專利名稱:一種h5n1禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種新型高致病性H5m禽流感病毒樣顆粒 (VLPs)的構(gòu)建、規(guī)?；苽浞椒ā?br>技術(shù)背景
流感是危害人類健康的重要傳染病。其病原體屬于正粘病毒科流感病毒屬，根據(jù)病毒核蛋白抗原性不同，分為A、B和C三型。A型流感病毒(Influenza A Virus, IAV)為有囊膜的RNA病毒，基因組由分節(jié)段的8個單股負(fù)鏈RNA片段組成。根據(jù)病毒粒子表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性不同，A型流感病毒分為16種不同的HA亞型(H1-H16) 禾口 9種不同的亞型NA(N1-N9)。
A型流感病毒宿主范圍廣泛，具有高度的變異性，被認(rèn)為是未來流感大流行的最大威脅。人類歷史上發(fā)生過3次流感大暴發(fā)，分別是1918年由Hmi亞型流感病毒引起的西班牙大流感、1957年由H2N2亞型流感病毒引起的香港流感和1968年由H3N2亞型流感病毒引起的亞洲流感。2009年4月由人流感病毒、禽流感病毒和豬流感病毒重配產(chǎn)生甲型Hmi 流感病毒，具有新的抗原性和極強的水平傳播能力，引起巨大的公共衛(wèi)生恐慌。所幸的是， 這種新型Hmi流感病毒感染的死亡率較低。
對人類來說，H5N1型流感病毒是一種新型流感病毒，1997年在香港首次從人體分離到H5m毒株。此后，H5m禽流感病毒先后在亞洲、歐洲和非洲的60多個國家引起家禽和野禽的禽流感暴發(fā)，隨后直接從禽傳染到人，導(dǎo)致500多人感染，死亡率約60%。由于人群中先前存在的流感病毒抗體不能中和抵抗該型病毒，增加了該病毒在人群中爆發(fā)大流行的可能。尤其令人擔(dān)憂的是，如果這種高致病性H5m禽流感病毒因抗原變異及與人流感病毒(如新型Hmi流感病毒)之間發(fā)生基因重配產(chǎn)生能在人群中迅速傳播和引起流感大流行新病毒株時，將會對人類造成可怕的后果。
同其它病毒性疫病一樣，人禽流感的預(yù)防主要依賴于疫苗免疫接種。現(xiàn)行生產(chǎn)的 H5N1人用禽流感疫苗是采用傳統(tǒng)季節(jié)性人流感疫苗方法制備的全病毒滅活疫苗或裂解型疫苗。人H5m禽流感疫苗毒株系采用“反向遺傳操作技術(shù)”，用來源人感染患者H5m病毒分離株的HA和NA編碼基因替換季節(jié)性Hmi流感病毒基因組中相應(yīng)基因產(chǎn)生的重配株， 該重配株能編碼H5m禽流感病毒的HA和NA抗原，其它編碼基因則來源Hmi疫苗株基因組，以降低H5m禽流感病毒的致病性。盡管如此，采用這種重配H5m毒株按傳統(tǒng)流感疫苗工藝生產(chǎn)疫苗仍面臨許多困難。包括H5m病毒培養(yǎng)與實驗操作有嚴(yán)格的生物安全要求， 疫苗生產(chǎn)必須在三級生物安全實驗室(BSL3)內(nèi)操作，對生產(chǎn)人員安全構(gòu)成威脅，并導(dǎo)致成本升高；病毒滅活不徹底導(dǎo)致的毒力殘留給疫苗制品的安全造成巨大風(fēng)險；因毒力強引起雞胚致死，難以在雞胚中高滴度增殖；此外，在H5m禽流感爆發(fā)時勢必會增加對疫苗總量的要求，而爆發(fā)期間會引起雞的大量死亡，很難獲得滿足生產(chǎn)能力需求的雞胚。尤其重要的是，傳統(tǒng)流感疫苗生產(chǎn)工藝制備的H5m禽流感疫苗免疫原性較差，疫苗接種難以誘導(dǎo)持久免疫和交叉保護。因此，研發(fā)安全、高效的H5m禽流感新型疫苗顯得尤為迫切。[0006]近年來發(fā)展起來的病毒樣顆粒(virus like particles，VLPs)，含有病毒的一個或多個抗原蛋白、具有與病毒粒子相似結(jié)構(gòu)的顆粒，不含有病毒的遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制，沒有感染性，能以天然構(gòu)象和模式遞呈抗原，有效刺激細(xì)胞和體液免疫，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好的免疫保護，特別適用于流感病毒新型疫苗的研制。這種新疫苗策略應(yīng)用于高致病性 H5N1禽流感病毒VLPs疫苗研發(fā)，能克服現(xiàn)行H5W人用禽流感疫苗生產(chǎn)各種困難，具有良好的前景和巨大發(fā)展?jié)摿Α＝陙?，國?nèi)外在流感病毒VUs研制方面進行了許多有益的探索。Latham等Q001)首次利用桿狀病毒載體同時表達H3N2流感病毒HA、NA、Ml和M2蛋白，在Sf9細(xì)胞中制備出流感病毒VLPs，并證實該VLPs與野生型流感病毒粒子具有類似的結(jié)構(gòu)。Pushko等000 利用重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中共表達禽流感病毒H9N2的HA、NA 和Ml蛋白，并自裝配成具有血凝和神經(jīng)氨酸酶活性的VLPs，該VLPs純化后免疫動物能誘導(dǎo)針對H9N2的特異性抗體應(yīng)答和抗H9N2病毒強毒致死攻擊的免疫保護；Galarza等Q005) 利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建了表達H3N2流感病毒HA和Ml的VLPs疫苗，經(jīng)鼻內(nèi)滴注或肌肉注射免疫小鼠，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生HA抗體和抵抗同源流感毒株的致死攻擊。Bright等Q007) 利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建了 H5W流感病毒VLPs，能夠誘導(dǎo)小鼠和雪貂抵抗H5W流感病毒的攻擊。近來，我們(Tao等，2009)利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建了 H5m毒株HA、NA和Ml 蛋白組裝的VLPs，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抵抗人源和禽源H5W亞型病毒攻擊的免疫保護。盡管在研制人禽流感VLPs疫苗方面進行了許多有益的探索并取得了諸多成果，但在提高保護性抗原表達量和VLPs規(guī)?；苽浞矫孢€存在諸多值得改進的地方，致使人用H5W禽流感病毒VLPs疫苗仍未應(yīng)用臨床。
另一方面，美國氰胺公司的J.M.加拉爾薩和T.E.萊瑟姆博士在流感病毒顆粒 (VLP)裝配方面也開展了大量探索。在野生型和嵌合流感病毒VUs構(gòu)建、修飾、顆粒裝配和作為藥物應(yīng)用等方面提出了一些新的方法和理念，并已獲準(zhǔn)我國發(fā)明專利
專利名稱野生型和嵌合流感病毒樣克隆(VLP)的裝配，公開號CN1437655A
。該專利提出了 46項權(quán)利要求
