專利名稱:抗血友病因子純化方法
鑒于本發(fā)明得到美國衛(wèi)生和保健部Rol HL29688號和RR 053-99號撥款資助，美國政府對本發(fā)明享有權(quán)利。
本發(fā)明與蛋白純化方法有關(guān)。更具體地說，本發(fā)明與糖、多元醇、氨基酸或鹽的存在下，采用柱層析技術(shù)純化抗血友病因子ⅧC(以下簡稱AHF)的高回收率和高分辨率的方法有關(guān)。用此法制備的AHF純度高。
凝血促進(jìn)劑蛋白因子Ⅷ(AHF)是一種在血友病病人血漿中具有糾正凝固缺陷的一種血漿蛋白。事實(shí)上，AHF活性是以在血友病A血漿中其誘導(dǎo)凝固的能力來測量的。
一個單位AHF是指1毫升的正常男性成人血漿中所存在的AHF量。本文所采用的標(biāo)準(zhǔn)，即世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，可以從英國倫敦漢普斯特(Hampstead)，好萊.希爾(Holly Hill)的國立生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制研究所得到。
AHF在臨床治療方面的主要應(yīng)用一直是給血友病病人做靜脈注射。起初，這種應(yīng)用包括全血和新鮮的冷凍血漿做靜脈滴注，這種方法需要長時間的滴注，而且常常會引起血容量過多。
血漿冷沉淀物(“Cryo”)的應(yīng)用仍然需要很長的滴注時間。這種Cryo不能完全溶于滴注所用的溶劑中，因而需要過濾。它所含的AHF量低，且波動大。滴注所需要的Cryo體積大，而且在使用前為了解AHF含量而檢查多層封閉的滅菌容器這一步驟是相當(dāng)繁鎖的，且常常被忽略。因此，治療可得到的Cryo正確量可能是不確切的。而且，需要將Cryo裝在大的塑料儲血袋中，貯于-20℃，所以還需要有大型的冷凍設(shè)備。有鑒于此，這種原始方法不可能應(yīng)用于家庭治療。
冷凍干燥的AHF濃縮物的應(yīng)用解決了上面提及的許多問題。這種濃縮物一般可用下法制得先將血漿作冷沉淀處理，然后用聚乙二醇作第二次沉淀。該濃縮物在冷凍條件下是穩(wěn)定的，它們可以完全溶于重新溶解用的液體中，并可重新溶解于比Cryo更小的體積(10-30ml)中，因而可檢出的AHF濃度比存在于血漿中的高10-30倍。
遺憾的是，用這個方法獲得的產(chǎn)率(該產(chǎn)品中的AHF活性/原血漿中的AHF活性)只有約20%，這就使得該因子的生產(chǎn)成本高。此外，其所需要的滴注體積仍較大(30ml/1000單位AHF)，這就又產(chǎn)生了貯存問題，并使家庭治療難于開展，其結(jié)果是治療費(fèi)用增加。
而且，這些濃縮物中含有少于0.1%的AHF蛋白和99.9%的雜蛋白，其中包括(1)能夠引起溶血的特異的血型抗體;(2)可以引起T細(xì)胞比率(輔助/抑制)倒置在內(nèi)的免疫異常的蛋白，這種蛋白類似愛滋病(AIDS)，纖維蛋白元纖維結(jié)合素、維勒布蘭德因子(遺傳性假血友病因子)和其它蛋白。冷凍干燥的濃縮物常常受病毒(如乙型肝炎病毒，非甲非乙病毒，可能還有引起愛滋病的病毒)污染。將這些制品在液體狀態(tài)作加熱處理可以破壞大多數(shù)的微生物，但同時也會引起AHF的有活性的組分的變性。
層析技術(shù)(離子交換層析法和疏水層析法)一直在應(yīng)用著，但僅限于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。用這種技術(shù)所得到的產(chǎn)率一直是低的(最大30～40%)，且分辨率極差。
顯然，需要一種低成本和高產(chǎn)率的AHF制劑純化技術(shù)。
滿足這種要求的嘗試包括用單克隆抗體進(jìn)行的免疫親和層析的應(yīng)用。Zimmerman等報道了，帶有異種沉淀抗體的人凝血促進(jìn)劑蛋白因子Ⅷ的鑒定[Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)79∶1648(1982)和美國專利號4，361，509(1982年11月30日頒發(fā))]。雖然這些文獻(xiàn)報告可從血漿獲得純化164，000倍的AHF，但整個操作包括6個步驟，且在沒有加熱這一步驟的條件下，全部回收率約為12%。J.J.Morgenthaler報道抗血友病因子可在二氨基烷和氨基烷衍生的瓊脂糖凝膠上層析分離[Thromb.Hamoslas(stuttart)47(2)∶124(1982)]。在這篇文章里，作者透露把醋酸-賴氨酸緩沖液應(yīng)用于改良的瓊脂糖凝膠柱上，以從聚乙二醇沉淀的AHF純化抗血友病因子Ⅷ∶C，作者指出，是疏水力，不是離子力支配這些層析柱的性能，但這篇文獻(xiàn)沒有提及產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度。
Austen，D.E.G.和Smith，J.K.報道可在乙型肝炎病毒抗原可能減少的情況下，從氨基己基-瓊脂糖凝膠上分離抗血友病因子Ⅷ[Thromb.Hamostas(stuttgart)48(1)∶46(1982)]。這篇文獻(xiàn)透露一種用氨基己基-瓊脂糖凝膠柱層析法(柱長9×150毫米，醋酸-賴氨酸洗滌液和生理鹽水梯度洗脫液)處理血漿的方法。所報告的最大產(chǎn)率為46%，純度約為血漿100倍，據(jù)說該法的主要優(yōu)點(diǎn)是其處理大量樣品的能力。此外，作者還說明，該操作方法能使乙型肝炎病毒的污染略為減輕(約1.5個數(shù)量級，取決于病毒顆粒的含量)。
A.Faure等報告了改進(jìn)的因子Ⅷ凝血劑層析分離用緩沖液[J.Chromatog.257∶387(1983)]，這篇論文透露，血漿冷沉淀物在氨基己基-瓊脂糖凝膠上層析分離期間，醋酸-賴氨酸緩沖液中加入1%和10%的蔗糖可以改善因子Ⅷ的產(chǎn)率。所報告的唯一能提高因子Ⅷ與蛋白的分離效果和增加回收率的緩沖液是含約1%(0.03M)蔗糖和1%白蛋白的緩沖液。根據(jù)作者的見解，加入蔗糖的目的是為了抑制因子Ⅷ和活化了的因子Ⅸ和因子Ⅹ之間分子復(fù)合物的形成，加入白蛋白是為了減少非特異吸附。在一個實(shí)驗(yàn)中，這種緩沖液幾乎能使因子Ⅷ凝血劑從血漿不是冷沉淀物的回收率比用不含蔗糖和白蛋白的醋酸賴氨酸緩沖液或含蔗糖的緩沖液獲得的回收率提高一倍。但是，所報告的這種回收率增加是難以解釋的，因?yàn)樽髡邲]有給出回收率絕對值數(shù)據(jù)，也沒有給出純度和分辨率的資料。單獨(dú)應(yīng)用蔗糖并不能使產(chǎn)率穩(wěn)定地增加。
Lundblad，R.L等報道過右旋糖對抗血友病因子(因子Ⅷ)層析分離的影響[Thrombosis Research，1∶197(Pergamon Press.Inc.1972)]。本文透露，在牛因子Ⅷ離子交換柱層析分離(鄰-(三乙氨基乙基)-纖維素]的洗脫緩沖液中加入0.05M左旋糖能稍微改善產(chǎn)品純度，并能使洗脫液峰部分的產(chǎn)率由15～45%增加到60～70%，但分辨率略微減低。
