專利名稱:制備具有藥物作用的透明質(zhì)酸組分及含該組分的藥物的方法
本發(fā)明是關(guān)于透明質(zhì)酸的特殊分子量組分(以下稱為“HA”)，它有治療作用，且應(yīng)用時(shí)不發(fā)炎。
本發(fā)明的HA組份之一能用于促進(jìn)創(chuàng)口愈合，而另一種HA組份能用于眼球內(nèi)代替球內(nèi)液，或用于治療受傷骨關(guān)節(jié)內(nèi)注射。HA組份還被發(fā)現(xiàn)能作為眼科藥物的載體提供適合于角膜上皮的配方并提高眼科藥物的作用。
透明質(zhì)酸是天然存在的異多醣體，含有D-葡萄糖及N-乙酰-D-葡萄糖胺的改性殘余物。HA是高分子量的線性聚合物，通常分子量約高達(dá)800萬至1300萬，存在于細(xì)胞膜(cell coats)、脊椎動(dòng)物的結(jié)締組織的細(xì)胞外基質(zhì)、關(guān)節(jié)的滑囊液、眼球內(nèi)液、人臍帶組織及雄雞的雞冠中。
以前關(guān)于HA用途的研究包括在巴拉士(Balazs)的工作中，美國專利號4，141，973，指出HA組份可用于代替眼球內(nèi)液以及有其他治療應(yīng)用。該專利是指向于平均分子量大于750，000的，最好是大于1，200，000的HA組份。Balazs特別指出平均分子量低于750，000的HA組份由于它的發(fā)炎作用而沒有治療用途。Balazs棄去了那些低分子量的HA組份。結(jié)果使得從源組織取得的有效HA總量的約90%被拋棄了，結(jié)果只用上了有效HA的一小部分(約10%)。
與Balazs所指出的相反，本申請人發(fā)現(xiàn)低分子量的HA組份確有有用的藥物作用。這樣，按照本發(fā)明，從各種來源取得的HA約可利用80%，特別是，本申請人發(fā)現(xiàn)了HA的一種組份可用于刺激創(chuàng)口愈合，而另一種HA組份則可用于眼內(nèi)注射以代替眼球內(nèi)液以及治療受傷關(guān)節(jié)時(shí)用作關(guān)節(jié)內(nèi)注射。
圖1示本發(fā)明人鑒別出的透明質(zhì)酸的各種組份。
如上所述，以前關(guān)于HA的研究，例如Balazs的專利，是指向于利用平均分子量大于750，000的高分子組成。本申請人分離并特別鑒定了HA的二種新組份，一種具有低分子量而另一種具有中等度平均分子量，它們被認(rèn)為基本純凈，因?yàn)樗鼈兗兌雀叨覜]有發(fā)炎作用。這些HA的新組分可以從各種含有能萃取出透明質(zhì)酸的結(jié)締組織制得。本發(fā)明特定的組份，可按分子篩濾技術(shù)辨明分離出來。
本申請人分離出的第一種組份稱為海拉斯訂(HYALASTINE)，具有平均分子量約50，000到約100，000。這種HYALASTINE組份被肯定能適合于獸用及人用治療，因?yàn)樗袆?chuàng)口愈合作用。本申請人分離得到的第二種組份稱為海勒克汀(HYALECTIN)，具有平均分子量約500，000到約730，000。這種HYALECTIN組份適用于眼科手術(shù)作為眼球內(nèi)液的代用品，以及作獸用及人用治療關(guān)節(jié)的外傷性和變性疾病。HYALASTINE可皮內(nèi)注射給藥，或局部涂敷以愈合創(chuàng)口。另一方面HYALECTIN則適合作眼球及關(guān)節(jié)內(nèi)注射。
本申請人曾對各種HA組份做過詳細(xì)研究，采用比以往遠(yuǎn)為精確的方法，特別確定了治療上有用的HA組份及炎性和無用的HA組份。作為這些研究結(jié)果，本申請人確定并研究了HA組份的兩個(gè)特性，即細(xì)胞動(dòng)遷作用(cellmobilization)和內(nèi)生粘滯性(intrinsicviscosity)。動(dòng)物的創(chuàng)口愈合過程受細(xì)胞動(dòng)遷作用所促進(jìn)，特別是成纖維細(xì)胞的動(dòng)遷作用。另一方面，細(xì)胞動(dòng)遷作用或增生作用(即有絲分裂)在眼球內(nèi)手術(shù)時(shí)卻應(yīng)被避免。這在作視網(wǎng)膜剝離的嬌正手術(shù)中特別確實(shí)，因?yàn)?，在視網(wǎng)膜剝離中愈合速度增加會引起有害影響。
內(nèi)生粘滯性在決定利用HA組份時(shí)也是應(yīng)考慮的重要因素。具有高度內(nèi)生粘滯性的組份用于外科，治療外傷性和變性關(guān)節(jié)疾病，以及用于替代眼球內(nèi)液。另一方面，當(dāng)組份被用作促進(jìn)創(chuàng)口愈合的藥物時(shí)，則高粘滯性是不受歡迎的特性。事實(shí)上，用作創(chuàng)口愈合的組份應(yīng)具有低粘滯性，以便在實(shí)際應(yīng)用中使用更方便。
本申請人鑒別的HYALASTINE組份已被確定具有良好的動(dòng)遷性或細(xì)胞增生作用和低粘滯性諸特點(diǎn)。因而HYALASTINE具有適于作創(chuàng)口愈合材料的必需的特點(diǎn)。這些特點(diǎn)使因而HYALSTINE不宜用于眼球內(nèi)或關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療。
本申請人鑒別出的HYALECTIN組份被確定具有微小的細(xì)胞動(dòng)遷性和增生作用，而與此同時(shí)卻具有高粘滯性。這些特性因而使得HYALECTIN組份可用作眼球內(nèi)注射及關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療。但是，相反地HYALECTIN對創(chuàng)口愈合的治療卻無用，因?yàn)檫@組份沒有細(xì)胞動(dòng)遷作用。
在分離有用的透明質(zhì)酸組份時(shí)取得沒有發(fā)炎作用的那些組份也同樣重要。上述Balazs的專利指出為了要得到無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份，只能利用平均分子量大于750，000的組份。因此，Balazs把平均分子量小于750，000的組份，由于它們有發(fā)炎作用而拋棄不用。與Balazs所指出的相反，本申請人發(fā)現(xiàn)，被Balazs認(rèn)為低于平均分子量750，000的組份的發(fā)炎作用，實(shí)際上是由于平均分子量低于30，000的雜質(zhì)所致。因此，本發(fā)明提供了一種方法，用它能排除掉分子量低于30，000的發(fā)炎組份，該方法包括一系列分子篩技術(shù)及化學(xué)方法。