，內(nèi)容涉及流感病毒樣顆粒的生產(chǎn)方法、嵌合病毒樣顆粒，病毒樣顆粒稀釋劑或載體，以及藥物組合等諸多方面，并列舉了 15個實施例。但按照該專利的實施步驟，不能從流感病毒開始操作，生產(chǎn)出病毒樣顆粒疫苗制品。該專利涉及的病毒樣顆粒生產(chǎn)步驟更不適用于 H5N1禽流感病毒顆粒的規(guī)?；a(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型高致病性H5m禽流感病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的規(guī)?；苽浞椒?。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的規(guī)?；苽浞椒ㄒ来伟ㄈ缦虏襟E
1)重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建和提??；
2)將重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞桿狀病毒，在細(xì)胞內(nèi)裝配病毒樣顆粒；
3)規(guī)?；疭f9細(xì)胞培養(yǎng)、重組病毒感染和病毒樣顆粒的純化。
作為一種優(yōu)選，進一步的技術(shù)方案是
所述的重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建包括重組質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/ HANAMl的構(gòu)建及其在宿主菌DHlOMultibacte中重組。[0015]步驟3中所述的病毒樣顆粒的純化采用離心分離技術(shù)。
本發(fā)明方法利用桿狀病毒新型高效表達系統(tǒng)(Multibac)，將編碼H5W禽流感病毒株血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和基質(zhì)蛋白(Ml)的基因克隆到轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFBDM 和pUCDM中，置于桿狀病毒晚期啟動子plO和pH控制下，外源基因下游連接SV40polyA或 HSVtk polyA加尾信號序列，構(gòu)成外源基因表達盒；將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和 pUCDM/HANAMl轉(zhuǎn)化至攜帶桿狀病毒基因組的大腸桿菌DHlOMultibacte中進行T7轉(zhuǎn)座重組和LoxP位點特異性重組，篩選獲得重組Bacmid ；將rbacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，采用Sf9細(xì)胞規(guī)模化懸浮培養(yǎng)和重組桿狀病毒增殖，結(jié)合離心分離技術(shù)，純化得到高致病性 H5N1禽流感病毒樣顆粒(VLPs)疫苗。
本發(fā)明還提供VLPs制品的分析檢定方法和功能評價方法，包括VLPs免疫接種動物誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答和抗病毒感染攻擊的檢測方法。
本發(fā)明在充分借鑒抗病毒免疫和流感病毒樣顆粒疫苗最新研究成果基礎(chǔ)上，通過開展蛋白表達、病毒樣顆粒生產(chǎn)與純化步驟優(yōu)化，建立了一種新型高致病性H5m禽流感病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的規(guī)?；苽浞椒?，該方法適用于大規(guī)模制備人用抗高致病性H5m 禽流感新型基因工程VLPs疫苗，安全高效，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。


圖1表達H5m流感病毒HA、NA和Ml的重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
圖2表達H5m流感病毒HA、NA和Ml蛋白重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞時抗原蛋白表達.A為正常Sf9細(xì)胞；B為重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞；C為重組桿狀病毒感染的Sf9 細(xì)胞中表達HA (抗HA多克隆抗體免疫熒光檢測)；D為重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中表達 NA (抗NA多克隆抗體免疫熒光檢測)。
圖3Westernblot分析重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中HA、NA和Ml蛋白表達情況 (Ant i-HA、Ant i-NA和Ant i-Ml三種多克隆抗體分別檢測出對應(yīng)的蛋白；每種抗體對應(yīng)圖中第1列為未感染重組病毒的Sf9細(xì)胞陰性對照，第2列為感染重組病毒的Sf9細(xì)胞)。
圖4純化制備的VLPs分析檢測.A為Western blot分析VLPs中HA、NA和Ml蛋白組分(第1-4列為不同的樣品)；B和C分別為VLPs電子顯微鏡低倍和高倍觀察分析照片。
圖5VLPs免疫接種小鼠誘導(dǎo)的特異性抗HA和抗NA抗體㈧和H5W特異性病毒中和抗體(B)效價分析。
圖6VLPs免疫接種小鼠誘導(dǎo)抗H5W禽流感病毒致死攻擊的免疫保護.A為免疫接種小鼠和非免疫小鼠體重變化；B為免疫接種小鼠和非免疫小鼠抗強毒株致死攻擊的存活率比較。
圖7VLPs免疫接種小鼠產(chǎn)生抗異源H5W禽流感病毒非致死攻擊的免疫保護檢測.A為免疫接種小鼠和非免疫小鼠攻毒感染后肺病毒滴度比較；B和C為免疫接種小鼠和非免疫小鼠攻毒感染后肺組織病理變化比較(C顯示非免疫接種小鼠肺組織明顯的病理損傷；B顯示VLPs免疫接種小鼠顯著降低的組織病理損傷)；D為正常小鼠肺組織學(xué)觀察。
具體實施方式
[0026]下面結(jié)合具體實施例。進一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，下列實施例中未注明的具體實驗條件和方法， 通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實驗指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實驗指南等書中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
^MM 1H5N 1禽、流感病毒病毒樣顆粒(VLPs)瘡苗 射如聿與檢測丨
1.引物的設(shè)計合成
根據(jù)WHO推薦的H5W人禽流感病毒疫苗株
