;b是一個數(shù)，即它使得八嵌段共聚物的(C3H6O)部分構成該化合物的約60%-90%。該共聚物的(C3H6O)部分可以在該化合物中占高達95%。該共聚物的(C2H4O)部分可以在該化合物中占低至5%。a是一個數(shù)，即它使得由聚氧乙烯(C2H4O)代表的親水部分構成該化合物總分子量的約5%-40%;由聚氧丙烯(C3H6O)組成的八嵌段共聚物的疏水部分的平均聚集分子量約為4000-8000道爾頓;b是一個數(shù)，即它使得八嵌段共聚物的總分子量中的聚氧丙烯(C3H6O)部分占約60%-90%。該共聚物的(C3H6O)部分可以在該化合物中占高達95%。該共聚物的(C2H4O)部分可以在該化合物中占低至5%。改進的佐劑還含有具有下列通式的表面活性共聚物。其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000;親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%;以及含具有下列通式的八嵌段共聚物由(C3H6O)組成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量約為5000-7000;a是一個數(shù)，即它使得由(C2H4O)代表的親水部分構成該化合物總分子量的約10%-40%;b是一個數(shù)，即它使得八嵌段共聚物的(C3H6O)部分構成該化合物的約60%-90%。該共聚物的(C3H6O)部分在該化合物中可占高達95%。該共聚物的(C2H4O)部分在該化合物中可占低至5%。本發(fā)明還包括含有抗原和上述佐劑的疫苗。本發(fā)明還包括一種疫苗，該疫苗對于抗多糖、蛋白質、小肽和其他半抗原，使動物或人免疫特別有用。根據(jù)本發(fā)明，將小肽或半抗原與從微生物得到的鞭毛共軛。鞭毛可以從任何具有鞭毛的微生物得到;但是，優(yōu)選從沙門菌種得到的。應該理解，對于任何特殊的應用，那些優(yōu)選的獲得鞭毛的細菌種類取決于該應用需要的特定抗原，而這對于本發(fā)明不是關鍵的。有些細菌具有單一的鞭毛，而另一些具有一叢鞭毛，還有一些具有分布于整個細胞表面的鞭毛。細菌鞭毛的直徑為10-35nm，有時長度可以超過10-15μm，或者是細胞直徑的很多倍。多數(shù)細菌鞭毛呈現(xiàn)有規(guī)律的和均勻的卷曲，其波長約為2.5μm。當細菌鞭毛(實際上是蛋白質)被酸化至PH＝3時，它們分解成為完全相同的被稱為鞭毛蛋白的單節(jié)顯性亞單位，在大多數(shù)種類中，其分子量約為40000，在合適的PH和鹽濃度條件下，鞭毛蛋白單體將自發(fā)地再聚合，形成與完整的鞭毛完全相同的結構，該鞭毛具有與天然鞭毛同樣波長的有規(guī)律的卷曲。天然形式的或者用許多固定劑固定的完整細菌鞭毛可用于實施本發(fā)明。另外，再聚合的鞭毛蛋白在實施本發(fā)明中是令人滿意的。可以確信，本發(fā)明的基本組成部分是由聚合物組成的制劑，其中聚合物由規(guī)則地按幾何學模型分隔的鞭毛蛋白分子組成，從而產生拉長的特定微生物的典型鞭毛結構。已經發(fā)展了很多從細菌培養(yǎng)物制備鞭毛的方法，這些方法對于那些本領域的普通專業(yè)人員來說是眾所周知的。優(yōu)選的方法是如本文所述的改進的Kobayashi等人的方法。13將菌株TY2的傷寒桿菌(Salmonellatyphi)生物體在能動性瓊脂中生長。應該選擇高能動生物體，因為它們產生最多的鞭毛。然后將生物體接種于20升類胰蛋白酶(trypticase)大豆肉湯中，并在37℃培養(yǎng)約30小時，直到對數(shù)相生長終止。此時可以通過加入甲醛殺死生物體，從而產生0.3%懸浮液。優(yōu)選通過離心收集生物體;但是應該小心以避免產生過多的切應力。然后在振動器上劇烈振搖20分鐘，從生物體上除去鞭毛。其他能產生切應力以切下鞭毛而不破壞生物體的混合方法與裝置同樣是令人滿意的。然后通過差速離心將鞭毛從細胞體上分離。在標準實驗離心機上，以大約2000rpm的轉速離心，除去細胞體。然后以30，000rpm的轉速超速離心收集鞭毛。然后將鞭毛再懸浮并在超速離心機上再次離心，并將可溶性污染物質倒掉。大的污染物質將在透明鞭毛小球的底部形成黑點。物理分離出這種物質并將其去除。從20升細菌培養(yǎng)物中得到的最終產物將是約100mg純化的鞭毛。在大約pH2將未固定的鞭毛酸化過夜，可以制得鞭毛蛋白。這種處理將鞭毛蛋白分解，產生分子量約為30，000的鞭毛蛋白單體。當這種單體在中性pH條件下靜置至少24小時后，這種單體重新聚集成聚合的鞭毛。這種再聚合的鞭毛蛋白作為佐劑和載體對小抗原部分的作用接近于天然鞭毛。單節(jié)顯性鞭毛蛋白或者鞭毛蛋白的蛋白水解裂片效果非常低?？梢酝ㄟ^本領域普通專業(yè)人員所熟知的任何一種標準方法，將抗原即蛋白質、多糖、半抗原或者肽部分與鞭毛化學共軛。最簡單和最有效的方法之一是通過使用戊二醛。戊二醛是二價交聯(lián)化合物，它將肽共價連接于鞭毛上，并且進一步固定鞭毛制劑。其他化學交聯(lián)試劑或化學抗原衍生物例如二硝基氟苯都是有效的。這些抗原、半抗原或肽部分的共軛方法是本領域普通專業(yè)人員所熟知的。連接于鞭毛上的抗原的量隨具體應用而變化，并且這不是本發(fā)明的關鍵組成。優(yōu)選的是，在鞭毛制劑中每個鞭毛蛋白單體有2-10個肽或半抗原單位就足夠了。對于較大的蛋白質或者多糖抗原需要較少的倍數(shù)。通過透析、離心或者任何其他的標準方法，純化共軛的鞭毛制劑。然后將該物質再懸浮于鹽水中，濃度約為100μg/ml。該制劑在每支注射液1-100μg的低劑量則有效。在很多情況下，10μg的劑量產生令人滿意的應答?？梢酝ㄟ^任何常規(guī)的途徑注射該物質，例如靜脈內注射、皮下注射、肌內注射或者腹膜內注射。對于很多為疫苗使用目的，通常皮下或肌內途徑是最常規(guī)的。例如，與二硝基苯酚共軛的20μg的傷寒桿菌鞭毛注射液可導致對半抗原DNP的IgG抗體滴度特異性，IgG抗體滴度在注射后第一周末升高，并且能持續(xù)一年。鞭毛和與鞭毛共軛的抗原部分的免疫應答的持久性是不同尋常的和出人意料的。這種物質不含在注射處形成局部抗原積存。在24小時內，大約90-95%注射劑量的鞭毛破碎并且排泌掉。該物質的一部分保留在局部淋巴結中胚中心較長時間?？梢源_信，在胚中心內這種抗原的存在引起了時間延長的抗體產生。本發(fā)明有很多超出市售佐劑制劑的優(yōu)點。它極少在注射部位產生感染，并且可以完全生物降解。這與油乳膠或礦物鹽例如鋁形成鮮明的對照。產生延長的免疫應答只需要很小劑量的抗原?？贵w的有效部分是補體固定的IgG，它是抗瘧疾、子孢子和其他重要感染的保護作用所需的類型。當用固定劑例如戊二醛制備時該產品特別穩(wěn)定。它可以被凍干以及在室溫下無限期地貯存。當用鹽水再組成時，將其放入冰箱可以穩(wěn)定幾周，在室溫下可以穩(wěn)定幾天。與那些能在易感宿主中引起感染的活的減毒疫苗不同，這種疫苗制劑僅由聚合的蛋白質與微量多糖組成。按照本發(fā)明制備的疫苗優(yōu)選的劑量是5μg至500μg。任何疫苗的最佳劑量將取決于與鞭毛蛋白共軛的抗原和被接種的動物或人的免疫學條件。本發(fā)明的疫苗還包括將該疫苗與佐劑一起施用，從而進一步提高免疫應答?？梢耘c本發(fā)明的疫苗一起使用的優(yōu)選的佐劑是嵌段共聚物，它含有建立于乙二胺引發(fā)劑上的親水聚氧乙烯聚合物。然后將疏水聚氧丙烯聚合物加在親水聚氧乙烯中嵌段。于是產生了具有下列通式的八嵌段共聚物其中由(C3H6O)組成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量約為5000-7000道爾頓;a是一個數(shù)，即它使得由(C2H4O)代表的親水部分構成該化合物總分子量的約10%-40%;b是一個數(shù)，即它使得八嵌段共聚物的(C3H6O)部分構成該化合物的約60%-90%。該共聚物的(C3H6O)部分可以高達該化合物的95%。該共聚物的(C2H4O)部分可以低至該化合物的5%。優(yōu)選的佐劑具有下式其中a約等于5，b約等于32。可以與本發(fā)明包括的疫苗一起使用的另一種共聚物具有下式結構HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bH其中疏水基(C3H6O)的分子量約為2000-5500，該化合物總的分子量約為2300-5500。優(yōu)選的佐劑具有下式其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4600，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。另一種優(yōu)選的佐劑具有下式其中疏水基(C3H6O)的分子量約為5200，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。在堿性催化劑存在下，升高溫度和壓力，將環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷縮合到四官能度的乙二胺引發(fā)劑上，形成聚合物嵌段。在每一共聚物中，結合形成高分子鏈的單體單元在數(shù)量上有一些統(tǒng)計學變化，在每次制備中所給出的分子量是共聚物分子的近似平均重量。在US專利2674619和2979528中可以找到制備這些嵌段共聚物的進一步描述，這兩篇專利引入本文作為參考14所公開的poloxamers和poloxamines的分子量通常是通過羥基法測定的。聚醚鏈的末端基團是羥基。從分解測定的“OH數(shù)目”可以計算數(shù)均分子量，以mgKOH/g樣品表示。