用本發(fā)明的方法，可獲得無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸的各種有用組份，合并起來考慮，它們占了從特定的源物質(zhì)取得的全部透明質(zhì)酸的總量的80%。這占有效透明質(zhì)酸80%的產(chǎn)量，是混合組份，是HYALECTLN和HYALASTINE的組合物，其平均分子量從約250，000到約350，000。分得更細(xì)來說，所得到的HYALECTIN組份約占從源組織中取得的HA的30%，所得到的HYALASTINE約占從源組織中取得的HA的80%，這個(gè)因素是對上述Balazs專利的方法的重大改進(jìn)，因?yàn)楸景l(fā)明人發(fā)現(xiàn)顯著增加的有效透明質(zhì)酸數(shù)量對制藥是有益的。由于只利用平均分子量大于750，000的組份，Balazs的方法只能得到原來取自動(dòng)物器官的透明質(zhì)酸量的10%，而拋棄了約90%的所得到的透明質(zhì)酸。而按照本發(fā)明，透明質(zhì)酸總萃取量的利用率大為增加。
下列的表1示各種透明質(zhì)酸組份萃取相應(yīng)產(chǎn)量的比較表1透明質(zhì)酸的 每100克新鮮 % 參考文獻(xiàn)類型 組織的克數(shù)雄雞雞冠的 0.8 100 Swarr D.A.1968透明質(zhì)酸總量 Biophys
Biochim，Acta156.17-29HA(Balazs) 0.08 10 美國專利4，141，973號HYALECTIN+ 0.6 80 本發(fā)明HYALASTINEHYALECTIN 0.2 30 本發(fā)明HYALASTINE 0.4 50 本發(fā)明發(fā)炎組份 0.16 20 本發(fā)明圖1以圖形表示本申請人分離出的各種HA組份。圖1的鐘形曲線(實(shí)線)表示取自原始組織的HA組份的近似分布。圖1的“B”區(qū)表示由Balazs鑒別出的屬美國專利4，141，973號可用作藥物的部分。圖1中“A”區(qū)、Ⅰ和Ⅱ是由本申請人鑒別出的組份，A區(qū)是具有平均分子量低于30，000的發(fā)炎組份，Ⅰ區(qū)是HYALASTINE組份，Ⅱ區(qū)是HYALECTIN組份，從這圖能看出Balazs方法拋棄了大部分能有效萃取的透明質(zhì)酸，因?yàn)樗懦饬似骄肿恿康陀?50，000的HA組份。本發(fā)明則相反，可讓大部分可得到的HA作藥物之用，既然平均分子量小于30，000的低分子量透明質(zhì)酸曾被先前的研究者在各種HA萃取中發(fā)覺有發(fā)炎作用。本申請人發(fā)現(xiàn)，如果根據(jù)各別的治療應(yīng)用，按本發(fā)明所指示的那樣來分離，事實(shí)上大部分的有效HA能被用于治療目的。Balazs的專利特別指出只能用有效HA的10%，而本發(fā)明則可讓約80%有效HA組份能使用，既可以HYALASTINE組份的形式應(yīng)用于創(chuàng)口愈合，也可以HYALECTIN的形式應(yīng)用于眼球內(nèi)及關(guān)節(jié)內(nèi)，還可以HYALASTINE和HYALECTIN結(jié)合的形式應(yīng)用于創(chuàng)口愈合。
本申請人也研究了所鑒別出組份的化學(xué)和物理的特性，這些特性現(xiàn)被總結(jié)在表2之中。
制備的方法例1 制取無發(fā)炎作用的混合HYALASTINE和HYALECTIN組份的方法取新鮮的或冷凍的母雞雞冠(3000克)放在絞碎機(jī)中絞碎，然后放在機(jī)械勻化器機(jī)中仔細(xì)混勻。把所得到的漿放在AISI316不銹鋼容器中或玻璃容器中，加10份容積無水丙酮。全部內(nèi)容以50g/分鐘的速度搖動(dòng)6小時(shí)，放置、分離12小時(shí)，然后吸出丙酮棄去。
重復(fù)本萃取過程直到棄去的丙酮已達(dá)正確的濕度水平卡爾-費(fèi)歇爾法(Karl-Fischer)。
然后把所得物質(zhì)用離心法沉淀，以合適的溫度真空干燥5-8小時(shí)，用本法，從母雞雞冠約可制得500-600克干粉。
然后以300克干粉用0.2克木瓜酶經(jīng)過適量鹽酸半胱氨酸作為磷酸鹽緩沖的緩沖液作酶解。然后把這混合物在60-65℃恒溫下以60g/分鐘的速度搖動(dòng)24小時(shí)。整體冷卻至25℃，加60克賽里脫Celite(R)，在持續(xù)搖動(dòng)一小時(shí)。
將得到的混合物過濾，直到得到澄清液為止。然后，用分子排除限度為30，000的膜，對這種澄清液進(jìn)行分子超微過濾，使分子量大于30，000的分子保留在濾膜上，原來體積的六分之五被超微過濾掉，同時(shí)，不斷地往制品中加進(jìn)蒸餾水。暫停加進(jìn)蒸餾水，再將制品作超微過濾，直到制品減少成原來體積的三分之一。
加氯化鈉于殘液中使成為0.1M，把溫度升到50℃，在制品以60g/分鐘搖動(dòng)時(shí)加進(jìn)氯化十六烷吡啶45克。這混合物經(jīng)60分鐘的搖動(dòng)后，再加進(jìn)50克賽里脫(R)(Celite(R))。在搖動(dòng)時(shí)，本品的溫度降至25℃，形成的沉淀物以離心法收集。把這樣所得的沉淀物懸浮于含0.05%氯化十六烷吡啶的0.01M氯化鈉溶液(5公斤)中。在50℃下再搖動(dòng)60分鐘。降溫至25℃，把沉淀物離心。
然后重復(fù)水洗三次，最后沉淀物聚集進(jìn)含0.05%氯化十六烷吡啶的0.05M氯化鈉溶液3公斤的容器里。再以60g/分鐘的速度搖動(dòng)60分鐘，保持恒溫25℃2小時(shí)，用離心法棄去油狀浮液。
用含0.05%氯化十六烷吡啶的0.1M氯化鈉溶液重復(fù)本步驟數(shù)次，混合物經(jīng)離心沉淀，棄去上浮液。讓沉淀物在含0.05%氯化十六烷吡啶的0.30M氯化鈉溶液(3公斤)中散開。搖動(dòng)這混合物，把沉淀物和澄清液二者都收集起來。沉淀物重復(fù)再加三次萃取，每次用0.5公斤同樣的水溶液。
最后，清除沉淀物殘?jiān)?、澄清液都集中于一個(gè)容器中。搖動(dòng)時(shí)液溫升至50℃。這液體再加進(jìn)氯化鈉使成為0.23M。加進(jìn)1克氯化十六烷吡啶，持續(xù)搖動(dòng)12小時(shí)。冷卻這混合物至25℃，然后過濾，首先經(jīng)賽力脫(Celite)(R)包過濾，然后經(jīng)一過濾器(1微米)過濾。