A/reassortant/NIBRG-14 (H5N1)(A/Viet Nam/1194/200 Puerto Rico/8/1934) 基因組序列中血凝素HA編碼序列(Genbank No. GQ4M861)、神經(jīng)氨酸酶NA序列(Genbank No. GQ454862)和基質(zhì)蛋白M序列(Genbank No. GQ4M867)，分別設(shè)計合成三對特異性引物， 分別擴增HA、NA和Ml基因；設(shè)計一條A型流感病毒通用引物用于cDNA合成；各引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；各引物的序列和編號如下
1) HA基因PCR擴增引物
上游引物Pl (SEQ ID NO. 1)
5 ‘ -TACCCGGGGCCAGCATGGAGAAAATAGT-3‘
下游引物P2 (SEQ ID NO. 2)
5 ‘ -GGCTAGCTTAAATGCAAATTCTGC-3‘
(擴增產(chǎn)物5'端含有XmaI位點，3'端含有NheI位點)
2) NA基因PCR擴增引物
上游引物P3 (SEQ ID NO. 3)
5 ‘ -TGCCCGGGGCCACCATGAATCCAAATCA-3‘
下游引物P4 (SEQ ID N0. 4)
5' -CGCTAGCCTACTTGTCAATGGTG-3‘
(擴增產(chǎn)物5'端含有XmaI位點，3'端含有NheI位點)
3) M基因PCR擴增引物
上游引物P5 (SEQ ID N0. 5)
5 ‘ -TGTCGACGCCACCATGAGTCTTCTAACC-3‘
下游引物P6 (SEQ ID N0. 6)
5 ‘ -GCTAAGCTTTCACTTGAATCGCTGCAT-3‘
(擴增產(chǎn)物5'端含有MlI位點，3'端含有HindIII位點)
4)A型流感病毒通用逆轉(zhuǎn)錄引物(SEQ ID N0. 7)
5 ‘ -AGCAAAAGCAGG-3‘
2. H5N1禽流感病毒人用疫苗種毒株(NIBRG-14)總RNA提取及cDNA合成
取100 μ 1NIBRG-14 (Η5Ν1)病毒雞胚尿囊液，用總RNA提取試劑盒(一步法總RNA 抽提試劑盒，BSC51S1，上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品)，按試劑盒操作說明書介紹的方法提取病毒總RNA。提取的RNA溶于16 μ 1 DEPC處理過的水中，加入1 μ 1通用逆轉(zhuǎn)錄引物 (SEQ ID NO. 7)，70°C反應(yīng)5min，迅速冰浴5min，加入逆轉(zhuǎn)錄混合液5Χ逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 (RT Buffer) 5 μ 1，ClNTI3S(IOyM)O. 5 μ 1，RNA 酶抑制劑(RNsin)O. 5 μ 1, M-MLVl μ L· 在 PCR熱循環(huán)儀上進行以下反應(yīng)42°C 60min,95°C 5min，置冰浴，產(chǎn)物即為病毒基因組cDNA，凍存?zhèn)溆谩?br>3. PCR 擴增
以步驟2合成的H5m禽流感病毒cDNA為模板，PCR分別擴增HA，NA和Ml基因， 擴增反應(yīng)體系和具體反應(yīng)條件如下
1) HA基因擴增
cDNA 模板2 μ 1
Pl (10 μ Μ)1 μ 1
Ρ2(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10XPCR 緩沖液5 μ 1
pfu DNA 聚合酶(5U/μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進行以下反應(yīng)95°C變性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 20(^ec 進行 30 個循環(huán)。72°C IOmin0
2) NA基因擴增
cDNA 模板2 μ 1
Ρ3(10μΜ)1 μ 1
Ρ4(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10 X PCR 緩沖液5μ1
pfu DNA 聚合酶(5U/ μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進行以下反應(yīng)95°C變性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 17(^ec 進行 30 個循環(huán)。72°C反應(yīng) IOmin0
3) Ml基因擴增
cDNA 模板2 μ 1
Ρ5(10μΜ)1 μ 1
Ρ6(10μΜ)1 μ 1
ΝΤΡ(ΙΟμΜ)1 μ 1
10 X PCR 緩沖液5μ1
pfu DNA 聚合酶(5U/ μ 1)1 μ 1
ddH2039 μ 1
用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進行以下反應(yīng)95°C變性5min，再 950C 30Sec,52°C 30Sec,72°C 12(^ec 進行 30 個循環(huán)。72°C IOmin
4.含HA、NA和Ml基因重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/HANAMl構(gòu)建
1)用限制性核酸內(nèi)切酶Xma I和Nhe I雙酶消化pFBDM 載體(Redbiotec公司產(chǎn)品)，然后用Xma I和Nhe I雙酶消化步驟3. 1) PCR擴增的HA產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，DNA 回收試劑盒(W5211，上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品，下同)分別回收DNA片段(按試劑盒說明書操作)，以1 3的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑起重組子陽性克隆接種5毫升LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，質(zhì)粒純化試劑盒(Omiga公司產(chǎn)品，下同)提取質(zhì)粒 DNA (按試劑盒說明書操作)，經(jīng)酶切分析和核苷酸測序驗證，獲得重組質(zhì)粒pFBDM/HA。
2)用限制性核酸內(nèi)切酶Ml I和HindIII雙酶分別消化pFBDM/HA載體和步驟 3.3)PCR擴增的Ml產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，DNA回收試劑盒回收DNA片段，以1 3的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑起重組子陽性克隆接種5毫升LB培養(yǎng)基中37 V培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒(操作步驟同4. 1)，獲得重組質(zhì)粒pFBDM/HAMl。