不管是Lundblad氏還是Faure氏，他們都應(yīng)用了高濃度的糖。lundblad氏認(rèn)為，蔗糖可能與纖維素載體結(jié)合，從而阻止蛋白的非特異吸附。Faure氏則認(rèn)為，蔗糖糖的加入可能阻止AHF和因子IXa和因子X之間復(fù)合物的形成。但是這兩種假設(shè)尚未得到證實(shí)。
Arakawa，T、和Timasheff，S.N.報告用糖可使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化[Biochem 21∶6536(1982)]。本文透露，許多糖類都可引起水溶液中蛋白質(zhì)的優(yōu)先水合作用，所以糖在這樣的系統(tǒng)中起穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用。這篇文章指出，在糖溶液中，其平衡點(diǎn)移向較牢固地折疊的構(gòu)象。然而，該文沒有談及因子Ⅷ，也沒有談及蛋白純化和柱層析法。參考資料收有這篇文章泄露的內(nèi)容。
以下幾篇文章也透露，糖、多元醇、氨基酸或鹽能起穩(wěn)定水溶液系統(tǒng)蛋白的作用(1)Arakawa，T、和Timasheff，S.N.水溶性氨基端溶液中蛋白質(zhì)與溶液成分的優(yōu)先相互作用，Arch.Biochem.Biophys.224(1)∶169(1983);(2)Pittz，E.P.和Timasheff，S.N.，核糖核酸酶A在PH5.8條件下與水溶性2-甲基-2，4戊二醇的相互作用，Biochem17(4)∶615(1978);(3)Kekko，k和Timasheff，S.N.，甘油穩(wěn)定蛋白質(zhì)的機(jī)制在甘油一水混合物中的優(yōu)先水合作用，Biochem.20∶4667(1981);(4)Lee，J.C.和Timasheff，S.N.蔗糖對蛋白的穩(wěn)定作用，J.Biol.Chem.256(14)∶7193(1981;(5)Gekko，k.和Morikawa，T.牛血清白蛋白在多元醇-水混合物中的優(yōu)先水合作用，J.Biochem 90∶39-50(1981);(6)Arakawa，T和Timasheff，S.N.濃縮溶液中蛋白質(zhì)與鹽的優(yōu)先互相作用，Biochem 21∶6545-6552(1982)。上述6篇論文中也沒有透露有關(guān)蛋白質(zhì)或AHF純化或柱層析法的任何信息。但是，因?yàn)檫@些論文含對本發(fā)明的實(shí)踐有用的、測定蛋白質(zhì)優(yōu)先水合作用的技術(shù)和資料，這些文章所透露的內(nèi)容被收進(jìn)苯申請一般參考資料中。
最后，糖和多元醇一直被用于保護(hù)酶和其活性，并在蛋白質(zhì)從天然介質(zhì)分離后穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)。在純化后加熱處理和冷凍干燥期間這一操作一直應(yīng)用。
下面的二個術(shù)語，按其在本發(fā)明中的應(yīng)用，將具有如下意義“生物液”是指含有或可能含有蛋白質(zhì)而不會引起永久性變性或失活的任何溶液或混懸介質(zhì)，包括血漿、尿、培養(yǎng)基、緩沖液和生理溶液等等。
“水合作用調(diào)節(jié)劑”是指在層析法純化蛋白質(zhì)過程中，其單獨(dú)應(yīng)用或合拼應(yīng)用能提高所純化的蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，純度和分辨率的糖，多元醇，氨基酸，鹽。應(yīng)用這一術(shù)語是為了方便。雖然本發(fā)明的發(fā)明人已觀察到，在本法的最適性與優(yōu)先水合作用的特定水平之間的密切關(guān)系，并且已經(jīng)把蛋白質(zhì)水合作用的資料作為本發(fā)明中所用的水合作用調(diào)節(jié)劑量的標(biāo)志，但是還不能認(rèn)為，蛋白質(zhì)的水合作用和層析法純化效果的改善之間存在必然的因果關(guān)系。
本發(fā)明的目的之一是提供一種從生物體液中純化AHF和其它蛋白質(zhì)的方法。提供一種從原材料生產(chǎn)高純度和高產(chǎn)率的AHF和其它蛋白質(zhì)制劑的方法，也是本發(fā)明的目的之一。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有較高濃度的AHF或其它蛋白的AHF制劑和其它蛋白制劑的制備方法。
本發(fā)明還有另一個目的提供一種含低濃度雜蛋白的AHF(或其它蛋白)純化制劑的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是要降低蛋白質(zhì)尤其是AHF的純化成本。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種從原先含較低濃度污染病毒的受污染的生物體液中，得到純化了的AHF制劑和其它蛋白制劑的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是，為用柱層析技術(shù)從血漿成分中提取AHF，更一般地說，為用柱層析技術(shù)從生物體液提取蛋白質(zhì)提供一種方法。
由于下面所透露的內(nèi)容，加上權(quán)利要求
書以及附圖，本發(fā)明的這樣、那樣的目的和特點(diǎn)，對本專業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是清楚的。
圖1是AHF產(chǎn)率對在各種糖存在下牛血清白蛋白(BSA)的優(yōu)先水合作用作圖。
圖2是血漿AHF的純化程度對在各種糖存在下BSA的優(yōu)先水合作用作圖。
圖3是二乙氨乙基-2-羥丙基葡聚糖陽離子交換層析法和氨基己基-瓊脂糖親和層析法得到的AHF分辨率的關(guān)系圖。
本發(fā)明的目的是提供在能使本法提純的蛋白產(chǎn)率、分辨率和純度中至少一項(xiàng)顯著增加的足夠濃度的糖、多元醇、氨基酸或鹽的存在下，用柱層析法純化蛋白的方法。
如上所述，業(yè)已發(fā)現(xiàn)糖、多元醇、氨基酸和鹽(水合作用調(diào)節(jié)劑)能通過蛋白質(zhì)的優(yōu)先水合作用，穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。有人認(rèn)為，蛋白質(zhì)水溶液中，蛋白質(zhì)的優(yōu)先水合作用參數(shù)的最適增加(或它的優(yōu)先互相作用參數(shù)的最適減少)能促進(jìn)蛋白質(zhì)凝聚，增加蛋白質(zhì)分子的折疊。有人進(jìn)一步認(rèn)為，其結(jié)果是，蛋白質(zhì)的疏水基比在水溶液中埋得更牢，其表面變得更親水。