應該理解，多分散化合物的分子量的絕對值根據(jù)測定分子量所用的方法可以不同。因此，知道用何種方法測定的共聚物的分子量是重要的。本文所用的所有共聚物的分子量是通過羥基法測定的。當用另一種方法例如高效液相色譜法測定分子量時，得到略微不同的數(shù)值。將本發(fā)明的疫苗與八嵌段共聚物混合，并且給人或動物施用。與本發(fā)明的疫苗一起施用的佐劑優(yōu)選的量是約0.1mg-5.0mg，最優(yōu)選的量是約0.5mg-2mg。本發(fā)明佐劑的另一種具體例子是類脂A的各種衍生物。Takyama，K等人和Raetz.C.R.H的論文中描述了不同種類脂A的結構，這兩篇文獻都引入本文作為參考。15，16磷?；愔珹比完全類脂A分子毒性更低，而對動物的毒性比完全類脂A更低。類脂IVA和類脂X是類脂A的生物合成前體。將作為本發(fā)明一部分的一些類脂A衍生物的結構表示在圖10-13中。新近的幾篇報導暗示了IgG2a抗體具有抗幾種病毒和細菌感染的保護作用。對IgG2b抗體的研究尚不完善;但是已有其具有保護性的報導。IgG1抗體亞類不固定補體，并且被認為在很多情況下具有相當?shù)偷谋Ｗo效力。所以，可以預期，LPS衍生物能夠將抗體應答轉向IgG2同型，特別是當與共聚物混合時，從而增加疫苗的效力?？捎糜诒景l(fā)明的抗原是那些引入哺乳動物中時將導致抗體形成的化合物。按照本發(fā)明可使用的典型的抗原包括(但不限于)天然的產物，重組體或者從病毒、細菌、真菌、寄生蟲以及除自身免疫疾病、激素或者可用于蛋白水解或治療疫苗的腫瘤抗原外，還有其他感染劑得到的合成產物，這些病毒或細菌產物可以是酶促裂解產生的生物體成分，或者可以是通過重組DNA技術產生的生物體成分，這是本領域普通專業(yè)人員所熟知的。下面是典型抗原的部分目錄病毒HIVRotavirus腳與口腔疾病流行性感冒類流行性感冒皰疹，單純性皰疹，EB病毒雞痘，假性狂犬病狂犬病脊髓灰質炎肝炎A肝炎B肝炎C麻疹瘟熱委內瑞拉馬腦脊髓炎Rota病毒貓白血病病毒呼吸道腸道病毒呼吸Sycytial病毒Lassa熱病毒多瘤腫瘤病毒犬細小病毒牛乳頭瘤病毒蜱產生的腦炎牛疫人鼻病毒腸道病毒，Mengo病毒副粘液病毒鳥感染的支氣管炎病毒細菌百日咳桿菌流產桿菌(Brucellaabortis)大腸桿菌(Escherichiacoli)沙門菌種，傷寒桿菌鏈球菌霍亂志賀菌假單胞菌結核麻風立克次體感染洛磯山斑疹熱Thyphus寄生蟲瘧疾(惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)，間日瘧原蟲(P.vivax)，三日瘧原蟲(P.malariae))血吸蟲錐蟲真菌新型隱球菌(Cryptococcusneoformans亞單位重組蛋白單純性皰疹EB病毒肝炎B假性狂犬病黃熱病毒，登山熱，黃熱病淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae)瘧疾子孢子周蛋白，裂殖子蛋白錐蟲表面抗原蛋白百日咳α病毒腺病毒蛋白質白喉類毒素破傷風類毒素腦膜炎雙球菌外膜蛋白(OMP)鏈球菌M蛋白肝炎B流感血凝素合成肽瘧疾流感腳與口腔疾病病毒肝炎B，肝炎C多糖肝炎球菌多糖流感嗜血桿菌多核糖基-核糖醇磷酸酯(PRP)腦膜炎雙球菌綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)肺炎桿菌(Klebsiellapneumoniae)寡糖肺炎球菌半抗原是那些當結合于致免疫載體并引入脊索動物中時將引起對半抗原具有特異性的抗體形成的化合物。典型的半抗原是類固醇例如雌激素和皮質醇、低分子量肽、其他低分子量生物化合物、藥物例如抗生素和化療化合物、工業(yè)污染物、調味劑、食物添加劑和食物污染物，和/或它們的代謝產物或者衍生物。除上述的本發(fā)明具體例子之外，二氧化硅懸浮液中加入某些共聚物提供了出人意料的該組合物佐劑活性的增加。二氧化硅是已知的佐劑，但是因其毒性使應用受到限制，特別是纖維變性。通過將二氧化硅結合至油狀賦形劑中可以降低這種毒性并且增加效力，該賦形劑可以含有或者不含有其他佐劑部分，例如表面活性共聚物或LPS。通過本發(fā)明降低了二氧化硅的劑量和毒性，同時提高了效力。優(yōu)選的是，油乳膠含有油和二氧化硅顆粒，乳液含有40%-99%的油。優(yōu)選的油是角鯊烷(Sigma化學公司，St.louis，MO)。除了油之外，可以任意地向油中加入去污劑或去污劑的混合物?？捎糜诒景l(fā)明的去污劑的例子是聚氧乙烯脫水山梨脫(Tween)和脫水山梨醇(Span)(Sigma化學公司，St.Louis，MO)。而共聚物例如PLURONICL121經常是優(yōu)選的。由于疫苗佐劑的某些成分易于氧化，所以要加入抗氧劑如防腐劑。油賦形劑角鯊烯特別容易氧化。嵌段共聚物也會受到影響。很多抗氧劑可以購買到，它們能夠被接受，以防止疫苗成分的氧化降解。已經發(fā)現(xiàn)，這些抗氧劑的例子，生育酚(維生素E)或生育酚衍生物，除了防止氧化之外，還能夠提高疫苗的活性。已經發(fā)現(xiàn)，當抗氧劑與嵌段共聚物或者二氧化硅乳劑結合使用時，除了作為抗氧劑之外，對于增加免疫應答和降低局部炎癥特別有效。因此，抗氧劑例如生育酚或生育酚衍生物與本文所述的佐劑和疫苗的混合物將作為本發(fā)明的一部分。下面的具體例子將說明本發(fā)明用于提高生物體對小的半抗原的免疫應答?？梢砸庾R到，對于本領域的普通專業(yè)人員來說其他的例子將是顯而易見的，并且本發(fā)明并非局限于這些具體的說明例子。實施例1使TY2菌侏的沙門氏傷寒菌生物體在能動性瓊脂中生長。然后使生物體在20升trypticase大豆肉湯中接種，并在37℃孵育30小時至生長log相結束。此時加入甲醛殺死生物體而得0.3%的懸浮液。離心分離收集生物體。注意避免產生過分的剪切力。在振蕩器中用力振蕩20分鐘，然后從生物體上移取鞭毛。能夠不破壞生物體而產生剪切力折斷鞭毛的其它混合設備及裝置均符合要求。通過差離心作用使鞭毛從細胞體上分離。用標準實驗室離心機在2000rpm轉速下離心移出細胞體。以30000rpm轉速超速離心收集鞭毛。超速離心后鞭毛再次懸浮，再用超速離心機離心，將可溶性污染物質傾析掉。大的污染物質在透明的鞭毛小球底部形成黑斑。這些污染物質用物理方法除去或扔棄。由20升細菌培養(yǎng)物中得到的最終產物是大約100mg的純鞭毛。實施例2在pH值大約2左右將鞭毛酸化12個小時得到鞭毛蛋白。這種處理是將鞭毛蛋白質離解成分子量大約為30000的鞭毛蛋白單體。這種單體在中性pH值放置至少24個小時后又變成聚合的鞭毛。實施例3戊二醛是一種二價交聯(lián)化合物，其肽與鞭毛共價相連并進而固定了鞭毛的制制。這些將功能基團共軛連接到蛋白質上的方法對本領域普通技術人員來說是熟知的。其它化學交聯(lián)試劑或抗原衍生物例如二硝基氟苯也是有效的。實施例4共軛鞭毛制劑是通過透析、離心或其它標準方法進行純化的，將此物質再次在大約100μg/ml的鹽水中懸浮。此制劑在每次注射1至100μg之間的低劑量范圍內就有效。在許多情況下使用10μg的劑量能產生滿意的應答。此制劑可通過任何常用途徑進行注射靜脈內注射、皮下注射、肌內注射或腹膜內注射。皮下和肌內通常是接種很多疫苗的最方便的途徑。實施例5Ra-LPS(Ra-detox)去毒作用按以下步驟完成從大腸桿菌EH-100(10.0mg)中獲得的Ra-LPS懸浮在5.0ml水中，聲處理15分鐘，在100℃孵育5分鐘。孵育后將樣品移開孵育箱，立刻向樣品中加入三十分之一體積的三乙胺并混合均勻。將此樣品在室溫(22℃)放置4天。然后將樣品凍干，用己烷萃取由此釋放出的游離脂肪酸。剩余物組成Ra-detox。在0.1MHCl17中水解的樣品的TLC分析表明MPL的形式已由六酰-五酰轉移為五酰-四酰。被認為類脂A的3位置上，單個的3-羥基肉豆蔻酸釋放出來，導至具有減少內毒素活性的占主導地位的五酰Ra-LPS的形成。18去毒的LPS可以從多種不同的其它LPS形式制備得到，包括(但不局限于)由S.minnesotaR60或S.typhimuriumTV119得到的Ra-LPS以及由S.typhimuriumSF1512得到的SR-LPS，并用作佐劑。實施例6用ELISA檢定法測定直接對抗三硝基苯酚半抗原的抗體。這是對最初由Sanuders公開的方法的改進。19檢定中使用一種蛋白蛋，牛血清白蛋白，水凝膠用以減少附著于塑性載體上的蛋白質的變性作用，并且蛋白質和表面活性劑的使用可減少能增加本底、減少靈敏性的蛋白質的非特殊吸附。用戊二醛將抗原連接到覆蓋96孔的微滴平板的BSA上。洗脫未結合的戊二醛。加到平板上的抗原通過戊二醛的游離醛基與平板共價相連。剩余醛基基團用賴氨酸阻隔，這樣平板就制好備用了。平板用不同稀釋度的抗血清孵育、洗滌，再用第二種抗體例如過氧化物酶共軛的山羊抗鼠IgG或其亞鋼中的一員進行孵育和洗滌。將平板洗滌并加入基質(例如鄰二胺基苯的過氧化物)。用TitertekMultiscan光度計讀出其波長492nm處的吸收率?？贵w的滴度作為抗血清的稀釋度計算，需要產生本底的1/3至1/2的最大值的光密度。通過同時將樣品和參照抗血清進行比較使其標準化。這樣作簡化了不同日期測定的滴度的比較。抗體之間的相對親合力可通過光密度對血清稀釋度的曲線斜率的分析而進行估計。用本領域的普通技術可發(fā)展相近似的ELISA檢定，使其針對很多抗原包括蛋白質，肽和多糖。另外，加入第一種抗體后向ELISA孔中加入1-4摩爾硫氰酸胺能促進除去低親合力抗體，從而提供一種更加定量的親合力的測量方法。實施例7在下述實施例中，通過后足肉趾給老鼠服用25μg的鞭毛，每鞭毛與平均四個分子的TNP共軛。