本說明書能夠?qū)崿F(xiàn)用于治療肌肉病癥如肌營養(yǎng)不良癥的組合物和方法。

背景技術(shù)：

1、本說明書中參考文獻(xiàn)的著錄細(xì)節(jié)也在說明書的末尾列出。

2、本說明書中對(duì)任何現(xiàn)有技術(shù)的引用不是，也不應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)或任何形式的暗示該現(xiàn)有技術(shù)形成任何國家的公知常識(shí)的一部分。

3、肌營養(yǎng)不良癥(md)是一組以特定肌肉組織進(jìn)行性衰弱和消瘦(肌壞死)為特征的疾病，骨骼肌被纖維、骨或脂肪組織取代。肌營養(yǎng)不良癥有幾種不同的形式，影響男性或男性和女性，其中許多出現(xiàn)在嬰兒期和兒童期，直到中年或更晚。其形式和嚴(yán)重程度隨著發(fā)病年齡的不同而不同，尤其是較年輕的受試對(duì)象經(jīng)常經(jīng)歷急性進(jìn)展性疾病。

4、最常見的md形式有duchene肌營養(yǎng)不良癥(dmd)、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(lgmd)、becker肌營養(yǎng)不良癥(bmd)、先天性肌營養(yǎng)不良癥(cmd，包括fukuyama型先天性md和先天性md伴肌球蛋白缺乏癥、面肩肱型、眼咽型、emery-dreifuss型和遠(yuǎn)端型。幾乎所有類型的md都是由單基因突變引起的。

5、dmd和bmd涉及x染色體上的肌營養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)基因缺陷。肌營養(yǎng)不良蛋白用于連接肌肉細(xì)胞(肌節(jié))和細(xì)胞骨架的收縮機(jī)制(肌動(dòng)蛋白絲)和細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)，膠原蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)中傳遞肌肉力量(grounds?md，2008)。已知ecm在肌肉功能和肌肉再生中扮演著復(fù)雜的角色。營養(yǎng)不良的肌纖維與壞死、炎癥和纖維化有關(guān)。由于肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏導(dǎo)致進(jìn)展性疾病的確切事件序列在分子水平上還不清楚?；加衐md的兒童有肌營養(yǎng)不良蛋白缺陷的肌肉，容易受到收縮引起的肌肉損傷，從而觸發(fā)免疫系統(tǒng)，加劇肌肉損傷，fda?cder的主任的出版物對(duì)此進(jìn)行了總結(jié)(rosen等人，2015)。肌肉力量的持續(xù)退化影響下肢，導(dǎo)致活動(dòng)能力受損，并且還影響上肢，導(dǎo)致功能和自我護(hù)理能力的進(jìn)一步喪失。雖然基因治療和跳過外顯子的方法將是理想的，但研究人員也專注于了解疾病的性質(zhì)，以便開發(fā)能夠減輕其嚴(yán)重性和延緩其進(jìn)展的策略和藥物。mdx小鼠模型被廣泛用于臨床前研究機(jī)制和干預(yù)措施。grounds?md，2008，確定了在mdx小鼠中針對(duì)慢性期和急性期疾病的兩級(jí)方法的必要性。

6、dmd是一種破壞性的疾病，主要影響男孩，發(fā)病率約為1:3,500活產(chǎn)。男孩在很小的時(shí)候就失去了行走的能力，在青春期之后就只能坐在輪椅上，而且常常是在生命的第三個(gè)十年中死于心肺功能衰竭。bmd與dmd相似但更溫和。