本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)與水合作用添加劑的接觸能引起蛋白質(zhì)的離子相互作用的明顯增加，和疏水相互作用的明顯減少。這些水合作用添加劑的作用是可逆的，并取決于其在蛋白質(zhì)溶液中的濃度。本發(fā)明利用糖、多元醇、氨基酸和鹽的這些性質(zhì)，以有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合到離子柱上，以及有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)選擇性地從疏水性親和柱上洗脫。
首先，本發(fā)明參照一個優(yōu)選的實(shí)施方案加以敘述，該方案包括先通過離子交換層析柱，然后通過疏水性親和層析柱這樣一種連續(xù)操作方法從冷沉淀物純化AHF。但是，本發(fā)明不限于這些層析分離法的一起應(yīng)用，也不只限于純化AHF，如果愿意，可以只采用二種層析分離法中之一種，并可將本發(fā)明應(yīng)用于不僅存在于血漿而且存在于其它生物體液或生理體液中的難純化蛋白的純化。
按照一個優(yōu)先的實(shí)施方案，根據(jù)P.R.Foster等人(Vox Sang 42∶180(1982))改良的，眾所周知的J.Newman等人的方法(Brit.J.Hamatol 21∶1(1971))從血漿制備冷沉淀物。現(xiàn)特將這二篇文章透露的內(nèi)容按參考文獻(xiàn)綜合如下簡單地說，用錘式粉碎機(jī)將冷凍血漿粉碎至“雪花”大小，并移至溫度保持在15-28℃攪拌速度保持在55轉(zhuǎn)/分鐘的解凍容器中，使其融化。融化了的液體和懸浮的冷沉淀物靠重力作用排出，并收集于冷凍離心機(jī)中，用離心法收集冷沉淀物。
將這種冷沉淀物以1/10的起始體積溶于含0.02M三羥甲基氨基甲烷(Tris)pH7.4，0.02M枸櫞酸鈉和0.02M氯化鈉的緩沖液(緩沖液Ⅰ)中。隨意地加入氫氧化鋁，以吸附凝固因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ和一些纖維素蛋白元，纖維結(jié)合素以及維勒布蘭德(遺傳性假血友病)蛋白。然后標(biāo)本離心，除去氫氧化物，收集上清液。
加山梨醇到樣品中，直到其濃度達(dá)1M。滴加0.02M鹽酸(HCl)到該溶液中，使其呈酸性，PH6.6。然后加入終濃度為4%的聚乙二醇(PEG)，用以沉淀纖維蛋白元，纖維結(jié)合素和維勒布蘭德(遺傳性假血友病)蛋白。離心的上清液作柱層析。
二乙氨乙基-2-羥丙基-葡聚糖A-25凝膠(QAE-Sephadex-A-25)和二乙氨乙基-2-羥丙基-瓊脂糖凝膠4 B Fast Flow(QAE-Sepharose 4 B Fast Flow)購自(Pharmacia Chemicals Inc.Piscataway，新澤西州)。在室溫和慢速攪拌條件下，將QAE-Sephadex A-25浸泡于0.5M Na Cl過夜(或在接近沸騰的溫度下浸泡1～2小時)。然后將相當(dāng)于樣品濾液中所含2/3總蛋白毫克數(shù)的膨脹了的樹脂(以毫升計)裝入層析柱(如果用QAE-Sepharose Fast Flow，約用相當(dāng)于1/4蛋白量的凝膠就可能足夠了)。
層析柱中凝膠寬/長比率約為2∶1。然后分別用5體積的1M Na Cl/0.01M Tris(PH7.4)和5體積的0.5M-Na Cl/0.02M Tris(PH7.4)和5體積的含0.02M Tris(PH7.4)0.15M Na Cl和1M山梨醇的緩沖液(緩沖液Ⅱ)。
以每分鐘約1%柱床體積的流速把樣品濾液裝柱，然后用2體積的緩沖液Ⅱ，以每分鐘3%柱床體積的流速洗滌柱子。接著依次用5體積的含0.02M Tris(PH7.4)、0.20M Na Cl和1M山梨醇的緩沖液(緩沖液Ⅲ)和2體積的含0.02M醋酸鈉(Na Ac)PH6.0、0.035M氯化鈣(Ca Cl2)和1M山梨醇的緩沖液(緩沖液Ⅳ)進(jìn)行洗滌。
AHF蛋白用2體積的含0.1MNa Ac(PH6.0)、0.25M Ca Cl、10%甘油和0.01%～0.05%吐溫-80＊(多聚山梨酸酯-80，實(shí)驗(yàn)化學(xué)工業(yè)公司，威爾明頓，德拉韋)(吐溫的應(yīng)用對于用QA E-sepharose 4 B-Fast Flow獲得最高的AHF產(chǎn)率特別重要)的緩沖液(緩沖液Ⅴ)洗滌。收集相當(dāng)于柱床體積25%的各部分洗脫液，檢查每一部分洗脫液的AHF活性。根據(jù)改良的Bradford法(參見M.M.Bradford一種快速、靈敏的利用蛋白-染料結(jié)合原理的微克量蛋白定量法，Anal.Biochem 72∶248-254(1976)]檢測相應(yīng)各部分洗脫液的蛋白濃度。該文報告的內(nèi)容被收進(jìn)參考資料。
合并含AHF活性的各分部QAE洗脫液，并用4體積水稀釋之。
氨基己基(AH)-瓊脂糖樹脂(購自新澤西州Piscataway市Pharmacia Chemicals Inc.)以10體積0.5MNa Cl浸泡過夜。以1000單位的AHF用4ml浸泡凝膠的比例，將膨脹的凝膠裝入寬/長比率為1∶1的層析柱，并用5體積的0.02MNa Ac(PH6.0)0.15M Na Cl和0.02M Ca Cl2(緩沖液Ⅵ)淋洗。
將經(jīng)過稀釋的QAE洗脫液樣品上柱，并分別用10體積的緩沖液Ⅵ，5體積的含0.02MNa Ac，PH6.0、0.35MNa Cl和0.02MCa Cl的緩沖液(緩沖液Ⅶ)和2體積的含0.02M Tris PH7.4，0.35M Na Cl和0.02M Ca Cl2的緩沖液(緩沖液Ⅷ)淋洗。
AHF用2體積的含0.1 M Tris(PH7.4)，0.35M Ca Cl2，1M山梨醇和0.1%吐溫-80(多聚山梨酸酯80)的緩沖液(緩沖液Ⅸ)洗脫。測定各分部洗脫液的AHF活性，并將有AHF活性的各分部合并。
含AHF各分部洗脫液中的蛋白濃度用Weissman氏法測定。[Schaffner，W.和Weissman，C一種快速、靈敏和特異的用于測定洗脫液中蛋白質(zhì)的方法。Anal.Biochem 56∶502-514(1973)。這篇文獻(xiàn)報告的內(nèi)容特地被收進(jìn)參考資料。]簡短地說，樣品用終濃度為15%(v/v)的三氯醋酸沉淀，然后通過硝基纖維素濾膜(馬薩諸塞州梅德弗德市Millipore公司生產(chǎn)的微孔過膜HAWP)過濾，收集沉淀物。沉淀物用氨基黑進(jìn)行染色，并用甲醇-醋酸-水混合液進(jìn)行脫色，切下色斑，洗脫入1ml氫氧化鈉-EDTA(乙二胺四乙酸)，讀取A630值。