把所得的混合物再進(jìn)一步經(jīng)分子排除限度為30.000的膜，作分子性超微過濾，加進(jìn)0.33M氯化鈉溶液使超微過濾3份原容積的量。停止加進(jìn)氯化鈉溶液，液體容積減少至原有容積的四分之一。
這樣濃縮的溶液，在25℃溫度下，用三份容積的乙醇(95%)經(jīng)搖動(dòng)(60g/分鐘)使沉淀。以離心法收集沉淀物，棄去上浮液。把沉淀物溶于1公斤0.1M的氯化鈉溶液中，用三倍容積的95%乙醇重復(fù)這沉淀步驟。
收集及洗滌沉淀物，先用75%乙醇(三次)，再用純乙醇(三次)，第三步用純丙酮(三次)。
這樣得到的產(chǎn)品HYALASTINE+HYALECTIN組份具有的平均分子量為250，000到350，000之間。
透明質(zhì)酸的產(chǎn)量等于原來的新鮮組織的0.6%。
例2-一從根據(jù)例1的方法制得的混合物中制取HYALASTINE組份的方法把依例1說明的方法制得的混合物，溶解于無致熱原的蒸餾水中，比例為10毫克產(chǎn)品比1毫升水。這樣得到的溶液，經(jīng)分子排除限度為200，000的膜，用濃縮技術(shù)進(jìn)行分子超微過濾，不在膜上加水。在經(jīng)過排除限度為200，000的分子將不能通過，而較小的分子則可隨水透過濾膜。在過濾過程中，濾膜上方的部分不加水;所以，這部分容積將減小，同時(shí)分子量超過200，000的分子的濃度將增加。再作超微過濾，直到濾膜上部的容積減小至初始容積的10%，加入二份無致熱原的雙蒸餾水后再把溶液超微過濾，直到其容積減為三分之一。這項(xiàng)操作再需重復(fù)兩次。
通過濾膜的溶液，用氯化鈉使成為1.0M，再用95%乙醇四份沉淀。沉淀物用75%乙醇洗三次，然后真空干燥。
這樣取得的產(chǎn)品(HYALASTINE組份)具有的平均分子量為50，000至100，000之間。
透明質(zhì)酸的產(chǎn)量等于原來新鮮組織的0.4%。
例3制取HYALECTIN組份的方法將從例2說明的分子排除限度為200，000的超微過濾膜上收集進(jìn)容器的濃縮溶液，加水沖淡，直至得到含5毫克/毫升濃度的透明質(zhì)酸溶液，以基于葡萄糖醛酸測定的定量分析法測定。
用氯化鈉成0.1M，使這溶液，然后加4份95%乙醇使之沉淀。把沉淀物用75%乙醇洗滌三次，然后真空干燥。
這樣制得的產(chǎn)品(HYALECTIN組份)具有的平均分子量為500，000至730，000之間。這相當(dāng)于一個(gè)特殊的透明質(zhì)酸組份，它是高純度的，分子鍵長度界限約為2，500-3，500個(gè)醣單元的組份。
透明質(zhì)酸產(chǎn)量等于原來新鮮組織的0.2%。
生物學(xué)和藥物學(xué)作用的評價(jià)1.透明質(zhì)酸組份的細(xì)胞動(dòng)遷性生物學(xué)作用本方法，包括測定在培養(yǎng)基中的成纖維細(xì)胞的脫離作用，用作評價(jià)HA組份的細(xì)胞動(dòng)遷作用的方法。
把鼠BALB373系細(xì)胞培養(yǎng)在杜爾貝可(Dulbecco)氏改良伊爾氏(Eagle)培養(yǎng)基中，添加10%小牛血清、青霉素(250單位/毫升)和鏈霉素(0.25毫克/毫升)，在37℃濕潤的5%CO2，95%空氣中孵育。為了實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?xì)胞按常規(guī)地被接種于直徑為60毫米的塑料組織培養(yǎng)碟中(6×10個(gè)細(xì)胞/碟)。
輕輕傾出融合的373系細(xì)胞單層，再加進(jìn)含2.0毫克/毫升各種HA組份的新鮮培養(yǎng)液。用顯微鏡定時(shí)觀察細(xì)胞的脫離現(xiàn)象，并以枯爾脫(Co ulter)計(jì)數(shù)器統(tǒng)計(jì)動(dòng)遷的細(xì)胞。
脫離現(xiàn)象測定為了測量脫離現(xiàn)象的動(dòng)力學(xué)(Kinetics)，把細(xì)胞接種進(jìn)塑料碟培養(yǎng)24小時(shí)。過了這時(shí)間后，輕輕傾出培養(yǎng)液，加入含有2.0毫克/毫升HA的新鮮培養(yǎng)液。每24小時(shí)輕輕移注二只碟，一碟是測試培養(yǎng)碟，另一碟是對照培養(yǎng)碟;兩者的上浮液中的細(xì)胞及互聯(lián)的細(xì)胞均以枯爾脫(Coulter)計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。
表3報(bào)告了用上述例1-3中制備的組份中進(jìn)行試驗(yàn)所取得的結(jié)果。
表3表3中報(bào)告的數(shù)據(jù)表明，HYALASTINE組份顯示了高度的細(xì)胞動(dòng)遷作用，從而使這組份用于創(chuàng)口愈合的應(yīng)用。當(dāng)把HYALASTINE制成的藥品施用于受傷組織區(qū)域時(shí)，它的細(xì)胞動(dòng)遷作用會刺激新生細(xì)胞的移動(dòng)和增生。
相反地，HYALECTIN組份卻極少顯示有細(xì)胞動(dòng)遷作用，所以對創(chuàng)口的愈合無用。然而HYALECTIN由于它的平均分子量高和固有的粘滯性，還用于眼球和關(guān)節(jié)內(nèi)注射，而缺少細(xì)胞動(dòng)遷作用卻正是HYALECTIN組份的重要特性，這使得它對眼球內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)注射特別有用。
2.透明質(zhì)酸組份的生物學(xué)的發(fā)炎作用為對這作出評價(jià)，則用在兔眼內(nèi)施藥后對入侵細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。
方法
本測驗(yàn)要使用5只新西蘭或加利福尼亞種兔子，體重約2公斤，并確證視力完好。以肉眼檢查兔子的眼外部炎癥過程，以眼底鏡檢查眼內(nèi)部，如果眼底是清晰可見并正常，則可進(jìn)行試驗(yàn)。
對選用的動(dòng)物，滴入幾滴合適的眼用無菌麻醉劑作局部麻醉;也可滴入幾滴眼科用的阿托品溶液。
試驗(yàn)要在無菌條件下進(jìn)行。用力壓出眼球，以便能作注射，在離角膜緣約5-6毫米穿過鞏膜，用26號針頭，注射100微升溶液于玻璃體腔的中心部。另一只眼作為對照。在處理過的眼中滴進(jìn)二滴抗生素液，再把該動(dòng)物單獨(dú)存放一籠。