7、目前使用皮質(zhì)類固醇的治療旨在通過減少炎癥來減輕疾病的嚴(yán)重程度，從而在一段時(shí)間內(nèi)保持肌肉質(zhì)量和功能。皮質(zhì)類固醇有急性抗炎效果，但可能是短期的，其作用機(jī)制尚不清楚。它們不是最理想的，因?yàn)楦弊饔脟?yán)重限制了它們的使用，而且它們還可能導(dǎo)致萎縮。潑尼松龍0.75mg/kg/天和地夫可特(deflazacort)0.9mg/kg/天是能行走的dmd患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但當(dāng)男孩變得不能行走時(shí)，對(duì)于cs的益處沒有達(dá)成共識(shí)，男孩可能會(huì)繼續(xù)治療，有時(shí)是他們失去行走能力時(shí)所用的固定劑量，即減少的mg/kg/天劑量，否則他們可能會(huì)停止cs治療。edasalonexent作為一種抗炎的nf-κb藥物正在開發(fā)中，作為一種單一療法用于患有dmd的年輕能行走的男孩。有幾種藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，針對(duì)營養(yǎng)不良的不同方面。例如，針對(duì)纖維化的它莫西芬(tamoxifen)、用于呼吸功能的艾地苯醌(idebenone)和用于跳過終止密碼子的ataluren正在進(jìn)行md的臨床試驗(yàn)。通過誘導(dǎo)肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子的定向跳躍來治療dmd的寡核苷酸治療已經(jīng)被評(píng)估，結(jié)果好壞參半。eteplirsen，一種嗎啉代寡核苷酸，已經(jīng)在13％的在第51外顯子發(fā)生遺傳終止密碼子突變的dmd兒童中進(jìn)行了驗(yàn)證性研究，可跳過外顯子51，而drispersen，一種用于第51外顯子跳過的2'-o-甲基硫代磷酸寡核苷酸，未能獲得活性和fda批準(zhǔn)。

8、目前治療中的這些缺陷表明需要另外的治療方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在整個(gè)說明書中，詞語“包括(comprise)”或諸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的變化形式將被理解為意指包括所陳述的要素、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其他要素、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟的組。

2、如本文所用，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)方面，除非上下文另外明確指出。因此，例如，提及“一種組合物”包括單一組合物，以及兩種或更多種組合物；提及“一種試劑”包括一種試劑，以及兩種或更多種試劑；提及“本發(fā)明”包括本發(fā)明的單個(gè)和多個(gè)方面等。

3、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的方法，其包括向人cd49d(vla-4的α4鏈)施用抑制性寡核苷酸。

4、在一個(gè)實(shí)施方案中，示例性抑制性寡核苷酸包括分離的或合成的反義rna或dna、sirna或sidna、mirna、mirna模擬物、shrna或dna和反義dna或rna或dna:rna雜合體。

5、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療有需要的受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的方法，該方法包括周期性地向受試對(duì)象施用藥物組合物，該藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體(carrier)和治療有效量的包括以下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸：

6、5'-mecmeug?agt?mectg?ttt?meumecmec?ameumeu?mecmeu-3'

7、其中，

8、a)寡核苷酸的19個(gè)核苷酸鍵中的每一個(gè)是o,o-連接的硫代磷酸二酯；

9、b)自5'端起1-3位核苷酸為2'-o-(2-甲氧乙基)修飾的核糖核苷；

10、c)自5'端起4-12位核苷酸為2'-脫氧核糖核苷；

11、d)自5'端起13-20位核苷酸為2'-o-(2-甲氧乙基)修飾的核糖核苷；并且

12、e)所有胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶(mec)，

13、或其藥學(xué)上可接受的鹽。

14、在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥的時(shí)間和條件足以改善受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的一種或多種標(biāo)志物、體征或癥狀或延遲受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的進(jìn)展。

15、在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥與標(biāo)準(zhǔn)皮質(zhì)類固醇治療組合。

16、在一個(gè)實(shí)施方案中，皮質(zhì)類固醇以低劑量施用。低劑量皮質(zhì)類固醇包括標(biāo)準(zhǔn)劑量的2/3、1/2、1/4和1/3。

17、在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的給藥在標(biāo)準(zhǔn)或低劑量皮質(zhì)類固醇存在下是治療有效的。

18、在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的給藥在不存在皮質(zhì)類固醇的情況下是治療有效的。

19、在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的給藥在不存在皮質(zhì)類固醇的情況下是治療有效的，并且其中受試對(duì)象是能行走的。

20、在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的給藥在不存在皮質(zhì)類固醇的情況下是治療有效的，并且其中受試對(duì)象是不能行走的。

21、在另一個(gè)實(shí)施方案中，本說明書實(shí)現(xiàn)了用于在患有肌營養(yǎng)不良癥的受試對(duì)象中改善肌肉功能或延遲肌肉功能衰退的方法，該方法包括周期性地向受試者施用藥物組合物，該藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體(carrier)和治療有效量的包括以下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸：

22、5'-mecmeug?agt?mectg?ttt?meumecmec?ameumeu?mecmeu-3'

23、其中，

24、a)寡核苷酸的19個(gè)核苷酸鍵中的每一個(gè)是o,o-連接的硫代磷酸二酯；

25、b)自5'端起1-3位核苷酸為2'-o-(2-甲氧乙基)修飾的核糖核苷；

26、c)自5'端起4-12位核苷酸為2'-脫氧核糖核苷；

27、d)自5'端起13-20位核苷酸為2'-o-(2-甲氧乙基)修飾的核糖核苷；并且

28、e)所有胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶(mec)，

29、或其藥學(xué)上可接受的鹽或立體異構(gòu)體，持續(xù)時(shí)間和條件足以在受試對(duì)象中改善營養(yǎng)不良肌纖維的一種或多種標(biāo)志物、體征或癥狀或延遲肌營養(yǎng)不良癥的進(jìn)展。

30、在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸是rna-dna雜合體。

31、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象由于md而不能行走。

32、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象是青春期后的。

33、在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括監(jiān)測cd4+和/或cd8+t細(xì)胞水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括監(jiān)測降低的cd4+和/或cd8+t細(xì)胞水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括監(jiān)測m1巨噬細(xì)胞或hladr+單核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括監(jiān)測減少的m1巨噬細(xì)胞或hladr+單核細(xì)胞。

34、在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括測定md或營養(yǎng)不良的肌纖維的一種或多種標(biāo)志物的水平或存在，包括免疫細(xì)胞或免疫調(diào)節(jié)因子的水平或數(shù)量、炎性標(biāo)志物的水平或纖維化標(biāo)志物的水平或肌肉狀態(tài)標(biāo)志物的水平。

35、在一個(gè)實(shí)施方案中，md或md進(jìn)展或營養(yǎng)不良肌纖維的一種或多種標(biāo)志物包括免疫細(xì)胞或免疫調(diào)節(jié)因子的水平或數(shù)量、炎性標(biāo)志物的水平或纖維化標(biāo)志物的水平或肌肉狀態(tài)標(biāo)志物的水平。

36、肌肉狀態(tài)的標(biāo)志物包括但不限于運(yùn)動(dòng)肌功能的標(biāo)志物、指示肌肉纖維化或其不存在的標(biāo)志物、指示肌肉退化或再生的標(biāo)志物、心臟功能的標(biāo)志物和肺功能的標(biāo)志物。

37、在一個(gè)實(shí)施方案中，改善md或營養(yǎng)不良的肌纖維的一種或多種體征包括改善肢體功能、身體肌肉功能、心臟和/或肺功能。

38、在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括測定md或營養(yǎng)不良肌纖維的一種或多種體征的水平或存在。說明性的體征包括肢體功能、身體肌肉功能、心臟和肺功能。

39、在一個(gè)實(shí)施方案中，md或營養(yǎng)不良肌纖維的一個(gè)或多個(gè)癥狀包括生活質(zhì)量因素，諸如能量水平、幸福感、感覺到的步行舒適性、上肢功能活動(dòng)等。

40、在一個(gè)實(shí)施方案中，有需要的受試對(duì)象包括有md的遺傳和/或臨床診斷以及相對(duì)低水平的營養(yǎng)不良肌纖維和炎性標(biāo)志物的受試對(duì)象。

41、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象顯示炎性細(xì)胞水平正常或僅稍微升高。炎性細(xì)胞包括t細(xì)胞(cd4、cd8)、b細(xì)胞(cd-19)、粒細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞)。

42、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象顯示正?；騼H稍微升高水平的cd49d細(xì)胞。

43、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象顯示cd49d?t細(xì)胞水平正?；騼H稍微升高。

44、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象表現(xiàn)出免疫細(xì)胞標(biāo)志物如cd3、cd4、cd8、cd49d、cd29和hla-dr的水平正?；騼H稍微升高。

45、標(biāo)志物的合適方法包括細(xì)胞或蛋白質(zhì)/核酸或脂質(zhì)分析是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于流式細(xì)胞術(shù)、微珠技術(shù)和基于elisa的方法、層析和/或ms方法、基于雜交或測序的方法。

46、在另一個(gè)實(shí)施方案中，診斷為患有md的受試對(duì)象表現(xiàn)出嚴(yán)重營養(yǎng)不良肌纖維的顯著升高或急性水平，伴有嚴(yán)重肌肉壞死和炎癥。

47、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象顯示相對(duì)于正常健康對(duì)照顯著升高的cd49d?t細(xì)胞水平。

48、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象中md的形式選自由以下組成的組：杜興型肌營養(yǎng)不良癥(duchene?muscular?dystrophy，dmd)、肢帶型肌營養(yǎng)不良癥(lgmd)、貝克型肌營養(yǎng)不良癥(becker?muscular?dystrophy，bmd)、先天性肌營養(yǎng)不良癥(cmd)，包括fukuyama型先天性md和先天性md伴肌球蛋白缺乏癥、面肩肱型、眼咽型、emery-dreifuss型和遠(yuǎn)端肌營養(yǎng)不良。

49、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象有dmd或bmd并且是不能行走的。

50、在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象具有dmd或bmd并且是青春期后的。

51、在本發(fā)明的另一種形式中，考慮了涉及的實(shí)施方案；當(dāng)藥物組合物用于目前描述的方法或用途時(shí)，本文描述的組合物在制備用于治療或預(yù)防受試對(duì)象肌營養(yǎng)不良癥的藥物中的用途，用于目前描述的方法的藥物組合物。

52、因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括以下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸的用途：

53、5'-mecmeug?agt?mectg?ttt?meumecmec?ameumeu?mecmeu-3'

54、其中，

55、a)寡核苷酸的19個(gè)核苷酸鍵中的每一個(gè)是o,o-連接的硫代磷酸二酯；

56、b)自5'端起1-3位核苷酸為2'-o-(2-甲氧乙基)修飾的核糖核苷；

57、c)自5'端起4-12位核苷酸為2'-脫氧核糖核苷；

58、d)自5'端起13-20位核苷酸為2'-o-(2-甲氧乙基)修飾的核糖核苷；并且

59、e)所有胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶(mec)，

60、或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療或預(yù)防受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥或延遲受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的進(jìn)展的藥物中的用途。

61、在另一個(gè)實(shí)施方案中，本說明書能夠?qū)崿F(xiàn)包括以下結(jié)構(gòu)的寡核苷酸：

62、5'-mecmeug?agt?mectg?ttt?meumecmec?ameumeu?mecmeu-3'

63、其中，

64、a)寡核苷酸的19個(gè)核苷酸鍵中的每一個(gè)是o,o-連接的硫代磷酸二酯；

65、b)自5'端起1-3位核苷酸為2'-o-(2-甲氧乙基)修飾的核糖核苷；

66、c)自5'端起4-12位核苷酸為2'-脫氧核糖核苷；

67、d)自5'端起13-20位核苷酸為2'-o-(2-甲氧乙基)修飾的核糖核苷；并且

68、e)所有胞嘧啶均為5-甲基胞嘧啶(mec)，

69、或其藥學(xué)上可接受的鹽或立體異構(gòu)體，用于治療或預(yù)防受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥或延遲受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的進(jìn)展。

70、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)治療有需要的受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的方法，該方法包括周期性地向受試對(duì)象施用治療有效量的人cd49d抑制性寡核苷酸以改善受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的一種或多種標(biāo)志物、體征或癥狀或延遲其進(jìn)展。

71、在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸給藥與標(biāo)準(zhǔn)或低劑量皮質(zhì)類固醇治療相結(jié)合或作為輔助治療。

72、在一個(gè)實(shí)施方案中，皮質(zhì)類固醇以低劑量施用。

73、在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸的給藥在沒有皮質(zhì)類固醇治療的情況下是有效的。

74、在另一個(gè)實(shí)施方案中，公開了人cd49d的抑制性寡核苷酸在制備用于在患有肌營養(yǎng)不良癥的受試對(duì)象中改善肌營養(yǎng)不良癥的一種或多種標(biāo)志物、體征或癥狀或延遲肌營養(yǎng)不良癥進(jìn)展的藥物中的用途。

75、在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包括針對(duì)人cd49d的抑制性寡核苷酸的藥物組合物，其用于治療受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥或延遲受試對(duì)象的肌營養(yǎng)不良癥的進(jìn)展。

76、以上概述并非且不應(yīng)以任何方式視為對(duì)本發(fā)明的所有實(shí)施例的詳盡列舉。

77、在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，許多修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。

78、本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本公開的廣義范圍的情況下，可以對(duì)上述實(shí)施方案行多種變化和/或修改。因此，本實(shí)施方案在所有方面都被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。

79、序列表的關(guān)鍵字

80、seq?id?no：1人α4整合蛋白反義復(fù)合物(atl1102)

81、seq?id?no：2鼠α4整合蛋白反義復(fù)合物(isis348574)