采用下法可使QAE柱再生先用最大濃度為2M的梯度Na Cl溶液進(jìn)行洗滌，然后用0.1NNa OH洗，以除去蛋白，用乙酸或非離子型表面活性劑洗，以除去脂類，最后用緩沖液Ⅱ洗，以重新建立平衡。
采用下法可使AH瓊脂糖再生分別用1體積水，2體積正丁醇，1體積95%乙醇，5體積1MNa Cl，5體積0.5M Na Cl 0.02MNa Ac，PH6.0和5體積緩沖液Ⅵ。
從這些連續(xù)的層析分離步驟得到的AHF的產(chǎn)率、純度和濃度是高的。本發(fā)明的主要特點(diǎn)是水合作用添加劑的應(yīng)用，以及在AHF其它蛋白純化過程中這種水合作用添加劑濃度的控制，以促進(jìn)AHF和其它蛋白吸附到離子交換樹脂上，并促進(jìn)其從疏水性親和樹脂上的解離，并獲得高產(chǎn)率回收，分辨力高、純度高的蛋白。
本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，水合作用添加劑的應(yīng)用可以起這樣的作用(a)明顯增強(qiáng)AHF與陰離子交換樹脂的親和力，有選擇性地使其停留在相當(dāng)窄的柱段內(nèi);
(b)明顯地使AHF與疏水性樹脂的親和力失去穩(wěn)定，從而使其容易洗脫。
在陰離子交換層析法中選用這一系列特別的材料和步驟的理由如下(a)用緩沖液Ⅱ把樣品裝上陰離子柱并用相同的緩沖液洗滌這種方法，可以使AHF蛋白離子結(jié)合到樹脂上，而讓大多數(shù)其它蛋白洗脫掉。(一般說來，陰離子交換柱能獲得的初次純化程度比疏水性和柱高)。緩沖液Ⅱ含有一個濃度的水合作用添加劑，在該濃度下，AHF對陰離子交換柱的親和力比許多其它蛋白對這種柱的親和力強(qiáng)。
(b)緩沖液Ⅲ可以從這種樹脂上洗掉吸附的雜蛋白。
(c)緩沖液Ⅳ通過把這種洗脫液的PH降低到接近AHF的等電點(diǎn)，從而選擇性地減弱AHF與樹脂的結(jié)合這種方法，為AHF的洗脫作準(zhǔn)備。但是為了防止這種緩沖液引起AHF和樹脂結(jié)合鍵的破壞(和AHF的提前洗脫)，溶劑的離子強(qiáng)度也同時降低。
(d)緩沖液Ⅴ含有(ⅰ)一種高鹽濃度的緩沖，以保證所有蛋白處于一個適當(dāng)?shù)腜H環(huán)境中;(ⅱ)鈣離子，用于洗脫這種蛋白質(zhì)，并破壞AHF和混雜的維勒布蘭德因子之間的非共價鍵;(ⅲ)甘油用于穩(wěn)定AHF蛋白(因?yàn)樵摼彌_液中去掉了糖，以促進(jìn)AHF蛋白從樹脂上的解吸附作用;(ⅳ)吐溫-80，用于幫助消除AHF蛋白與凝膠載體的非特異性結(jié)合。
氨基己基-瓊脂糖樹脂柱用于從混雜的親水性蛋白中純化AHF。通常這種樹脂通過疏水性的相互作用與蛋白結(jié)合，而該樹脂上的氨基則是通過靜電相互作用，結(jié)合蛋白質(zhì)。為這種層析柱選擇實(shí)驗(yàn)步驟和材料的理由如下(a)緩沖液Ⅵ含中等量的鹽以洗脫結(jié)合弱的蛋白。
(b)緩沖液Ⅶ含較高量的鹽，以洗脫結(jié)合較緊的蛋白。
(c)緩沖液Ⅷ提供了洗脫的PH，以使許多蛋白離子化，從而將它們從這種柱上洗脫下來。雖然在這一PH下，AHF的電荷是增加的，但它仍保持與這種層析柱的結(jié)合，盡管這種結(jié)合較為松馳。
此緩沖液Ⅸ用于洗脫AHF蛋白。較高鹽濃度的液使PH發(fā)生改變。鈣提供了一種洗脫用的平衡離子，并破壞AHF與可能仍然存在的維勒布蘭德因子之間的非公價鍵。山梨醇增加了AHF對這種層析柱的離子的相互作用，減少了AHF對這種層析柱的疏水性的相互作用。吐溫-80有助于消除AHF蛋白對這種凝膠的疏水性和非特異性的結(jié)合，從而進(jìn)一步提高產(chǎn)率。
如上所述，上面報告的方法只是本發(fā)明中的一個優(yōu)選的實(shí)施方案。正如該方案所闡述的那樣，單獨(dú)用陰離子交換層析柱或單獨(dú)用疏水的親和層析柱均可獲得高質(zhì)量的純化的AHF蛋白。像對這種純化方法熟練程度一般的人容易領(lǐng)會的那樣，可以對此技術(shù)作許多改進(jìn)而不會影響分離的質(zhì)量，現(xiàn)將許多這樣的改良法透露如下(a)可以用其它已知的方法，如可應(yīng)用于QAE柱的親水性多聚物(例如聚乙二醇)(以每毫升蛋白用約4-10mg的量)，制備AHF粗提物。
(b)冷沉淀物能重新溶解在PH范圍5.0～9.0(雖然6.4～7.8更好，而7.0為最適PH)的任何適當(dāng)?shù)木彌_液中，氫氧化鋁并不需要，各種生理性鹽類中之任一種可用于該緩沖液中。
(c)1～6%的聚乙二醇(PEG)能用于沉淀纖維蛋白元蛋白，但只有當(dāng)這種冷沉淀物濃度大于6mg蛋白/ml溶液時，這一步驟才具有重要性。另一方面，其它親水性多聚物，或肝素也可用作纖維蛋白元/纖維結(jié)合素沉淀劑。
(d)從任何制造廠購得的陰離子交換樹脂或疏水性親和樹脂均可使用。雖然某些具有與本發(fā)明所用的樹脂不同電荷密度，疏水性和基質(zhì)的樹脂需要稍微調(diào)正緩沖液，但這種緩沖液的更換可以由一個對本技術(shù)熟悉的人員容易地完成。而且這種緩沖液的更改一般都包括在制造商的說明書中。順丁烯二酸酐多聚電介質(zhì)層析可以代替疏水性的親和層析法。而且，在陰離子交換層析柱后再用疏水性親和層析柱進(jìn)行分離純化，并不是必須的。其它的離子交換柱或其它部分地疏水的層析柱(包括但不是僅限于順丁烯二酸酐多聚電介質(zhì))都可以用來純化AHF蛋白。此外，如上所述，如果愿意的話，一個類型的層析柱(離子交換，多聚電介質(zhì)或疏水性親和柱)可以只使用一次。
(e)AHF蛋白與膨脹了的QAE凝膠的比例可以80∶1到0.5∶1，雖然適宜的范圍是5∶1到0.5∶1以及最適范圍是3∶1到0.5∶1。
(f)各種不同直徑的層析柱可以使用，柱的寬∶長比值可從1∶100～100∶1，雖然適宜的范圍是1∶1～5∶1，以及最適范圍是2∶1。對本技術(shù)熟練的人會體會到，不同管徑大小的層析柱可以改變分辨率，必須相應(yīng)地調(diào)整緩沖濃度和洗脫液體積。
(g)除層析柱容量外，對流速并無限制。但是，流速慢可以獲得較大的分辨力。
(h)緩沖液Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ全都用來洗滌并不是絕對必要的。此外，所用的每種緩沖液的量是可以改變的。對緩沖液Ⅱ來說，其工作范圍是0-10倍(或更多)于柱床體積，優(yōu)選范圍為2-5倍于柱床體積，最佳用量為柱體積的2倍。對緩沖液Ⅲ來說，其有效用量范圍為0-10倍(或更多)于柱床體積。優(yōu)選用量范圍為柱床體積的3-6倍，最佳用量為柱床體積的5倍;對緩沖液Ⅳ來說，其有效用量范圍為柱床體積的0-10倍，優(yōu)選用量為柱床體積的2倍。