3)用限制性核酸內(nèi)切酶Xma I和Nhe I雙酶分別消化pFBDM載體和步驟3. 2PCR 擴增的NA物，瓊脂糖凝膠電泳，DNA回收試劑盒回收DNA片段，以1 3的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑起重組子陽性克隆接種5毫升LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒(操作步驟同4. 1)，獲得重組質(zhì)粒pFBDM/NA。
4)用RneI和AvrII消化pFBDM/HAMl，凝膠電泳分離，DNA回收試劑盒純化HAMl融合片段；用SpeI和NruI消化pFBDM/NA凝膠純化得線性化的pFBDM/NA，把線性化的pFBDM/ NA和MHAWl 3的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，從相應(yīng)的抗性平板上挑斑。 并用菌落PCR鑒定出陽性克隆。從5毫升大腸桿DH5ci菌培養(yǎng)物中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，提取質(zhì)粒(操作步驟同4. 1)，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBDM/HANAMl。
5)用PmeI和AvrII酶切pFBDM/HANAMl，凝膠電泳分離，DNA回收試劑盒純化 HANAMl融合片段；用PmeI和AvrII酶切pUCDM，凝膠電泳分離，DNA回收試劑盒純化線性化質(zhì)粒PU⑶M，pUCDM與HANAMl融合片段按1 3的比例混合連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW23474，從相應(yīng)的抗性平板上挑斑。并用菌落PCR鑒定出陽性克隆。從5毫升大腸桿BW23474菌培養(yǎng)物中37°C培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒(操作步驟同4. 1)，獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pUCDM/HANAMl。
5.重組Bacmid的獲得
1)制備感受態(tài)大腸桿菌DH10Multibac&e
采用CaCl2法制備大腸桿菌DHlOMultibacte (Redbiotec公司產(chǎn)品)感受態(tài)細(xì)胞。 具體地，取1. 5ml培養(yǎng)至對數(shù)生長期菌液至2ml離心管中，冰浴IOmin ；4°C，4200rpm離心 5min ；棄去上清，加入Iml預(yù)冷0. IM CaCl2溶液重懸細(xì)胞，冰浴IOmin ；4°C，4200rpm離心 5min，棄去上清，加入100 μ 1預(yù)冷0. IM CaCl2溶液重懸細(xì)胞；4°C保存過夜，次日用于轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物；或者加入DMSO，-70°C長期保存?zhèn)溆谩?br>2)重組質(zhì)粒在宿主菌DHlOMultibacte中重組
將純化的重組質(zhì)粒pFBDM/HANAMl轉(zhuǎn)化DH10Multibac&e，按照 MultibacExpression System說明書操作。具體地，取1 μ 1重組質(zhì)粒pHANAMl加入 100 μ IDHlOMultibactte感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ；42°C，熱激45sec ；冰浴^iiin ； 加入二抗的LB培養(yǎng)基(卡那霉素50 μ g/ml和四環(huán)素10 μ g/ml) ,37V, 200rpm培養(yǎng)4h ；將轉(zhuǎn)化DHlOMultibactte培養(yǎng)菌液10倍梯度稀釋，每梯度取200 μ 1涂布含有X_gal (100 μ g/ ml)和IPTG (40 μ g/ml)的三抗平板(含卡那霉素50 μ g/ml，四環(huán)素10 μ g/ml，慶大霉素 7口8/1111)，371靜置培養(yǎng)36-4 1。挑取白色菌落，繼續(xù)在含有X_gal和IPTG三抗平板(含卡那霉素50 μ g/ml,四環(huán)素10 μ g/ml，慶大霉素7 μ g/ml)上畫線兩次，挑取白色菌落，獲得含重組Bacmid克隆。[0093]雙表達盒重組Bacmid制備將純化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/ HANAMl 共轉(zhuǎn)化 DHlOMultibacte，按照 Multibac Expression System 說明書操作。具體地， 取 2-4 μ g 重組質(zhì)粒 pHANAMl 和 2-4 μ g pUCDM/HANAMl 加入 100 μ IDHlOMultibaccre 感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min ；42°C，熱激45sec ；冰浴aiiin ；加入二抗LB培養(yǎng)基(含卡那霉素 50μ g/ml，四環(huán)素 10μ g/ml)，37°C，200rpm 培養(yǎng) 4h ；將轉(zhuǎn)化 DHlO Multibacte 培養(yǎng)菌液10倍梯度稀釋，每梯度取200μ 1涂布含有X-gal(100yg/ml)和IPTG (40 μ g/ml)的四抗平板上(卡那霉素50 μ g/ml，四環(huán)素10 μ g/ml，慶大霉素7 μ g/ml，氯霉素25 μ g/ml)，37°C 靜置培養(yǎng)36-4他。挑取白色菌落，繼續(xù)在含有X-gal和IPTG的四抗平板上畫線兩次，挑取白色菌落，獲得含重組Bacmid的克隆。
3)重組 Bacmid(rbacmid)提取
經(jīng)抗性和藍(lán)白斑篩選獲得純rbacmid菌落，挑取純培養(yǎng)工程菌落，接種5ml液體LB，37°C培養(yǎng)；14000g離心lmin，收集菌體；棄去上清，沉淀用0. 3ml溶液I，重懸；力口入0. 3ml溶液II，輕輕混勻，室溫靜置5min ；慢慢加入0. 3ml 3M乙酸鉀，混勻，冰上靜置 5min ； 14000g,離心IOmin ；將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，再加入0. 8ml異丙醇，混勻，冰上放置 IOmin ；4°C，14000g離心15min ；用70%的乙醇洗兩次，室溫放置讓乙醇揮發(fā)；TE(pH7. 4)溶解，_20°C保存?zhèn)溆谩＋@得穿梭質(zhì)粒rbacmid/HANAMl。
4)rbacmid 鑒定
由于rbacmid基因組大，不能直接進行酶切鑒定，采用引物特異性PCR擴增和產(chǎn)物測序加以驗證。按步驟5. 3)提取重組bacmid作為模板，用引物P1(SEQID NO. 1)與P2 (SEQ ID N0.2)、P3(SEQ ID NO. 3)與 P4(SEQ ID N0.4)、P5(SEQ IDNO. 5)與 P6 (SEQ ID NO. 6)分別進行PCR，擴增出HA、NA和Ml基因，瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA試劑盒純化各種PCR產(chǎn)物， 測序驗證正確的克隆用于拯救重組桿狀病毒。