過50-60小時(shí)后，試驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行。用選用動(dòng)物時(shí)檢查眼晴的方法檢查眼晴。注射噴多撒爾(Pentothal)殺死該動(dòng)物，然后，首先用胰島素注射針筒及26號針頭收集眼房水(約0.2毫升)，再挖出眼球，除去異物，用生理鹽水沖洗，用吸水紙吸干，切開放在丕脫里(Petri)板上，分離玻璃體的主要部分并用滅菌針筒(約0.7毫升)收集它。把玻璃體放置在小型聚乙烯試管中，再加進(jìn)50微升透明質(zhì)酶(100單位NF/毫升)，再把這混合液置37℃溫度下3小時(shí)以使液體變得稀簿些。
在顯微鏡下，于勃克(Buaker)室中，用位相反差法(120×)作白血球計(jì)數(shù)。每份試樣需作一系列計(jì)數(shù)，計(jì)算出平均值，以每mm3有多少個(gè)白血球數(shù)來表示其結(jié)果。
在下列情況時(shí)，將認(rèn)為試驗(yàn)屬陽性1)受檢眼球無受損跡象，而且2)在5只處理過的眼中，至少要有4只其平均白血球數(shù)不超過200/mm3，而在每只對照組的眼中，其平均白血球數(shù)不超過50/mm3。
表4報(bào)告了這個(gè)評價(jià)得出的結(jié)果，它使用了上述例1-3中制備的HA組份表4發(fā)炎作用研究的結(jié)果組份 入侵細(xì)胞數(shù)對照組 25HYALASTINE+HYALECTIN 32HYALASTINE 20HYALECTIN 22發(fā)炎組份(平均分子量30，000) 150由母雞雞冠所得透明質(zhì)酸總量 120(參考Swann D.A.1968，B.B.A.156，17-29)表4報(bào)告的結(jié)果表明，HYALASTINE+HYALECTIN各組份沒有顯示出比對照組為高的發(fā)炎作用，而HYALASTINE和HYALECTIN相結(jié)合的組份則顯示出比對照組稍微高的發(fā)炎作用。因此，HYALASTINE和HYALECTIN組份都是有用的藥物，未顯示出不希望有的發(fā)炎副作用。這些結(jié)果也更進(jìn)一步肯定了本申請人的發(fā)現(xiàn)，即.小于30，000的平均分子量低的HA組份是HA制品發(fā)炎作用的原因。按照施旺(Swann)寫的文獻(xiàn)中的方法(Swann D.A.1968，B.B.A.156，17-29)從母雞雞冠制備得的透明質(zhì)酸顯示出明顯的發(fā)炎作用的。
這樣已顯示出平均分子量約為50，000至100，000的HYALASTINE組份表現(xiàn)出高度的細(xì)胞動(dòng)遷作用，因而，應(yīng)用于創(chuàng)口愈合就非常有用，它也未表現(xiàn)出不希望有的炎癥反應(yīng)。平均分子量約為500，000至730，000的HYALECTIN組份已顯示出由于它的高分子量和固有的粘滯性而對眼球和關(guān)節(jié)內(nèi)注射很有用，同時(shí)，它未刺激細(xì)胞動(dòng)遷作用，引起藥物應(yīng)用時(shí)都應(yīng)避免的有害的副作用-炎癥反應(yīng)。
準(zhǔn)確地說，HYALASTINE組份已被認(rèn)為作為創(chuàng)口愈合制品是很有用的，因?yàn)樗邢吕攸c(diǎn)1.本制品能使愈合時(shí)間明顯地縮短，與慣常的療法相比，患區(qū)迅速清潔，潰瘍邊緣整齊，肉芽組織發(fā)育旺盛，大吞噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞動(dòng)遷活躍，早期得到上皮化。
2.本制品使較嚴(yán)重病例增加其對再造外科(Reconstructive Surgery)適應(yīng)。
3.無蟹狀疙瘩或牽引疤痕形成，結(jié)疤組織的最終再造形能得到良好的美容和功能效果。
HYALASTINE制品被發(fā)現(xiàn)可用于治療各種創(chuàng)傷，包括褥瘡，營養(yǎng)性潰瘍，燒傷，頑固性創(chuàng)傷，外傷性潰瘍，靜脈曲張和靜脈血染色的靜脈炎后潰瘍，放射性壞死，皮損，植皮和單純皰疹引起的皮損。對這些創(chuàng)口愈合作治療時(shí)，HYALASTINE制品或它的鈉鹽，能以各種方法給藥。例如，用紗布墊塞，乳膏，噴撒或皮內(nèi)注射，如以乳膏或置于紗布墊塞上作局部應(yīng)用，則最好把HYALASTINE與一種乳化劑結(jié)合起來，乳化劑從暴露區(qū)吸收分泌物而使透明質(zhì)酸發(fā)揮極好的擴(kuò)散作用。也可與一種斥水?dāng)U散劑結(jié)合起來，以易于更換創(chuàng)口敷料。
HYALECTIN組份被發(fā)現(xiàn)特別適用于馬的治療，特別是賽馬，它們患有關(guān)節(jié)疾病和由急性或慢性外傷引起的、傳染性的、或關(guān)節(jié)內(nèi)反復(fù)注射皮質(zhì)激素引起的疾病。用HYALECTIN能治療的特出的病例包括有或無炎癥征象的骨關(guān)節(jié)病，急性或慢性滑囊炎，關(guān)節(jié)軟骨的變性病變，及干性關(guān)節(jié)病。這些病患的最常見的癥狀通常是疼痛，關(guān)節(jié)功能受損和關(guān)節(jié)彎曲不便。本發(fā)明的HYALECTIN組份被發(fā)現(xiàn)對這種病馬，與傳統(tǒng)治療相比，能促使愈合時(shí)間明顯縮短，促使早期和持續(xù)關(guān)節(jié)功能改善，減輕疼痛及跛瘸，這些臨床上優(yōu)越的效果據(jù)信是由滑囊液的粘滯伸縮性正常化及關(guān)節(jié)軟骨的組織修補(bǔ)過程激活作用所引起的。
此外，HYALECTIN組份可促進(jìn)上述一切優(yōu)越效果而無局部及/或全身毒性作用。反復(fù)使用HYALECTIN也未產(chǎn)生有過敏反應(yīng)的證據(jù)，也沒有任何有害的或延續(xù)性的影響。
藥物制品上述說明表明HYALASTINE和HYALECTIN組份有良好的藥物應(yīng)用作用。下述的實(shí)例被介紹作為實(shí)例之目的，只是說明HA組份實(shí)際用作體內(nèi)用藥時(shí)可能使用的各種藥物制品。
A.創(chuàng)口愈合用的制品例1，皮內(nèi)注射用安瓿-每安瓿含-HYALASTINE鈉鹽 4毫克-氯化鈉 16毫克