(i)可以對緩沖液Ⅴ作許多改動而不會明顯減弱它的洗脫效果。該緩沖液的有效PH范圍是4-9，優(yōu)選范圍為5.9-6.5，最適PH為6.0(該P(yáng)H對AHF蛋白的穩(wěn)定性是可靠的，但它較接近于AHF的等電點(diǎn))。至于特定的緩沖液濃度并沒有限定，雖然其優(yōu)選范圍是0.02～2.0M，最佳濃度是0.35M。對平衡離子，除了其濃度最在好在0.02～2M范圍內(nèi)，以及二價離子的最佳濃度為0.35M，單價離子的最佳濃度為1M外，其種類并無限制。任何水溶液醇，或多元醇，或水溶性有機(jī)溶劑都可使用，雖然它們并不是絕對需要的，用量為0.05～15%的乙醇為優(yōu)選溶劑，其最佳用量為1%，任何離子型的和非離子型的洗滌劑或者表面活性劑都可以使用，雖然它們并不是必要的。關(guān)于吐溫-80，其有效用量范圍為0～50%，其優(yōu)選范圍為0.001～0.2%，其最佳用量為0.025%。
(j)水合作用添加劑濃度隨所用的添加劑不同而不同。
(k)適合于非腸道給藥的其它生理緩沖液，也可在上面指定的PH和離子強(qiáng)度范圍內(nèi)應(yīng)用(完全按照本純化技術(shù)內(nèi)規(guī)定的應(yīng)用)。
(l)為了獲得最佳的AHF產(chǎn)率，純度和分辨力，確定糖、多元醇、氨基酸或鹽(水合作用添加劑)的用量是必須的。盡管某些糖和醇在AHF純化中的應(yīng)用來說，通過反復(fù)試驗(yàn)，已經(jīng)確定了其起始用量。
鑒于AHF純品(確實(shí)是以能取得優(yōu)選水合作用數(shù)據(jù)的AHF量)實(shí)際上未能得到，根據(jù)Gekko，K.和Morikawa，T.(見上面所引文獻(xiàn))提供的資料，可以把在不同濃度的水合作用添加劑水溶液條件下得到的牛血清白蛋白(BSA)的優(yōu)選水合作用相聯(lián)系?，F(xiàn)將Gekko和Morikawa的資料復(fù)制如下表Ⅰ在水溶性多元醇系統(tǒng)(25℃)中牛血清白蛋白與溶劑的偏微分比容積和優(yōu)選相互作用參數(shù)
a.每克水中乙醇克數(shù)。
b.1千克水中每摩爾蛋白每摩爾乙醇的熱卡值。
表Ⅲ 在葡萄糖水溶液中蛋白質(zhì)與溶劑的優(yōu)選相互作用參數(shù)
表Ⅲ BSA與氨基酸的優(yōu)選相互作用參數(shù)蛋白質(zhì)與氨基酸的作用
表Ⅰ 相互作用參數(shù)
表Ⅱ 在乳糖水溶液中幾種蛋白質(zhì)的偏微分比容和優(yōu)選相互作用參數(shù)
一個對本技術(shù)一般熟練的人，通過使用能使牛血清白蛋白產(chǎn)生0.23優(yōu)選水合作用值的若干濃度的各種水合作用添加劑，就能獲得希望純化的蛋白(在本文情況下，是AHF蛋白)的產(chǎn)率和純度的層析分析數(shù)據(jù)。
利用BSA在含各種糖的溶液中的水合作用數(shù)據(jù)，作了如下觀察當(dāng)BSA的優(yōu)先水合作用值對在不同濃度的各種糖、多元醇存在下的冷沉淀物層析分離得到的AHF產(chǎn)率和純度作圖時，可以發(fā)現(xiàn)，在能產(chǎn)生0.22～0.24g H2O/g BSA的BSA優(yōu)選水合作用的相當(dāng)窄的糖濃度范圍內(nèi)，AHF的產(chǎn)率(圖1)和純度(圖2)為最大。在能產(chǎn)生高于或低于此值的BSA優(yōu)選水合作用的糖濃度下，所純化的AHF的純度都是比較低的。1M山梨醇選為純化AHF的最佳濃度。
任何能優(yōu)選水合AHF的水合作用添加物量都可使用，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)能使BSA水合達(dá)0.23克水/克BSA的水合作用添加物用量為最佳用量。所用的水合作用添加劑不必是山梨醇，雖然它是優(yōu)選的。
能應(yīng)用的糖(不僅用于AHF，而且也可用于其它蛋白)有蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、松三糖、葡聚糖、木糖、阿洛糖、6-脫氧甘露糖、6-脫氧半乳糖等。最好用人工方法使糖降解，以省去進(jìn)一步的純化步驟，這應(yīng)該是可能的。AHF純化用的優(yōu)選糖是葡萄糖和麥芽糖。用于AHF純化的優(yōu)選的糖濃度范圍是蔗糖 0.5-2.0 M，以1.0M為最好;
乳糖 0.0-0.4，以0.25M為最好;
麥芽糖0.2-0.4，以0.3M為最好;
葡萄糖0.5-2.0 M，以1.0M為最好。
另一方面，多元醇、氨基酸或鹽也能用。
一般而言，合適的多元醇是山梨醇、甘露醇、肌醇、核糖醇、赤蘚醇、乙二醇、木糖醇、丙二醇、2-甲基-2，4-戊二醇、聚蔗糖(一種合成的蔗糖多聚物)和核糖醇，其中以山梨醇為最好。AHF層析分離中山梨醇的優(yōu)選濃度范圍是0.5～2.0M，以1.0M為最好。
適宜的氨基酸有甘氨酸，β-丙氨酸、β-丙氨酸，以及更好的甜菜堿。
適宜的鹽有醋酸鈉、醋酸鉀、氯化鈉、硫酸鈉、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鎂、硫氰酸鉀等。各種糖、醇、氨基酸和鹽的優(yōu)先水合作用參數(shù)可以從上面引用的Timasheff等的幾篇論文中得到，或根據(jù)他們的方法經(jīng)驗(yàn)地加以測定。
前面的參考文獻(xiàn)透露了使用多種溶劑的各種蛋白質(zhì)的優(yōu)選相互作用或優(yōu)選水合作用(下面給出這兩個術(shù)語的定義)值和測定優(yōu)選水合作用的方法。這些論文所透露的水合作用值和水合作用添加劑的濃度復(fù)制如下由于Lee等和Arakawa等(文獻(xiàn)見前面)所報告的方法是一種復(fù)雜的操作，而且需要一名高級的生理化學(xué)專家，因此，也許可以通過查明過去這些研究在牛白蛋白系統(tǒng)或其它蛋白系統(tǒng)中，是否已用過這種添加劑，確定達(dá)到希望的優(yōu)選相互作用或優(yōu)選水合作用所需要的該添加劑的大約濃度。
正如上面指出的那樣，對AHF純化來說，BSA可作為樣板。有人發(fā)現(xiàn)，能優(yōu)選地使蛋白水合到約0.22-0.24(克水)/(克BSA)水平的添加劑的量是用于AHF層析的最佳添加劑用量。
在從上面的表列數(shù)據(jù)查得水合作用值后，還有一點(diǎn)是重要的，即通過改變層析分離期間所用的添加劑的量(在由白蛋白的優(yōu)選水合作用所指示的那個濃度的適中范圍內(nèi))確定對所用的某一特定蛋白最適宜的添加劑濃度，因?yàn)槊糠N蛋白與每種添加劑的相互作用是不同的。
另一方面，Lee等的方法可用于測定所挑選的蛋白的優(yōu)選水合作用參數(shù)，也可用于糖、多元醇、或氨基酸的層析系統(tǒng)中，其濃度必須是最適宜。