6.重組桿狀病毒的拯救
1) Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)
采用貼壁方式培養(yǎng)Sf9細(xì)胞拯救重組桿狀病毒。從液氮罐取出1支Sf9種子細(xì)胞， 37°C水浴快速解凍，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至15ml無菌離心管，加入27°C預(yù)溫的Grace' s培養(yǎng)液 (含10%胎牛血清)中，輕輕混勻，IOOOrpm離心5min，棄上清，細(xì)胞用10ml Grace' s培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)懸浮，接種到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置27°C靜置培養(yǎng)4-6天至細(xì)胞單層形成。
2)重組桿狀病毒的產(chǎn)生
采用Lipofectamine2000 (invitrogen 公司產(chǎn)品)將穿梭質(zhì)粒 rbacmid/HANAMl 轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞，拯救重組桿狀病毒。轉(zhuǎn)染過程參照產(chǎn)品說明書進行，具體步驟如下取生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，用0. 25%的胰酶消化，按每孔2-4 X IO5個細(xì)胞的濃度鋪于6孔板(6 孔板，Corning公司產(chǎn)品)，待細(xì)胞80%-90%密度單層；用96 μ 1 Grace' s (無血清)稀釋 4 μ g 重組 bacmid DNA,輕輕混勾；取 8 μ ILipofectamine 力口入 92 μ 1 Grace ‘ s (無血清)， 輕輕混勻；靜置15min，將重組質(zhì)粒混合物緩慢加入到脂質(zhì)體混合物中，輕輕混勻，27°C，孵育30min ；期間用無血清Grace' s培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，向細(xì)胞孔內(nèi)加入800 μ 1 Grace‘ s (無血清)；將脂質(zhì)體-質(zhì)?；旌衔锏渭拥郊?xì)胞孔中，輕輕混勻，27°C，培養(yǎng)箱孵育他后，吸去轉(zhuǎn)染混合物，換用含2 %胎牛血清的Grace ‘ s培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4_6天，將細(xì)胞凍融1次，4°C 500g離心lOmin，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，獲得表達禽流感HA、NA和Ml蛋白的重組桿狀病
ο
3)重組桿狀病毒的克隆純化
采用有限稀釋法純化桿狀病毒。具體方法如下在96孔板中，按5X IO5細(xì)胞/ml 的量鋪板50 μ 1，他；待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍；將病毒液加入Grace ‘ s 培養(yǎng)基(無血清)至100 μ 1稀釋到10_7，吸取1μ 1病毒液加入到細(xì)胞孔中，Ih ；棄去培養(yǎng)基，加Grace' s培養(yǎng)基胎牛血清)100 μ 1，27°C孵育72h ；挑取一孔中僅有一個細(xì)胞被感染的單個細(xì)胞；按5 X IO5細(xì)胞/ml的量鋪板50 μ 1于96孔板中，將前面挑取的單個感染細(xì)胞放入該96孔板細(xì)胞孔中培養(yǎng)，27°C孵育72h，收取上清；按5X IO5細(xì)胞/ml的量鋪板200 μ 1，上一步驟收取的上清轉(zhuǎn)移到M孔細(xì)胞板中，擴大培養(yǎng)，直至得到滴度較高的重組桿狀病毒。此時得到的病毒再按上述步驟操作一次，即可得到純化的重組桿狀病毒。
7.重組桿狀病毒的鑒定
1) PCR鑒定重組桿狀病毒
按基因組DNA提取試劑盒說明書(Solarbio，Beingjing Solarbio 2008)提取重組桿狀病毒基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳，檢測制備的DNA完整性和濃度。以所制備的 DNA 為模板，用引物 Pl (SEQ ID NO. 1)與 P2 (SEQ ID NO. 2)、P3 (SEQ IDN0. 3)與 P4(SEQ ID NO. 4)、P5(SEQ ID NO. 5)與 P6 (SEQ ID NO. 6)分別進行 PCR，擴增出 HA、NA 和 Ml 基因，測序驗證。
2)間接免疫熒光染色檢測重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中目的蛋白表達
取生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞單層，用0.25%胰酶消化，用Grace' s培養(yǎng)液 (8-10%胎牛血清)制成IX IO5細(xì)胞懸液，接種于6孔板(lml/孔)，27°C靜置培養(yǎng)48h。 取200 μ 1重組桿狀病毒液，用6ml無血清Grace ‘ s稀釋，加入生長Sf9細(xì)胞的6孔板中(0.5ml/孔)，不加病毒稀釋液的孔為陰性對照；27°C靜置lh。吸棄病毒液，換成含2% 胎牛血清Grace' s培養(yǎng)液，27 °C繼續(xù)培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1次；加入 200μ 1-20°C預(yù)冷丙酮/甲醇混合液(1 1，vol/vol)，室溫固定IOmin ；吸棄丙酮/甲醇混合液，PBST洗滌細(xì)胞2次，5min/次；加入稀釋的抗-HA或抗-NA多克隆抗體(1 800稀釋)QOO μ 1/孔)，37°C作用Ih ；吸棄抗體混合液，PBST洗滌3次，5min/次；加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(l 200) (31460,Pierce公司產(chǎn)品)，37°C避光作用Ih ；吸棄標(biāo)記抗體混合液，PBST洗滌3次，5min/次；在熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。
結(jié)果顯示，感染重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞中能表達H5m禽流感病毒HA和NA蛋白。
3) Western Blotting重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞中HA、NA和Ml蛋白質(zhì)表達
用抗-HA、抗-NA、抗-Ml多克隆抗體或三者的混合組分為一抗，Westernblotting 分析相應(yīng)蛋白表達。具體步驟包括
(1)樣品處理重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞(T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶)7 后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞，上清液真空凍干，加入200 μ 1 PBS重懸。細(xì)胞用細(xì)胞刮收集，200 μ 1 PBS重懸細(xì)胞。取200 μ 1細(xì)胞重懸液和上清液(凍干粉重懸液體積)，分別加入等體積樣品緩沖液 (Loading buffer)混勻，水浴鍋煮沸5分鐘，冷卻備用。
(2)蛋白質(zhì)組分SDS-PAGE電泳分離采用5%濃縮膠、10%分離膠進行電泳。具體按《分子克隆，實驗手冊》進行。為便于比較，電泳加樣時使用相同體積的各樣品。[0115](3)轉(zhuǎn)膜與抗體反應(yīng)待電泳結(jié)束，取出凝膠并用清水洗滌。同時用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡硝酸纖維膜(NC)和濾紙5min，按陰極-海綿-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿-陽極順序鋪設(shè)凝膠和NC膜，放入電泳槽，88V電壓低溫條件下電泳池。取出NC膜用1 X PBST (% Tween-20的PBS)洗滌5min，加入含5%脫脂奶粉的PBST封閉緩沖液(blocking buffer)， 37°C孵育池。PBST洗滌NC膜3次，每次lOmin。加入兔抗HA、抗NA和Ml多克隆抗體混合物(1 500PBST稀釋)，37°C孵育2h。PBST充分洗滌NC膜3-5次，每次lOmin。加入HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(31460，Pierce公司產(chǎn)品，PBST 1 3000稀釋)，37°C孵育lh, PBST 充分洗滌NC膜3-5次，每次lOmin。加入DAB顯色液(具體配方見《分子克隆，實驗手冊》)， 室溫避光顯色5-lOmin，清水洗NC膜觀察記錄結(jié)果。
結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的重組桿狀病毒能同時表達HA、NA和Ml蛋白(圖3)
8.重組桿狀病毒增殖和滴度測定
1)重組桿狀病毒的增殖
取0. Iml經(jīng)克隆化的重組桿狀病毒液稀釋至5ml (含8-10 %胎牛血清的 Grace' s)，接種70-80%的Sf9細(xì)胞單層上(T25瓶)，輕輕混勻，27°C靜置培養(yǎng)48_72h，凍融細(xì)胞1次，細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，4°C，500g離心lOmin，收獲上清液，記錄重組病毒代次，-70°C或液氮中凍存?zhèn)溆谩?br>2)病毒滴度測定
取生長良好的Sf9細(xì)胞，0.25%胰酶消化，加入Grace' s培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，使?jié)舛认♂屩?X IO5細(xì)胞/ml，按Iml/孔接種6孔板，27°C，靜置培養(yǎng)48_72h。
待Sf9細(xì)胞長至70-80%單層，用無血清無抗生素的Grace' s培養(yǎng)基輕輕沖洗細(xì)胞，取重組病毒原液用無血清無抗生素的Grace ‘ s培養(yǎng)基10倍梯度稀釋，加入到Sf9細(xì)胞單層上(lml/孔)，每個稀釋度做2個平行孔；27°C，靜置吸附Ih ；吸棄病毒液，換成含甲基纖維素的Grace' s培養(yǎng)基(8_10%胎牛血清)，27°C，靜置培養(yǎng)4_6天，觀察空斑形成。
每個細(xì)胞孔用200 μ 1福爾馬林固定30min，加入的結(jié)晶紫(5(^1/孔)，室溫染色lh，清水輕輕沖洗后，再加入中性紅復(fù)染30min ；沖洗、晾干后計數(shù)空斑；計算病毒效價 pfu/mlο
3)重組桿狀病毒基因組遺傳穩(wěn)定性測定
重組桿狀病毒按MOI = 3接種70-80%單層Sf9細(xì)胞，27°C，靜置培養(yǎng)4-6天，收獲病毒液；按相同方法連續(xù)傳代20代次以上，收獲各代次病毒液，分裝，凍存-70°C或液氮中， 備用。
分別取第5代、第10代、第15代和第20代的病毒液，提取病毒基因組，按基因組 DNA提取試劑盒說明書(Solarbio，Beingjing Solarbio 2008)進行，采用特異性引物PCR 擴增HA、NA基因片段，測序分析兩個基因的核苷酸序列。
結(jié)果顯示，重組桿狀病毒在Sf9細(xì)胞上連續(xù)傳代20代次，抗原蛋白編碼基因HA和 NA未發(fā)生突變。
實施例2H5m禽流感病毒病毒樣顆粒(VLPs)疫苗的規(guī)模化制備及檢定
1. Sf9昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化與規(guī)?；?xì)胞懸浮培養(yǎng)
1)重組桿狀病毒最佳接種濃度優(yōu)化
取生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，0. 25%胰酶消化，接種到6孔板中，細(xì)胞形成約80%單層，分別以MOI = 0. 01、0. 1、1、3、5和10幾種不同稀釋度接種第三代重組桿狀病毒，吸附 Ih后，更換新鮮Grace' s培養(yǎng)液胎牛血清)，于27°C靜置培養(yǎng)，分別于接種病毒后2、 3、4、5、6和7天各收獲病毒液。
按步驟8. 2的方法測定各MOI感染劑量在不同增殖時間后的病毒滴定，確定重組桿狀病毒的最佳感染劑量和增殖培養(yǎng)時間。
結(jié)果表明，在Sf9細(xì)胞中，重組桿狀病毒最佳接種濃度為MOI = 3或MOI = 5;接種病毒72-120h后獲得最高病毒滴度。
2)細(xì)胞初始接種密度確定
取生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，用Grace' s (8_10%胎牛血清) 配制成5 X 105/ml細(xì)胞懸液，按IOml/瓶接種在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每批接種10-20瓶，27°C 靜置培養(yǎng)4-6天，待細(xì)胞長滿單層，吸棄Grace ‘ s培養(yǎng)液，用0. 25 %胰酶消化后，加入新鮮 Grace' s培養(yǎng)液(含8-10%胎牛血清)懸浮細(xì)胞；
取0. Iml細(xì)胞懸液，用PBS (pH7. 4)稀釋至lml，加入等體積4%臺盼藍(lán)染色液，室溫染色5-lOmin，輕輕混勻，滴注細(xì)胞計數(shù)板中顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞密度。
按2-4X IO5細(xì)胞/ml的密度，將Sf9細(xì)胞接種到轉(zhuǎn)瓶中，根據(jù)細(xì)胞總數(shù)加入200-1000ml培養(yǎng)基和終濃度10U/ml的肝素鈉(商品肝素鈉粉劑的活性單位 150-190U/lmg)，27°C，28rpm懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。每日無菌條件下吸取Iml懸浮培養(yǎng)液，加入等體積4%臺盼藍(lán)染色液染色5-lOmin，顯微鏡下計數(shù)，計算細(xì)胞密度和存活率。結(jié)果顯示， Sf9細(xì)胞懸浮培養(yǎng)42-%h密度達2X IO6細(xì)胞/ml、細(xì)胞存活率在90%以上，此時進行重組病毒接種。
2.病毒樣顆粒的純化
1)待懸浮細(xì)胞擴增至濃度約為2X106細(xì)胞/ml、細(xì)胞存活率在90%以上時，按MOI =3的劑量接種重組桿狀病毒rBV-HANAMl，于27°C，28rpm繼續(xù)懸浮培養(yǎng)72h。
2)收取接種了重組桿狀病毒的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)移至50_250ml離心管中進行差速離心，即:4°C, IOOg 離心 5min, 500g 離心 5min, IOOOg 離心 5min, 1500g 離心 5min, 2000g 離心lOmin，最后4000g離心30min，收取上清。
3)取50_250ml Beckman離心管(離心管大小視樣品量選取)2-6只，離心管底部鋪30%蔗糖溶液10ml，將步驟2. 2)制備的培養(yǎng)上清液緩緩加入到離心管蔗糖層上，4°C， 40，OOOg，離心3-4h ；棄去上清液，用l_2ml預(yù)冷的無菌PBS重懸沉淀物。
4)取10_50ml Beckman離心管2_6只，向離心管底部加入濃度梯度20% -60% 蔗糖溶液，每個蔗糖梯度溶液加3-細(xì)1，用Iml注射器吸取各蔗糖梯度溶液，深入離心管底部，由低濃度加到高濃度，將步驟2. 3)制備的樣品混合物小心加入到蔗糖溶液頂層，4°C， 100, 000g，離心12-14h ；用注射器分別收集各蔗糖層樣品，采用Western blot、血凝試驗分別檢測樣品中HA、NA、Ml蛋白表達和VLPs血凝活性；采用磷鎢酸溶液染色，電鏡觀察VLPs 結(jié)構(gòu)。
3.病毒樣顆粒的檢定
Dffestern blot檢測SF9細(xì)胞系中病毒蛋白(HA，NA和Ml)的表達方法同實施例 1步驟7. 4。
2)血凝活性測定[0146]取96孔V型血凝板，向第二列至第十二列孔加入生理鹽水(5(^1/孔)，在第一孔內(nèi)加入50 μ 1純化的VLPs樣品液，在第二列孔內(nèi)加入50 μ 1純化的VLPs樣品液，混合數(shù)次，吸出50μ 1加入至第三列孔，混勻，依次系列倍比稀釋至第十一列，混勻后棄去50μ 1混合液，第十二列孔作為陰性對照。每孔加入50μ 1 的雞紅細(xì)胞懸液，輕輕混勻，室溫靜置 10-30min，至陰性對照孔紅細(xì)胞完全沉淀時開始觀察結(jié)果。
以測定管出現(xiàn)紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)作為該樣品的凝集效價。結(jié)果顯示，經(jīng)蔗糖梯度離心分離純化的H5W禽流感VUs血凝效價為1 32-1 64。
3)病毒樣顆粒的電子顯微鏡檢測
取純化的VLPs樣品液1-2滴，滴加在銅網(wǎng)支持膜上，作用Imin后用濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸干，向樣品銅網(wǎng)上滴加1-2滴2%磷鎢酸染色液(蒸餾水配制，pH 6. 8)，室溫染色 lmin，濾紙沿銅網(wǎng)邊緣吸干，將制備好的負(fù)染色樣品置透射電子顯微鏡下觀測，記錄結(jié)果。
電鏡觀察結(jié)果顯示，本發(fā)明描述技術(shù)獲得的H5m禽流感病毒VUs呈典型的流感病毒顆粒結(jié)構(gòu)(圖4B、4C)。
^MM 3H5N1禽、流感病毒病毒樣顆粒(VLPs)瘡苗的功能檢測丨
為了評價H5W禽流感病毒VLPs疫苗的安全性和免疫效力，本發(fā)明采用BALB/c小鼠為動物模型。
1. H5N1禽流感病毒VLPs疫苗安全性評價
取5-6周齡健康雌性BALB/c小鼠20只，隨機分成2組，每組10只，A組小鼠肌肉注射H5m禽流感病毒VLPs疫苗(劑量每只小鼠10 μ g/100 μ 1)，B組小鼠肌肉注射100 μ 1 無菌PBS作為陰性對照。
小鼠注射后觀察21天，測量體重變化，分別于5、7、9、14和21天，尾部采血，計數(shù)
白細(xì)胞數(shù)量。
結(jié)果顯示，VLPs接種組和PBS對照組小鼠體重變化和各采血時間點白細(xì)胞數(shù)量無
顯著差異。
2. H5W禽流感病毒VLPs疫苗效力評價
1) VLPs疫苗小鼠免疫接種
取5-6周齡健康雌性BALB/c小鼠45只，隨機分成3組(A、B、C組)，每組15只， 疫苗接種前小鼠斷尾采血，分離血清用于抗體檢測。a、B組為實驗組，分別用本發(fā)明所描述 H5N1VLPS疫苗采用后腿肌內(nèi)注射方法免疫接種，劑量為10 μ g/100 μ 1的VLPs (總蛋白含量)；C組小鼠肌肉注射ΙΟΟμΙ PBS作為陰性對照。每組小鼠免疫三次，間隔14天。
第三次免疫后第7天，每組選取5只，斷尾取血以分離血清備用。 2) VLPs疫苗小鼠體液免疫應(yīng)答檢測
(1)間接ELISA法測定小鼠血清中HA抗體效價。具體步驟包括
包被用被緩沖液(0. 05Μ PH 9. 6的碳酸鹽緩沖液)將重組HA蛋白(本實驗室制備保存)稀釋至5yg/ml，包被96孔ELISA酶標(biāo)板(Corning公司產(chǎn)品，下同)每孔100 μ 1， 4°C包被過夜；
封閉將包被HA抗原的ELISA酶標(biāo)板用PBS-T (PBS含0. 1 % Tween-20, pH 7. 5，下同)洗滌5次，每次5min ；加入100 μ 1封閉液(含3% BSA的PBST)，37°C封閉60min ；PBST 洗滌5次后。[0165]加待檢血清小鼠血清用含BSA的PBST作1 100梯度稀釋，將稀釋血清加入ELISA酶標(biāo)板各孔中(100 μ 1/每孔)，37°C孵育60min ；PBST洗滌5次。
加酶標(biāo)二抗二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(31432Pierce公司產(chǎn)品)，用含BSA的PBSIMtl 5000稀釋，加入ELISA板各孔中(100 μ 1/每孔)，37°C作用60min ；PBST洗滌5次。
加入顯示底物溶液向酶標(biāo)板各孔中加入顯色底溶液(含0. 045% H2O2，0. 4mg/ml o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD)的磷酸-檸檬酸鹽緩沖液)，每孔 100 μ 1， 37°C避光顯色15min ；每孔加入2M H2S0450 μ 1終止反應(yīng)。
OD492值測定在酶標(biāo)儀上波長492nm處測定每孔內(nèi)光密度吸收值(0D㈣)
結(jié)果表明，本發(fā)明制備的VLPs疫苗免疫接種小鼠能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平特異性 HA抗體(圖5A)。
(2)血凝抑制實驗測定免疫接種小鼠血清中和抗體效價
將待檢血清與受體破壞酶(RDE)按1 4比例混合，37°C作用14h，再56°C作用Ih 以滅活RDE ；將處理好的待檢血清用生理鹽水做系列倍比稀釋，加入到血凝板各孔中，每孔 25 μ 1 ；然后向每孔加入25 μ 1含有8個血凝單位的滅活A(yù)/VietNam/1194R(H5Nl)病毒液， 混勻，室溫靜置30min，向每孔加入50 μ 1 1 %雞紅細(xì)胞懸液，混勻，室溫靜置30-60min，觀察實驗結(jié)果。血凝效價定義為能夠100%抑制紅細(xì)胞凝集的血清稀釋度。
結(jié)果表明，本發(fā)明制備的VLPs疫苗免疫接種小鼠能有效誘導(dǎo)機體產(chǎn)生H5W禽流感病毒中和抗體(圖5B)。
3) VLPs疫苗接種小鼠抗H5W禽流感病毒攻擊感染的免疫保護
(1)疫苗接種誘導(dǎo)機體抗H5W同源強毒株致死攻擊感染的保護效力
VLPs疫苗第三次加強免疫后第14天，稱量小鼠體重，然后用乙醚麻醉小鼠，滴鼻接種A/Viet Nam/1194R(H5N1)病毒液50 μ 1 (IOLD5tl)；攻毒后每天觀察記錄小鼠發(fā)病和存活情況，每天稱量小鼠體重，觀察至攻毒感染后第14天，計算體重變化。
實驗結(jié)果顯示，注射PBS陰性對照組小鼠體重從攻毒后第2天開始降低，持續(xù)直至所有小鼠死亡；VLPs免疫組小鼠的體重從攻毒感染后第4天開始降低，第6天體重開始恢復(fù)，第10天體重恢復(fù)到初始水平；觀察至攻毒感染后第14天所有小鼠存活(圖6Α、6Β)。表明VLPs免疫接種能夠誘導(dǎo)小鼠抵抗同源H5W禽流感病毒攻擊的免疫保護。
(2)疫苗接種誘導(dǎo)機體抗H5W異源毒株攻擊感染的保護效力
VLPs疫苗第三次加強免疫后第14天，稱量小鼠體重，用乙醚麻醉小鼠，滴鼻接種 A/Hubei/489(H5N1)病毒液50 μ 1 (IO3EID5tl)。攻毒感染后第6天，取5只小鼠，斷頸處死，無菌取出全肺，加入Iml PBS研磨勻漿，3000rpm離心lOmin，收集上清液，接種9-10日齡SPF 雞胚，觀察記錄雞胚死亡數(shù)，采用Reed-Muench法計算病毒效價。另取5只小鼠，斷頸處死， 取全肺置于10%福爾馬林固定lOmin，石蠟包埋、切片，HE染色分析肺組織病理變化。
結(jié)果顯示，VLPs疫苗免疫組小鼠肺組織病毒效價為2. 07士0. 811gEID50/肺，接種 PBS陰性對照組小鼠肺組織病毒效價為6. 9士0. 681gEID50/肺(圖7A)；與對照組小鼠相比，VLPs疫苗免疫組小鼠肺組織顯示更輕微的病理損傷(圖7D)，表明VLPs疫苗接種能誘導(dǎo)機體抵抗H5W禽流感病毒攻擊感染的免疫保護，抑制病毒在小鼠肺組織內(nèi)復(fù)制和加速病毒清除。
權(quán)利要求
1.一種H5m禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒ǎ涮卣髟谟谝来伟ㄈ缦虏襟E1)重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建和提?。凰龅闹亟M質(zhì)粒rbacmid/HANAMl的構(gòu)建包括重組質(zhì)粒pFBDM/HANAMl和pUCDM/HANAMl的構(gòu)建及其在宿主菌DHlOMultibactte中重組，其中pFBDM/HANAMl是將H5m禽流感病毒HA、NA和Ml基因克隆到pFBDM 載體中制備， pUCDM/HANAMl是將H5m禽流感病毒HA、NA和Ml基因克隆到pUCDM載體中制備；2)將重組質(zhì)粒rbacmid/HANAMl轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞拯救重組桿狀病毒，在Sf9細(xì)胞內(nèi)裝配病毒樣顆粒；3)規(guī)模化Sf9細(xì)胞培養(yǎng)、重組病毒感染和病毒樣顆粒的純化。
2.如權(quán)利要求
1所述的H5W禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒ǎ涮卣髟谟?步驟3中所述的病毒樣顆粒的純化采用離心分離技術(shù)。
3.如權(quán)利要求
1所述的H5W禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒?，其特征在于 在Sf9細(xì)胞培養(yǎng)中，接種濃度為MOI = 3或MOI = 5。
4.如權(quán)利要求
1所述的H5W禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒?，其特征在于 在Sf9細(xì)胞培養(yǎng)中，增殖培養(yǎng)時間為72-120h。
5.如權(quán)利要求
1所述的H5W禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒?，其特征在于 在Sf9細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞初始接種密度為2 X IO6細(xì)胞/ml。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種新型H5N1禽流感病毒樣顆粒疫苗的規(guī)?；苽浞椒āＲ来伟ㄈ缦虏襟E1)重組質(zhì)粒rbacmid/HANAM1的構(gòu)建和提?。?)將重組質(zhì)粒rbacmid/HANAM1轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞拯救重組桿狀病毒，在Sf9細(xì)胞內(nèi)裝配病毒樣顆粒；3)規(guī)?；疭f9細(xì)胞培養(yǎng)、重組病毒感染和病毒樣顆粒的純化。該方法適用于大規(guī)模制備人用抗高致病性H5N1禽流感VLPs疫苗，安全高效，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。
文檔編號C12N7/01GKCN101947317 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 201010293705
公開日2012年5月30日 申請日期2010年9月27日
發(fā)明者朱丹丹, 潘茲書, 璩驍, 陶攀 申請人:武漢大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),