TNP共軛的鞭毛在0.5ml鹽水中給藥。TNP的抗體特性在施用TNP共軛鞭毛后的下列時間進行測定8天，19天，30天，50天和90天。實驗結果列于圖1?？梢钥吹郊词?0天后對TNP共軛鞭毛的免疫應答仍然明顯很高。而對常規(guī)的TNP共軛體例如TNP共軛的雞蛋白蛋白，其免疫應答時間就短得多，而且抗體的滴度低得多。往往在單獨一次注射后，動物對可溶性蛋白質載體上的半抗原的可檢測出的抗體完全沒有反應。實施例8老鼠對劑量的反應通過施用不同劑量的TNP共軛鞭毛進行測定。每分子鞭毛(分子量大約是40000)與平均4個分子TNP共軛的鞭毛通過后足肉趾對老鼠給藥。TNP共軛鞭毛在0.5ml鹽水中給藥。給老鼠服用下列濃度的TNP共軛鞭毛4μg，10μg，25μg和50μg。服用TNP共軛鞭毛后8天和19天，測定產生的應答TNP共軛鞭毛的抗體，實驗結果示于圖2。實施例9老鼠對TNP共軛的雞蛋白蛋白(HEA)的免疫應答和對TNP共軛的細菌鞭毛蛋白質的免疫應答的對比見圖3。在此實驗中，TNP對HEA的共軛與對鞭毛共軛方式一樣使用活性三硝基苯磺酸的衍生物(TNBS)。通過老鼠的后足肉趾給老鼠服用100μgTNP共軛的HEA或25μgTNP共軛的鞭毛。服用TNP共軛蛋白質后10天，按照實施例6測定抗體的滴度，結果見圖3。通過測定抗體滴度知TNP共軛鞭毛與TNP共軛HEA相比可導致大得多的免疫應答。應該注意，本實驗中施用TNP-HEA的量是TNP共軛鞭毛量的4倍(100μgTNP-HEA對25μgTNP共軛鞭毛)。實施例10用實施例9中相同的制劑再加入1.0mgT150R1佐劑對老鼠給藥。通過后足肉趾給老鼠施用100μgTNP共軛HEA或25μgTNP共軛鞭毛。施用TNP共軛蛋白質和佐劑后10天，按實施例6測定抗體滴度。這些實驗結果匯集于圖3。可以看到該佐劑提高了TNP共軛HEA和TNP共軛鞭毛的免疫性應答。然而TNP共軛鞭毛導致的免疫應答比TNP共軛HEA大得多。用鎖眼血籃蛋白(KLH)代替HEA做相似的實驗得到了相似的結果。作為載體、KLH比HEA更有效，但不如鞭毛效果好。實施例11因為嵌段共聚物佐劑是通過獨特機理進行反應的，因此有可能將其加入更復雜配方中以優(yōu)化它在特殊應用中的活性。TNP10-HEA是在水包油乳狀液中與1.0mg具有下面分子式的表面活性共聚物配制的其中疏水基團(C3H6O)的分子量大致是4600，親水基(C2H4O)的重量百分含量大約是10%。表面活性共聚物在水包油乳狀液中與TNP10-HEA和不同類脂A衍生物配制，包括從兩個來源得到的Re-LPS和單磷?；愔珹。另外，評價了兩種類脂母體、類脂IVA和類脂X。LPS和兩種類脂A制劑與單獨使用三嵌段共聚物相比，其抗體應答顯著增加。油(2%角鯊烷)和共聚物與干燥的三硝基苯共軛的雞蛋白蛋白(TNP10-HEA)混合，接著在pH為7.4的PBS中與0.2%Tween-80攪抖均勻。將50μl制劑分開注入老鼠兩只后足肉趾中，每只動物所用劑量為50μg抗原、0.6mgL141、0.1mgT150R1。粘性物與離子載體共聚物的結合作用所產生的抗體應答比單獨使用兩者之一有顯著的增加。這些實驗結果見圖4及圖5。標記有MPL-TDM和TDM的棒形制劑可在市場上買到、由RibiImmunochemical(Hamilton，Montana)提供。這些佐劑的配制可參照佐劑的說明書?？稍诳吹缴虡I(yè)佐劑MPL-TDM和TDM與其它制劑相比，在老鼠身上只能引起最小值的應答，然而共聚物與類脂A衍生物的不同結合作用卻引起意料之外的高抗體滴度。實施例12評價2%角鯊烷的水包油乳液中共聚物與凍干抗原的佐劑效果。油與共聚物與干燥TNP10-HEA混合、然后在pH為7.4的PBS中與0.2%Tween-80攪勻。將50μl制劑分開注入老鼠的兩只后足肉趾中。每只動物的劑量是50μg抗原、0.6mg標示L141的三嵌段共聚物和1mg標示T150R1的共聚物。標示L141的共聚物有如下結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4600，親水基(C2H4O)的重量百分含量大約是10%。標示T150R1的共聚物是離子載體，其具有下面的分子式其中a大約為5，b大約為32。實驗結果見圖5?？梢钥吹饺抖喂簿畚锱c反八嵌段共聚物的結合，給出了協(xié)同佐劑效果。實施例13在此實驗中，在一只老鼠的兩個足趾分開給老鼠施用50μl劑量的50μg凍干TNP10-HEA(每摩爾10.4TNP)。在與鹽水乳化作用之前使干燥抗原與油混合。弗氏完全佐劑(FCA)試劑(GrandIslandBiologicals)是由鹽水中60%油構成，沒有別的附加成份。其它所有制劑是60%油及50μlSpan-80，10μlTween-80及每劑量1.6μl乳狀液中15mg二氧化硅(5μmMinusil)。使用時每只老鼠的劑量包含0.6mg濃度的三嵌段共聚物和0.1mg濃度的八嵌段共聚物。實驗數(shù)據(jù)由每組5-15只老鼠的兩組實驗復合而成(見圖6)。標示L121三嵌段共聚物的分子式如下其中疏水基(C3H6O)的分子量大約是4000，親水基團(C2H4O)的重量百分含量大約是10%。標示L141的共聚物的分子式如下其中疏水基(C3H6O)的分子量大約為4600，親水基團(C2H4O)的重量百分含量大約為10%。0.1mg標示T150R1的帶有反共聚物的八嵌段共聚物的分子式如下其中a約等于5，b約等于32。除弗氏完全佐劑(FCA)以外，所有配方都含有二氧化硅作為主劑?？梢钥吹胶泄簿畚锏慕M合物都增加輔助活性并比FCA更為有效(見圖6)。油和二氧化硅的結合比單獨使用油或二氧化硅更有效。60%油乳狀物自己的平均滴度為100，二氧化硅自身的滴度小于20，當結合使用一次注射30天后，其滴度超過300。對于免疫雞滑囊病病毒或免疫帶各種蛋白抗原的兔子，使用二氧化硅本身或共聚物一同使用，其效果比單獨使用油乳狀物更好。最后，我們發(fā)現(xiàn)其它表面活性劑可代替Span和Tween，只要它們能產生穩(wěn)定的乳狀物。與由弗氏完全佐劑引起的劇烈慢性炎癥反應相比，二氧化硅乳狀液只產生溫和的局部反應。另外，二氧化硅混合物不能引起自免疫佐劑關節(jié)炎。與最常用產生抗血清的佐劑弗氏完全佐劑相比，這是它的一個主要優(yōu)點。實施例14將由5至10只老鼠組成的各組老鼠用含1mg每種圖7表示的共聚物的2%水包角鯊烷乳狀液中的TNP-HEA進行免疫。除L81只引起短暫的反應外，每組中抗體反應經歷的時間相近。滴度的峰值大約在注射后一個月處并持續(xù)過三個月。免疫后90天時給動物加強注射，一周后再次給它們抽血。含10%或更少聚氧乙烯(POE)的共聚物都可引起強的免疫應答。共聚物L122是差的佐劑。含有一定范圍POE鏈長和分子量為5200的聚氧丙烯鏈(POP)的共聚物(L180.5，L181.5和L182.5)的佐劑活性遵循先前一系列小共聚物L121，L122和L123建立的模式。再次發(fā)現(xiàn)含高于10%POE共聚物是無效佐劑。每POP鏈長含10%或更少POE的共聚物促進平均滴度的程度隨POP疏水基團分子量的增加而增加，見圖7。盡管組與組之間不一樣，但重復發(fā)現(xiàn)滴度隨疏水基團分子量而增加的一般模式。用標定級特異抗血清進行ELISA檢測，在多個時間點測量抗體的同型，見圖8。誘導抗體的有效佐劑共聚物制劑可誘導同型的完全不同模式。低分子量制劑，L101，誘導了帶較少量的IgG2a和IgG2b的顯著的IgGI應答。增加疏水基團分子量可增加IgG2，特別是IgG2b的比例。有趣的是IgG3同型的產生遵循相反的模式，由低分子量制劑L121尤其是L101產生高滴度。IgG1對IgG2b抗體的比例隨疏水基團分子量增長的關系呈近似的線性關系，見圖8。再在多個時間間隔測量同型的分布情況繼續(xù)28天。由各個共聚物產生的同型模式在下步的檢定中趨于不變。實施例15用50μg含1mg共聚物L141和/或100μg去毒的RaLPS水包角鯊烷乳狀液中的TNP-HEA對各組老鼠進行免疫。圖13顯示了當去毒的RaLPS和L141與TNP-HEA混合并給老鼠給藥的協(xié)同反應。圖14顯示由各個佐劑結合物引起的IgG同型加上與毒性LPS的比較。30天后，測定幾種內毒素衍生物和減少了毒性的成份的抗體同型。共聚物141本身主要產生IgG1同型抗體應答及較少量的IgG2a和IgG2b以及痕量IgG3。去毒的RaLPS減小對TNP-HEA的IgG1抗體的量而顯著增加IgG2a和IgG2b抗體。在相似的實驗中，無毒性S.SphaeroidesLPS不能明顯增加IgG滴度的總量，但卻能減少IgG1抗體的量而增加IgG2a和IgG2b量。其它無毒和去毒LPS衍生物既增加其滴度也使同型的平衡移向IgG2a和IgG2b。注射無任何佐劑的抗原不能產生可測抗體。實施例16將與單磷酰基類脂A結合的L141共聚物與二霉菌酸海藻糖酯進行比較。用50μg含所表明佐劑的水包油乳狀液中的TNP-HEA使老鼠免疫。每劑量乳狀液中含50μgMPL和/或TDM。在28天時從老鼠身上抽血。與TDM-MPL結合相比，L141與MPL的結合作用可產生較高滴度。IgG2a亞綱的滴度是主要的，如圖15所示，所有三種材料的結合產生了最高的IgG2滴度并明顯添加了IgG3。實施例17人們一直認為來自革蘭氏陰性細菌的脂多糖是有效的免疫調節(jié)劑和免疫佐劑。但這些材料的毒性卻妨礙了它們作為佐劑的發(fā)展。最近報告了一種既減少它們的毒性同時又保持其實質佐劑活性的方法。此方法包括從類脂A中除去磷酸根基團而產生單磷?；愔珹(MPL)。另外，從類脂A部分除去一個或多個脂肪酸鏈也可減少毒性。有些類型的LPS，尤其是從紅假單胞球形菌(結構見圖11)中得到的LPS，其本身無毒性。其結構與毒性類脂A非常類似。Rietchsel認為整個類脂A結構具有毒性，并證實許多修改可減少其毒性。設計本實驗以評價一系列LPS衍生物與非離子嵌段共聚表面活性劑結合作為佐劑的潛力。選擇LPS衍生物來評價結構修飾譜，這種結構修飾用來評估減少毒性的幾種方法和以同型及免疫應答強度來評估結構。用這些試劑自身和它們與嵌段共聚佐劑L141的結合來評估試劑間的協(xié)同作用，這種協(xié)同作用是通過獨特機理實現(xiàn)的。最后報導出6，6′-二霉菌酸海藻糖酯(TDM)是將抗原連接到油滴表面的粘著佐劑。研究結果比較了TDM與和LPS衍生物結合的嵌段共聚物的佐劑活性。動物使用由CharlesRiverLaboratories，Raleigh，NC處得到的幾組7-10周大的雌鼠ICR(選系繁殖)。抗原制劑將三硝基苯基(TNP)半抗原與重結晶的雞蛋白蛋白(HEA)連接。在PH為8.221的硼酸鹽緩沖液中用5mM三硝基苯磺酸鹽使TNP與HEA共軛。用分光光度法在350nm處用15400消光系數(shù)側定三硝基苯基化程度，每摩爾HEA連接有8-9個單位的TNP。佐劑由stlouis，Mo的SigmaChemicalCompany購買從S.minnesotaR7中提取的Rd1-LPS，從鼠傷寒沙門氏菌SL684中提取的Rc-lps和從大腸桿菌EH-100中提取的Ra-LPS由Hamilton，MT的RibiImmunochemResearch，Inc購買從S.minnesotaR595中提取的MPL;從西德Borstel的InstitutefürExperimentelleBiotogieundMedizin得到S.minnesotap345，S.minnesotaR60和鼠傷寒沙門氏菌SF1512培養(yǎng)基。由StatensSeruminstitut，DK-2300Copenhogen，Denmark處得到大腸桿菌O9和O58的培養(yǎng)基。由NewHaven，CT.的GeneticStockCenter，DepartmentofHumanGenetics，yaleUniversitySchoolofMedicine處得到大腸桿菌D31m4的培養(yǎng)基。對溫度敏感的大腸桿菌MN7和鼠傷寒沙門氏菌i50突變體的生長以及類脂X和母體類脂IVA的制備已分別由Takayama，K.，等和Raetz，CRH，等描述過，將之所有引入作為參考。22，23大腸桿菌D31m4的生長和純的Re-LPS的制備已由Qureshi，等進行了描述，在此引入作為參考。24參照Quireshi，N.，等的方法(引入作為參考)25由D31m4和Re-LPS制備MPL。這個產品包含一個六酰和少量的五酰MPL的混合物。用經修改的Galanos，等的方法由S.minnesotaR345，S.MinnesotaR60，鼠傷寒沙門氏菌SF1512和球形紅假單胞菌ATCC17023制備粗化學類型的脂多糖。26，27由最小(Re-LP5)到最大(SR-LPS)一系列粗化學類型的LPS結構見圖10。球形紅假單脆菌LPS的結構見圖11。大腸桿菌O9和O58在LB肉湯中生長，光滑的化學型脂多糖用Westphal和Jann的熱苯酚-水萃取方法制備28。由大腸桿菌O9和O58得到的LPS產率分別是8.0和14.9%(干重量)。大腸桿菌O58LPS的O-抗原區(qū)域的結構確定如下n(1→3)2(3)RhaLAOAc其中RhaLA是3-O-(R-1’-羧乙基)-L-鼠李糖(rhamnolactylicacid)。將O9LPS(100.7mg)溶解在2.0ml含0.6%脫氧膽酸，pH值為7.8的0.2M三鹽酸中，并在37℃下用相同的緩沖液在2.8×54cmBio-GelP-100栓(Bio-Rad，Richmond，CA)柱上進行分餾。其過程與Vukajlovich等的方法相似，在此引為參考。29收集2ml各餾份分析其KDO和甘露糖。根據(jù)這些分析將餾份27-35(Ⅰ)，36-43(Ⅱ)和44-51(Ⅲ)匯集起來并徹底地用流動的水滲析。最后這些樣品在Bio-GelP-4柱上脫鹽而得43.5mgⅠ，27.2mgⅡ和6.6mgⅢ。三個樣品用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳顯示餾份Ⅰ主要含有光滑化學型LPS，餾份Ⅱ含有光滑和粗糙化學型LPS的混合物，餾份Ⅲ幾乎只含有粗糙化學型LPS。這些結果與甘露糖對總的亞磷摩爾比相一致，即對于Ⅰ是9.2∶1.0，對于Ⅱ是5.3∶1.0，對于Ⅲ是2.9∶1.0。O9LPS的外核已糖區(qū)域顯示出大腸桿菌R1類型，而內核對所有沙門氏菌和大腸桿菌均相同。O9LPS的O-抗原區(qū)域的結構確定為[→3)-Man-α(1→3)-Man-α(1→2)-Man-α(1→2)-Man-α(1→2)-Man-α(1→]12-14由Dr.KuniTakayama，VAHospital，Madison，WI處獲得類脂A母體和其衍生物(包括MPL)。由RibiImmunochemResearch，Inc.，Hamilton，MT處購賣MPL和MPL-TDM制劑。由CytRxCorporation，Atlanta，GA處獲得非離子嵌段共聚物表面活性劑L141。它由分子量為4600道爾頓的中心聚合物聚氧丙烯(POP)和在兩端帶有平均分子量為500道爾頓的聚氧乙烯(POE)的親水鏈組成。免疫應答的激發(fā)作用將單獨或結合的上述添加劑凍干，并并入含2%角鯊烷(hexamethyltetracosane)的水包油乳狀液中。對每只老鼠的最后濃度是50μgTNP-HEA，100μgLPS，50μgMPL和MPL-TDM，以及1mg共聚物L141。根據(jù)試驗的特定小組給動物的后足肉趾進行皮下注射(40-50μl體積)含上述劑量的抗原和佐劑。用使血液不凝固的Natelson毛細管通過后眼窩血管叢在本研究過程內不同時間點對老鼠抽血，血漿在-70℃下保存?？贵w檢測過程用EnzymeLinkedImmunosorbantAssay(ELISA)分析評價由各個制劑引起的免疫應答。使苦基磺酸與BSA餾份V反應制備抗原。在4℃下，用0.5μg/ml濃度PBS中的pH為8.4的TNP-BSA(每摩爾BSA含25個單位的TNP)將微滴平板處理過夜)。處理量為每孔100μlTNP-BSA。用pH為7.4，含1%BSA的PBS代替抗原溶液，并使平板在室溫下孵育1小時，以阻隔任何對抗體非特異性連結可利用的位點。然后用pH7.4，含0.05%poloxamer188的PBS沖洗4次平板。然后加入100μl含0.1%BSA的試驗血清的系列稀釋劑和PH7.4，含0.1%poloxamer188的PBS，并在軌道振蕩器上(200rpm)于室溫下孵育1小時。然后將平板洗三次，并在37℃用針對鼠IgG或特異IgG亞綱的親合純化辣根過氧化酶共軛的山羊抗體孵育90分鐘。除對IgG3使用1∶1000稀釋液外，其它組都使用共軛物的1∶2000稀釋液。下一步是將平板洗三次，在PH5.0的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液中，用0.4mg/ml鄰苯二胺(OPD)HCl顯色。在加入OPD后15分鐘用2.5N硫酸終止反應，并用BIORAD型3550微板讀數(shù)器在490nm處讀出數(shù)據(jù)。滴度被定義為產生1.0吸收率所需的抗血清稀釋度。下面公式計算協(xié)同作用LPS+L141的滴度/LPS或L141的滴度結果圖16表示在后足肉趾上用50μg含1mg共聚物L141加100μg一系列類脂A衍生物之一的2%水包角鯊烷乳狀液中的TNP-HEA進行免疫的遠系繁殖的ICR雌性老鼠各組的情況。最小的衍生物類脂X在所有時間范圍內測量都抑制了免疫反應。其它每個衍生物在免疫作用10天后都產生了加速免疫應答，具較高滴度，但30天和60天時產生了中度的抑制免疫應答作用。用從與核多糖大小不同的突變生物體中取得的LPS制劑進行相似的研究，見圖17。注射后10天這些LPS衍生物產生了增長的抗體應答。最小的制劑，Re-LPS，在60天時抑制應答。其它衍生物產生中度的促進作用。最后評價了與共聚物L141結合的含不同量O-多糖的LPS各餾份的佐劑效果，見圖18。這些制劑的每一個在整個測量期間持續(xù)產生快速增加的免疫應答。表1總結了單獨使用和與共聚物L141結合使用的每個LPS餾份和衍生物的觀測結果。表1IPS/類脂A存活抗體滴28天的母體1來源百分數(shù)2度3協(xié)同比</tables>1、在材料和方法章節(jié)中描述的不同型式LPS和類脂A的結構。S＝平滑;R＝粗糙2、注射100μg含1.0mgL141和50μgTNP-HEA的水包角鯊烷乳狀液中的LPS衍生物的動物的存活百分數(shù)。3、用LPS加TNP-HEA的L141乳狀液免疫的動物在28±SE天時對TNP的IgG抗體滴度。4、協(xié)同比例是由LPS加L141引起的抗TNP抗體除以用L141而無LPS的相似乳狀液引起的抗TNP抗體5、從大腸桿菌09得到的LPS在Bio-GelP-100柱上分餾得到餾分Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ。S＝光滑;R＝粗糙。使表中的滴度標準化以有利于實驗結果間的比較。計算協(xié)同比例以估價LPS制劑和衍生物對增加IgG抗體應答的相對能力，它們均超過作為佐劑單獨使用的期望值。由存活率判斷出含LPS的免疫原的毒性明顯地不同。存活率小于100%的制劑通常產生撓發(fā)及其它引起痛苦的內毒素標志。然而有幾種制劑不產生死亡，極少產生臨床毒性標志。這些制劑包括單磷?；愔珹，類脂A衍生物，類脂X，類脂IVA，去毒的Ra和球形紅假單脆菌LPS。這些制劑增加抗體應答的能力方面(超過單獨使用共聚物L141或LPS制劑的應答)在使用LPS制劑中明顯是各不相同的。一些制劑抑制免疫應答而其它制劑則幾乎沒有效果。然而那些確實增加抗體滴度的制劑增加免疫應答并在觀察期間持續(xù)超過三個月。特別成功的制劑是去毒的Ra-LPS衍生物，它自身是一弱的佐劑，但與共聚物L141結合時能顯著增加滴度(見圖3)?？贵w同型對幾種去毒衍生物和減小毒性的餾份測定抗體的同型(圖13和14)。正如預料的那樣，共聚物L141自身主要產生IgG1同型抗體應答，及較少量的IgG2a和2b，以及痕量的IgG3。注射無佐劑抗原不產生可檢測出的抗體。在產生IgG1抗體方面，LPS衍生物具有不同的效果，實質結果是主要產生IgG2反應。即使使用不產生促進抗體滴度的制劑，也可出現(xiàn)同型由IgG1向IgG2a和b的偏移。實施例18動物由charlesRiverBreedingLakoratories(Raleigh，N.C.)處得到6周大的雌性遠系繁殖ICR白鼠，并在免疫前使其在動物籠內適應一周，隨意喂水和食物。共聚物和其它試劑由CytRxCorporation，Norcross，GA處獲的協(xié)同嵌段共聚物L121，L141L180.5;由SyntexCorporation(PaloAlto、CA)處得到胞壁酰二肽(MDP)的蘇氨酰衍生物;以及從Dr.KuniTakayama，VAHospital(Makison，Wi)處得到球形紅假單胞菌。癥疾肽和肽共軛用430A型肽合成儀(AppliedBiosystems，Inc.)在MicrochemistryFacilityofEmoryUniversity(Atlanta，GA)合成肽(NAGG)5，純度用氨基酸分析和HPLC確定。(NAGG)5是獼猴瘧原蟲N1H菌株的子孢子的環(huán)子孢子蛋白質中的一個串聯(lián)重復。用改進的1984年Rougon等人的一步戊二醛偶聯(lián)法將肽(P)共軛到牛血清白蛋白(BSA)或雞蛋白蛋白(HEA)(sigmachemicalCo.，stLou-is，Mo)上。主要是將4×10-6摩爾溶解在PH8.7的0.8mlPBS中的肽與1.5×10-7摩爾在PH8.7的1.2mlPBS中的BSA或HEA混合。室溫下超過15分鐘以每等份0.05ml的量將2ml0.02M戊二醛溶液(SigmachemicalCo.，St.Louis，Mo)加到混合物中，每次添加之間攪拌成漩渦。溫室下將混合物在軌道振蕩器上旋轉過液(150rpm)。用PH7.3的PBS將混合物通過SephadexG-25柱將未結合的戊二醛和肽除去。在空容器中收集P-BSA或P-HEA并在-20℃保存?？贵w滴度和同型定量的ELISA分析用改進的Saunders法30得到針對該肽的抗體滴度。按0.1ml/每孔的標準用0.002mg/ml濃度的與PH7.3的PBS中雞蛋白蛋白(P-HEA)共軛的肽溶液涂覆96孔微滴平板(FlowLaboratories，Mclean，VA)于4℃下過夜。其它進一步的孵育都在室溫下進行。用0.1mlpH7.3PBS中的1%人白蛋白溶液(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)阻塞抗原涂覆的孔一小時。用含0.05%表面活性劑PLURONICF68(Poloxamer188)的PH7.3的PBS洗滌后，用相同方式向孔中加入0.1ml從免疫老鼠身上取出的血漿的一系列三倍稀釋液。并同樣加入從未免疫老鼠身上取出的血漿的三倍稀釋液和針對肽，(NAGG)5的單克隆抗體，分別作為ELISA的陰性和陽性空白實驗。在軌道振蕩器(200rpm)上使平板孵育1小時。洗滌后，向各孔中加入0.1ml以1∶2000稀釋的過氧化酶共軛的山羊抗鼠IgG，IgG1，IgG2a或IgG2b或以1∶1000稀釋的抗IgG3(FisherBiotech，Orangeburg，NY)，并以200rpm轉速孵育11/2小時。重新洗滌后，向各孔中加入0.1ml2.5mg/ml鄰苯二胺(SigmachemicalCo.，stLouis，Mo.)和0.03%PH5.0的檸蒙酸鹽緩沖液的過氧化氫(SigmachemicalCo.，StLouis，Mo.)，孵育15分鐘，用2.5M硫酸中止顯色反應。用BiokadMicroplate讀數(shù)器測定在490nm處的吸收率，用回歸分析測定滴度(使用稀釋液使吸收率為1)。借助標準曲線，通過使ELISA滴度轉變?yōu)楦鱾€亞綱每毫升血漿毫微克來做同型定量分析。用10微克/ml濃度的稀釋度在PH7.3PBS中的多克隆山羊抗鼠IgG(FisherBiotech，Orangeburg，NY)涂覆在96孔微滴平板的孔中。洗滌，阻塞，孵育次數(shù)與上述ELISA分析相同。每種同型的老鼠骨髓瘤蛋白質(SigmaChemicalCo.，StLouis，Mo.)的稀釋物作為標準使用。在119ng-0.03ng濃度，用山羊抗鼠同型特異性馬蘿葡過氧化酶共軛物(FisherBiotech，Orangeburg，NY)測量標準吸收率。用回歸分析根據(jù)吸收率(490nm)對濃度的標準曲線測定吸收率為1的同型特異標準物的濃度。吸收率為1時的肽特異性同型的濃度乘上吸收率為1小時的ELISA滴度，得到的濃度以ng/ml表示。鞭毛制劑在美國典型培養(yǎng)物收集中心獲得沙門氏傷寒菌株TYZ(type29)。使儲備培養(yǎng)基在TrypticSoyAgar平板(DifcoLaboratories，Detroit，MI)上生長，并在0.3%TrypticSoyMotilityAgar中過4-5遍。選擇游動性好的細菌，因為它們能提供最多的鞭毛。生物體在tryptic大豆肉湯中接種并在37℃孵育6小時。將細菌的肉湯懸浮液分等份接種到MuellerHintonAgar平板(CarrScarlborough)上并在37℃孵育16小時，用含0.1%乙基汞硫代水楊酸鈉(sigmachemicalCo.，StLouis，Mo)的PBS收集平板上的細胞。在機械振蕩器上(RedDevilPaintShaker)劇烈振蕩20分鐘使鞭毛離開細胞，并按以下方式通過差離心作用使鞭毛與細胞體分開用帶有GSA旋翼的SorvallRc-5B冷凍超速離心機(DupontInstruments)以6000×9轉速離心30分鐘，將細胞體團成小球。然后以16000×9離心10分鐘將破裂的細胞和其它小碎片也團成球。然后在帶有SW27旋轉捅式旋翼BeckmanL8-70M超速離心機中以90000×9將鞭毛團成球，再懸浮于乙基汞硫代水楊酸鈉-PBS中。然后再懸浮于乙基汞硫代水楊酸鈉-PBS中。用lowry′s蛋白質測定法測定蛋白質濃度。31按5.2mg/ml將鞭毛分等分于-70℃下冷凍。鞭毛共軛作用應用Liang等32的二步驟戊二醛偶聯(lián)法將多肽與沙門氏鞭毛(P-flagella)共軛。用等體積0.02M戊二醛處理溶解在1.2mlPH8.7的PBS中的肽(1.5×10-7摩爾)，以0.05ml的量分等分加入并在加入過程之間攪拌成漩渦。在軌道振蕩器上、于室溫下旋轉過夜(150rpm)。在4℃下用PBS滲析過夜，移去未反應的戊二醛之后，按肽對鞭毛的摩爾比為26∶1，13∶1和6.5∶1，將0.8mlPBS(PH8.7)中的4×10-6，2×10-6，1×10-6摩爾肽分別加入到滲析的鞭毛中，混合物在室溫下旋轉過夜。用帶SW27旋轉桶式旋翼的BechmanL8-70M超速離心器以90000×9超速離心1小時，將未反應的肽從鞭毛中分離出來。將鞭毛球重新懸浮于PH7.3的PBS中，再離心，再懸浮于PBS中，然后加入0.02M賴氨酸(SigmaChemicalCo.，StLouis，Mo.)。4℃下反應過夜，然后再離心，再懸浮于2ml的PBS中。乳液和免疫作用模式用含2%角鯊烷(SigmaChemcicalCo.StLouis，Mo)與含0.2%Tween-80(SigmaChemicalCo.，StLouis.)PH7.2PBS混合物的水包油乳狀液使5-8只老鼠的各組進行免疫。若存在的話，共聚物佐劑L121或L141其濃度是1mg/0.04ml，球形紅假單胞菌LPS的濃度是0.1mg/0.04ml凍干肽或PBSA的濃度是0.1mg/0.04ml或P-鞭毛濃度是0.05mg/0.05ml。除一個實驗中PBSA是0.05ml外，其余乳狀液的制備均用相同濃度。用機動研杵在2ml玻璃均化器中將凍干抗原與角鯊烷和共聚物混合2分鐘。除一個實驗是將P-BSA或P-鞭毛不經凍干而加入PBS加到水相外，其它所有實驗都是將水相和其余佐劑加入到油相，然后再乳化2分鐘?；蛘呤菍?.04ml含0.1mgP-BSA的乳狀液注射到一只后足肉趾中，或者是將0.025mlP-BSA或P-鞭毛(0.05mg/ml)注入每個后足肉趾中。在一個比較免疫途徑的實驗中，將0.1mg在0.04ml有或沒有L121或L141的水包角鯊烷乳狀液中的P-BSA注射入一只后足肉趾中(FP)或0.2mlIP或SC乳狀液中的0.1mgP-BSA注射入一只后足肉趾(FP)中。29天時，用相同量的相同配方，水包油乳狀液中的抗原和L121或者PBS中的抗原對所有的老鼠進行第二次免疫。在一項實驗中，三組老鼠用含L121的水包油乳狀液中的P-BSA進行第三次免疫，在初次免疫后的0，10，28和36天對大多數(shù)組的老鼠從后眼窩血管叢(retroorbitalplexis)抽血到血液不凝固試管中。實驗過程中，在初次免疫后10，28，60，90，97，111，141，171，201，207和214收集血漿，分別用ELISA分析從各個老鼠身上取得的血漿，并測定每組的平均和標準誤差。實施例19用0.1mg有或沒有共聚物和/或球形紅假單胞菌LPS(每只老鼠0.1mg)的2%水包角鯊烷乳化液中的肽或肽-BSA對每組8只老鼠進行免疫。一個月后對所有的老鼠進行第二次免疫并在一周后收集血漿。根據(jù)上文描述的方法分析肽特異性總IgG和IgG同型。總的IgG抗體滴度以每組平均值±SEM列出。結果總結于表2。表2當將L121和肽-BSA加入到LPS中時，盡管總的IgG滴度比沒有LPS時稍低，但IGg2b的比例近乎加倍，并且IgG2a增長至總IgG量的8%。L141和LPS有協(xié)同作用，既使總IgG滴度增加近3倍也在影響亞綱分布上有協(xié)同作用。與單獨使用L141相比IgG2b比例的增長超過了8倍，達到超過總IgG量的39%。并出現(xiàn)相當量的IgG2a，并且這種佐劑結合產生了2.8%比例的IgG3。實施例20IgG同型分布上半抗原密度效應使用有L121的干燥制劑測定每個鞭毛蛋白單體肽的不同摩爾比的效果。在兩個后足肉趾上用含0.05mg肽-鞭毛(摩爾比為26∶1，13∶1和6.5∶1)的乳狀液使各組老鼠免疫。一個月時用溶解在鹽水中具有相同半抗原密度的肽-鞭毛加強注射老鼠。一周后收集血漿并分析肽特異性IgG同型的濃度。改變肽對鞭毛的摩爾比會影響IgG抗體應答的強度和同型的分布(圖19)。摩爾比由6.5∶1增加到26∶1可使總IgG濃度增加6倍，并使同型類型產生很大的改變。具有26∶1肽比的鞭毛可產生11%IgG1，43%IgG2a，17%IgG2b和29%IgG3。減少肽比至13∶1幾乎專影響IgG3，使其比例減少至4%。比例降至6.5∶1，消除IgG1和IgG3并減少IgG2a的濃度。實施例21動物將由CharlesRiverLaboratories得到的7-10周大的雌性ICR(遠系繁殖)老鼠作為實驗用動物;所有共聚物由CytRxCorporation，Atlanta，GA處獲得;TNP-HEA(SigmaChemicalCompany，St.Louis，Mo)根據(jù)MethodsinImmunology33中的方法配制。乳狀液制劑乳狀液是1ml最終體積和0.04ml注射體積。加入TNP-HEA(凍干)的標示量0.05mg/老鼠，加入2%角鯊烷鹽水，加入標示量1.0mg/老鼠的共聚物。將混合物均化2分鐘。有PBS/Tween80(0.2%)補足量至1ml，室溫下均化大約2分鐘。注射在后足肉趾上給老鼠進行初次皮下注射(0.04ml)，以一定抗原十共聚物的各種情況，在90天時對老鼠加強注射。足肉趾測量在注射前測量基數(shù)，在注射后在特定時間點進行測量直到發(fā)炎退去。血的收集在整個實驗過程中在特定時間點收集用于血漿抗體檢測的血液。通過后眼窩血管叢用血液不凝固Natelson試管收集。在2500rpm下將樣品離心15分鐘。血清在-70℃下保存。表3</tables>用含1mg每種共聚物的2%水包角鯊烷乳液中的TNP-HEA對每組5-10只老鼠免疫，見表3。每組中抗體應答時間過程相似、滴度峰大約在注射后一個月并持續(xù)幾個月。三個月后對老鼠加強注射。一周后再次抽血。含10%聚氧乙烯，而聚氧丙烯分子量等于或小于4600的共聚物導致很強的免疫應答。僅當含小比例聚氧乙烯，分子量為5200的聚氧丙烯的大制劑是有效的佐劑。含有較大比例聚氧乙烯的制劑效果要小得多。實施例22下面實驗是將本發(fā)明配方之一與現(xiàn)有技術佐劑進行比較。配方具有下面一般組成首先將二氧化硅與共聚物結合并充分混合使二氧化硅完全涂覆在共聚物上，然后加入Span80和角鯊烷，并用磁子攪拌混合大約45分鐘，制備含50%水的油包水乳狀液使抗原懸浮于水中。本實驗中所用其它佐劑包括由RibiImmunochemResearch.Inc.HamiltonMT得到的RAS;由Alpha-BetaTechnology，Inc.Worcester，MA處得到的ADJUVAXTM;以及由SigmachemicalCo.st.Louis，Mo.得到的弗氏完全佐劑。所用佐劑的配制均參照廠家說明并按其指示施用。用肽蛋白質共軛物(釋放牛血清白蛋白激素的黃體化激素，LHRH-BSA)對各組雌性新西蘭白兔(N＝4)進行免疫，如下圖20表示出每種佐劑在14，28，42，和56天時的抗BSA抗體滴度。由圖20可看出在第56天時，本發(fā)明的配方產生的滴度是Freund’s完全佐劑的3-4倍。而本發(fā)明配方注射體積只是freund’s佐劑的五分之一。而且本發(fā)明配方毒性比freund’s完全佐劑明顯小得多。其它方面，本發(fā)明配方引起的免疫應答至少等于或大于Freund’s。實施例23共聚物L180.5具有出人意料的物理性質，使其在無油的情況下是一有效的佐劑。在室溫下此共聚物是不溶的，但在冷卻溫度(≈4℃)時是可溶的。與小分子佐劑L101，L121和L141不同，此不溶形式在室溫下是一小顆粒穩(wěn)定懸浮體。小共聚物都形成不穩(wěn)定懸浮體，它們結成大的不定形塊。這樣的制劑是不好的疫苗佐劑。下面的例子證實了共聚物180.5自身以及無油時與去毒的Ra-LPS結合作為佐劑的能力。將0.1mlTNP10-HEA(25mg/ml)與0.4ml共聚物L180.5(125mg/ml)混合。將混合物放入冰箱中直到共聚物形成溶液。然后將其移出并緩慢升至室溫以有利于抗原與共聚物顆粒連接。除加入適量去毒的Ra-LPS外，按相同方法制備相似制劑。用50μgTNP10-HEA，1mg共聚物180.5，及10μgLPS從后足肉趾對6只老鼠的各組進行免疫。18天時使某些組老鼠按相似方法加強注射。在24天和72天時抽血進行抗體測定。結果總結于表4。表4IgG抗體滴度</tables>無油共聚物產生持續(xù)的和中度的一級和二級抗體應答。在LPS存在下，共聚物使動物出現(xiàn)非常強的二級抗體應答。沒有佐劑下進行相似的抗原注射沒有產生可測的一級應答只產生很弱的二級應答。實施例24在另外一個實驗中將動物用含佐劑的107全滅活的鼠瘧疾(plasmodiumyoelii)嗜血期寄生蟲免疫，這些佐劑或只含1mg共聚物L180.5或是與去毒的10μgRa-LPS結合的0.1mg共聚物L180.5或是含1mg共聚物L180.5的水包角鯊烷乳狀液或是含1mg與10μg去毒的Ra-LPS結合的共聚物L180.5的水包角鯊烷乳狀液。在加入0.5%Tween80鹽水之前在均化器中使角鯊烷共聚物，LPS和抗原結合形成水包油乳狀液。在35天時對動物加強注射并在第70天時用104毒性嗜血期瘧原蟲生物體攻擊動物。對照動物和用Freund’s完全佐劑的抗原免疫的老鼠被瘧疾感染。而用上述四種含或不含LPS的L180.5佐劑中的抗原進行免疫的動物得到了保護?！氨槐Ｗo”定義為寄生物血在血紅細胞中占不到10%，并在感染的第14天下降。保護與寄生蟲表面的表位IgG2a同型抗體有關。研究結果證明對于瘧疾而言使用含有或不含有油或LPS共聚物的佐劑都可引起保護性免疫應答，并比Freund’s完全佐劑更有效。它們也導致高的抗體滴度。實施例25用人體免疫缺乏病毒的重組蛋白質(Gp120ofHIV)進行實驗。老鼠用25μg水包角鯊烷中的Gp120或無油配方的1mg(有或沒有10μg去毒RaLPS)共聚物L180.5進行免疫。在加入0.5%Tween80鹽水之前在均化器中使角鯊烷、共聚物，LPS和抗原結合，形成水包油乳狀液。所有動物組在第28天時作一次加強注射。表5顯示了在第42天HIV蛋白質的滴度表5對HIVGp120的IgG滴度</tables>實施例26制備兩種RaLPS制劑。一種用硼酸鹽處理30分鐘去毒。另一種用硼酸鹽處理7小時去毒。6只雌性ICR鼠的各組用各50μgRaLPS免疫，該RaLPS系在含50μgTNP10HEA，1mg共聚L141，5mg角鯊烷(懸浮于0.5%Tween80鹽水中)的油、水乳液中、在加入0.5%Tween80鹽水前在一均化器中使角鯊烷、共聚物，LPS和抗原結合，形成水包油乳狀液。注射體積是每只老鼠50μl。在間隔一定時間對動物抽血用ELISA方法測定IgG抗體滴度。如圖21所示，LPS溫和去毒制劑導致較高的早期應答，而更深度去毒制劑適中地增加了早期應答，但與部分去毒LPS制劑和全毒性的LPS制劑相比它持續(xù)時間長。這些結果與從前用MPL和其它不帶核多糖的LPS制劑(同無LPS乳劑相比它們早期增加滴度而晚期抑制滴度)的研究形成鮮明對照。實施例27用與實施例26相同的配方，用0.1、0.05，0.025和0.01μg劑量的溫和去毒和深度去毒的RaLPS對動物進行免疫。在第28天時，對動物抽血進行IgG同型測定。如圖22所示，兩種制劑的所有劑量都增加了全部同型。IgG2a增加決定于溫和去毒的RaLPS的劑量。IgG2b的增加不完全決定于劑量，而相對來說在實驗范圍中IgG1不取決于劑量。出人意料的是，深度去毒的RaLPS高劑量產生的同型模式變化比得上部分去毒的RaLPS低劑量所產生的同型模式的變化。這證明可通過改變LPS的劑量或去毒程度來控制和優(yōu)化特殊應用中的同型變換。實施例28用實驗測定本身具有低毒性的從假單孢菌中提取的LPS的佐劑活性。這種低毒性是根據(jù)已報導的事實，即從假單孢菌中提取的LPS只含有5個具有10碳鏈長的脂肪酸。用標準方法將LPS從假單孢菌綠膿桿菌中離析出來。如前面所述用TEA處理將LPS樣品去毒。用50μgLPS，50μgTNP10HEA，1mg共聚物L141，5mg角鯊烷(懸浮在0.5%的Tween80鹽水中)，或沒有L141或沒有LPS的相似乳狀液對6只ICR雌性鼠的各組進行免疫，如圖23所示。在加入0.5%Tween80鹽水溶液之前在一均化器中使角鯊烷、共聚物，LPS和抗體結合形成水包油乳狀液。LPS本身是一弱的佐劑，但與L141結合時卻產生很強的協(xié)同作用，對IgG2a和IgG2b尤其如此。其作用與實施例27中溫和去毒的RaLPS相似。去毒的假單胞菌LPS的作用與實施例27中深度去毒的RaLPS的作用相似。實施例29從自身具有中等毒性的膠質紅假單胞菌提純出LPS。將6只TCR雌鼠的各組用50μgLPS，50μgTNP10HEA，1mg共聚物L121，L141，L180.5，5mg角鯊烷(懸浮于0.5%Tween80鹽水中)進行免疫。在加入0.5%Tween80鹽水之前在均化器中使角鯊烷、共聚物，LPS和抗原結合形成水包油乳狀液。如圖24所示，共聚物L121和L180.5引起的免疫應答與L141相似。膠質紅假單胞菌LPS與每種共聚物結合都可大大增加IgG2a和IgG2b同型，但只很少或不增長IgG1。而且共聚物L180.5是最有效的。實施例305只Rhesus猴子各組用與白喉類毒素共軛的合成肽(NAGG)5，共聚物180.5和去毒RaLPS組成的抗子孢子瘧疾疫苗免疫。在加入0.5%Tween80鹽水之前在均化器中使角鯊烷、共聚物、LPS和抗原結合形成水包油乳狀液。在兩周時間間隔內給動物進行三次皮下注射，每次劑量是2%水包角鯊烷乳狀液中的100μg肽共軛物，100μgRaLPS，5mg共聚物L180.5。所有動物都出現(xiàn)高IgG抗體滴度(由ELISA測定1∶500稀釋度的OD大約是3)。對子孢子表面抗原決定基的免疫熒光法測定抗體滴度證實，平均IgG抗體滴度為100000。在免疫后兩周，未測到免疫部位局部反應，也沒有全身性中毒的跡象。應該清楚，前文敘述只涉及了本發(fā)明中優(yōu)選的具體實施例。在不偏離后面權利要求中本發(fā)明范圍和精神的條件下，可提出很多修改和變化。1Clark，W.R.，TheExperimentalFoundationsofModemImmunology，Chapter4，“Thepropertiesandfinestructureofimmunoglobulins”，pgs.62-74，JohnWiley&amp;Sons2Feldmann，M.，etal.，“TheRelationshipBetweenAntigenicStructureandtheRequirementforThymus-DerivedCellsintheImmuneResponse”，J.Exp.Med.，Vol.134，pgs.103-119(1971)3Lee，etal.，“DeclineandSpontaneousRecoveryoftheMonoclonalResponsetoPhosphorylcholineDuringRepeatedImmunization”，J.Immun.，Vol.113，pgs.1644-1646(1974)4Hunter，R.L.，etal.，“TheAdjuvantActivityofNonionicBlockPolymerSurfactantsⅠ.TheRoleofHydrophile-LipophileBalance”，J.Immunol.;Vol.127，pgs.1244-1250(1981)5Hunter，R.L.，etal.，“TheAdjuvantActivityofNonionicBlockPolymerSurfactantsⅡ.AntibodyFormulationandInflammationRelatedtotheStructureofTriblockandOctablockCopolymers”，J.Immunol.，Vol.133，pgs.3167-3175(1984)6Hunter，R.L.，etal.，“TheAdjuvantActivityofNonionicBlockPolymerSurfactantsⅢ.CharacterizationofSelectedBiologicallyActiveSurfaces”，Scand.J.Immunol.，Vol.23，pgs.287-300(1986)7SeeU.S.PatentNumbers4，606，918and4，770，8748Louis，J.A.，etal.，LipopolysaccharidesFromImmunostimulationtoAutoimmunity，SpringerSeminarsinImmunopathology，Vol.2，pgs.215-229(1979)9Forexample，Galanos，C.，etal.，“BiologicalActivitiesandImmunologicalPropertiesofLipidA”，Microbiology，pgs.269-276(1977)10Scott，M.T.，etal.，“RestrictedIgGisotypeprofilesinT.cruziinfectedmiceandChagas'diseasepatients”，Clin.Exp.Immunol.，Vol.58，pgs.372-379(1984)11Takehara，etal.，“Trypanosomacruziroleofdifferentantibodyclassesinprotectionagainstinfectioninthemouse”，Exp.Parasitology，Vol.52，pgs.137-146(1981)12Wechsler，etal.，“HeatlabileIgG2aantibodiesaffectcureofTrypanosomamuculiinfectioninC57BL/6mice”，J.Immunol.Vol.137，pgs.2968-2972(1986)13Kobayashi，etal.，Arch.Biochem.Biophys.84，pgs.342-362(1959)14AlsoseeSchmolka，I.R.，“AReviewofBlockPolymerSurfactants”，J.Am.OilChemists'Soc.，54110-116(1977)andBlockandGraftCopolymerization，Vol.2，editedbyR.j.Ceresa，JohnWiley&amp;Sons，NewYork(1976)15Takayama，K.，etal.，“FattyAcylDerivativesofGlucosaminelPhosphateinEscherichiacoliandTheirRelationtoLipidA”，J.Biol.Chem.，Vol.256，pgs.7379-7385(1983)16Raetz，C.R.H.，“StructureandBiosynthesisofLipidAinEscherichiacoli，inEscherichiaColiandSalmonellaTyphimurium”，CellularandMolecularBiology，Vol.1，Neidhardt，F(xiàn).C.Editor，AmericanSocietyforMicrobiology17Qureshi，N.，etal.，“PurificationandstructuraldeterminationofnontoxiclipidAobtainedfromthelipopolysaccharideofSalmonellatyphimurium”，J.Biol.Chem.，Vol.257，pgs.11808-11805(1982)18Louis，etal.，supra19Saunders，G.C.，“Theartofsolidphaseenzymeimmunoassayincludingselectedprotocols”，ImmunoassaysintheClinicalLaboratory，AlanR.Liss，NewYork，pgs.111-112(1979)20Rietchsel，E.，etal.，“BacterialEndotoxinsRelationshipsBetweenChemicalStructureandBiologicalActivity”，ImmunologicAdjuvantsandVaccines，Vol.179，Ed.byGrcgoriadis，G.，etal.，PlenumPress，pgs.61-7421JustineS.G.，etal.，MethodsinImmunology，3rdEd.，Chapter18，pgs.153-158(1977)22Takayama，K.，etal.，“Fattyacylderivativesofglucosamine1-phosphateinEscherichiacoliandtheirrelationtolipidA.CompletestructureofadiacylGlcN-1-Pfoundinaphosphatidylglycerol-deficientmutant”，J.Biol.Chem.，Vol.258，pgs.7379-7385(1983)23Raetz，C.R.H.，etal.，“IsolationandcharacterizationofeightlipidAprecursorsfroma3-deoxy-D-manno-octylosonicaciddeficientmutantofSalmonellatyphimurium”，J.BiolChem.，Vol.260，pgs.16080-16088(1985)24Qureshi，etal.，“CompletestructuraldeterminationoflipopolysaccharideobtainedfromdeeproughmutantofEscherichiacoli.Purificationbyhighperformanceliquidchromatographyanddirectanalysisbyplasmadesorptionmassspectrometry.”J.Biol.Chem.，Vol263，pgs.11971-11976(1988)25Qureshi，N.，etal.，“PurificationandstructuraldeterminationofnontoxiclipidAobtainedfromthelipopolysaccharideofSalmonellatyphimurium”，J.Biol.Chem.，Vol.257，pgs.11808-11815(1982)26Galanos，C.，etal.，“Anewmethodfortheextractionoflipopolysaccharides”，Eur.J.Biochem.，Vol.9，pgs.245-249(1969)27Qureshi，N.，etal.，“PositionofestergroupsinthelipidAbackboneoflipopolysaccharidesobtainedfromSalmonellatyphimurium”，J.Biol.Chem.，Vol.258，pgs.12947-12951(1983)28Westphal，etal.，“Extractionwithphenol-waterandfurtherapplicationsoftheprocedure”，MethodsCarbohydrateChem.Vol.5，pgs.83-91(1965)29Vukajlovich，etal.，“ConversionoflipopolysaccharidestomolecularaggregateswithreducedsubunitheterogeneityDemonstrationofLPS-responsivenessin‘EndotoxinunresponsiveC3H/HeJsplenocytes’”，J.Immunol.，Vol.130，pgs.2804-2808(1983)30Saunders，supra31Lowry，O.H.，etal.，“Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent”，J.Biol.Chem..，Vol.193，pgs.265-275(1951)32Liangetal.，“OralAdministrationofCholeraToxin-SedaiVirusConjugatePotentiatesGut.andRespiratoryImmunityAgainstSendaiVirus”，J.Immunol.，Vol.141，No.5，pgs.1495-1501(1988)33JustineS.G.，etal.，supra權利要求1.一種疫苗佐劑，含有具有下式結構的表面活性共聚物其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4500-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%。2.權利要求1的疫苗佐劑，其中所述表面活性共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為5200，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為5%。3.權利要求1的疫苗佐劑，其中所述表面活性共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為5200，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為15%。4.權利要求1的疫苗佐劑，其中所述表面活性共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4600，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。5.含有無毒脂多糖的疫苗佐劑。6.權利要求5的疫苗佐劑，其中無毒脂多糖是分子的糖部份保持完整，而分子的類脂A部分被改性，因而是具有很低毒性的脂多糖。7.權利要求5的疫苗佐劑，其中脂多糖是紅假單胞菌種(RhodopseudomonasSpecies)分離出的。8.權利要求7的疫苗佐劑，其中紅假單胞菌種選自由球形紅假單胞菌(R.sphaeroides)、嗜酸紅假單胞菌(R.acidophilia)、胚素紅假單胞菌(R.blastica)、膠質紅假單胞菌(R.gelatinosa)、莢膜紅假單胞菌(R.capsulate)、池沼紅假單胞菌(R.palustris)和綠霉紅假單胞菌(R.Viridis)組成的一組中。9.權利要求5的疫苗佐劑、其中無毒脂多糖是去毒脂多糖。10.一種疫苗佐劑，含有有效量的脂多糖和有效量的表面活性共聚物、該表面活性共聚物具有如下結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%。11.權利要求10的疫苗佐劑，其中脂多糖是無毒脂多糖。12.權利要求11的疫苗佐劑，其中無毒脂多糖是分子的糖部分保持完整而分子的類脂A部分已被化學改性、從而具有非常低毒性的脂多糖。13.權利要求11的疫苗佐劑，其中無毒脂多糖是從紅假單胞菌種分離出的。14.權利要求13的疫苗佐劑，其中紅假單胞菌選自由球形紅假單胞菌(R.sphaeroides)、嗜酸紅假單胞菌(R.acidophilia)、胚素紅假單胞菌(R.blastica)、膠原紅假單胞菌(R.gelatinosa)、莢膜紅假單胞菌(R.capsulata)、池沼紅假單胞菌(R.palustris)和綠霉紅假單胞菌(R.Viridis)組成的一組。15.權利要求10的疫苗佐劑，其中無毒脂多糖是去毒脂多糖。16.權利要求10的疫苗佐劑，其中表面活性共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為5200，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為5%。17.權利要求10的疫苗佐劑，其中表面活性共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為5200，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為15%。18.權利要求10的疫苗佐劑，其中表面活性共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4600，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。19.權利要求10的疫苗佐劑，其中表面活性共聚物具有下式其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。20.權利要求10的疫苗佐劑，其中表面活性共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3250，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。21.一種佐劑，含有a、油b、適于形成油包水乳劑的非離子表面活性劑c、二氧化硅d、表面活性共聚物，含有其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%。22.權利要求21的佐劑，其中油是動物油。23.權利要求22的佐劑，其中動物油是角鯊烷。24.權利要求21的佐劑，其中非離子表面活性劑是一油酸脫水山梨醇酯。25.權利要求21的佐劑，其中共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4600，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。26.一種提高人或動物對抗原免疫應答的方法，包括以下步驟a、將該抗原與佐劑混合，佐劑含有ⅰ、油ⅱ、適于形成油包水乳劑的非離子表面活性劑ⅲ、二氧化硅ⅳ、表面活性共聚物，含有其中疏水基(C3H6O)的分子量約為3000-9000，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為3%-15%。b、給人或動物施用該抗原和佐劑的混合物。27.權利要求26的方法，其中油是動物油。28.權利要求27的方法，其中動物油是角鯊烷。29.權利要求26的方法，其中非離子表面活性劑是一油酸脫水山梨醇酯。30.權利要求26的方法，其中共聚物具有下式結構其中疏水基(C3H6O)的分子量約為4600，親水基(C2H4O)的重量百分數(shù)約為10%。全文摘要本發(fā)明包括佐劑，當該佐劑與抗原混合并給人或動物施用時，比起單獨施用抗原，對該抗原引起更強的免疫應答。在很多情況下，本發(fā)明所述佐劑將增加對該抗原具有特異性的特異同型抗體的總滴度。例如，在鼠中，當本發(fā)明的佐劑與常規(guī)的抗原混合時，在鼠中誘導的同型，從占優(yōu)勢的IgG1轉化為更具保護性的IgG2同型，有些情況下轉化為IgG3同型。因此，通過實施本發(fā)明，可以改造常規(guī)疫苗的總體保護作用。文檔編號A61K39/39GK1060027SQ91105280公開日1992年4月8日申請日期1991年6月27日優(yōu)先權日1990年6月27日發(fā)明者R·L·亨特,K·K·塔卡亞瑪申請人:埃默里大學