Lee等的方法是研究在水-糖(多元醇、氨基酸等等)混合系統(tǒng)中，溶劑成分與蛋白質(zhì)的優(yōu)選結(jié)合作用。這里，水為成分1，蛋白質(zhì)為成分2，糖(或其他水合作用添加劑)為成分3。這些相互作用可借助追蹤作為水合作用添加劑濃度的一個功能的蛋白質(zhì)偏微分比容的變化，加以測量。偏微分比容可用一只精密的MDA-02型密度計(Anton Paar公司.Grats)，由式1算出φ＝1/0(1- (ρ-ρo)/(C) )(1)式中，φ＝表觀偏微分比容ρ+ρo＝分別為溶液+溶劑的密度C＝蛋白濃度(g/ml)由于蛋白質(zhì)的密度是在恒定的化學(xué)勢和恒定的溶劑成分的重量克分子濃度下加以測量，因而就有可能測定成分3，2和1之間優(yōu)選相互作用的程度。
(2g3/2g2)T，μ1，μ3≡ξ3(優(yōu)先相互作用參數(shù))與該系統(tǒng)中密度(P)的變化有關(guān)ξ3=(2g3/2g2)T,μ1,P3=(2g/2g2)T,μ1,μ1-(2g/2g2)T,P,m1(2g/2g3)T,P,m1]]>式中，mi是成分i的重量克分子濃度，μi是它的化學(xué)勢T＝熱力學(xué)溫度
P＝壓力gi＝以克/克水表示的成分i的濃度。
根據(jù)一定的稀釋倍數(shù)下偏微分比容的定義，我們可以寫成下式
(2)式中，標(biāo)在右上角的符號°表示大分子類的一定稀釋倍數(shù)。
＝成分3的偏微分比容;
Po＝溶劑的密度;
φ＊2＝蛋白質(zhì)的近似偏微分比容;在恒定的容積克分子濃度條件下進(jìn)行測定;
φ12＝在恒定的化學(xué)勢條件下測定的蛋白質(zhì)近似偏微分比容。
(2g3/2g2)T，μ1，μ3的符號可以是正的，這表示成分3與蛋白質(zhì)的優(yōu)選結(jié)合，或也可以是負(fù)的，這表示蛋白質(zhì)周圍成分3的不足，結(jié)果造成與水的優(yōu)選相互作用。當(dāng)此符號為負(fù)時，可用下式表示優(yōu)選水合作用參數(shù)(2g1/2g2)T，μ1，μ3＝-1/g3(2g3/2g2)T，μ1，μ3(3)這些測量用精密的密度計進(jìn)行，并用方程式1計算近似偏微分比密(ψ)，然后將此所觀察到的外推ψ值和在無限大稀釋度下外推的ψ值繪制成圖，作為蛋白質(zhì)濃度的一種功能，并將這些數(shù)值應(yīng)用于方法式2中，以便計算優(yōu)選相互作用的程度。這樣便可以用方程式3計算優(yōu)選水合作用參數(shù)。
應(yīng)用本文報導(dǎo)的發(fā)明技術(shù)，可以獲得純化程度比以前的方法高100-150倍的AHF蛋白，和產(chǎn)率比以前方法高的AHF回收率。用下面的一些例子對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。這些例子想試圖說明本發(fā)明，但并沒有限制其應(yīng)用范圍。
例1∶3升冰凍人血漿使呈部分軟化狀態(tài)后，用一橡皮錘碾碎，然后將其置37℃融化，而使血漿溫度保持在0-2℃，接著立即移至冰浴，然后在4℃以2500×g速度離心半小時。沉淀物重新溶解于300ml緩沖液Ⅱ中，并加入1.3%氫氧化鋁懸液(每立升血漿加30ml)，然后將上述混合物在10℃以2500×g速度離心15分鐘。根據(jù)上清液的檢測結(jié)果，其蛋白和AHF濃度分別約為4毫克/毫升和2.8單位/毫升，按此值計算，總蛋白量和總AHF量分別為1200毫克和840單位。
制備寬/長比例為2∶1的含800ml QAE-Sephadex A-25膨脹凝膠的層析柱。以12毫升/分鐘的流速把300毫升樣品上清液裝上柱，然后分別用2體積緩沖液Ⅱ，5體積緩沖液Ⅲ，2體積緩沖液Ⅳ和2體積緩沖液Ⅴ，以24毫升/分鐘的流速洗柱(用QAE-Sepharose4 B-fast flow凝膠時，為了獲得最大的純度和產(chǎn)率，需要較高的鹽濃度)。用緩沖液Ⅴ收集的抽提物如下
分部號 因子ⅧC 因子ⅧC 總蛋白(單位/毫升) (單位/管) (毫克/毫升)1 0 0 02 0 0 03 0.09 10.8 -4 0.74 88.8 -5 1.80 252.0 0.0756 1.30 169.0 0.0457 1.40 168.0 0.0048 0.75 90.0 -9 0.41 49.0 -產(chǎn)品中的AHF總量每毫升含827單位AHF，0.124毫克總蛋白。
純化倍數(shù)3200倍于冷沉淀物回收率98%合并代表70%回收率和純化2600倍的5-7分部，其總量為390毫升，并用4倍體積的緩沖液Ⅵ稀釋，使其總量為1950毫升。
4毫升膨脹了的AH-瓊脂糖凝膠填裝入寬/長比例為1∶1的小層析柱中。把通過QAE-Sephadex A-25柱純化的含因子Ⅷ∶C的溶液，以24毫升/分鐘的流速裝上柱，然后分別用10倍體積的緩沖液Ⅵ，5倍體積的緩沖液Ⅶ，2倍體積的緩沖液Ⅷ和2倍體積的緩沖液Ⅸ洗滌柱。用緩沖液Ⅸ洗脫期間分部收集，每管1毫升，結(jié)果如下
管號 單位/毫升 毫克/毫升1 0 -2 194 0.4343 239 0.4064 84 0.1965 46 0.1826 15 0.1687 5 0.0568 0 0.028總AHF量和總蛋白量(此步驟)分別為577單位，1.47毫克純化倍數(shù)(此步驟)11倍總純化倍數(shù)28，000倍于血漿回收率(此步驟)98%總回收率70%在上面的例子中，只有三個分部收集物用于疏水性親和層析，這樣做是為了獲得最大的分辨率和純度。如要獲得最大產(chǎn)率，所有從QAE層析柱收集的有AHF活性的各分部均可用于疏水性親和層析分離。以這樣和那樣的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，其總回收率將會達(dá)到96%。
例2-6如例1所述，從QAE柱上洗下冷沉淀物，其純化倍數(shù)和回收率如下例號 純化倍數(shù)(自血漿) 回收率(%)2 3500 1003 6200 1004 5300 995 4500 796 3700 100平均 4640 95.6例7-9除山梨醇省去不同外，按例1所述，從QAE柱洗脫下冷沉淀物，結(jié)果列于下面例號 純化倍數(shù)(自血漿) 回收率(%)7 1400 698 2500 499 2900 59平均 2300 59
例14-22除使用不同的糖外，其余按例1所述方法將冷沉淀物從QAE柱上洗脫下來。如上所述，用因子Ⅷ無法進(jìn)行優(yōu)選水合作用實(shí)驗(yàn)，故采用Arakawa.Gekko和Morikawa等人用BSA得到的優(yōu)選水合作用數(shù)據(jù)代替之(見前面的優(yōu)選水合作用表)，結(jié)果列表如下牛血清白蛋白(BSA) 因子Ⅷ例號 糖 克分子濃度 優(yōu)先水合作用值 回收率 純化倍數(shù)(%) (自血漿)14 乳糖 0.25 0.300 85 440015 乳糖 0.20 0.300 70 270016 葡萄糖 1.0 0.250 83 510017 山梨醇 1.6 0.235 88 270018 山梨醇 1.1 0.229 100 550019 葡萄糖 1.5 0.226 100 610020 葡萄糖 2.0 0.212 76 490021 山梨醇 0.55 0.205 62 170022 山梨醇 0.82 0.198 72 1900當(dāng)這些AHF純度和產(chǎn)率數(shù)據(jù)對在等量的糖用量下BSA的優(yōu)選水合作用數(shù)據(jù)作圖時，觀察每種糖的最佳峰(圖1和2)
例23在用或不用山梨醇的條件下，按例1所述的方法用QAE層析柱純化沉淀物。結(jié)果如下山梨醇克分子濃度 回收率(%) 純化倍數(shù)1 77 42001 82 37001 100 56001 92 40001 98 9001 94 39001 91 34000 35 5600 48 5350 59 6830 59 18000 71 700例24除使用不同濃度的麥芽糖外，其余按例1所述的方法，用QAE層析柱純化冷沉淀物，其結(jié)果如下
麥芽糖(M) 回收率(%) 自起始血漿的最終純化倍數(shù)0.3 100 21000.3 81 14200.3 100 22000.3 100 34000.0 64洗滌緩沖液0.05M Ca Cl2，0.02M Na Ac0.3 100 36000.3 88 80000.3 100 3000洗滌緩沖液0.02M Na Ac;0.035 M Ca Cl20.3 92 40000.3 91 180000.3 98 90000.0 71 7000.0 78 5600.3 94 3900
例25除山梨醇省去不用外，按例1所介紹的氨基己基瓊脂糖層析法所獲得QAE抽提物，其結(jié)果如下QAE洗脫液洗脫液中山梨 純化倍數(shù) 回收率 最終純化倍數(shù)醇克分子濃度 (自血漿) (%) (自血漿)0 2000 13 1，8000 2100 48 2，3001 4400 100 38，1001 4500 96 38，1001 5700 89 25，0001 2100 100 20，7001 5600 94 80，0001 5700 60 17，000例26按例1方法，用順丁烯二酸酐聚電介質(zhì)層析法處理根據(jù)例1方制備的冷沉淀物。順丁烯二酸酐聚電介質(zhì)可從英國威爾士，雷克塞姆的Speywood公司得到(以“SPEYL ITE”商標(biāo)銷售)。在Johnson.A.J等人的論文(J.Lab.Clin Med.92(2)194-210(1978年8月)]中已報告順丁烯二酸酐聚電介質(zhì)在AHF純化中的應(yīng)用。
聚電聚介質(zhì)樹脂按下法制備將干樹脂浸泡在0.15MNa Cl中，30分鐘后用枸櫞酸把PH調(diào)低到4.0，維持此PH值20分鐘，然后用Na OH調(diào)高到PH6.6。
層析分離按如下步驟進(jìn)行用5倍于柱床體積的0.15M Na Cl，0.02M枸櫞酸鈉溶液(PH6.6)平衡柱，用枸櫞酸調(diào)節(jié)AHF濃縮物的PH至6.6，并以1毫升/分鐘的流速上樣。其結(jié)果如下洗脫液中山梨 冷沉淀物純化倍數(shù) 回收率 最終純化倍數(shù)醇克分子濃度 (自血漿) (%) (自血漿)0 60 42 26000 60 55 20000 60 35 18000 60 31 18101 60 71 38701 60 85 41001 60 72 27001 60 71 3500上面的結(jié)果表明，用順丁烯二酸酐聚電介質(zhì)樹脂代替氨基己基瓊脂糖是可行的。
如上面報告的那樣，氨基己基-瓊脂糖層析分離的結(jié)果，并不總是令人滿意的。本發(fā)明的發(fā)明者已把這種情況與不同批號瓊脂糖質(zhì)量的差異相聯(lián)系。
雖然為了說明的目的，本發(fā)明的具體操作方法已經(jīng)透露，但是，還有待對本技術(shù)熟悉的人來評價;在不離開本發(fā)明的應(yīng)用范圍和原則的情況下，本發(fā)明的許多附加法、替代法和改良是可行的。
例如，雖然本文闡述的是AHF蛋白的純化，但本純化方法也可以應(yīng)用于所有能被糖、醇、氨基酸或鹽類穩(wěn)定和(或)被優(yōu)選水合的各種蛋白。
本發(fā)明最適用于以少量存在于生物體液或希望獲高產(chǎn)率回收的那些蛋白的純化。這樣的蛋白包括其它血液凝固因子，如因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ，但不是僅限于這些。白蛋白和免疫球蛋白也可以用這一方法加以純化，雖然這僅限于著重高回收率時，因?yàn)閾?jù)說在通常情況下(例如當(dāng)必須純化相當(dāng)大的蛋白量和較低的回收率能允許時)，用本法純化白蛋白和免疫球蛋白并不是低成本的。對于每一種蛋白來說，層析分離用的水合作用添加劑的最佳濃度均須加以確定。按上面所討論的方法就能做到這一點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.純化蛋白質(zhì)的方法，該方法是在選自糖、多羥基醇、氨基酸和鹽的水合作用添加劑存在下，并且在添加劑的濃度是以使從柱上回收的上述蛋白質(zhì)的回收率、純度和分辨率中至少一項(xiàng)有顯著增加的條件下，用柱層析使蛋白質(zhì)純化。
2.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述柱層析法選自包括離子交換層析法，疏水性親和層析法，疏水性/離子交換混合層析法，和它們的一系列混合方法。
3.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)可選自抗血友病因子，血液凝聚因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ，白蛋白和免疫球蛋白。
4.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述水合作用添加劑是選自蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、核糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、棉子糖、松三糖、葡聚糖、木糖、阿洛糖、6-脫氧甘露糖和6-脫氧半乳糖的糖。
5.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述水合作用添加劑是選自山梨醇、甘露糖醇、肌醇、核糖醇、赤蘚醇、乙二醇、丙三醇、丙二醇、木糖醇、2-甲基-2，4-戊二醇、聚蔗糖和核糖醇的多羥基醇。
6.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述水合作用添加劑是選自甘氨酸、β-丙氨酸和甜菜堿。
7.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述水合作用添加劑是選自醋酸鈉和醋酸鉀、氯化鈉、硫酸鈉、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈰和硫氰酸鉀的鹽。
8.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中柱層析是離子交換柱層析。
9.按照權(quán)利要求
8所述的方法，其中蛋白質(zhì)是抗友病因子，并且所述柱層析是陰離子交換柱層析。
10.按照權(quán)利要求
9所述的方法，包括所述因子用陰離子交換層析法純化后，還要用疏水性親和柱層析法進(jìn)行第二次純化。
11.按照權(quán)利要求
8所述的方法，其中將水合作用添加劑用于柱層析，以增加所述蛋白質(zhì)和離子交換材料在柱內(nèi)的結(jié)合。
12.按照權(quán)利要求
11所述的方法，其中將水合作用添加劑用于樣品緩沖液中，以便選擇性地增加所述蛋白質(zhì)和柱之間的結(jié)合，因而促進(jìn)在柱的離子交換材料上的吸附。
13.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中水合作用添加劑在所述蛋白洗脫之前從柱上除去。
14.按照權(quán)利要求
13所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是抗血友病因子。
15.按照權(quán)利要求
14所述的方法，其中所述添加劑是選自劑是選自蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、山梨醇和甘露糖醇。
16.按照權(quán)利要求
15所述的方法，其中所述添加劑是蔗糖，并且它的濃度范圍在約0.5和2.0摩爾之間。
17.按照權(quán)利要求
15所述的方法，其中所述添加劑是麥芽糖，并且它的濃度范圍在約0.2和0.4摩爾之間。
18.按照權(quán)利要求
15所述的方法，其中所述添加劑是葡萄糖，并且它的濃度范圍在約0.5和2.0摩爾之間。
19.按照權(quán)利要求
15所述的方法，其中所述添加劑是山梨醇，并且它的濃度范圍在約0.5和2.0摩爾之間。
20.按照權(quán)利要求
12所述的方法，其中在加入含有所述蛋白質(zhì)的生物液體樣品到柱上之前，所述水合作用調(diào)節(jié)劑被加到所述柱平衡緩沖液中。
21.按照權(quán)利要求
20所述的方法，其中所述樹脂是四氨乙基陰離子交換樹脂。
22.從血漿冷沉淀中純化抗血友病因子的方法，該方法包括在選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和山梨醇的添加劑存在下，在添加劑的量足以明顯增加AHF對所述柱的表面結(jié)合親和力的條件下，將上述冷沉淀裝到陰離子交換層析柱上;洗滌該柱，以便除去雜質(zhì);從柱上消除添加劑;并且洗脫和回收因子。
23.權(quán)利要求
22的方法，其中陰離子交換柱是四氨乙基陰離子樹脂柱。
24.權(quán)利要求
23所述的方法，其中洗脫一步包括應(yīng)用生理上可以接受的洗滌劑，以提高上述因子從柱上的解吸。
25.權(quán)利要求
24所述的方法，其中所述添加劑是應(yīng)用濃度范圍在約0.5和2.0摩爾之間的山梨醇。
26.權(quán)利要求
25所述的方法，其中所述洗滌劑是濃度范圍在約0.01%和0.05%之間的多乙氧基醚80。
27.權(quán)利要求
26所述的方法，其中添加劑是應(yīng)用濃度在約1摩爾的山梨醇。
28.，按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中柱層析是疏水性親和柱層析。
29.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中蛋白質(zhì)是抗血友病因子。
30.按照權(quán)利要求
1所述的方法，其中水合作用添加劑被加到柱上，以便選擇性地減弱上述蛋白質(zhì)和疏水性親和材料之間在柱內(nèi)的結(jié)合，因而促進(jìn)上述蛋白質(zhì)從柱上洗脫。
31.按照權(quán)利要求
29所述的方法，其中上述水合作用添加劑被加到該柱的洗脫緩沖液中，該洗脫緩沖液是用于洗脫上述蛋白質(zhì)的。
32.按照權(quán)利要求
30所述的方法，其中上述添加劑選自山梨醇、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖和甘露糖醇。
33.按照權(quán)利要求
30所述的方法，其中疏水性親和層析柱主要由氨基己基瓊脂糖所組成。
34.按照權(quán)利要求
31所述的方法，其中洗脫步驟包括應(yīng)用生理上可以接受的洗滌劑，以便增加上述因子的解吸。
35.按照權(quán)利要求
34所述的方法，其中上述洗滌劑是濃度范圍在約0.01%和0.8%之間的多乙氧基醚80。
36.按照權(quán)利要求
34所述的方法，其中上述添加劑是應(yīng)用濃度范圍在約0.5和2.0摩爾之間山梨醇。
37.按照權(quán)利要求
34所述的方法，其中上述添加劑是蔗糖，并且它的濃度范圍在約0.5和2.0摩爾之間。
38.按照權(quán)利要求
34所述的方法，其中上述添加劑是麥芽糖，并且它的濃度范圍在約0.2和0.4摩爾之間。
39.按照權(quán)利要求
34所述的方法，其中上述添加劑是葡萄糖，并且它的濃度范圍在約0.5和2.0摩爾之間。
40.權(quán)利要求
34所述的方法，其中上述添加劑是應(yīng)用濃度約為1摩爾的山梨醇。
41.權(quán)利要求
1所述的方法，其中上述的層析在混合的離子交換/疏水性親和柱上進(jìn)行。
42.權(quán)利要求
41所述的方法，其中上述柱是順丁烯二酸酐聚電解質(zhì)柱。
43.按照權(quán)利要求
34所述的方法，其中上述的洗滌劑是濃度范圍在約0.5%和0.2%之間的多乙氧基醚80。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種純化蛋白質(zhì)的方法，該方法是在選自糖，多羥基醇，氨基酸和鹽的水合作用添加劑存在下，并且在添加劑的濃度足以使從柱上回收的上述蛋白質(zhì)的回收率，純度和分辨率中至少一項(xiàng)有顯著增加的條件下，用柱層析使蛋白質(zhì)純化。
文檔編號B01D15/08GK86102829SQ86102829
公開日1987年11月4日 申請日期1986年4月24日
發(fā)明者里塔·懷特·馬修斯, 阿蘭·J·約翰森 申請人:紐約大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan