專(zhuān)利名稱(chēng)：三環(huán)化合物，其生產(chǎn)方法以及含該化合物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有藥物活性的新三環(huán)化合物及其生產(chǎn)方法以及含有這些化合物的藥物組合物。
更具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明涉及新的三環(huán)化合物，它們具有諸如免疫抑制活性，抗微生物活性等等藥物活性，本發(fā)明也關(guān)系到這些化合物的生產(chǎn)方法以及含有這些化合物的藥物組合物及應(yīng)用。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的三環(huán)化合物，該化合物可用于治療和預(yù)防移植排斥，由骨髓移植引起的宿主抗移植體病，自身免疫疾病，傳染病等等。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供以發(fā)酵法和合成法來(lái)生產(chǎn)該三環(huán)化合物的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供含該三環(huán)化合物作為活性組份的藥物組合物。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供該三環(huán)化合物的應(yīng)用，將其制成用于治療和預(yù)防移植排斥，由骨髓移植引起的宿主抗移植體病，自身免疫病、傳染病等等的藥劑。
關(guān)于本發(fā)明，應(yīng)注意到，它是根據(jù)某些新的特殊化合物的首次新發(fā)現(xiàn)而提出的，這些化合物即FR-900506，F(xiàn)R-900520，F(xiàn)R-900523和FR-900525物質(zhì)。更詳細(xì)地說(shuō)，純的FR-900506 FR-900520，F(xiàn)R-900523和FR-900525物質(zhì)首次最新從屬于鏈霉菌屬的新菌種發(fā)酵培養(yǎng)液中分離獲得的。
為說(shuō)明FR-900506、FR-900520、FR-900523，和FR-900525物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步研究結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人成功地測(cè)定了這些物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)并成功地生產(chǎn)出本發(fā)明的三環(huán)化合物。
本發(fā)明的新的三環(huán)化合物可以下面的通式表示
其中R1是羥基或被護(hù)羥基，基，R2是氫、羥基或被護(hù)羥基，R3是甲基、乙基、丙基或烯丙基，n是整數(shù)1或2，而實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)代表單鍵或雙鍵。本發(fā)明也包括該通式化合物的鹽。
上述目的化合物(Ⅰ)中，發(fā)現(xiàn)下面四種化合物可由發(fā)酵生產(chǎn)。
(1).化合物(Ⅰ)，其中R1和R2各為羥基、R3是烯丙基、n是整數(shù)2、而實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)符號(hào)系單鍵，此化合物稱(chēng)為FR-900506物質(zhì);
(2)化合物(Ⅰ)，其中R1和R2各為羥基、R3是乙基、n是整數(shù)2，實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)符號(hào)系單鍵，此化合物稱(chēng)為FR-900520物質(zhì)(又名WS7238A物質(zhì));
(3)化合物(Ⅰ)，其中R1和R2各為羥基、R3是甲基、n是整數(shù)2，實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)符號(hào)表示單鍵，此化合物稱(chēng)為FR-900523物質(zhì)(又名WS7238B物質(zhì));
(4)化合物(Ⅰ)，其中R1和R2各為羥基、R3是烯丙基，n是整數(shù)1，實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)符號(hào)系單鍵，此化合物稱(chēng)之為FR-900525物質(zhì)。
關(guān)于本發(fā)明的三環(huán)化合物，應(yīng)理解為有一個(gè)或多個(gè)構(gòu)象異構(gòu)體或立體異構(gòu)體對(duì)存在，例如旋光異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體，因?yàn)橛胁粚?duì)稱(chēng)碳原子(一個(gè)或多個(gè))和雙鍵(一個(gè)或多個(gè))存在，本發(fā)明也包括這些異構(gòu)體。
按照本發(fā)明，目的三環(huán)化合物(Ⅰ)可由下面的方法制備〔Ⅰ〕發(fā)酵法
〔Ⅱ〕合成法(1)方法Ⅰ(引入保護(hù)羥基基團(tuán))
(2)方法2(引入保護(hù)羥基基團(tuán))
(3)方法3(形成雙鍵)
(4)方法4(羥乙撐基團(tuán)的氧化)
(5)方法5(烯丙基基團(tuán)的還原)
<p>其中R1、R2、R3、n和實(shí)線(xiàn)虛線(xiàn)符號(hào)定義均同前，R1a和R2a均為被護(hù)羥基，而R2b系離去基團(tuán)。
上述定義的細(xì)目以及優(yōu)選實(shí)施方案下面將詳細(xì)解釋。
在本說(shuō)明書(shū)中使用的“低”這一名詞，除另有說(shuō)明外，表示1-6個(gè)碳原子。
至于“被護(hù)羥基”這一詞、適宜的保護(hù)羥基基團(tuán)可以包括低烷基硫代甲基這類(lèi)1-(低烷基硫代)低烷基(例如甲基硫代甲基，乙基硫代甲基、丙基硫代甲基、異丙基硫代甲基、丁基硫代甲基、異丁基硫代甲基、己基硫代甲基)等等，優(yōu)選的是C1-C6烷基硫代甲基，而最優(yōu)選的是甲基硫代甲基;
三低烷基甲硅烷基這樣的三取代甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三丁基甲硅烷基、叔-丁基-二甲基甲硅烷基、三-叔-丁基甲硅烷基等等)，還有低烷基-二芳基甲硅烷基(例如甲基-二苯基甲硅烷基、乙基-二苯基甲硅烷基、丙基-二苯基甲硅烷基、叔-丁基-二苯基甲硅烷基等等)以及類(lèi)似基團(tuán)。其中優(yōu)選的是三(C1-C4)烷基甲硅烷基和C1-C4烷基-二苯基甲硅烷基，而最優(yōu)選的是叔-丁基-二甲基甲硅烷基和叔-丁基-二苯基甲硅烷基;
從羧酸和磺酸衍生的酰基例如脂肪?；?、芳酰基以及芳基取代的脂肪?；鹊?。
脂肪?；梢园ê粋€(gè)或多個(gè)適當(dāng)取代基(如羧基)這樣的低級(jí)烷?；?例如甲?；⒁阴；?、丙?；⒍□；惗□；?、戊酰基、異戊?；?、新戊?；?、己?；?、羧乙酰基、羧丙酰基、羧丁酰基、羧己?；鹊?，含一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)取代基(如低烷基)的環(huán)(低)烷氧基(低)烷?；?例如環(huán)丙氧基乙?；?、環(huán)丁氧基丙酰基、環(huán)庚氧基丁酰基、 氧基乙酰基、氧基丙?；?氧基丁?；?氧基庚?；?氧基己?；鹊?、也包括樟腦磺酰基等等。
芳?；梢园ㄓ幸粋€(gè)或多個(gè)適當(dāng)取代基(如硝基)的芳酰基(例如苯甲?；?、甲苯?；?、二甲苯酰基、萘酰基、硝基苯基、二硝基苯基、硝基萘?；鹊?，有一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)取代基(如鹵素)的芳基磺?；?例如苯磺?；⒓妆交酋；⒍妆交酋；⑤粱酋；⒎交酋；⒙缺交酋；?、溴苯磺?；⒌獗交酋；鹊?以及類(lèi)似基團(tuán)。
以芳基團(tuán)取代的脂肪?；梢园ň哂幸粋€(gè)或多個(gè)適當(dāng)取代基(如低烷氧基和三鹵代(低)烷基)的芳(低)烷酰基(例如苯基乙?；?、苯基丙酰基、苯基丁?；?、2-三氟甲基-2-甲氧基-2-苯基乙?；?、2-乙基-2-三氟甲基-2-苯基乙?；?-三氟甲基-2-丙氧基-2-苯基乙酰基等等)以及類(lèi)似基團(tuán)。
業(yè)已定義的更為優(yōu)選的?；梢允荂1-C4烷?；?該C1-C4烷酰基可帶有羧基)，環(huán)(C5-C6)烷氧基(C1-C4)烷酰基(環(huán)烷上有二個(gè)(C1-C4)烷基基團(tuán))、樟腦磺?；?、帶有一個(gè)或二個(gè)硝基的苯甲?；?，帶有鹵素的苯磺酰基、帶有C1-C4烷氧基和三鹵代(C1-C4)烷基的苯(C1-C4)烷酰基，而最優(yōu)的是乙?；缺；?、 氧基乙?；⒄聊X磺?；⒈郊柞；?、硝基苯甲酰基、二硝基苯甲酰基、碘苯磺酰基以及2-三氟甲基-2-甲氧基-2-苯乙?；?br> 適合的離去基團(tuán)可以是羥基、酰氧基，該酰氧基的?；糠挚梢允巧厦媪信e的那些?；约邦?lèi)似基團(tuán)。
下面詳細(xì)解釋本發(fā)明的三環(huán)化合物(Ⅰ)的生產(chǎn)方法。
〔Ⅰ〕發(fā)酵法可以將能產(chǎn)生FR-900506、FR-900520、FR-900523和/或FR-900525物質(zhì)的菌株在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵來(lái)制備FR-900506、FR-900520、FR-900523和FR-900525物質(zhì)。該菌株屬于鏈霉菌屬，例如Streptomyces tsukubaensis No.9993和Streptomyces hygroscopicus subsp.yakushimaensis亞種No.7238。
用于生產(chǎn)FR-900506、FR-900520、FR-900523和FR-900525物質(zhì)的微生物將在下面詳述。
〔A〕將產(chǎn)生FR-900506、FR-900520和/或FR-900525物質(zhì)的菌株在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵、可以生產(chǎn)本發(fā)明的FR-900506、FR-900520和FR-900525物質(zhì)，該菌株屬于鏈霉菌屬，例如Streptomyces tsukubaensis No.9993。
微生物用于生產(chǎn)FR-900506、FR-900520和/或FR-900525物質(zhì)的微生物是屬于能夠產(chǎn)生FR-900506、FR-900520和/或FR-900525物質(zhì)的鏈霉菌屬菌株，其中，Streptomyces tsukubaensis No.9993是最近從日本Ibaraki縣Toyosato-Cho，Tsukuba-gun采集的土壤樣品中分離出來(lái)的。
新分離出的Streptomyces tsukubaensis No.9993凍干樣品已貯存于工業(yè)科學(xué)技術(shù)廳發(fā)酵研究所(No1-3，Higashi 1-Chome，yatabemachi Tsukuba-gun、Ibaraki縣，日本)貯存號(hào)為FERMp-7886，貯存日期1984年10月5日，并且后又按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，于1985年10月19日在同一貯存處更改為新的貯存號(hào)FERM BP-927。該菌種已于1985年11月4日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No.0083。
應(yīng)當(dāng)了解新的FR-900506、FR-900520和/或FR-900525物質(zhì)的生產(chǎn)并不局限于使用在這里描述的特殊微生物，這里給出的僅為說(shuō)明而言，本發(fā)明也包括使用任何能產(chǎn)生FR-900506、FR-900520，和/或FR-900525物質(zhì)的突變種，包括天然突變種以及人工突變種，該人工突變種可用常規(guī)方法從上述的有機(jī)體產(chǎn)生，例如用X射線(xiàn)、紫外線(xiàn)照射、用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、2-氨基嘌呤處理等等類(lèi)似方法。
鏈霉菌No.9993有下述形態(tài)、培養(yǎng)、生物及生理特征〔1〕形態(tài)特征主要采用由Shirling和Gottlieb敘述的方法(Shirling.E.B.和D.GottliebMethods for characterization of Streptomyces species，International Journal of Systematic Bacteriology.16，313-340，1966)進(jìn)行分類(lèi)學(xué)研究。
用光學(xué)和電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察于30℃在燕麥粉瓊脂、麥芽-酵母提取瓊脂和無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂上生長(zhǎng)14天的培養(yǎng)物。成熟的孢囊柱形成Rectiflexibiles，每一鏈上10-50或50以上個(gè)孢子，用電子顯微鏡觀(guān)察孢子是長(zhǎng)方形或圓柱形、0.5-0.7×0.7-0.8微米大小，孢子表面是光滑的。
〔2〕培養(yǎng)特征用上面提到的Shirling和Gottlieb以及Wa-ksman(Waksman，S.A.放線(xiàn)菌目第2卷屬和種的分類(lèi)、鑒定和描述。The Williams and Wilkins Co.，Baltimore，1961)介紹的十種培養(yǎng)基來(lái)觀(guān)察培養(yǎng)特征。
于30℃溫育14天，在這一研究中使用的顏色名稱(chēng)根據(jù)Guide染色標(biāo)準(zhǔn)(由Nippon Shikisai Kenkyusho.Tokyo出版的手冊(cè))，當(dāng)在燕麥粉瓊脂、酵母-麥芽提取物瓊脂和無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂上生長(zhǎng)時(shí)，菌落屬于灰色系?？扇苄陨卦诮湍?麥芽提取物瓊脂中產(chǎn)生，但不在其它培養(yǎng)基中產(chǎn)生。其結(jié)果示于表Ⅰ。

細(xì)胞壁分析采用Becker等(Becker，B.，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon and H.A.Lechevalier;以整體細(xì)胞水解物的紙層析法快速鑒別諾卡氏菌和鏈霉菌Appl.Microbiol.，12，421-423，1964)和yamaguchi(yamaguchi，T.形態(tài)上截然不同的放線(xiàn)菌目的細(xì)胞壁成份比較J.Bacteriol，89，444-453，1965)的方法。菌株No.9993的整體細(xì)胞水解產(chǎn)物分析表明存在LL-二氨基庚二酸。因此，確信此菌株應(yīng)屬類(lèi)型Ⅰ。
〔3〕生物和生理特性菌株No.9993的生理特性按照上面提到的由Shirling和Gottlieb描寫(xiě)的方法測(cè)定。其結(jié)果列于表2。使用溫度梯度培養(yǎng)器(由Toyo Kagaku Sangyo Co.，Ltd制造)于酵母-麥芽提取物瓊脂上測(cè)定生長(zhǎng)溫度范圍和最佳生長(zhǎng)溫度范圍。生長(zhǎng)溫度范圍為18-35℃，最佳溫度為28℃。牛奶凍化和膠液化為陽(yáng)性，黑色素產(chǎn)生為陰性。
碳源利用按照Pridham和Gattlieb(Pridham，T.G.和D.Gottlieb通過(guò)某些放線(xiàn)菌目碳源的利用輔助測(cè)定菌種J.Bacteriol.，56，107-114，1948)的方法測(cè)定。于30℃溫育14天以后觀(guān)察生長(zhǎng)情況。
菌株的碳源利用匯總列于表3。甘油、麥芽糖和琥珀酸鈉可被菌株No.9993利用。并且、無(wú)疑地D-葡萄糖、蔗糖、D-甘露糖和柳醇的利用也可觀(guān)察到。
表3 菌株No.9993和鏈霉菌Streptomyces misakiensis IFO 12891碳源利用碳源 No.9993 IFO 12891D-葡萄糖 ± -蔗糖 ± -甘油 + -D-木糖 - -D-果糖 - -乳糖 - -麥芽糖 + -鼠李糖 - -棉籽糖 - -D-半乳糖 - +L-阿拉伯糖 - -D-甘露糖 ± -D-海藻 - -肌醇 - -D-甘露糖醇 - -菊粉 - +纖維素 - -柳醇 ± -幾丁質(zhì) - ±檸檬酸鈉 - -琥珀酸鈉 + -醋酸鈉 - -符號(hào)+利用 ±不肯定利用-不利用菌株No.9993的顯微研究和細(xì)胞壁組成分析表明該菌株屬鏈霉菌屬Waksman和Henrici1943)。
于是，將該菌株與出版的說(shuō)明書(shū)中所介紹的各種鏈霉菌〔International Journal of Systematic Bacteriology 18.69 to 189，279 to 392(1968)和19.391 to 512(1969)，and細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)(Bergy′s Manual of Determinative Bacteriology)第8版(1974)〕進(jìn)行了比較。
比較結(jié)果，認(rèn)為菌株No.9993與Streptomyces aburaviensis、Streptomyces(Nishimura等)avellaneus(Baldacci和Grein)和Streptomyces misakiensis(Nakamura)相似。因此將菌株No.9993的培養(yǎng)特征與相應(yīng)的Streptomyces aburaviensis IFO 12830，Streptomyces avellaneus IFO 13451和Streptomyces misakiensis IFO 12891相比較。結(jié)果，菌株No.9993與Streptomyces misakiensis IFO 12891最相似，因此菌株No.9993進(jìn)一步與Streptomyces misakiensis IFO 12891比較，結(jié)果示于上述表1、2和3中。進(jìn)一步比較的結(jié)果，看出菌株No.9993在下述幾點(diǎn)上與Streptomyces misakiensis IFO 12891有區(qū)別，因此菌株No.9993被認(rèn)為是一種新的鏈霉菌菌種，稱(chēng)之為Streptomyces tsukubaensis sp.nov.，來(lái)源于取自Tsukuba-gun的分離出該生物的土壤。
Streptomyces misakiensis IFO 12891的差別菌株No.9993和Streptomyces misakiensis IFO 12891在燕麥瓊脂、麥芽-酵母提取瓊脂、葡萄糖-天門(mén)冬酰胺瓊脂，Czapek瓊脂和馬鈴薯-右旋糖瓊脂上的培養(yǎng)特性不同。
菌株No.9993的淀粉水解是陰性，而Streptomyces misakiensis IFO 12891的淀粉水解為陽(yáng)性。
菌株No.9993明膠液化為陽(yáng)性，而Streptomyces misakiensis IFO 12891的明膠液化為陽(yáng)性。
在碳源利用上，菌株No.9993可利用甘油、麥芽糖和琥珀酸鈉，但Streptomyces misakiensis IFO 12891不能利用這些，而菌株No.9993不可能用D-半乳糖和菊粉，但Streptomyces misakiensis IFO 12891卻可以利用這些。
FR-900506，F(xiàn)R-900520和FR-900525物質(zhì)的生產(chǎn)將能產(chǎn)生FR-900506、FR-900520和/或FR-900525物質(zhì)的屬于鏈霉菌屬(例如Streptomyces tsukuba-ensis No.9993，F(xiàn)ERM BP-927)的菌株在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)可生產(chǎn)本發(fā)明的新的FR-900506、FR-900520和FR-900525物質(zhì)。
一般情況下，將能產(chǎn)生FR-900506、FR-900520和/或FR-900525物質(zhì)的菌株在含有可同化的碳和氮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中、最好是需氧條件下培養(yǎng)(例如振動(dòng)培養(yǎng)、浸沒(méi)培養(yǎng)等等)可生產(chǎn)FR-900506，F(xiàn)R-900520和/或FR-900525物質(zhì)。
在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中較好的碳源是碳水化合物，例如葡萄糖、木糖、半乳糖、甘油、淀粉、糊精等等。其它的為麥芽糖、鼠李糖、棉籽糖、阿拉伯糖、甘露糖、水楊苷、琥珀酸鈉等等。
優(yōu)選的氮源是酵母提取物、胨、谷膠粉、棉籽粉、豆粉、玉米浸液、干酵母、小麥胚種、羽毛粉、花生粉等等以及無(wú)機(jī)和有機(jī)氮化合物例如銨鹽(如硝酸銨、硫酸銨、磷酸銨等等)，尿素、氨基酸等等。
碳和氮源、雖結(jié)合采用有利、卻并不需其純凈物質(zhì)，因?yàn)楹形⒘可L(zhǎng)因素和相當(dāng)多的礦物養(yǎng)料的低純度材料也是合用的。假如必要還可以在培養(yǎng)基中加入一些礦物鹽，例如碳酸鈉或碳酸鈣、磷酸鈉或磷酸鉀、氯化鈉或氯化鉀、碘化鈉或碘化鉀、鎂鹽、銅鹽、鈷鹽等等。特別當(dāng)培養(yǎng)基泡沫嚴(yán)重時(shí)，若有必要，還可加入消沫劑，例如液體石蠟、脂肪油、植物油、礦物油或硅氧烷。
大量生產(chǎn)FR-900506、FR-900520和FR-900525物質(zhì)，以浸沒(méi)需氧培養(yǎng)條件為好，而少量生產(chǎn)則采用燒瓶或瓶子中的振動(dòng)培養(yǎng)或表面培養(yǎng)。為了避免在FR-900506、FR-900520和FR-900525物質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中生長(zhǎng)遲滯，生長(zhǎng)在大罐中進(jìn)行時(shí)，最好使用營(yíng)養(yǎng)態(tài)微生物在生產(chǎn)罐中接種。因此首先將用微生物的芽孢或菌絲接種到相對(duì)少量的培養(yǎng)基，生成該微生物的營(yíng)養(yǎng)接種物并培養(yǎng)上述經(jīng)過(guò)接種的培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)過(guò)的營(yíng)養(yǎng)接觸物無(wú)菌轉(zhuǎn)移到大罐中。產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)接種物的培養(yǎng)基與用于生產(chǎn)FR-900506，F(xiàn)R-900520和FR-900525物質(zhì)的培養(yǎng)基大體相同或稍有差別。
培養(yǎng)混合物攪拌和充氧可以以各種方式來(lái)完成。可由螺旋漿或類(lèi)似機(jī)械攪拌裝置，可由旋轉(zhuǎn)或振動(dòng)發(fā)酵罐，可由各種充氣裝置或通過(guò)通向培養(yǎng)基的無(wú)菌空氣通道等手段來(lái)提供攪拌。通過(guò)發(fā)酵混合物的無(wú)菌空氣可有效地充氧。
發(fā)酵通常在20℃-40℃左右進(jìn)行，最好是25-35℃，時(shí)間為50小時(shí)-150小時(shí)，隨發(fā)酵條件和生產(chǎn)規(guī)模不同而異。
產(chǎn)生的FR-900506、FR-900520和/或FR-900525物質(zhì)，可以用回收別的已知生物活性物質(zhì)所使用的常規(guī)方法從培養(yǎng)基回收。產(chǎn)生的FR-900506、FR-900520和FR-900525物質(zhì)在培養(yǎng)菌絲體和濾液中得到，并且該FR-900506、FR-900520和FR-900525物質(zhì)可從通過(guò)將培養(yǎng)物過(guò)濾或離心培養(yǎng)液得到的菌絲體和濾液中分離和提純，分離提純的方法可采用常規(guī)方法如減壓濃縮、冷凍干燥、用常規(guī)溶劑萃取、調(diào)節(jié)PH值、用常規(guī)樹(shù)脂處理(例如陰離子或陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，非離子吸附樹(shù)脂等等)、用常規(guī)吸附劑處理(例如活性炭、硅酸、硅膠、纖維素、氧化鋁等等)、結(jié)晶、重結(jié)晶等等類(lèi)似方法。
FR-900506、FR-900520和FR-900525物質(zhì)的生理和化學(xué)特性按上述方法生產(chǎn)的FR-900506、FR-900520和FR-900525物質(zhì)具有下述物理和化學(xué)性質(zhì)FR-900506物質(zhì)(1)形狀和顏色白色粉末(2)元素分析C64.72% H8.78% N1.59%64.59% 8.74% 1.62%(3)顯色反應(yīng)陽(yáng)性硫酸鈰反應(yīng)、硫酸反應(yīng)、Ehrlich反應(yīng)、Dragendorff反應(yīng)以及碘蒸汽反應(yīng)陰性氯化鐵反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)和Molish反應(yīng)(4)溶解性可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚以及苯。
難溶于正己烷、石油醚不溶于水(5)熔點(diǎn)85-90℃(6)旋光度〔α〕23D-73°(C＝0.8，CHCl3)(7)紫外吸收光譜尾端吸收(8)紅外吸收光譜CHCl3極大值3680 3580 3520 2930 2870 28301745 1720 1700 1645 1450 13801350 1330 1310 1285 1170 11351090 1050 1030 1000 990 960(sh)918(厘米-1)(9)13C核磁共振譜δ(ppm、CDCl3)
(10)1H核磁共振譜示于圖2(11)薄層色譜固定相 展開(kāi)溶劑 Rf值氯仿甲醇(10∶1，v/v)，0.58硅膠板 乙酸乙酯 0.52(12)物質(zhì)性質(zhì)中性物質(zhì)有關(guān)FR-900506物質(zhì)，需注意到當(dāng)測(cè)定13C和1H核磁共振譜時(shí)，該物質(zhì)在各種化學(xué)位移中顯示出幾對(duì)信號(hào)。
因此FR-900506物質(zhì)還具有下述特性
(ⅰ)于25℃和60℃測(cè)定13C核磁共振譜揭示了其中各種信號(hào)的每一對(duì)的強(qiáng)度都不同。
(ⅱ)薄層色譜和高壓液相色譜表明，F(xiàn)R-900506物質(zhì)在薄層色譜中為一點(diǎn)，在高壓液相色譜中為一單峰。
可以將此白色粉末FR-900506物質(zhì)從乙腈中重結(jié)晶變成結(jié)晶形式，該晶體具有如下物理和化學(xué)性質(zhì)。
(1)形狀和顏色無(wú)色棱晶(2)元素分析C64.30% H8.92% N1.77%64.20% 8.86% 1.72%(3)熔點(diǎn)127°-120℃(4)旋光度〔α〕23D-84.4°(C＝1.02，CHCl3)(5)13C核磁共振譜δ(ppm CDCl3)
其譜圖示于圖3(6)1H核磁共振譜示于圖4。
其它物理化學(xué)性質(zhì)，即顯色反應(yīng)、溶解性、紫外吸收光譜、紅外吸收光譜，薄層色譜以及FR-900506物質(zhì)的無(wú)色棱晶物質(zhì)的性質(zhì)在相同條件下與該物質(zhì)的白色粉末狀物相同。
根據(jù)上述物理化學(xué)性質(zhì)以及X射線(xiàn)衍射分析，可以確定FR-900506物質(zhì)結(jié)構(gòu)如下
17-烯丙基-1，14-二羥基-12-〔2-(4-羥基-3-甲氧環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-23、25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22，3，1，04.9〕二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮FR-900520物質(zhì)紅外吸收光譜νCHCl3極大值3680 3575 3520 2940 2875 28251745 1725 1700 1647 1610(sh) 14521380 1350 1330 1285 1170 11351090 1030 1005 990 980(sh)960(sh) 913 908(sh)厘米-1FR-900525物質(zhì)(1)形狀和顏色白色粉末(2)元素分析C65.17%，H8.53%，N1.76%(3)顯色反應(yīng)陽(yáng)性硫酸鈰反應(yīng)，硫酸反應(yīng)，Enrlich反應(yīng)，Dragendorff反應(yīng)和碘蒸汽反應(yīng)陰性氯化鐵反應(yīng)，茚三酮反應(yīng)和Molish反應(yīng)(4)溶解性可溶于甲醇、乙醇，丙酮、乙酸乙酯，氯仿、乙醚和苯難溶于正己烷，石油醚不溶于水(5)熔點(diǎn)85-89℃(6)旋光度〔α〕23D-88°(C＝1.0，CHCl3)(7)紫外吸收光譜尾端吸收(8)紅外吸收光譜CHCl3ν極大值3680 3580 3475 3340 2940 28802830 1755 1705 1635 1455 13821370 1330 1310 1273 1175 11351093 1050 1020 995 970 920 867(厘米-1)(9)13C核磁共振譜δ(ppm CDCl3)
譜圖示于圖5。
(10)1H核磁共振譜譜圖示于圖6(11)薄層色譜固定相 展開(kāi)溶劑 Rf值硅膠板 乙酸乙酯 0.34(12)物質(zhì)性質(zhì)中性有關(guān)FR-900525物質(zhì)，當(dāng)測(cè)定13C和1H核磁共振譜時(shí)注意到在各種化學(xué)位移中，該物質(zhì)顯示出幾對(duì)信號(hào)，而當(dāng)測(cè)定薄層色譜和高壓液相色譜時(shí)，該物質(zhì)在薄層色譜中顯示出單點(diǎn)、在高壓液相色譜中顯示出單峰。
從上述物理和化學(xué)性質(zhì)以及成功地測(cè)定FR-900506物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以確定FR-500525物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
16-烯丙基-1，13-二羥基-11-〔2-(4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基-1-甲代乙烯基-22，24-二甲氧基-12，18，20，26-四甲基-10，27-二氧雜-4-氮雜三環(huán)-〔21，3，1，04.8〕二十七碳-17-烯-2，3，9，15-四酮。
〔B〕可以將能產(chǎn)生FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)屬于鏈霉菌屬的菌株例如Streptomyces hygroscopicus subsp.akushimaensis No.7238在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵來(lái)制備本發(fā)明的FR-900520和FR-900523物質(zhì)。
微生物用于生產(chǎn)FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)的微生物是能產(chǎn)生FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)的、屬于鏈霉菌屬的菌株，其中Streptomyces hygroscopicus subsp.yakushimaensis No.7238是最近從日本kagoshima縣yakushima采集的土壤樣品中分離得到的。
新分離出的Streptomyces hygroscopicus subsp.yakushimaensis No.7238凍干樣品已貯存于工業(yè)科學(xué)和技術(shù)廳發(fā)酵研究所(No.1-3Higashi 1-Chome yatabemachi Tsukuba-gun，Ibaraki縣，日本)，貯存號(hào)為FERM P-8043(貯存日期1985年1月12日)，然后按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，1985年10月19日，于同一貯存地貯存，轉(zhuǎn)換成新貯存號(hào)FERM BP-928。該菌種已于1985年11月4日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCE No.0082。
應(yīng)當(dāng)了解，生產(chǎn)新的FR-900520和FR-900523物質(zhì)并不限于使用在此敘述的特殊生物，這里提到的僅用于說(shuō)明。本發(fā)明也包括使用任何能產(chǎn)生FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)的突變體，包括天然突變體以及人工突變體，該突變體可以通過(guò)常規(guī)方法從上述微生物產(chǎn)生，例如X-射線(xiàn)照射，紫外線(xiàn)照射，用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍，2-氨基嘌呤處理等等類(lèi)似方法。
Streptomyces hygroscopicus subsp.yakushimaensis No.7238具有如下形狀、培養(yǎng)、生物及生理物征〔1〕形態(tài)特征主要采用由Shirling和Gottlieb(Shirling，E.B.and D.Gottlieb表示鏈霉菌種特性的方法International Journal of Systematic Bacteriology，16，313-340，1966)描述的進(jìn)行分類(lèi)學(xué)研究。
用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，對(duì)在燕麥粉瓊脂、麥芽-酵母提取瓊脂和淀粉-無(wú)機(jī)鹽瓊脂上培養(yǎng)14天(于30℃)的生長(zhǎng)情況作形態(tài)觀(guān)察，成熟的孢囊柱中等長(zhǎng)短，以每個(gè)鏈20個(gè)左右孢子形成Retinaculiaperti和螺旋形。在燕麥瓊脂和淀粉-無(wú)機(jī)鹽瓊脂上的氣菌絲中發(fā)現(xiàn)吸水孢子團(tuán)。孢子上表面不平整程度介于極短而厚的楞和肉贅形態(tài)之間。
〔2〕培養(yǎng)特征以上面提到的Shirling和Gottlieb敘述的，以及由Waksman(Waksman，S.A.放線(xiàn)菌目，Vol.2.屬和種的分類(lèi)、鑒別和描述)The Williams and Wilkins Co.，Baltimore，1961)敘述的10種培養(yǎng)基觀(guān)察培養(yǎng)特征。
于30℃溫育14天，此研究中使用的顏色命名根據(jù)Guide顯色標(biāo)準(zhǔn)(由Nippon Shikisai kenkyusho出版的手冊(cè)，東京)。當(dāng)在燕麥粉瓊脂，麥芽-酵母提取瓊脂和淀粉無(wú)機(jī)鹽瓊脂上生長(zhǎng)時(shí)，菌落屬于灰色系列。在試驗(yàn)培養(yǎng)基中不產(chǎn)生可溶性色素，其結(jié)果列于表4中。

用Becker等人〔Becker，B.，M.P.Leche-valier，R.E.Gordon和H.A.Lechevalier細(xì)胞壁全水解產(chǎn)物的紙色譜分析快速鑒別諾卡氏菌屬和鏈霉菌屬Appl.Microbiol.，12，421-423，1964〕和yamaguchi〔yamaguchi，T.形態(tài)學(xué)性質(zhì)不同的放線(xiàn)菌類(lèi)的細(xì)胞壁組成的比較J.Bacteriol.，89，444-453，1965〕的方法進(jìn)行細(xì)胞壁分析。No.7238菌株的細(xì)胞全水解產(chǎn)物的分析表明存在LL-二氨基庚二酸。因此，可認(rèn)為這種菌株的細(xì)胞壁是Ⅰ型。
〔3〕生物和生理特性按照上述的Shirling和Gottlieb介紹的方法測(cè)定No.7238菌株的生理特性，結(jié)果列于表5。用一種溫度梯度細(xì)菌培養(yǎng)器(Toyo kagaku Sangyo公司制造)測(cè)定在酵母-麥芽提取物瓊脂上生長(zhǎng)的溫度范圍和最佳溫度。生長(zhǎng)的溫度范圍是18-36℃，最佳溫度是28℃。淀粉水解作用和凝膠液化作用是陽(yáng)性。沒(méi)有產(chǎn)生以黑色素為特征的色素。
按照Pridham和Gottlieb的方法〔Pridham，T.G.and D.Gottlieb供助若干放線(xiàn)菌作菌種測(cè)定的碳化物的利用J.Bacteriol，56，107-114，1948〕研究碳源的利用。在30℃，培育14天后觀(guān)察生長(zhǎng)情況。
這種菌株的碳源利用列于表6。No.7238菌株可利用D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、D-海藻糖、肌醇、菊粉和水楊苷。
表6 菌株No.7238、Streptomyces antimycoticus IFO12839Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosus IFO 13786的碳源利用碳源 No.7238 IFO12839 IFO13786D-葡萄糖 + + +蔗糖 + + +甘油 - + +D-木糖 - ± +D-果糖 - + +乳糖 + + -麥芽糖 + - +鼠李糖 - + -棉籽糖 - + +D-半乳糖 - + +L-阿拉伯糖 - ± ±D-甘露糖 - + +
碳源 No.7238 IFO12839 IFO13786D-海藻糖 + ± +肌醇 + + +D-甘露糖醇 - + +菊粉 + + -纖維素 ± - -水楊苷 + + -幾丁質(zhì) ± - -檸檬酸鈉 - - ±琥珀酸鈉 - + +醋酸鈉 - - -符號(hào)說(shuō)明+有利用±難以肯定利用-不利用No.7238菌株的顯微鏡研究和細(xì)胞壁組成分析表明這種菌株屬于Waksman和Henrici1943年發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌屬。
因此，按照已公開(kāi)的說(shuō)明(International Journal of Systematic Bacteriology，18，69 to 189，279 to 392(1968)and 19，391 to 512(1969)，andBergy′s細(xì)菌學(xué)測(cè)定手冊(cè)8th Edition(1974)〕可把這種菌株與各種鏈霉菌種進(jìn)行比較。
比較的結(jié)果，認(rèn)為No.7238菌株類(lèi)似于1957年Waksman發(fā)現(xiàn)的Streptomyces antimycoticus和1962年Ohmori等人發(fā)現(xiàn)的Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosus。因此，No.7238菌株的培養(yǎng)特性進(jìn)一步與相應(yīng)的Streptomyces antimycoticus IFO 12839和Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosus IFO 13786進(jìn)行比較，結(jié)果如上述的表4，5，和6。由比較結(jié)果可以看出，在下面的幾個(gè)方面，No.7238菌株與Streptomyces antimycoticus IFO 12839和Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosus是有區(qū)別的。
(ⅰ)與Streptomyces antimycoticus IFO 12839的差別在酵母-麥芽提取物瓊脂、葡萄糖-天冬酰胺瓊脂、甘油-天冬酰胺瓊脂、土豆-葡萄糖瓊脂和酷氨酸瓊脂上No.7238菌株的培養(yǎng)特性與Streptomyces antimycoticus IFO12839是不同的。
在碳源的利用方面，No.7238菌株可以利用麥芽糖，但是菌Streptomyces antimycoticus IFO 12839不能利用麥芽糖。并且，No.7238菌株不能利用甘油、D-果糖、鼠李糖、棉籽糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甘露糖醇和琥珀酸鈉，但是Streptomyces antimycoticus IFO12839可以利用它們。
(ⅱ)Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosus IFO 13786的差別在酵母-麥芽提取物瓊脂、土豆-葡萄糖瓊脂和酪氨酸瓊脂上No.7238菌株的培養(yǎng)特性與Streptomyces hygroscopicus subsp.的培養(yǎng)特性不同。
No.7238菌株的牛奶胨化作用是陰性，但Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosus IFO 13786的牛奶胨化作用是陽(yáng)性。No.7238菌株可以在7%的NaCl存在的情況下生長(zhǎng)，但是，Streptomyces是，吸hygroscopicus subsp.glebosus IFO 13786不能在同樣的條件下生長(zhǎng)。
在碳源的應(yīng)用方面，No.7238菌株可以利用乳糖、菊粉和水楊苷，但是，Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosusIFO 13786不能利用它們。No.7238菌株不能利用甘油、D-木糖、D-果糖、棉籽糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甘露糖醇和琥珀酸鈉，但是Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosus可以利用它們。
然而，在燕麥粉瓊脂和無(wú)機(jī)鹽-淀粉瓊脂上的氣生網(wǎng)狀菌絲體中，No.7238形成吸水的孢子體，并且其形態(tài)和培養(yǎng)特性和Streptomyces hygroscopicus subsp.glebosus IFO 13786類(lèi)似。因此，認(rèn)為No.7238菌株屬于Streptomyces hygroscopicus。雖然，在Streptomyces hygroscopicus亞種中，該已知菌株與No.7238菌株最為相似，但是，No.7238菌株與Streptomyces hygroscopicus glebosus IFO 13786不同。由上述的事實(shí)可以認(rèn)為No.7238菌株是Streptomyces hygroscopicus的一個(gè)新種，并命名為Streptomyces hygroscopicus subsp.與分離yakushimaensis subsp.nov.，該命名與分離出該微生物的、從yakushima收集來(lái)的土壤有關(guān)。
FR-900520和FR-900523物質(zhì)的生產(chǎn)通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于鏈霉菌屬(例如Streptomyceshygroscopicus subsp.yakushimaensis No.7238，F(xiàn)ERM BP-928)的能產(chǎn)生FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)的菌株，就可以生產(chǎn)新的FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)。
一般說(shuō)來(lái)，通過(guò)在含有可同化的碳和氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中，最好是在有氧的條件下(例如，振動(dòng)培養(yǎng)、浸沒(méi)培養(yǎng)等)培養(yǎng)能產(chǎn)生FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)的菌株就可生產(chǎn)FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)。
在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中較好的碳源是糖類(lèi)，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、淀粉、糊精等?？砂ǖ钠渌奶荚词躯溠刻?、D-海藻糖、肌醇、菊粉、水楊苷等。
較好的氮源是酵母提取物、胨、谷蛋白粉、棉子粉、大豆粉、玉米漿、干酵母、麥胚芽、羽毛粉、花生粉等，以及無(wú)機(jī)和有機(jī)氮化物，例如銨鹽(如硝酸銨、硫酸銨、磷酸銨等)、脲、氨基酸等。
雖然碳源和氮源一起使用是有利的，但是不需要用純的碳源和氮源，因?yàn)楹形⒘可L(zhǎng)因子和相當(dāng)量的礦物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不純的原料也是用的。當(dāng)需要的時(shí)候，可以把某些礦物鹽加到培養(yǎng)基中，這些礦物鹽是碳酸鈉或鈣、磷酸鈉或鉀、氯化鈉或鉀、碘化鈉或鉀、鎂鹽、銅鹽、鈷鹽和類(lèi)似的鹽。如果需要，特別是當(dāng)培養(yǎng)基嚴(yán)重發(fā)泡時(shí)，可以加消泡劑，如液體石蠟、脂油、植物油、礦物油或硅氧烷。
當(dāng)大量生產(chǎn)FR-900520和FR-900523物質(zhì)時(shí)，最在浸沒(méi)的通氣的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。少量生產(chǎn)時(shí)，用燒瓶或瓶子振動(dòng)或表面培養(yǎng)。此外，當(dāng)在大罐中進(jìn)行生長(zhǎng)時(shí)，最好用營(yíng)養(yǎng)體微生物在生產(chǎn)罐中接種，以便避免在生產(chǎn)FR-900520和FR-900523物質(zhì)的過(guò)程中生長(zhǎng)緩慢。因此，首先需要用微生物的孢子或網(wǎng)狀菌絲體接種較少量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)接過(guò)種的培養(yǎng)基，產(chǎn)生微生物營(yíng)養(yǎng)接種物，然后把所培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)接種物無(wú)菌轉(zhuǎn)移到大罐中。產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)接種物的培養(yǎng)基與生產(chǎn)FR-900520和FR-900523物質(zhì)所用的培養(yǎng)基基本上相同或不同。
培養(yǎng)混合物可以用多種方式攪動(dòng)并供氣?？梢杂寐菪凉{或類(lèi)似的機(jī)械攪拌設(shè)備、旋轉(zhuǎn)或振動(dòng)發(fā)酵器、各種泵送設(shè)備或通過(guò)培養(yǎng)基的無(wú)菌的空氣通道攪拌培養(yǎng)混合物。可以使無(wú)菌的空氣通過(guò)發(fā)酵混合物使之供氣。
通常進(jìn)行發(fā)酵的溫度為20℃-40℃，最好25-35℃，時(shí)間約50-150小時(shí)，根據(jù)發(fā)酵的條件和生產(chǎn)規(guī)模，溫度和時(shí)間可以變化。
因此，通過(guò)常規(guī)的通常用于回收其他已知的生物活性物質(zhì)的方法可以從培養(yǎng)基中回收所生成的FR-900520和/或FR-900523物質(zhì)。所生成的FR-900520和FR-900523物質(zhì)主要存在于培養(yǎng)的菌絲體中，因此，可以從菌絲體中分離并提純FR-900520和FR-900523物質(zhì)，通過(guò)過(guò)濾或離心分離培養(yǎng)液，通過(guò)常規(guī)的方法如減壓濃縮、冷凍干燥、用常規(guī)的溶劑抽提、調(diào)節(jié)PH值、用常規(guī)的樹(shù)脂(例如陽(yáng)或陰離子交換樹(shù)脂、非離子的吸附樹(shù)脂等)處理、用常規(guī)的吸附劑(例如活性炭、硅酸、硅膠、纖維素、氧化鋁等)處理、結(jié)晶、重結(jié)晶和類(lèi)似的方法可以得到FR-900520和FR-900523物質(zhì)。
特別是將發(fā)酵所產(chǎn)生的含有FR-900520和FR-900523產(chǎn)物的原料溶解在合適的溶劑例如乙酸乙酯、正己烷等中，然后把該溶液在硅膠柱上用合適的有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯和正己烷或它們的混合物進(jìn)行色譜分離，可以把FR-900520和FR-900523兩種物質(zhì)分開(kāi)。這樣分開(kāi)的FR-900520和FR-900523兩種物質(zhì)都可進(jìn)一步用常規(guī)方法，例如重結(jié)晶、再次用色譜法分離、高效液相色譜和類(lèi)似的方法提純。
FR-900520和FR-900523物質(zhì)的生理和化學(xué)特性FR-900520物質(zhì)(1)形態(tài)和顏色無(wú)色片狀(2)元素分析C64.81%，H8.82%，N1.55%(3)顯色反應(yīng)陽(yáng)性硫酸鈰反應(yīng)、硫酸反應(yīng)、埃爾利希反應(yīng)、道拉根道夫反應(yīng)和碘蒸汽反應(yīng)。
陰性氯化鐵反應(yīng)、水合茚三酮反應(yīng)和莫利施反應(yīng)。
(4)可溶性可溶的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二乙醚和苯。
微溶的正己烷、石油醚。
不溶的水。
(5)熔點(diǎn)163-165℃。
(6)旋光率〔α〕23D-84.1°(C＝1.0，CHCl3)(7)紫外吸收光譜末端吸收。
(8)紅外吸收光譜νCHCl33680 3575 3520 2940 2875 2825最大 1745 1725 1700 1647 1610(sh) 14521380 1350 1330 1285 1170 11351090 1030 1005 990 980(sh)960(sh) 913 908(sh)(厘米-1)(9)13C核磁共振譜
<p>
其譜圖示于圖7。
(10)1H核磁共振譜其譜圖示于圖8。
(11)薄層色譜固定相 展開(kāi)溶劑 Rf值硅膠板 氯仿∶甲醇(20∶1，v/v) 0.38乙酸乙酯 0.51(12)物質(zhì)的性質(zhì)中性物質(zhì)。
關(guān)于FR-900520物質(zhì)，應(yīng)注意到，在作13C和1H核磁共振譜測(cè)定時(shí)，這種物質(zhì)顯示出各種化學(xué)移位信號(hào)成對(duì)，然而，作薄層色譜和高效液體色譜測(cè)量時(shí)，F(xiàn)R-900520物質(zhì)分別在薄層色譜顯示單個(gè)的色譜斑，在高效液體色譜顯示單峰。
由上述的物理和化學(xué)性質(zhì)及成功的測(cè)定FR-900506物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可以確定FR-900520物質(zhì)有下面的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
17-乙基-1，14-二羥基-12〔2-(4-羥基-3-甲氧環(huán)己基)-1-甲基乙烯基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)-〔22.3.1.04.9〕二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮FR-900523物質(zhì)(1)形態(tài)和顏色無(wú)色針狀。
(2)元素分析C64.57%，H8.84%，N1.81%。
(3)顯色反應(yīng)陽(yáng)性硫酸鈰反應(yīng)、硫酸反應(yīng)、埃爾利希反應(yīng)、德拉根道夫反應(yīng)和碘蒸汽反應(yīng)。
陰性氯化鐵反應(yīng)和水合茚三酮反應(yīng)。
(4)可溶性可溶的甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、二乙醚和苯。
微溶的正己烷和石油醚。
不溶的水(5)熔點(diǎn)152-154℃。
(6)旋光率〔a〕23D-73.0°(C＝0.65，CHCl3)(7)紫外吸收光譜末端吸收。
(8)紅外吸收光譜νCHCl33670 3580 3510 2930 2875 2825最大 1745 1722 1700 1647 1450 13801350 1330 1307 1285 1170 11351090 1050 1030 1000 990 978960 930 915 888 870 850(厘米-1)(9)13C核磁共振譜δ(ppm，CDCl3)
其譜圖示于圖9。
(10)1H核磁共振譜其譜圖示于

圖10。
(11)薄層色譜固定相 展開(kāi)溶劑 Rf值硅膠板 氯仿∶甲醇(20∶1，v/v) 0.38乙酸乙酯 0.51(12)物質(zhì)的性質(zhì)中性。
關(guān)于FR-900523物質(zhì)，應(yīng)注意的是在作13C和1H核磁共振譜測(cè)定時(shí)，這種物質(zhì)在各種化學(xué)移位顯示成對(duì)的信號(hào)，然而，在薄層色譜和高效液體色譜測(cè)定時(shí)，F(xiàn)R-900523物質(zhì)在薄層色譜和高效液體色譜分別顯示單色斑和單峰。
由上述的物理和化學(xué)性質(zhì)和對(duì)FR-900506物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的成功確定，可以確定FR-900523物質(zhì)有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)
1，14-二羥基-12-〔2-4-羥基-3-甲氧環(huán)己基)-1-甲基乙烯基〕-23，25-二甲氧基-13，19，17，21，27-五甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04，9〕-二十八碳-18-烯-2，3，10，16-四酮(ⅱ)合成方法(1)方法1(引入羥基保護(hù)基)在化合物(Ⅰa)中引入羥基保護(hù)基可制得化合物(Ⅰb)。在這個(gè)反應(yīng)中所用的合適的引入羥基保護(hù)基的試劑，可以是象二(低級(jí))烷基亞礬這樣的常規(guī)的試制，例如低碳烷基甲基亞砜(例如二甲亞砜、乙基甲基亞砜、丙基甲基亞砜、異丙基甲基亞砜、丁基甲基亞砜、異丁基甲基亞砜、己基甲基亞砜，等等)、象三(低級(jí))烷基甲硅烷基鹵化物這樣的三取代的甲硅烷基化合物(例如三甲基甲硅烷基氯、三乙基甲硅烷基溴、三丁基甲硅烷基氯、叔丁基二甲基甲硅烷基氯，等等)、低碳烷基二芳基甲硅烷基鹵化物(例如甲基-二苯基甲硅烷基氯、乙基-二苯基甲硅烷基溴、丙基二甲苯基甲硅烷基氯、叔丁基二苯基甲硅烷基氯，等等)和能引入上述?；孽；瘎?，象羧酸、硫酸和它們的活性衍生物，例如?；u、酸酐、活性酰胺、活性酯及類(lèi)似物。這些活性衍生物的較好的實(shí)例可以包括?；?、?；?、含有下列酸的酸酐，例如取代的磷酸(例如二烷基磷酸、苯基磷酸、二苯基磷酸、二芐基磷酸、鹵化的磷酸，等等)這樣的混合酸酐、二烷基亞磷酸、亞硫酸、硫代硫酸、硫酸、碳酸烷基酯(例如碳酸甲酯、碳酸乙酯、碳酸丙酯，等等)、脂肪羧酸(例如新戊酸、戊酸、異戊酸、2-乙基丁酸、三氯乙酸、等等)、芳香羧酸(例如苯甲酸，等等)、對(duì)稱(chēng)酸酐、帶有含亞氨基官能團(tuán)的(例如咪唑、4-取代咪唑、二甲基吡唑、三唑和四唑)雜環(huán)化物的活性酰胺、活性酯(例如對(duì)硝基苯基酯、2，4-二硝基苯基酯、三氯苯基酯、五氯苯基酯、甲磺?；交?、苯偶氮基苯基酯、苯基硫代酯、對(duì)硝基苯基硫代酯、對(duì)甲苯基硫代酯、羧甲基硫代酯、吡啶基酯、哌啶基酯、8-喹啉基硫代酯，或帶有象N，N-二甲基羥胺、1-羥基-2-(1H)-吡啶酮、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基苯鄰二甲酰亞胺、1-羥基苯并三唑、1-羥基-6-氯苯并三唑等一類(lèi)N-羥基化合物的酯，及其類(lèi)似物。
在該反應(yīng)中，在把二(低碳)烷基亞砜用做羥基保護(hù)基引入劑的情況下，通常反應(yīng)在有象乙酐這樣的低碳鏈烷酐存在下進(jìn)行。
而在三取代的甲硅烷基化合物用作羥基保護(hù)基的引入劑的情況下，反應(yīng)最好在象咪唑及其類(lèi)似物這樣的常規(guī)縮合劑存在下進(jìn)行。
更進(jìn)一步，在?；瘎┯米髁u基保護(hù)基的引入劑的情況下，反應(yīng)最好在下面這樣的有機(jī)或無(wú)機(jī)鹼存在下進(jìn)行，如堿金屬(例如鋰、鈉、鉀，等)、堿土金屬(例如鈣等)、堿金屬氫化物(例如氫化鈉等)、堿土金屬氫化物(例如氫化鈣，等)、堿金屬氫氧化物(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀，等)、堿金屬碳酸鹽(例如碳酸鈉、碳酸鉀，等)、堿金屬碳酸氫鹽(例如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀，等)、堿金屬醇鹽(例如甲醇鈉、乙醇鈉、叔丁醇鉀，等)、鏈烷酸的堿金屬鹽(例如乙酸鈉，等)、三烷基胺(例如三乙胺，等)、吡啶化合物(例如吡啶、二甲基吡啶、甲基吡啶、4-N，N-二甲基氨基吡啶，等)、喹啉等等。
在該反應(yīng)中，用游離形式的酰化劑或其鹽時(shí)，反應(yīng)最好在下面的常規(guī)縮合劑存在下進(jìn)行，如碳化二亞胺化物(例如N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺、N-環(huán)己基-N′-(4-二乙氨基環(huán)己基)-碳化二亞胺、N，N′-二乙基碳化二亞胺、N，N′-二異丙基碳化二亞胺、N-乙基-N′-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺，等)、烯酮亞胺化合物(例如N，N′-羰基雙(2-甲基咪唑)、1，5-亞戊基乙烯酮-N-環(huán)己基亞胺、二苯基乙烯酮-N-環(huán)己基亞胺，等);烯屬的或炔屬的醚化物(例如乙氧基乙炔、β-環(huán)乙烯基乙基醚)、N-羥基苯并三唑衍生物的磺酸酯〔例如1-(4-氯苯磺酰氧基)6-氯-1H-苯并三唑、等〕，和類(lèi)似化合物。
反應(yīng)通常在對(duì)反應(yīng)不起不良作用的常規(guī)溶劑中進(jìn)行，這些溶劑象水、丙酮、二氯甲烷、醇(例如甲醇、乙醇等)、四氫呋喃、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺等，或其混合物，而且在堿或羥基保護(hù)基的引入劑是液體的情況下，它們也可用作溶劑。
反應(yīng)溫度并不嚴(yán)格，反應(yīng)通常在從冷卻到加熱的情況下都能進(jìn)行。
本方法的范圍包括這樣一種情況，即在反應(yīng)的過(guò)程中，化合物(Ⅰa)的R2的羥基有時(shí)可能轉(zhuǎn)換成目的化合物(Ⅰb)的相應(yīng)的被護(hù)羥基。
而且，本方法的范圍也包括這樣一種情況，即當(dāng)在低碳鏈烷酐存在下，二(低碳)烷基亞砜用作羥基保護(hù)基的引入劑時(shí)，帶有部分結(jié)構(gòu)式
的化合物(Ⅰa)在反應(yīng)的過(guò)程中有時(shí)可能被氧化，形成帶有部分結(jié)構(gòu)式
的化合物(Ⅰb)，其中二個(gè)式子中的R2都是羥基。
(2)方法2(引入羥基保護(hù)基)在化合物(Ⅰc)中引入羥基保護(hù)基可以制備化合物(Ⅰd)。
反應(yīng)基本上是按方法1的相同方法進(jìn)行，因此，反應(yīng)條件(例如堿、縮合劑、溶劑、反應(yīng)溫度等)就是方法1的那些條件。
本方法的范圍包括在反應(yīng)的過(guò)程中，化合物(Ⅰc)的R1的羥基常常可能轉(zhuǎn)變成目的化合物(Ⅰd)的相應(yīng)的被護(hù)羥基。
(3)方法3(形成雙鍵)化合物(Ⅰe)與堿反應(yīng)可以制得化合物(Ⅰf)。
在這個(gè)反應(yīng)中所用的合適的堿可以包括方法1中所用的堿。
這個(gè)反應(yīng)也可以在堿存在下用化合物(Ⅰe)與酰基化劑進(jìn)行反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，(Ⅰe)中的R2是羥基。
這個(gè)反應(yīng)通常在對(duì)反應(yīng)不起不良影響的常規(guī)溶劑中進(jìn)行，這些溶劑象水、丙酮、二氯甲烷、醇(例如甲醇、乙醇、丙醇等)、四氫呋喃、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺等，或者它們的混合物，此外，在堿是液體的情況下，該堿也可以用作溶劑。
反應(yīng)溫度并不嚴(yán)格，反應(yīng)通常在從冷卻到加熱的情況下都能進(jìn)行。
(4)方法4(羥基乙烯基的氧化)可以通過(guò)氧化化合物(Ⅰg)制備化合物(Ⅰh)。
在這個(gè)反應(yīng)中所用的氧化劑可以包括在方法1中給出的那些二(低碳)烷基亞砜。
這個(gè)反應(yīng)通常是在象乙酐這樣的低碳鏈烷酐存在下，在對(duì)反應(yīng)不起不良影響的常規(guī)溶劑中進(jìn)行，這些常規(guī)溶劑如丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氫呋喃、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺等，或它們的混合物，而且在低碳鏈烷酐是液體的情況下，它們也可用作溶劑。
反應(yīng)溫度并不嚴(yán)格，反應(yīng)通常在從冷卻到加熱的情況下都能進(jìn)行。
這個(gè)方法的范圍包括在反應(yīng)的過(guò)程中，原料化合物(Ⅰg)的R1的羥基有時(shí)可能轉(zhuǎn)變成目的化合物(Ⅰh)上的1-(低碳烷基硫代)(低碳)烷氧基。
(5)方法5(烯丙基的還原)把化合物(Ⅰi)還原可以得到化合物(Ⅰj)。
在這個(gè)方法中，可以用能把烯丙基還原成丙基的常規(guī)方法進(jìn)行還原，如催化還原或類(lèi)似方法。
在催化還原中用的合適的催化劑是那些常規(guī)催化劑，如鉑催化劑(例如鉑片、海綿狀鉑、鉑黑、膠態(tài)鉑、氧化鉑、鉑絲等)、鈀催化劑(例如海綿狀鈀、鈀黑、氧化鈀、碳載鈀、膠態(tài)鈀、硫酸鋇載鈀、碳酸鋇載鈀等)、鎳催化劑(例如還原的鎳、氧化鎳、阮內(nèi)鎳等)、鈷催化劑(例如還原鈷、阮內(nèi)鈷等)、鐵催化劑(例如還原鐵、阮內(nèi)鐵等)、銅催化劑(例如還原銅、阮內(nèi)銅、Ullman銅等)和類(lèi)似的催化劑。
還原通常是在對(duì)反應(yīng)不起不良影響的常規(guī)溶劑中進(jìn)行，這些溶劑如水、甲醇、乙醇、丙醇、吡啶、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或它們的混合物。
這種還原的反應(yīng)溫度并不嚴(yán)格，反應(yīng)通常是在從冷卻到加溫的情況下都能進(jìn)行。
按照上述的合成方法1到5得到的目的三環(huán)化合物(Ⅰ)可以用常規(guī)方法分離和提純，例如提取、沉淀、分級(jí)結(jié)晶、重結(jié)晶、色譜法等等。
化合物(Ⅰ)和(Ⅰb)到(Ⅰj)的合適的鹽可以包括象堿鹽這樣的醫(yī)藥上可以采用的鹽，例如堿金屬鹽(例如鈉鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽、鎂鹽等)、銨鹽、胺鹽(例如三乙胺鹽，N-芐基-N-甲胺鹽等)和其他常規(guī)有機(jī)鹽。
應(yīng)該注意的是，在上述的合成方法1到5的反應(yīng)中或在其中的反應(yīng)混合物的后處理中，由于原料和目的化合物的不對(duì)稱(chēng)碳原子或雙鍵的存在，同分異構(gòu)體和/或立體異構(gòu)體有時(shí)可能轉(zhuǎn)變成其他的同分異構(gòu)體和/或立體異構(gòu)體，而這樣的情況也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的三環(huán)化合物(Ⅰ)具有藥理活性，例如免疫抑制活性、抗菌活性等。因此，用來(lái)治療和預(yù)防由象心臟、腎、肝臟、骨髓、皮膚等這樣的器官或組織的移植引起的抗病性，由骨髓移植引起的宿主抗移植體疾病，自身免疫疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、橋本甲狀腺炎、復(fù)合硬化癥、重癥肌無(wú)力、Ⅰ型糖尿病、眼葡萄膜炎等，由致病的微生物引起的傳染性疾病等等。
下面給出一些實(shí)例，以說(shuō)明三環(huán)化合物的藥理活性和藥理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
試驗(yàn)1三環(huán)化合物(Ⅰ)抑制試管內(nèi)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)MLR試驗(yàn)在一組微滴定培養(yǎng)皿中進(jìn)行，每一培養(yǎng)皿的穴中加入0.2毫升RPMI1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、2毫摩爾碳酸氫鈉、青霉素(50單位/毫升)和鏈霉素(50微克/毫升)，每一培養(yǎng)皿中的穴中含有5×105C57BL/6應(yīng)驗(yàn)細(xì)胞(H-2b)和用絲裂霉素C處理(在37℃，用25微克/毫升絲裂霉素C處理30分鐘，并用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌三次)的5×105BALB/C刺激細(xì)胞(H-2d)。這些細(xì)胞在37℃，在5%二氧化碳和95%空氣的潮潤(rùn)的環(huán)境培養(yǎng)68小時(shí)，并且在收集細(xì)胞前用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(0.5微Ci)使之振動(dòng)4小時(shí)。把本發(fā)明的目的化合物溶解在乙醇中，并進(jìn)一步稀釋在RPMI 1640培養(yǎng)基中，加到培養(yǎng)物中，最后達(dá)到的濃度為0.1微克/毫升或更少。
所得的結(jié)果列于表7到10。本發(fā)明的三環(huán)化合物抑制小鼠的MLR。
表7FR-900506物質(zhì)對(duì)MLR的影響FR-900506 放射性抑制率 IC50的濃度 (平均每分鐘計(jì)數(shù) (毫微克/(毫微克/毫升) ±標(biāo)準(zhǔn)誤差) (%) 毫升)2.5 54±4 99.51.25 168±23 98.30.625 614±57 93.80.313 3880±222 60.9 0.260.156 5400±431 44.70.078 7189±365 27.60 9935±428表8FR-900520物質(zhì)對(duì)MLR的影響FR-900520 放射性抑制率 IC50的濃度 (平均每分鐘計(jì)數(shù) (毫微克/(毫微克/毫升) ±標(biāo)準(zhǔn)誤差) (%) 毫升)100 175±16 99.210 515±55 97.81 2744±527 88.1 0.380.500 9434±1546 59.20.25 14987±1786 35.10 23106±1652 0
表9FR-900523物質(zhì)對(duì)MLR的影響FR-900523 放射性抑制率 IC50的濃度 (平均每分鐘計(jì)數(shù) (毫微克/(毫微克/毫升) ±標(biāo)準(zhǔn)誤差) (%) 毫升)100 25±12 99.910 156±37 99.31 5600±399 75.8 0.50.500 11624±395 49.70.250 17721±1083 23.30 23106±1052 0表10FR-900525物質(zhì)對(duì)MLR的影響FR-900525 放射性抑制率 IC50的濃度 (平均每分鐘計(jì)數(shù) (毫微克/(毫微克/毫升) ±標(biāo)準(zhǔn)誤差) (%) 毫升)100 469±56 97.010 372±32 97.65 828±369 94.7 1.552.5 3564±512 77.41.2 10103±421 35.80 15741±411
試驗(yàn)2三環(huán)化合物(Ⅰ)的抗微生物活性用在薩布羅瓊脂中連續(xù)瓊脂稀釋法測(cè)定三環(huán)化合物(Ⅰ)抗各種真菌的抗微生物活性。在30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，最小的抑制濃度(MIC)以微克/毫升表示。
下面的表11和12列出了本發(fā)明的三環(huán)化合物對(duì)真(例如煙曲霉IFO 5840和Fusarium oxysporum IFO5942)的抗微生物活性。
表11三環(huán)化合物(Ⅰ)抗煙曲霉IFO5840的MIC(最小抑制濃度)值(微克/毫升)物質(zhì) MIC(微克/毫升)FR-900506 0.025FR-900520 0.1FR-900523 0.3FR-900525 0.5表12三環(huán)化合物(Ⅰ)抗Fusarium Oxysporum的MIC值(微克/毫升)物質(zhì) MIC(微克/毫升)FR-900506 0.05FR-900525 1
試驗(yàn)3三環(huán)化合物(Ⅰ)對(duì)鼠的同種異體皮膚移植存活的影響把供體(Fischer)鼠的vental移植皮組織移植到受體(WKA)鼠的側(cè)面胸部區(qū)域。在第五天解去包扎。每天檢查移植的情況，直到排斥為至，排斥定義為移植皮組織90%以上壞死。
把FR-900506物質(zhì)溶解在橄欖油中，并從移植的那天開(kāi)始連續(xù)14天肌肉注射給藥。
如表13所示，用橄欖油連續(xù)肌肉注射14天治療的鼠在8天之內(nèi)全部同種異體移植的皮膚都被排斥，但是每天用FR-900506物質(zhì)治療的鼠明顯地延長(zhǎng)了同種異體皮膚移植的存活。
表13FR-900506物質(zhì)對(duì)皮膚同種異體移植存活時(shí)間的影響劑量(毫克/公斤) 動(dòng)物數(shù)量 皮膚同種異體移植存活天數(shù)對(duì)照物 - 11 7，7，7，7，7，7，8，8，8，8，8(橄欖油)FR-900506 1 8 19，19，19，20，21，21，22，22物質(zhì)3.2 6 22，23，23，26，27，3510 5 56，61，82，85，89，
試驗(yàn)4三環(huán)化合物(Ⅰ)對(duì)鼠的Ⅱ型膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的影響把膠原溶解在冷的0.01M乙酸中，濃度為2毫克/毫升。該溶液用等體積的弗羅因德不完全佐劑乳化。把總體積為0.5毫升的冷乳化液皮下注射到雌Lewis鼠的背部的幾個(gè)部位和尾部的一個(gè)或兩個(gè)部位。把FR-900506溶于橄欖油并口服給藥。用同樣量的Ⅱ型膠原免疫的對(duì)照鼠，僅口服橄欖油。觀(guān)察關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率。
試驗(yàn)結(jié)果列于表14。從以Ⅱ型膠原免疫的同一天開(kāi)始用橄欖油治療14天的所有鼠都引起了炎性的多關(guān)節(jié)炎。
在三個(gè)星期的觀(guān)察當(dāng)中，每天用FR-900506物質(zhì)治療，治療14天，完全抑制了關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
表14FR-900506物質(zhì)對(duì)Ⅱ型膠原誘發(fā)鼠關(guān)節(jié)炎的影響劑量(毫克/公斤/天) 關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率對(duì)照(橄欖油) - 5/5FR-900506物質(zhì) 3.2 0/5試驗(yàn)5三環(huán)化合物(Ⅰ)對(duì)SJL/J鼠試驗(yàn)性過(guò)敏腦脊髓炎(EAE)的影響由SJL/J鼠制得脊髓均漿。用吸入法取出脊髓，在4℃與大約等體積的水混合并均化。等體積的該冷均漿(10毫克/毫升)用含有0.6毫克/毫升結(jié)核分支桿菌H37RA的弗羅因德完全佐劑(CFA)乳化。
在0天和13天在STL/J鼠身上兩次注射0.2毫升脊髓CFA乳液誘發(fā)EAE。對(duì)這些試驗(yàn)中的所有鼠每天都進(jìn)行EAE的臨床診斷評(píng)價(jià)并打上記號(hào)。
按照下面的標(biāo)準(zhǔn)做EAE嚴(yán)重程度的記號(hào)1級(jí)-尾巴下垂;2級(jí)-愚笨的步態(tài);3級(jí)-一肢或多肢軟弱;4級(jí)-下身麻痹或半身不遂。
把FR-900506物質(zhì)溶解于橄欖油，并從0天(免疫的第一天)開(kāi)始口服給藥19天。如表15所示，F(xiàn)R-900506物質(zhì)明顯地預(yù)防了EAE臨床癥狀的發(fā)展。
表15FR-900506物質(zhì)對(duì)SJL/J老鼠試驗(yàn)性過(guò)敏腦脊髓炎的影響在24天劑量(毫克/公斤) 有病的動(dòng)物數(shù)對(duì)照(橄欖油) - 10/10FR-900506物質(zhì) 32 0/5試驗(yàn)6三環(huán)化合物(Ⅰ)對(duì)鼠局部宿主抗移值體反應(yīng)(GVHR)的影響把C57BL/6供體的有活力的脾細(xì)胞(1×107細(xì)胞)皮下注射到BDF1鼠的右后腳誘發(fā)局部GvHR。7天后把鼠殺死，稱(chēng)量右(注射的腳)和左(未注射的腳)腿彎部的淋巴結(jié)(PLN)。由右和左PLN的重量的差別表示GvHR。
把FR-900506物質(zhì)溶于橄欖油并從敏感作用的同一天開(kāi)始口服給藥5天。
FR-900506物質(zhì)防止局部宿主抗移植體反應(yīng)的ED50值是19毫克/公斤。
試驗(yàn)7三環(huán)化合物(Ⅰ)的急性毒性試驗(yàn)在ddy鼠腹膜內(nèi)注射，試驗(yàn)FR-900506、FR-900520、FR-900523和FR-900525物質(zhì)的急性毒性，在每種情況下，劑量為100毫克/公斤時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到有死亡的。
本發(fā)明的藥用組合物可以以藥制劑的形式使用，例如固體、半固體或液體的形式，其中含有本發(fā)明的三環(huán)化合物(Ⅰ)，作為一種活性組分，與有機(jī)或無(wú)機(jī)載體或賦形劑混合，適用于外用、腸道或非腸道?；钚越M分可以與常用的非毒性的醫(yī)藥上可采用的載體混合，做成片劑、小丸藥、膠囊、栓劑、溶液、乳劑、懸浮液和其他任何適用的形式?？梢允褂玫妮d體是水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯膠、明膠、甘露糖醇、淀粉糊、三硅酸鎂、滑石、玉米淀粉、角蛋白、膠態(tài)硅、土豆淀粉、脲和其他在制備中適用的載體，以固體、半固體或液體形式，另外可以用輔助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和染色劑及香料。藥物組合物中含有的活性目的化合物的量要足以產(chǎn)生根據(jù)病情和治療所要求的效果。
該組合物用于人體，最好通過(guò)非腸道或腸道給藥。而三環(huán)化合物(Ⅰ)的有效治療劑量可以變化，取決于要治療的每個(gè)病人的病情和年齡，一般地治病的活性組分每天的劑量大約0.01-1000毫克，較好為0.1-500毫克，更好為0.5-100毫克，一般地平均單劑量大約0.5毫克、1毫克、10毫克、50毫克、100毫克、250毫克和500毫克。
下面給出的例子說(shuō)明本發(fā)明的目的。
例1Streptomyces tsukubaensis No.9993的分離Streptomyces 9993號(hào)通過(guò)使用下述的稀釋平皿技術(shù)分離。
把在日本ToYoSato-Cho，Tsukuba Gun，Ibaraki縣采集的大約一克左右的土壤樣品，加入消毒試管中，并用無(wú)菌水配制成體積為5毫升。該混合物用管式聲波發(fā)生器(tube buzzer)混合10秒鐘，繼續(xù)混合10分鐘。上清液繼續(xù)用100倍的無(wú)菌水稀釋。稀釋液(0.1毫升)涂復(fù)在陪替氏培養(yǎng)皿中的Czapek瓊脂上，添加維生素B1(蔗糖30克、硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂0.5克、氯化鉀0.5克、硫酸亞鐵0.01克、維生素B10.1克、瓊脂20克、自來(lái)1000毫升，pH為7.2)。在30℃溫育21天之后，把在稀釋平皿上生長(zhǎng)的許多菌落轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基〔酵母-麥芽浸膏瓊脂(ISP-培養(yǎng)基2)〕，并且在30℃培養(yǎng)10天。在分離的菌落中，能夠發(fā)現(xiàn)Streptomyces tsukubaensis No.9993。
發(fā)酵把含1%甘油、1%可溶性淀粉、0.5%葡萄糖、0.5%棉子粉、0.5%干酵母、0.5%玉米浸漬液和0.2%碳酸鈣(調(diào)pH為6.5)的160毫升培養(yǎng)基，分成20份倒入20個(gè)500毫升錐形瓶中，并在120℃消毒30分鐘。把Streptomyces tsukubaensis No.9993(CGMCC.No.0083)的全環(huán)斜面培養(yǎng)物接種到上述20個(gè)500毫升錐形瓶中的培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)式振動(dòng)器上，在30℃培養(yǎng)4天。生成的培養(yǎng)物接種到預(yù)先在120℃消毒20分鐘的200升的發(fā)酵罐中，其中含4.5%可溶性淀粉、1%玉米浸漬液、1%干酵母、0.1%碳酸鈣和0.1%Adekanol(消沫劑商標(biāo)，制造者Asahi Denka公司)的150升培養(yǎng)基中，并在150升/分通氣速度和250轉(zhuǎn)/分的振動(dòng)速度下，在30℃，培養(yǎng)4天。
分離和純化上面得到的培養(yǎng)物借助于5公斤硅藻土過(guò)濾。菌絲體餅用50升甲醇提取，得到50升提取物，菌絲體餅的甲醇提取物和濾液合并通過(guò)10升“Diaion HP-20”(商標(biāo)，制造者M(jìn)itsubishi化學(xué)工業(yè)有限公司)非離子吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附。在用30升水和30升甲醇水溶液洗滌之后，用甲醇洗脫。洗脫液在減壓下蒸發(fā)，得2升殘留水。這種殘留水用2升乙酸乙酯提取。乙酸乙酯提取物在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。該油狀殘留物與兩倍重量的酸性硅膠(專(zhuān)用硅膠12級(jí)，制造者Fuji Devison公司)混合，這種混合物用乙酸乙酯調(diào)成糊狀。在蒸發(fā)溶劑之后，生成的干粉末在用正己烷填充的和上述相同的800毫升酸性硅膠柱上，用色譜法進(jìn)行分離。該硅膠柱用3升正己烷、正烷和乙酸乙酯的混合物(9∶1V/V，3升和4∶1V/V，3升)和3升乙酸乙酯展開(kāi)。收集含目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。把該殘留物用正己烷和乙酸乙酯(1∶1V/V，30毫升)的混合物溶解，并在用相同溶劑體系填充的500毫升硅膠(制造者M(jìn)erck有限公司，230-400目)柱上，用色譜法進(jìn)行分離。
用正己烷和乙酸乙酯(1∶1V/V，2升和1∶2V/V，1.5升)的混合物洗脫。收集含第一目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到淡黃色油狀物。該油狀物與兩倍重量的酸性硅膠混合，這種混合物用乙酸乙酯調(diào)成糊狀。在蒸發(fā)溶劑之后，生成的干粉末在用正己烷填充的酸性硅膠柱上，用色譜法進(jìn)行分離。并用正己烷展開(kāi)。收集含目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到1054毫克白色粉末的FR-900506物質(zhì)粗品。這種粗產(chǎn)品100毫克，用高壓液相色譜法進(jìn)行分離。用Lichroborb SI 60(商標(biāo)，制造者M(jìn)erck公司)作為載液的柱(8×500毫米)進(jìn)行洗脫。這種色譜法在流速為5毫升/分，流動(dòng)相是二氯甲烷和二噁烷(85∶15V/V)的混合物的條件下，用紫外檢測(cè)器，在230毫微米處檢測(cè)。收集活性餾分，并蒸發(fā)，再次進(jìn)行這種高壓液相色譜分離，得到14毫克純化的白色粉末狀的FR-900506物質(zhì)。
另外，洗脫用1.5升乙酸乙酯繼續(xù)地進(jìn)行。收集含第二目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到30毫克淡黃色油狀的FR-900525物質(zhì)粗品。
例2發(fā)酵把pH為6.5含1%甘油、1%玉米淀粉、0.5%葡萄糖、1%棉子粉、0.5%玉米浸漬液、0.5%干酵母和0.2%碳酸鈣的預(yù)培養(yǎng)基100毫升倒入一個(gè)500毫升的錐形瓶中，并在120℃消毒30分鐘。Streptomyces tsukubaensis No.9993的全環(huán)斜面培養(yǎng)物接種到這種培養(yǎng)基中，并在30℃培養(yǎng)4天。把生成的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到預(yù)先在120消毒30分鐘的30升的發(fā)酵罐中的相同的20升的預(yù)培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)物在30℃溫育二天后，16升的預(yù)培養(yǎng)基接種到預(yù)先在120℃消毒30分鐘的2噸罐中的含4.5%可溶性淀粉、1%玉米浸漬液、1%干酵母、0.1%碳酸鈣和0.1%Adekanol(消沫劑，商標(biāo)，制造者Asahi Denka公司)pH為6.8的1600升發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在30℃培養(yǎng)4天。
分離和純化上面得到的培養(yǎng)液借助于25公斤硅藻土過(guò)濾。菌絲體餅用500升丙酮提取，得到500升提取物。菌絲體的丙酮提取物同1350升濾液合并，并通過(guò)100升“Diaion HP-20”(商標(biāo)，制造者M(jìn)itsubishi化學(xué)工業(yè)有限公司)非離子吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附。在用300升水和300升50%的丙酮水溶液洗滌之后，用75%的丙酮水溶液洗脫。洗脫液在減壓下蒸發(fā)，得到300升殘留水。這種殘留物用20升乙酸乙酯提取三次，乙酸乙酯提取物在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。這種油狀殘留物與兩倍重量的酸性硅膠(專(zhuān)用硅膠12級(jí)，制造者Fuji Devison公司)混合，這種混合物用乙酸乙酯調(diào)成糊狀。在蒸發(fā)溶劑之后，生成的干粉末在用正己烷填充的與上述相同的8升酸性硅膠柱上，用柱色譜法進(jìn)行分離。該硅膠柱用30升正己烷、正己烷和乙酸乙酯(4∶1V/V，30升)的混合物及30升乙酸乙酯展開(kāi)。收集含目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。該油狀殘留物與兩倍重量的酸性硅膠混合，而這種混合物用乙酸乙酯調(diào)成糊狀。在蒸發(fā)溶劑之后，生成干粉末在用正己烷填充的3.5升酸性硅膠柱上，用色譜法進(jìn)行分離。硅膠柱用10升正己烷、正己烷和乙酸乙酯(4∶1V/V，10升)混合物及10升乙酸乙酯展開(kāi)。收集含目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到淡黃色油狀物。把這種油狀殘留物用正己烷和乙酸乙酯(1∶1V/V，300毫升)的混合物溶解，并在用相同溶劑體系填充的2升硅膠(制造者M(jìn)erck有限公司，230-400目)柱上，用柱色譜法進(jìn)行分離。用正己烷與乙酸乙酯(1∶1V/V，10升和1∶2V/V，6升)的混合物和6升乙酸乙酯洗脫。
收集含第一目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到34克白色粉末狀的FR-900506物質(zhì)。把這種白色粉末用乙腈溶解，并在減壓下濃縮。這種濃縮物保持在5℃過(guò)夜，得到22.7克棱晶。用相同的溶劑再結(jié)晶，得到13.6克純化的無(wú)色棱晶的FR-900506物質(zhì)。
另外，收集含第二目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到314毫克淡黃色粉狀的FR-900525物質(zhì)粗品。
例3發(fā)酵把含1%甘油、1%玉米淀粉、0.5%葡萄糟、1%棉子粉、0.5%干酵母、0.5%玉米浸漬液和0.2%碳酸鈣(調(diào)pH為6.5)的160毫升培養(yǎng)基分成10份，倒入10個(gè)500毫升的錐形瓶中，并在120℃消毒30分鐘。把Strepomyces tsukubaensis No.9993全環(huán)斜面培養(yǎng)物接種到上述每一培養(yǎng)基中，并在旋轉(zhuǎn)式振動(dòng)器上，在30℃培養(yǎng)4天。把生成的培養(yǎng)物接種到預(yù)先在120℃消毒20分鐘的200升的發(fā)酵罐中的含5%可溶性淀粉、0.5%花生粉、0.5%干酵母粉、0.5%谷蛋白粉、0.1%碳酸鈣和0.1% Adekanol(消沫劑，商標(biāo)，制造者Asahi Denka公司)的150升培養(yǎng)基中，在通氣速度為150升/分和旋轉(zhuǎn)式振動(dòng)器的振動(dòng)頻率為250轉(zhuǎn)/分的振動(dòng)下，在30℃培養(yǎng)4天。
分離和純化上面得到的培養(yǎng)液借助于5公斤硅藻土過(guò)濾。菌絲體餅用50升丙酮提取，得到50升提取物。菌絲體丙酮提取物和135升濾液合并，并通過(guò)10升“Diaion HP-20”(商標(biāo)，制造者M(jìn)itsubishi化學(xué)工業(yè)有限公司)非離子吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附。在用30升水和30升50%的丙酮水溶液洗滌后，洗脫用75%的丙酮水溶液完成。30升洗脫液在減壓下蒸發(fā)，得到2升殘留水。這種殘留物用2升乙酸乙酯提取三次。乙酸乙酯提取物在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。該油狀殘留物與兩倍重量的酸性硅膠(專(zhuān)用硅膠12級(jí)，制造者Fuji Devison公司)混合，這種混合物用乙酸乙酯調(diào)成糊狀。在蒸發(fā)溶劑之后，生成的干粉末在用正己烷填充的與上述相同的800毫升酸性硅膠柱上，用柱色譜法進(jìn)行分離。該硅膠柱用3升正己烷、正己烷與乙酸乙酯(4∶1V/V，3升)的混合物和3升乙酸乙酯展開(kāi)。收集含目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。這種油狀殘留物用正己烷與乙酸乙酯(1∶1V/V，30毫升)的混合物溶解，并在用相同溶劑體系填充的500毫升硅膠(制造者M(jìn)erck有限公司，230-400目)柱上，用柱色譜法進(jìn)行分離。洗脫用正己烷與乙酸乙酯(1∶1V/V，2升和1∶2V/V，1.5升)的混合物和1.5升乙酸乙酯完成。
收集含第一目的化合物餾份，并在減壓下濃縮，得到3克淡黃色粉末狀的FR-900506物質(zhì)粗品。
另外，收集含第二目的化合物餾份，并在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。這種油狀殘留物用硅膠柱再進(jìn)行色譜分離，得到淡黃色油狀物。上述的油狀殘留物與兩倍重量的酸性硅膠混合，把這種混合物用乙酸乙酯調(diào)成糊狀。在蒸發(fā)溶劑之后，生成的干粉末在用正己烷填充的100毫升酸性硅膠柱上，用色譜法進(jìn)行分離，并用正己烷展開(kāi)。收集含目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到380毫克淺淡黃色粉末狀的FR-900525物質(zhì)。這種粉末用正己烷與乙酸乙酯(1∶2V/V，5毫升)的混合物溶解，并在用與上述相同的溶劑體系填充的100毫升酸性硅膠(專(zhuān)用硅膠922級(jí)，制造者Fuji Devison公司)柱上，用色譜法進(jìn)行分離，并用與填充酸性硅膠的相同溶劑體系洗滌。洗脫用乙酸乙酯完成。收集活性餾分，并在減壓下濃縮，得到230毫克純化的白色粉末的FR-900525物質(zhì)。
例4Streptomyces hygroscopicus subsp.Yakushimaensis No.7238的分離Streptomyces hygroscopicus subsp.Yakushimaensis No.7238是使用下述的稀釋平技術(shù)分離的。
把在日本Kagoshima縣yakushima采集的大約一克土壤樣品，加入消毒試管中，并用無(wú)菌水配制成為5毫升。這種混合物用管式聲波發(fā)生器混合10秒鐘，并繼續(xù)混合10分鐘。上清液用100倍的無(wú)菌水連續(xù)地稀釋。0.1毫升稀釋液涂復(fù)在陪替氏培養(yǎng)皿中的Czapek瓊脂上，添加維生素B(蔗糖30克、硝酸鈉3克、磷酸氫二鉀1克、硫酸鎂0.5克、氯化鉀0.5克、硫酸亞鐵0.01克、維生素B0.1克、瓊脂20克、自來(lái)水1000毫升，pH7.2)。在30℃溫育21天之后，把在稀釋平皿上生長(zhǎng)的許多菌落轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上養(yǎng)〔酵母-麥芽浸膏瓊脂(ISP-培養(yǎng)基2)〕，并在30℃培養(yǎng)10天。在分離的菌落中，能夠發(fā)現(xiàn)Streptomyces hygroscopicus subsp.yakushmaensis No.7238。
發(fā)酵把含1%甘油、1%可溶性淀粉、0.5%葡萄糖、0.5%棉子粉、0.5%干酵母、0.5%玉米浸漬液和0.2%碳酸鈣(調(diào)pH為6.5)160毫升培養(yǎng)基，分成20份，倒入20個(gè)500毫升的錐形瓶中，并在120℃消毒30分鐘。把Streptomyces hygroscopicus subsp.yakushmaensis No.7238(CGMCC No.0082)的斜面培養(yǎng)物接種到上述的20個(gè)500毫升錐形瓶中的培養(yǎng)基上，在旋轉(zhuǎn)式振動(dòng)器上，在30℃培養(yǎng)4天。生成的培養(yǎng)物接種到預(yù)先在120℃消毒20分鐘的200升發(fā)酵罐中的含4.5%葡萄糖、1%玉米浸漬液、1%干酵母、1%谷蛋白粉、0.5%麥胚芽、0.1%碳酸鈣和0.1% Adekanol(消沫劑，商標(biāo)，制造者Asahi Denka公司)150升培養(yǎng)基中，并且在150升/分的通氣速度和250轉(zhuǎn)/分的振動(dòng)速度下，在30℃培養(yǎng)4天。
分離和純化上面得到的培養(yǎng)液借助于5公斤硅藻土過(guò)濾。菌絲體餅用50升丙酮提取，得到50升提取物。菌絲體的丙酮提取物與135升濾液合并，并通過(guò)10升“Diaion HP-20”(商標(biāo)，制造者M(jìn)itsubishi化學(xué)工業(yè)有限公司)非離子吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附。在用30升水和30升丙酮水溶液洗滌之后，洗脫用丙酮完成。洗脫液在減壓下蒸發(fā)，得到2升殘留水。這種殘留物水溶液用4升乙酸乙酯提取。乙酸乙酯提取物在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。該油狀殘留物與兩倍重量的酸性硅膠(專(zhuān)用硅膠12級(jí)，制造者Fuji Devison公司)混合，這種混合物用乙酸乙酯調(diào)成糊狀。在蒸發(fā)溶劑之后，生成的干粉末在用正己烷填充的與上述相同的800毫升酸性硅膠柱上，用色譜法進(jìn)行分離。該硅膠柱用3升正己烷、正己烷與乙酸乙酯(4∶1V/V，3升)的混合物和3升乙酸乙酯展開(kāi)。收集含F(xiàn)R-900520和FR-900523物質(zhì)的餾分，并且在減壓下濃縮，得到油狀殘留物。把該油狀殘留物用正烷與乙酸乙酯(1∶1V/V，50毫升)的混合物溶解，并在用相同溶劑體系填充的1000毫升硅膠(制造者M(jìn)erck有限公司，70-230目)柱上，用柱色譜法進(jìn)行分離。用正己烷與乙酸乙酯(1∶1V/V，3升和1∶2V/V，3升)混合物洗脫。收集含目的化合物餾分，并在減壓下濃縮，得到4.5克淡黃色粉末。這種粉末用20毫升甲醇溶解，并與10毫升水混合。該混合物在用甲醇與水(4∶1V/V)的混合物填充的500毫升(60-200目)“YMC”(商標(biāo)，制造者Yama mura化學(xué)研究所)反相硅膠柱上，用色譜法進(jìn)行分離，并用甲醇和水(4∶1V/V)的混合物展開(kāi)。
收集含F(xiàn)R-900520物質(zhì)的餾分，并在減壓下濃縮，得到1.8克淺淡黃色粉末的FR-900520物質(zhì)的粗產(chǎn)物。把這種粉末用少量乙醚溶解。在靜置一夜之后，通過(guò)過(guò)濾收集析出的晶體，并用乙醚洗滌，然后在減壓下干燥。從乙醚中再結(jié)晶，得到600毫克純化的無(wú)色片狀的FR-900520物質(zhì)。
在用相同的溶劑體系填充的反相硅膠柱上，用色譜法進(jìn)行分離，隨后收集含F(xiàn)R-900523物質(zhì)的餾分，并且在減壓下濃縮，得到0.51克淺淡黃色粉末狀的FR-900523物質(zhì)的粗產(chǎn)物。這種粗產(chǎn)物用3毫升乙腈溶解，并且在用乙腈、四氫呋喃和50毫摩爾磷酸鹽緩沖劑溶液(pH2.0)(3∶2∶5V/V)的混合物填充的“YMC”70毫升反相硅膠柱上，進(jìn)行色譜分離，該硅膠柱用乙腈、四氫呋喃和50毫摩爾磷酸鹽緩沖劑溶液(pH2.0)(3∶2∶5V/V)的混合物展開(kāi)，收集含目的化合物餾分，并用乙酸乙酯提取。該提取物在減壓下濃縮，得到190毫克淡黃白色粉末。這種淡黃白色粉末再次在“YMC”反相硅膠柱上，用色譜法進(jìn)行分離，得到80毫克白色粉末。這種白色粉末用少量乙醚溶解，并在室溫下靜置過(guò)夜，得到56毫克晶體。用乙醚再結(jié)晶，得到34毫克無(wú)色針狀的FR-900523物質(zhì)。
例5在室溫下，把0.1毫升吡啶和0.05毫升醋酸酐加入含10.4毫克FR-900506物質(zhì)的0.2毫升二氯甲烷溶液中，該混合物攪拌5小時(shí)。在減壓下，除去反應(yīng)混合物中的溶劑。殘留物用硅膠薄層色譜法(展開(kāi)溶劑乙醚和二氯甲烷，1∶2V/V)進(jìn)行分離，得到6.0毫克12-〔2-(4-乙酰氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-17-烯丙基-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.0〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)3520，1728，1705(尖銳吸收峰)，1640，1095厘米-1例6在室溫下，把0.5毫升吡啶和0.3毫升醋酸酐加入52.5毫克FR-900506物質(zhì)的1毫升二氯甲烷溶液中，該混合物在室溫下攪拌9小時(shí)。在減壓下，除去反應(yīng)混合物中的溶劑。殘留物用硅膠薄層色譜法(展開(kāi)溶劑乙醚和己烷，3∶1V/V)進(jìn)行分離，分別得到48.0毫克14-乙酰氧基-12-〔2-(4-乙酰氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-17-烯丙基-1-羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮和5.4毫克12-〔2-(4-乙酰氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-17-烯丙基-1-羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-14，18-二烯-2，3，10，16-四酮。
第一化合物紅外光譜V(CHCl3)1730，1720(尖銳吸收峰)，1640厘米-1第二化合物紅外光譜ν(CHCl3)1730，1690，1640，1627厘米-1例7在室溫下，把50微升的苯甲酰氯加入含9.7毫克FR-900506物質(zhì)的0.2毫升二氯甲烷和0.1毫升吡啶溶液中，該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。在減壓下，除去反應(yīng)混合物中的溶劑，得到粗油狀物。這種油狀物用硅膠薄層色譜法(展開(kāi)溶劑乙醚和己烷，2∶1V/V)提純，得到8.0毫克17-烯丙基-12-〔2-(4-苯甲酰氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.0〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)3500，1735(尖銳吸收峰)，1710，1640，1600厘米-1例8把大約100毫克對(duì)硝基苯甲酰氯加入含30.5毫克FR-900506物質(zhì)的1毫升吡啶溶液中，該混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。這種反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋?zhuān)从蔑柡偷奶妓釟溻c水溶液、水、1當(dāng)量鹽酸、水、飽和碳酸氫鈉水溶液、水和氯化鈉水溶液的順序洗滌，然后干燥。在減壓下濃縮生成的溶液，殘留物在硅膠柱上用色譜法提純，得到37.7毫克17-烯丙基-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-12-｛2-〔4-(對(duì)硝基苯甲酰氧基)-3-甲氧基環(huán)己基〕-1-甲代乙烯基｝-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)1720，1640，1610，1530-1520厘米-1例9按照與例8相似的方法，通過(guò)30.6毫克FR-900506物質(zhì)與含33毫克3，5-二硝基苯甲酰氯的0.5毫升吡啶反應(yīng)，得到36.0毫克17-烯丙基-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-12-｛2-〔4-(3，5-二硝基苯甲酰氧基)-3-甲氧基環(huán)己基〕-1-甲代乙烯基｝-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)1730，1640，1610，1530-1520厘米-1例10按照與例8相似的方法，通過(guò)48毫克FR-900506物質(zhì)與含0.08毫升2-l-蓋氧基乙酰氯的0.5毫升吡啶反應(yīng)，得到50.9毫克17-烯丙基-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-12-｛2-〔4-(2-l-蓋氧基乙酰氧基)-3-甲氧基環(huán)己基〕-1-甲代乙稀基｝-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)-〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(純凈)(neat)3520，1760，1740(尖銳吸收峰)，1720(尖銳吸收峰)，1625厘米-1例11在室溫下，把47毫克N，N1-二環(huán)己基碳化亞胺加入含51毫克(一)-2-三氟甲基-2-甲氧基-2-苯乙酸的10毫升乙酸乙酯中。在室溫下攪拌1.5小時(shí)后，加入25.0毫克FR-900506物質(zhì)和11毫克4-(N，N-二甲基氨基)-吡啶，然后在室溫下，攪拌3.5小時(shí)。濃縮生成的溶液，得到殘留物，把這種殘留物用乙醚溶解，并按用鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和氯化鈉水溶液的順序洗滌。有機(jī)層用硫酸鈉干燥并濃縮，得到殘留物，該殘留物在硅膠柱上，用色譜法(展開(kāi)溶劑二氯甲烷和乙醚，10∶1V/V)分離，得到6.5毫克17-烯丙基-12｛2-〔4-((一)-2-三氟甲基-2-甲氧基-2-苯基乙酰氧基〕-3-甲氧基環(huán)己基〕-1-甲代乙烯基｝-1.14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮和20.2毫克17-烯丙基-14-｛(一)-2-三氟甲基-2-甲氧基-2-苯基乙酰氧基｝-12-｛2-〔4-((一)-2-三氟甲基-2-甲氧基-2-苯基乙酰氧基)-3-甲氧基環(huán)己基〕-1-甲代乙烯基｝-1-羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
第一化合物紅外光譜V(純凈)(neat)3510，1750，1730(尖銳吸收峰)，1710，1652，1500厘米-1第二化合物紅外光譜V(純凈)(neat)1750，1720，1652，1500厘米-1例12把145毫克琥珀酸酐和7毫克4-(N，N-二甲基氨基)吡啶加入含248毫克FR-900506物質(zhì)的攪拌的7毫升吡啶溶液，生成的混合物在室溫下攪拌18小時(shí)。該反應(yīng)混合物在減壓下濃縮，殘留物在20克用乙酸乙酯填充的硅膠柱上，進(jìn)行色譜分離，得到90毫克17-烯丙基-12-｛2-〔4-(3-羧基丙酰氧基)-3-甲氧基環(huán)己基〕-1-甲代乙烯基｝-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)3500，3100-2300，1720，1705(尖銳吸收峰)，1635厘米-1例13把500毫克對(duì)碘苯磺酰氯加入100.7毫克FR-900506物質(zhì)的3毫升吡啶溶液中，該混合物在室溫下攪拌36小時(shí)。這種溶液用乙酸乙酯稀釋?zhuān)⒂蔑柡偷奶妓釟溻c水溶液、水和氯化鈉水溶液洗滌。有機(jī)層用硫酸鈉干燥，過(guò)濾和在減壓下濃縮。殘留物在硅膠柱上，用色譜法(展開(kāi)溶劑乙醚和己烷，3∶1V/V)分離，分別得到61毫克17-烯丙基-1，14-二羥基-12-｛2-〔4-(對(duì)碘苯磺酰氧基)-3-甲氧基環(huán)己基〕-1-甲代乙烯基｝-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮和12毫克17-烯丙基-1-羥基-12-｛2-〔4-(對(duì)碘苯磺酰氧基)-3-甲氧基環(huán)己基〕-1-甲代乙烯基｝-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-14，18-二烯-2，3，10，16-四酮。
第一化合物紅外光譜V(CHCl3)3470，1730，1717，1692，1635，1568厘米-1第二化合物1H核磁共振譜δPPm(CDCl3)
7.60(2H，m)，7.90(2H，m)，例14按照與例13相似的方法，通過(guò)27毫克FR-900506物質(zhì)與0.6毫升含97毫克d(右旋)樟腦磺酰氯的吡啶溶液反應(yīng)，生成34毫克17-烯丙基-12-〔2-(4-d(右旋)-樟腦磺酰氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(純凈)(neat)3500，1747，1720(尖銳吸收峰)，1710(尖銳吸收峰)，1655厘米-1例15把118毫克咪唑和52.2毫克叔丁基-二苯基甲硅烷基氯加入含89.7毫克FR-900506物質(zhì)的3毫升二氯甲烷的攪拌溶液中。在室溫下，該混合物攪拌2小時(shí)后，反應(yīng)混合物用飽和氯化銨水溶液稀釋?zhuān)⒂靡颐烟崛∪巍＿@種提取物用水和氯化鈉水溶液洗滌，用硫酸鈉干燥，然后在減壓下濃縮。殘留物在硅膠柱上，用柱色譜法(展開(kāi)溶劑乙酸乙酯和己烷，1∶3V/V)提純，得到107毫克17-烯丙基-12-〔2-(4-叔丁基-二苯基甲硅烷氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(純凈)(neat)3520，1742，1705，1650厘米-1例16按照與例15相似的方法，通過(guò)80毫克FR-900506物質(zhì)與含17毫克叔丁基-二甲基甲硅烷基氯(存在15毫克咪唑)的1毫升N，N-二甲基甲酰胺反應(yīng)，生成85毫克17-烯丙基-12-〔2-(4-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)1735，1720(尖銳吸收峰)，1700，1640厘米-1例17把1.5毫升醋酸酐加入含100毫克FR-900506物質(zhì)的1.5毫升二甲亞砜溶液中，該混合物在室溫下攪拌14小時(shí)。反應(yīng)混合物用乙酸乙酯稀釋?zhuān)⒂蔑柡吞妓釟溻c水溶液、水和氯化鈉水溶液洗滌。有機(jī)層用硫酸鈉干燥、過(guò)濾，然后在減壓下濃縮。殘留物在硅膠柱上，用薄層色譜法(展開(kāi)溶劑乙醚)分離，分別得到51毫克17-烯丙基-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-12-〔2-(4-甲基硫代甲氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-14，18-二烯-2，3，10，16-四酮、18毫克17-烯丙基-1-羥基-12-〔2-(4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-14，18-二烯-2，3，10，16四酮和10毫克17-烯丙基-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-12-〔2-(4-甲基硫代甲氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
第一化合物紅外光譜 V(CHCl3)3470，1730，1635，1630(尖銳吸收峰)，1580(尖銳吸收峰)厘米-1第二化合物紅外光譜V(CHCl3)1728，1640，1090厘米-1第三化合物紅外光譜V(CHCl3)3480，1735，1710，1640厘米-1例18把0.5毫升醋酸酐加入含39.9毫克17-烯丙基-12-〔2-(4-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮的1.5毫升吡啶溶液中，該混合物在室溫下攪拌6小時(shí)。在減壓下除去反應(yīng)混合物中的溶劑，得到粗油狀物，這種油狀物在硅膠柱上，用薄層色譜法(展開(kāi)溶劑乙醚和己烷，1.1V/V)提純，得到26.5毫克14-乙酰氧基-17-烯丙基-12-〔2-(4-叔丁基-二甲基甲硅烷氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1-羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)1728，1715(尖銳吸收峰)，1635厘米-1例19按照與例18相似的方法，通過(guò)10.6毫克17-烯丙基-12-〔2-(4-叔丁基-二苯基甲硅烷氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1，14-二羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮與含0.1毫克醋酸酐的0.2毫升吡啶反應(yīng)，生成10毫克14-乙酰氧基-17-烯丙基-12-〔2-(4-叔丁基-二苯基甲硅烷氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1-羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)3500，1730，1720(尖銳吸收峰)，1660(尖銳吸收峰)，1640，1620(尖銳吸收峰)，1100厘米-1例20在室溫下，把大約100毫克碳酸鉀加入含43.8毫克14-乙酰氧基-17-烯丙基-12-〔2-(4-叔丁基-二苯基甲硅烷氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1-羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮的1.5毫升四氫呋喃溶液中，該混合物在室溫下攪拌3小時(shí)。反應(yīng)混合物用乙醚稀釋?zhuān)傻娜芤河冒达柡吐然@水溶液、水和氯化鈉水溶液的順序洗滌，然后用硫酸鈉干燥。干燥后的溶液在減壓下濃縮，殘留物在硅膠柱上，用薄層色譜法(展開(kāi)溶劑乙醚和己烷，3∶2V/V)分離，得到30毫克17-烯丙基-12-〔2-(4-叔丁基-二苯基甲硅烷氧基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-1-羥基-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-14，18-二烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl3)1733，1720(尖銳吸收峰)，1685，1640(尖銳吸收峰)，1620厘米-1例21含50毫克FR-900506物質(zhì)的2毫升乙酸乙酯溶液，用10毫克10%Pd-C催化劑在大氣壓和室溫下，進(jìn)行催化還原反應(yīng)20分鐘。過(guò)濾反應(yīng)混合物，濾液蒸發(fā)至干，這種殘留物用薄層色譜法提純。用氯仿和丙酮(5∶1V/V)展開(kāi)，得到50.0毫克1.14-二羥基-12-〔2-(4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-17-丙基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
紅外光譜V(CHCl)3480，1735(尖銳吸收峰)，1717，1700，1650(尖銳吸收峰)，1625厘米-1例22通過(guò)與例1相似的發(fā)酵方法得到的1克白色粉末狀粗FR-900506物質(zhì)，用5毫升乙腈溶解，用Shimazu LC4A(商標(biāo)，Shmazu Seisaku-sho制造)高壓液相色譜法CHPLC)進(jìn)行分離。使用由“YMC”S343(ODS)(商標(biāo)，Shimakyu有限公司制造)填充的鋼柱(內(nèi)徑25毫米，長(zhǎng)度250毫米)，流速12毫升/分。流動(dòng)相為28%乙腈、10%正丁醇、0.075%磷酸和3.75毫摩爾十二烷基硫酸鈉(SDS)混合物的水溶液，檢測(cè)在210毫微米處用Hitachi紫外檢測(cè)器完成。每次注入100微升樣品，高壓液相色譜(HPLC)分離重復(fù)進(jìn)行50次，以便全部樣品進(jìn)入柱內(nèi)得到分離。保留時(shí)間為85到90分鐘，收集每次洗脫液，并用3.6升相等體積的乙酸乙酯提取。分離乙酸乙酯層，并用2升1%的碳酸氫鈉水溶液洗滌，在真空下濃縮到少量體積。通過(guò)過(guò)濾除去濃縮結(jié)晶的十二烷基硫酸鈉(SDS)，得到的粗粉末用乙腈溶解，濃度為100毫克/毫升，然后再進(jìn)行高壓液相色譜分離。流動(dòng)相為12.5%乙腈、9.75%正丁醇、0.075%磷酸和3.75毫摩爾十二烷基硫酸鈉(SDS)混合物水溶液。柱子在流速為10毫升/分下洗脫，保留時(shí)間為131到143分鐘，收集洗脫液，并用等體積的乙酸乙酯提取。分離溶劑層，并用1%碳酸氫鈉水溶液洗滌，在真空下濃縮到少量體積，通過(guò)過(guò)濾除去濃縮結(jié)晶的十二烷基硫酸鈉(SDS)。
這樣得到的粗粉末用少量乙酸乙酯溶解，在10毫升硅膠柱上(Kiesel硅膠，230-400目，制造者M(jìn)erck有限公司)，用柱色譜法進(jìn)行分離。硅膠柱用30毫升正己烷與乙酸乙酯的混合物(1∶1V/V)和60毫升正己烷與乙酸乙酯的混合物(1∶2V/V)洗滌。洗脫用乙酸乙酯完成，并且分餾(每份3毫升)。收集18-24餾分，并在真空下濃縮至干，得到24毫克FR-900520物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.制備含通式(Ⅰ)化合物或其鹽的藥物組合物的方法
式中R′是羥基或被護(hù)羥基，R2是氫、羥基或被護(hù)羥基，R3是甲基、乙基、丙基或烯丙基，n是整數(shù)1或2，和實(shí)線(xiàn)和虛線(xiàn)表示單鍵或雙鍵，其特征在于式(Ⅰ)化合物或其鹽與藥物上可接受的適合于外用、腸胃內(nèi)施用或不經(jīng)腸胃施用的常規(guī)無(wú)毒性載體和/或賦形劑混合，配制成抗器官或組織移植排斥病、宿主排斥移植物病或自主免疫病的有效藥物制劑。
2.按權(quán)利要求1的方法，其中所述式(Ⅰ)化合物是17-烯丙基-1，14-二羥基-12-〔2-(4-羥基-3-甲氧基環(huán)己基)-1-甲代乙烯基〕-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧雜-4-氮雜三環(huán)〔22.3.1.04.9〕28碳-18-烯-2，3，10，16-四酮。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于三環(huán)化合物的，該化合物用于治療和預(yù)防移植排斥病，骨髓移植引起的宿主抗移植體病，自身免疫疾病、傳染病等等，該化合物可由下面分子式表示本發(fā)明也關(guān)系到上述化合物的制備方法，關(guān)系到含該化合物的藥物組合物以及它們的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/44GK1056103SQ91102788
公開(kāi)日1991年11月13日 申請(qǐng)日期1985年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1984年12月3日
發(fā)明者奧原正國(guó), 田中洋和, 后藤俊男, 木野亨, 畑中洋 申請(qǐng)人:藤澤藥品工業(yè)株式會(huì)社