-注射用水 適量加至 2毫升例2，皮內(nèi)注射用安瓿-每安瓿含-HYALASTINE鉀鹽 5毫克-氯化鈉 8毫克-注射用水 適量加至 1毫升例3，局部應(yīng)用噴涂小瓶-每瓶含-HYALASTINE鈉鹽 20毫克-氯化鈉 80毫克-注射用水 適量加至 10毫升例4，局部應(yīng)用噴涂小瓶-每瓶含-HYALASTINE鉀鹽 30毫克-甘露醇 100毫克-注射用水 適量加至 10毫升例5，局部應(yīng)用乳膏-每管乳膏含-HYALASTINE鉀鹽 25毫克-單脂酸聚乙烯甘油400 1000毫克-賽替渥爾(Cetiol)(油酸癸醛酯) 500毫克-蘭乃脫(Lanette)SX(十六烷脂酒精+月桂基硫酸9∶1) 150毫克-甘油 200毫克
-山梨醇 150毫克-去氫醋酸鈉 10毫克-對位一氧苯甲酸鹽 7.5毫克-對位一氧苯丙酸鹽 5毫克-雙蒸餾水 適量加至 10克例6，局部應(yīng)用乳膏-每管乳膏含-HYALASTINE鈉鹽 30毫克-石臘油膏 3毫克-單脂酸聚乙烯甘油400 1000毫克-賽替渥爾(Cetiol)(油酸癸典酯) 500毫克-蘭乃脫(Lanette)SX(十六烷脂酒精+月桂基硫酸9∶1) 150毫克-甘油 200毫克-山梨醇 150毫克-去氫醋酸鈉 10毫克-對位氧苯甲酸鹽 7.5毫克-對位氧苯丙酸鹽 5毫克-雙蒸餾水 適量加至 10克例7，局部應(yīng)用加藥紗布塞填-每塊塞填10×10公分，含-HYALASTINE鈉鹽 3毫克-甘油 1克
-聚乙烯甘油 2克-雙蒸餾水 適量加至 3克例8，局部應(yīng)用加藥紗布塞填-每塊塞填15×15公分，含-HYALASTINE鉀鹽 6毫克-石臘油膏 0.5毫克-甘油 1克-聚乙烯甘油 2克-雙蒸餾水 適量加至 3毫升例9，創(chuàng)口愈合用干粉-每克干粉含-HYALASTINE鈉鹽 10毫克-甘露醇 0.75克-甘氨酸 0.24克B.眼球內(nèi)用制品例10，1毫升裝小瓶-每小瓶含-HYALECTIN鈉鹽 10毫克-氯化鈉 8毫克-單基磷酸鈉·2H2O 0.25毫克-雙基磷酸鈉·12H2O 3毫克-注射用水 適量加至 1毫升例11，5毫升裝小瓶-每小瓶含-HYALECTIN鉀鹽 60毫克
-甘露醇 50毫克-單基磷酸鈉·2H2O 1.25毫克-雙基磷酸鈉·12H2O 15毫克-注射用水 適量加至 5毫升例12，預(yù)裝注射筒-每注射筒含-HYALECTIN鈉鹽 40毫克-氯化鈉 16毫克-單基磷酸鈉·2H2O 0.8毫克-雙基磷酸鈉·12H2O 8.16毫克-注射用水 適量加至 2毫升C.關(guān)節(jié)內(nèi)用制品例13，2毫升裝小瓶-每小瓶含-HYALECTIN鈉鹽 40毫克-氯化鈉 16毫克-注射用水 適量加至 2毫升例14，4毫升裝小瓶-每小瓶含-HYALECTIN鉀鹽 60毫克-甘露醇 35毫克-甘.氨酸 10毫克-注射用水 適量加至 4毫升例15，預(yù)裝注射筒-每個(gè)注射筒含-HYALECTIN鈉鹽 25毫克-氯化鈉 12毫克-甘露醇 10毫克
-單基磷酸鈉·2H2O 0.5毫克-雙基磷酸鈉·12H2O 6毫克-注射用水 適量加至 2毫升雖然上述制品是作為實(shí)例來說明，值得注意的是，由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的HYALASTINE和HYALECTIN組份或其鈉鹽或鉀鹽能和其他可藥用的載體、稀釋劑、賦形劑結(jié)合使用，制備其他藥物配方。可視配方之不同用途而改變劑量。
用于創(chuàng)口愈合，HYALASTINE組份的制品，可按上述配劑形式之一用于受損的皮膚區(qū)域，即，可用乳膏或噴涂劑或紗布塞填、或干粉劑或作皮內(nèi)注射。
用于關(guān)節(jié)內(nèi)，HYALECTIN制品通常以每個(gè)關(guān)節(jié)用2毫升的劑量用藥，可用上述現(xiàn)成的小瓶或預(yù)裝的注射筒。
在一個(gè)附加研究中，曾調(diào)查過作為各種分子載體的透明質(zhì)酸的能力和效率，特別是，用作眼科藥的載體，要保證完美的耐受性和對角膜上皮的適用性(即，沒有致敏現(xiàn)象)。透明質(zhì)酸被認(rèn)為作眼藥載體是特別意義的。如前所述，HA是存在于各種結(jié)締組織和生物性液體(例如滑囊液、特別是玻璃體)中的葡萄氨基烯糖(glycosaminoglycan)，因?yàn)樗幕瘜W(xué)和物理性質(zhì)和它的驚人的粘滯伸縮特性，它在生物性液體中能起結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上極其重要的作用。
因此，進(jìn)行了研究以調(diào)查各種分子量的HA的用途，特別是HYALASTINE和HYALECTIN組份和它們的混合物，以制備成不同的藥物形式，例如，眼藥水、凝膠、乳膏、嵌入劑或干粉劑。所以，研究各種形式的眼藥是為了對這個(gè)生物性高聚合物的各種組份在作為載體時(shí)的潛在用途取得廣泛的了解。
以下報(bào)道的實(shí)驗(yàn)，目的在于，確定透明質(zhì)酸作為賦形劑的各種配方是否能提高附于載體的藥物的生物使用價(jià)值，抑或能與附于載體的藥物，特別是有眼科效用的藥物，結(jié)合而產(chǎn)生協(xié)同作用。
在兔眼上曾用過四種不同類型和作用的眼藥，來研究作為載體的HA的這些潛在能力。所用的藥為硝酸毛果蕓香堿，氟羧強(qiáng)的松龍，表皮生長因子(EGF)及一種抗生素，例如，鏈霉素和慶大霉素。這些藥物都已知有縮瞳、消炎、愈合和抗菌效能。再者，對附載于透明質(zhì)酸上的抗生素-鏈霉素的作用估價(jià)是非常重要的。因?yàn)樗茄矍蚋腥緯r(shí)使用最廣的抗生素之一。
研究過的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃妥鲞^的實(shí)驗(yàn)如下1)兔眼中附載于透明質(zhì)酸的硝酸毛果蕓香堿的縮瞳作用;
2)右旋醣酐致炎的兔眼模型中附載于透明質(zhì)酸的氟羥強(qiáng)的松龍的消炎作用;
3)在兔眼角膜的上皮損害模型上附載于透明質(zhì)酸的表皮生長因子(EGF)的愈合作用;
4)瓊脂板附載于透明質(zhì)酸的鏈霉素對枯草桿菌(Bacillus Subtilis 6633)的抗菌作用。
Ⅰ.附載于透明質(zhì)酸中的硝酸毛果蕓香堿的縮瞳作用。
材料在各種硝酸毛果蕓香堿配方中，用下列材料作為毛果蕓香堿的賦形劑-透明質(zhì)酸鈉鹽，HYALASTINE組份，(分子量約100，000)，
濃度為10毫克/毫升及20毫克/毫升;
-透明質(zhì)酸鈉鹽，HYALECTIN組份，(分子量500，000-730，000)，濃度為10毫克/毫升及20毫克/毫升;
-5%聚乙烯酒精，作為比較性眼用賦形劑。
制備硝酸毛果蕓香堿的各種2%配方(滴眼劑或凝膠)，加進(jìn)兩種不同的HA鈉鹽組分作載體，濃度為10毫克/毫升及20毫克/毫升。
制備下列溶液配方1-生理鹽水和硝酸毛果蕓香堿(Pi NO3)(2%)，用作參照。
配方2-Pi NO3溶液(2%)，載附于5%聚乙烯酒精(用作參照。
配方3-Pi NO3溶液(2%)，載附于HYALASTINE組分鈉鹽(10毫克/毫升)。
配方4-Pi NO3溶液(2%)，載附于HYALASTINE組分鈉鹽(20毫克/毫升)。
配方5-Pi NO3溶液(2%)，載附于HYALECTIN組分鈉鹽(10毫克/毫升)。
配方6-Pi NO3溶液(2%)，載附于HYALECTIN組分鈉鹽20毫克/毫升)。
方法用新西蘭白兔(2-2.5公斤)，以微型注射器(101)(注原文如此)把要試驗(yàn)的配方液滴入一只眼睛;另一只眼作為參照用。間隔適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，測量各只兔眼瞳孔直徑，每種溶液至少在8只兔子上試驗(yàn)。每只眼處理不超過三次，每次處理之間至少要有一個(gè)星期的間歇期。
測得的參數(shù)為了及時(shí)測定縮瞳作用曲線，間隔不同的時(shí)間測量了瞳孔的直徑。下列作用參數(shù)是從縮瞳/時(shí)間圖連續(xù)計(jì)算出來的Imax＝處理眼和參照眼的瞳孔直徑的最大差距數(shù)。
高峰時(shí)間＝達(dá)到Imax所要的時(shí)間。
持續(xù)期＝保持基礎(chǔ)情況的時(shí)間。
高原期＝完全縮瞳的時(shí)期。
AUC＝縮瞳/時(shí)間曲線之下的區(qū)域。
結(jié)果表5報(bào)道了試驗(yàn)的結(jié)果。從所有試驗(yàn)溶液得出一條縮瞳作用時(shí)間曲線，由此確定出各種參數(shù)的數(shù)據(jù)，從這些數(shù)據(jù)能夠看出，把透明質(zhì)酸加進(jìn)2%硝酸毛果蕓香堿溶液中去，可引起藥物的縮瞳作用增加。實(shí)際上，這藥物的生物有效性可達(dá)含2%硝酸毛果蕓香堿(配方1)水溶液的生物有效性的2.7倍。
也應(yīng)當(dāng)指出，與硝酸毛果蕓香堿溶液附載于聚乙烯酒精(配方2)相反，如果以10及20毫克/毫升兩種濃度的透明質(zhì)酸的HYALECIN組份作為載體(配方5-6)則其作用從統(tǒng)計(jì)上看也大為增加。
把透明質(zhì)酸當(dāng)載體用特別有意義，因?yàn)?，?dāng)硝酸毛果蕓香堿用它為載體時(shí)，其縮瞳作用會維持更久，就是說，含透明質(zhì)酸的配方(配方6)把瞳孔直徑恢復(fù)到基礎(chǔ)情況的所需時(shí)間，與毛果蕓香堿單體與生理鹽水一起的配方(配方1)的所需時(shí)間相比較，則前者高達(dá)190分鐘，后者則為110分鐘。
Ⅱ.載附于透明質(zhì)酸的氟羥強(qiáng)的松龍的消炎作用材料用下列各項(xiàng)-透明質(zhì)酸鈉鹽溶液-HYALECTIN組份，分子量在500，000和730，000之間，10毫克/毫升于生理鹽水中;
-氟羥強(qiáng)的松龍溶液(10%于生理鹽水中)。
方法用雄性的新西蘭兔子(平均體重1.6公斤)做本實(shí)驗(yàn)。在五天適應(yīng)期后，給兔子眼球內(nèi)注射右旋醣酐(10%0.1毫升)引起眼球內(nèi)炎癥。用4%諾維西拿(Novesina)作局部麻醉下，對兩眼施藥，把注射針頭插入眼前房4毫米，距角膜緣2毫米。本試驗(yàn)要做10只動(dòng)物。
治療每只動(dòng)物的左右雙眼均施治療，滴藥3滴，一日三次，總共6天，用下列藥品-氟羥強(qiáng)的松龍溶液(10%于生理鹽水)滴入左眼(LE);
-透明質(zhì)酸鈉鹽溶液，HYALECTIN組份，(10毫克/毫升+氟羥強(qiáng)的松龍(10%)滴入右眼(RE)。
參數(shù)用裂隙燈分期觀察兔眼，以評價(jià)對由右旋醣酐引致炎性反應(yīng)的消炎作用，間隔期為0，1小時(shí)，3小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)，3天，4天，5天和6天。
在間隔期內(nèi)作眼檢查，可評價(jià)下列觀察-角膜和結(jié)膜的情況，因有可能出現(xiàn)充血、水腫，特別要對虹膜觀察，因它對眼球內(nèi)注射發(fā)炎劑后出現(xiàn)的炎性過程通常很敏感;
-丁達(dá)爾(Tyndall)效應(yīng)，其中若出現(xiàn)或多或少強(qiáng)烈的陰影(“云翳”)就說明在前房中已存在微粒(炎癥)成份。
觀察的結(jié)果，以“主觀記分”(從0到3)來表示所見作用的程度等級。
結(jié)果從表6中所報(bào)告的結(jié)果可以見到，施用氟羥強(qiáng)的松龍對虹膜有消炎作用，使前房中的不透明部消失[丁達(dá)爾(Tyndall)效應(yīng)]。炎癥過程自第1至第3小時(shí)最明顯，直到第3天至第4天逐步減輕，直到恢復(fù)幾乎正常狀態(tài)，至第6天眼睛才完全澄清透明。相反地，把透明質(zhì)酸鈉鹽、HYALECTIN組分、與氟羥強(qiáng)的松龍一起施用，可使上述單獨(dú)施用氟羥強(qiáng)的松龍相應(yīng)時(shí)日里觀察到的眼球內(nèi)炎癥減輕。就是說，虹膜的炎性過程和前房的不透明部在第24小時(shí)即見減退，48小時(shí)內(nèi)逐步減輕，而自第4天起炎癥反應(yīng)可完全消失。
在眼球內(nèi)注射右旋醣酐后，結(jié)膜及角膜基本上沒有明顯的反應(yīng)可觀察到。
因此，氟羥強(qiáng)的松龍與透明質(zhì)酸組分同時(shí)使用，結(jié)果是可提高藥物的作用，兔眼能更迅速痊愈即為證明。
Ⅲ.附載于透明質(zhì)酸的EGF的愈合作用材料用下列各項(xiàng)配方A-EGF(表皮生長因子)，溶于生理鹽水(0.5毫克/5毫升)配方B-透明質(zhì)酸鈉鹽，HYALASTINE組分，(分子量約100，000)溶于生理鹽水(10毫克/毫升)方法在新西蘭白兔上(平均體重1.8公斤)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)約5天適應(yīng)期之后，在用諾維西拿(Novesina)(4%)作局部麻醉的合適條件下造成角膜上皮損傷。用帶銳緣的凹形玻離柱(φ3mm)在單只眼的視覺帶，刺劃一周，造成損傷。
治療動(dòng)物分成小組，每組5只，從結(jié)膜滴注作如下藥物治療組別 治療組1(對照組) 生理鹽水組2 EGF溶液(配方A)組3 透明質(zhì)酸鈉鹽溶液，HYALASTINE組分+EGF溶液-配方A+配方B以1∶1比例結(jié)合成為配方C。
在右眼(RE)作治療，用結(jié)膜滴注法每8小時(shí)2滴，總共施藥三次。
參數(shù)評價(jià)角膜上皮痊愈的方法是，在刺劃后的不同間歇期間對眼觀察，并以裂隙燈拍照記錄0，8小時(shí)，16小時(shí)，24小時(shí)，32小時(shí)，40小時(shí)，和48小時(shí)。
結(jié)果表7報(bào)告了眼科檢查1，證明對照組(組1)在損傷后48小時(shí)已完全達(dá)到治愈(5/5動(dòng)物)，在用EGF治療的動(dòng)物組(組2)刺劃后，早在24小時(shí)即出現(xiàn)有顯著效驗(yàn)的愈合過程(4/5動(dòng)物)。在用包括透明質(zhì)酸鈉鹽，HYALASTINE組份+EGF的配方C的一組(組3)，刺劃后早在16小時(shí)全部動(dòng)物的愈合過程就完成了(5/5)。
這些結(jié)果表明，利用HYALASTINE透明質(zhì)酸組份作為EGF的載體，能因促使更迅速有效地愈合角膜損傷而加速痊愈過程。
表7角膜上皮損傷的愈合組別 治療 刺劃后小時(shí)數(shù)0 8 16 24 481 生理鹽水 + + + + -+ + + + -+ + + + -+ + + + -+ + + + -
2 EGF(配方A) + + + - -+ + + - -+ + + - -+ + + + -+ + + - -3 透明質(zhì)酸+EGF + + - - -(配方C) + + - - -+ + - - -+ + - - -+ + - - -+＝未痊愈的眼-＝已痊愈的眼Ⅳ.載附于透明質(zhì)酸的慶大霉素的抗菌作用材料使用了下列材料-溶于生理鹽水的慶大霉素(50毫克/毫升)-透明質(zhì)酸鈉鹽，HYALECTIN組份(2毫克/毫升)方法在11只兔子的雙眼眼球內(nèi)注射經(jīng)過滴定的綠膿桿菌，(Pseudomonas aeruginosa菌)(0.1毫升)懸浮液，引起化膿性炎癥，對那些有化膿性炎癥的兔子，把透明質(zhì)酸，HYALECTIN組份，和慶大霉素一起滴入右眼，而向左眼施用以緩沖生理鹽水為載體的慶大霉素。在注射感染劑后立即開始治療(每6小時(shí)3滴)，且繼續(xù)下去直到感染消失。在裂隙燈下每天觀察兔眼。
結(jié)果用慶大霉素與透明質(zhì)酸結(jié)合的治療結(jié)果，比單用抗生素使化膿性感染消失更快。從表8中的數(shù)據(jù)可以清楚地看到這個(gè)結(jié)論。
表8附載于透明質(zhì)酸HYALECTINE組份的慶大霉素對眼球內(nèi)化膿性炎癥的療效炎癥開始后的日數(shù)治療 1 2 3 4 5 6 7慶大霉素+緩沖生理0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 36.3 100鹽水載體慶大霉素+透明質(zhì)酸0.0 0.0 9.0+ 27.2+ 72.7+ 100 100HYALECTIN組份數(shù)值以百分比表示(炎癥治愈眼睛數(shù)比治療過的眼睛數(shù))。
+＝對緩沖載體的重要差異[小于0.05，弗歇(Fisher)精密T-試驗(yàn)]根據(jù)本發(fā)明，能附載于HA組份的眼藥其它樣品，(不僅于此)如下抗菌素氯霉素、新霉素、金霉素、粘霉素和多粘菌素、桿菌肽、霉菌素激素去甲睪丸和硫酸去甲睪丸素麻醉藥(局部)漢諾克新鹽(henoxinate)及其鹽酸鹽抗病毒藥碘去氧脲啶、碘去氧胱啶消炎藥地塞米松及其磷酸鹽血管加壓藥及血管收縮藥交感酚及新交感酚結(jié)論基于從上述實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，可以結(jié)論，透明質(zhì)酸鈉鹽(HYALASTINE和HYALECTIN兩種組份)溶液能作為眼藥的載體，而且對具有不同的生物學(xué)作用的各類藥物都有效。例如，包括抗青光眼藥如硝酸毛果蕓香堿，抗過敏和消炎藥如地塞米松，用于促進(jìn)眼組織愈合的促組織愈合和促細(xì)胞增生藥，如EGF，抗生素如鏈霉素和慶大霉素，它們各自的縮瞳、消炎、愈合及抗菌作用前已報(bào)道，凡此種種藥物均可有效地利用HA作為載體施用。
附載于各種分子量透明質(zhì)酸組份的眼藥配方，被證實(shí)可完全被用藥者耐受，并適用于角膜上皮而不會引起敏現(xiàn)象。
從數(shù)據(jù)也可觀察到這個(gè)生物學(xué)的產(chǎn)品-透明質(zhì)酸，是如何的一種有效載體，它能在體內(nèi)提高附載藥物的生物有效性，并加強(qiáng)其藥理作用。把透明質(zhì)酸組份作為藥物載體來用，其特別的效果是-增加了硝酸毛果蕓香堿的縮瞳作用，用時(shí)又延長了藥物作用時(shí)間。
-在對右旋醣酐引致的眼球內(nèi)炎癥上，可增加地塞米松的抗炎作用，并與單獨(dú)使用地塞米松相比較，能在更短的時(shí)間內(nèi)使炎癥過程減退;
-在對角膜損害治療上，對上皮生長因子(EGF)的保護(hù)作用能增加明顯的協(xié)同作用，并與單獨(dú)使用EGF后所需的復(fù)元時(shí)間相比較，它能減少愈合所需時(shí)間;
-能增加抗生素如，慶大霉素在體內(nèi)的生物學(xué)作用。
這種生物高聚合物透明質(zhì)酸能作為如此多樣特性和作用的藥物載體，由此結(jié)果，可推論出它作為許許多多其他眼藥載體的潛在可能性。
下面報(bào)告的是不同眼藥配方的各種例子，形式可以是粉劑、滴眼劑、凝膠、乳膏、或插嵌劑，它們都以只使用透明質(zhì)酸的各種組份HYALASTINE和HYALECTIN為賦形劑例1可以當(dāng)做“人造眼淚”的滴眼劑，含有-透明質(zhì)酸鈉鹽，HYALECTIN組份 10毫克-以磷酸鹽緩沖的生理鹽水PH7.6M 10毫升例2可以當(dāng)做“人造眼淚”的滴眼劑，含有-透明質(zhì)酸鈉鹽，HYALECTIN組份 20毫克-以磷酸鹽緩沖的生理鹽水PH7.6M 10毫升(注原文如此)
例3.含EGF的凝膠，每100克含有-透明質(zhì)酸鈉鹽 HYALSTINE組份 55克-透明質(zhì)酸鈉鹽 HYALECTIN組份 30克-EGF 0.5克-雙蒸餾水 23.5克例4加硝酸毛果蕓香堿的100毫克插嵌劑，含有-透明質(zhì)酸鈉鹽HYALASTINE組份 100毫克-硝酸毛果蕓香堿 2毫克例5含鏈霉素的局部應(yīng)用的粉劑，每100克含有-透明質(zhì)酸鈉鹽HYALECTINE組份 70克-透明質(zhì)酸鈉鹽，HYALECTIN組份 28.5克-鏈霉素 1.5克雖然以上制品只是作舉例說明用，要注意的是藥物配方可用透明質(zhì)酸組份，特別是，HYALASTIN或HYALECTINE組份或HYALECTIN/HYALASTINE結(jié)合的組份，或其鉀鹽或鈉鹽，加上其他有效藥物來制備，各種劑量要視配方的特征用途而定。
透明質(zhì)酸，特別是基本上純凈的HYALECTIN和HYALASTINE組分，已顯示出是一種有效的載體或賦形劑，能與各種眼科用藥相結(jié)合。以HA組份作為藥物載體的藥物成份之所以特別有用，是因?yàn)镠A組份對眼有高水平的耐受性，而且與角膜上皮高度相容。使用HA組份，還提供了真正提高眼藥在體內(nèi)的生物作用手段。使用特殊的HYALECTIN和HYALASTINE HA組份之所以更有用并且重要，是因?yàn)檫@些組分施用在眼上時(shí)，不引起令人失望的炎性副作用。
權(quán)利要求
1.制備基本上純凈、無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份的過程，包括使含透明質(zhì)酸有效量的組織脫水；使得到的脫水組織酶解；使得到的混和物作分子過濾，以便得到平均分子量為從約50，000至約100，000，從約250，000至約350，000，或從約500，000至約730，000的各種組份。
2.制備基本上純凈、無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份的方法，包括對用于萃取透明的組織脫水的方法;使得到的物質(zhì)酶解的方法;對得到的混合物作分子過濾的方法，用分子量排除限度為30，000的膜來排除分子量大于30，000的分子;收集留在上述膜上的混合物的方法，以便獲得第一具有平均分子量從約250，000至約350，000的透明質(zhì)酸組份產(chǎn)品。
3.如同權(quán)利要求
2的制備基本上純凈、無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份的方法，對前述第一種透明質(zhì)酸，用分子排除限度約為200，000的膜進(jìn)一步作分子超微過濾，以排除大于分子量200，000的分子，再繼續(xù)作超微過濾，直到作超微過濾的混合物的體積減少到初始體積的10%，收集通過該膜的混合物，由此得到的第2種具有平均分子量約50，000至100，00無發(fā)炎透明質(zhì)酸組份產(chǎn)品。
4.如同權(quán)利要求
3的、制備基本上純凈、無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份的方法，包括收集超微過濾步驟后留剩在膜上的混合物的方法;該膜具有分子排除限度約為200，000，從中得到第三種具有平均分子量約500，000到約730，000的透明質(zhì)酸組份產(chǎn)品。
5.制備一種藥物組合的方法，其特征在于它包含的步驟有制備基本上純凈、無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份，包含使含透明質(zhì)酸有效量的組織脫水，使得到的脫水組織酶解，使得到的混合物作分子過濾，以得到平均分子量為從約250，000至約350，000的組份，所述的組份實(shí)質(zhì)上不含分子量低于30，000的透明質(zhì)酸，然而把該優(yōu)選的透明質(zhì)酸組份或它的鉀鹽或鈉鹽的有效創(chuàng)口愈合劑量同至少一種藥用載體、賦形劑或稀釋劑混合。
6.制備一種藥物組合的方法，其特征在于它包含的步驟有制備基本上純凈、無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份，包括使含透明質(zhì)酸有效量的組織脫水，使得到的脫水組織酶解，使得到的混合物作分子過濾，以得到平均分子量為從約50，000至約100，000的組份，所述的組份實(shí)質(zhì)上不含分子量低于30，000的透明質(zhì)酸，然后把該優(yōu)選的透明質(zhì)酸組份或它的鉀鹽或鈉鹽的有效創(chuàng)口愈合劑量同至少一種藥用載體、賦形劑或稀釋劑混合。
7.制備一種藥物組合的方法，其特征在于它包含的步驟有制備基本上純凈、無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份，包括使透明質(zhì)酸有效量的組織脫水，使得到的脫水組織酶解，再使得到的混合物作分子過濾，以便得到平均分子量為從約500，000至約730，000的組份，所述的組份實(shí)質(zhì)上不含分子量低于30，000的透明質(zhì)酸，然后把該優(yōu)選的透明質(zhì)酸組份或它的鉀鹽或鈉鹽的有效創(chuàng)口愈合劑量同至少一種藥用載體、賦形劑或稀釋劑混合。
8.制備一種眼科用藥的方法，其特征在于制備基本上純凈、無發(fā)炎作用的透明質(zhì)酸組份，制備含有上述基本純凈而無發(fā)炎作用透明質(zhì)酸組份或其鉀鹽或鈉鹽同藥用載體、賦形劑或稀釋的劑混合，以及將上述含基本純凈而無發(fā)炎作用透明質(zhì)酸或其鉀鹽或鈉鹽的藥用載體、賦形劑或稀釋劑同具有眼科治療作用的藥物有效量相混合。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其特征在于其中所述的透明質(zhì)酸組份具有的平均分子量是從約50，000至100，000、從約250，000至約350，000、或從500，000至約730，000。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8的方法，其特征在于其中所述的透明質(zhì)酸組份具有的平均分子量是從約500，000至約730，000。
專利摘要
獲得透明質(zhì)酸的兩種可供藥用的組分。第一種組分的分子量在50,000至100,000之間，其可用于創(chuàng)傷愈合。第二種組分的分子量在500,000至730,000之間，可用于眼球內(nèi)和關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射。透明質(zhì)酸組分還可用作為眼藥的載體，能提供與角膜上皮相容的配方，且可提高這些藥物在體內(nèi)的作用。
文檔編號A61P31/04GK85102921SQ85102921
公開日1988年6月8日 申請日期1985年4月9日
發(fā)明者弗朗西斯科·戴拉·瓦萊, 西爾瓦娜·洛倫茲, 奧里略·羅密歐 申請人:菲地亞有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan