本發(fā)明生物醫(yī)藥，尤其是涉及一種基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、表位肽是一種能被免疫系統(tǒng)識(shí)別并結(jié)合的短肽，通常源自病原體的抗原蛋白質(zhì)。它能結(jié)合人免疫相容性復(fù)合物(mhc)，并被提呈給能t細(xì)胞或b細(xì)胞，進(jìn)而形成抗原特異性的免疫反應(yīng)。通過將表位肽直接制備成疫苗，理論上可以更有效地訓(xùn)練機(jī)體識(shí)別和抵御病原微生物。然而，表位肽疫苗的設(shè)計(jì)面臨多重挑戰(zhàn)。首先，精準(zhǔn)識(shí)別和選擇有效表位至關(guān)重要，但由于病原體的多樣性和表位結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，這一過程異常困難。其次，表位肽的免疫原性較低，往往需要結(jié)合合適的佐劑來增強(qiáng)免疫反應(yīng)，這進(jìn)一步增加了疫苗設(shè)計(jì)的復(fù)雜性。此外，表位肽易被機(jī)體降解，如何提高其穩(wěn)定性也是設(shè)計(jì)中的一個(gè)重要難點(diǎn)。

2、流感病毒是季節(jié)性流感爆發(fā)的主要病原，每年全球約有十億人感染，其中有300萬到500萬發(fā)展為重癥。在流感季節(jié)，存在多種流感變異株共存的情況。截至2023年底，檢測數(shù)據(jù)顯示，79.1％的毒株屬于a型流感病毒，其中72.9％為h1n1亞型，27.1％為h3n2亞型。b型流感病毒中，大多數(shù)屬于維多利亞系譜，占總統(tǒng)計(jì)數(shù)的21.5％。目前主要通過流感疫苗來減少流感病毒的傳播，并降低患者的死亡率。

3、當(dāng)前現(xiàn)有的流感疫苗普遍通過滅活的流感病毒或重組的流感蛋白激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，使其能夠在流感病毒感染后迅速激活并中和、清除病毒。血凝素蛋白(hemagglutinin，ha)是一種能夠使流感病毒黏附在宿主細(xì)胞膜上并誘導(dǎo)融合孔的產(chǎn)生以達(dá)到病毒入胞的表面蛋白之一。因此，通常使用ha蛋白作為疫苗設(shè)計(jì)的主要靶點(diǎn)。國際衛(wèi)生組織每年根據(jù)全球范圍內(nèi)流感的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)布建議的流感疫苗使用毒株。

4、然而，ha蛋白的表位信息在流感流行株中可能存在顯著差異，由此產(chǎn)生的抗原漂移或轉(zhuǎn)變可能會(huì)顯著降低疫苗的免疫效力。雖然在候選株的選擇上，已經(jīng)通過各種技術(shù)提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，但當(dāng)前流感疫苗的有效性仍然存在明顯波動(dòng)，其有效性為20％～60％。此外，老年人接種疫苗后的有效性更低，需要適當(dāng)?shù)淖魟﹣碓鰪?qiáng)其免疫原性。

5、因此，一種成功有效的流感疫苗應(yīng)包括從多種流感變異型中收集的表位信息，這樣宿主免疫系統(tǒng)才能在流感季節(jié)產(chǎn)生廣泛的保護(hù)性免疫?，F(xiàn)有流感疫苗研發(fā)策略為使用納米乳液的方法輸送重組病毒蛋白/多肽，以盡可能多地覆蓋主要表位。由于蛋白/多肽的疫苗免疫原性較低，一般會(huì)將佐劑共同封裝以解決這一問題。然而，好的乳液配方通常需要強(qiáng)大的剪切力和使用表面活性劑作為穩(wěn)定劑，這就需要進(jìn)一步純化以獲得可注射的配方。這一系列步驟大大增加了疫苗合成的時(shí)間和成本。此外，這些方法還存在多肽載量低和釋放快的問題，尤其是針對水溶性表位多肽。

6、因此，設(shè)計(jì)一種能夠更好地應(yīng)對流感病毒的高頻率變異、訓(xùn)練機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫的疫苗具有重要的應(yīng)用價(jià)值。然而，如何有效地將主要病毒亞型的表位多肽信息整合是疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、現(xiàn)有技術(shù)中表位肽疫苗存在著精準(zhǔn)識(shí)別和選擇有效表位異常困難、表位肽的免疫原性較低、表位肽易被機(jī)體降解、穩(wěn)定性較低等問題，基于此，本發(fā)明提供一種基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗及其制備方法與應(yīng)用。

2、在獲得本技術(shù)方案的過程中，本技術(shù)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)一些從sars-cov-2結(jié)構(gòu)蛋白中提取的多肽能與poly(i:c)(一種外源性核酸佐劑，toll樣受體3(toll-like?receptor，tlr3)配體)自組裝成納米晶體，這是一個(gè)由靜電作用和疏水作用驅(qū)動(dòng)的自發(fā)過程。利用機(jī)器學(xué)習(xí)分析表明，這些病毒多肽與宿主抗菌肽(amp)具有相同的理化特征，即帶陽離子和兩親性。復(fù)合物中的poly(i:c)不是隨機(jī)分布的，而是被組織成有周期性微結(jié)構(gòu)的液晶，平均間距約為3.4-3.6納米，這使它們能與tlr3進(jìn)行多價(jià)結(jié)合，從而促進(jìn)tlr3的招募，引起下游炎癥通路的強(qiáng)烈激活。盡管只有小于0.3％的病毒蛋白質(zhì)組被包裹在納米晶體中，但納米晶體處理過的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組與covid-19的基因表達(dá)模式非常吻合。

3、基于以上發(fā)現(xiàn)，本技術(shù)將包含病毒肽的納米晶體設(shè)計(jì)成一種流感疫苗，進(jìn)而可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對主要流感變異株的廣譜性免疫保護(hù)。

4、針對以上現(xiàn)有技術(shù)中表位肽疫苗設(shè)計(jì)的難點(diǎn)，本技術(shù)設(shè)計(jì)了一種可實(shí)現(xiàn)多種表位肽共遞送效果的新型疫苗劑型。本技術(shù)方案可以實(shí)現(xiàn)表位肽和核酸佐劑的共同遞送，本技術(shù)的方案可以一次性提呈多種表位肽，因此可以提高疫苗的有效性和廣譜性。同時(shí)，在具體應(yīng)用上，本技術(shù)選擇使用流感病毒為模型研究了組裝體的結(jié)構(gòu)和免疫刺激效應(yīng)的關(guān)系。

5、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

6、本發(fā)明提供一種基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗，包括病毒的抗原表位肽與核酸佐劑，所述病毒的抗原表位肽與核酸佐劑自組裝形成為具有周期性微結(jié)構(gòu)的納米晶體，其中單一表位肽與核酸佐劑形成的有周期性微結(jié)構(gòu)稱為單多肽納米晶體，由兩種或兩種以上復(fù)合表位肽與核酸佐劑形成的有周期性微結(jié)構(gòu)稱為復(fù)合多肽納米晶體。

7、本發(fā)明的基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗，以多肽作為特異性抗原，用以激活機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)；核酸佐劑用以激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)表位肽的免疫原性。

8、本發(fā)明所述基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗的粒徑在百納米尺度，因此容易被細(xì)胞內(nèi)吞，增加了基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗接觸到細(xì)胞內(nèi)核酸受體的概率，從而更好激活機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)。

9、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗為能夠覆蓋多種流感病毒亞型的流感疫苗，所述病毒的抗原表位肽選擇為多種亞型的流感病毒的ha蛋白中的表位肽。

10、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗為能夠覆蓋多種流感病毒亞型的流感疫苗，包括h1n1、h3n2、ibv亞型中一種或兩種以上的ha蛋白中表位肽與核酸佐劑，所述表位肽與核酸佐劑自組裝形成為納米晶體，其中h1n1、h3n2、ibv亞型的ha蛋白中單一多肽與核酸佐劑形成的納米尺度的晶體為單多肽納米晶體，h1n1、h3n2、ibv亞型的ha蛋白中兩種或兩種以上多肽與核酸佐劑形成的納米尺度的晶體為復(fù)合多肽納米晶體。

11、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述h1n1病毒的ha蛋白的表位肽選自h1a、h1b、h1c中的一種或幾種的組合，多肽h1a的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，多肽h1b的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，多肽h1c的氨基酸序列如seq?idno.3所示。

12、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述h3n2病毒的ha蛋白的表位多肽選自h3a、h3b、h3c中的一種或幾種的組合，多肽h3a的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，多肽h3b的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，多肽h3c的氨基酸序列如seq?id?no.6所示。

13、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述ibv病毒的ha蛋白的表位多肽選自ba、bb或bc中的一種或幾種的組合，多肽ba的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，多肽bb的氨基酸序列如seq?id?no.8所示，多肽bc的氨基酸序列如seq?id?no.9所示。

14、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸佐劑為dsrna。

15、在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的方案中，所述核酸佐劑為poly(i:c)。poly(i:c)為聚肌苷酸胞苷酸，為一種常用于疫苗制備的人工合成的dsrna佐劑。本發(fā)明的實(shí)施例中同樣是以poly(i:c)為例進(jìn)行描述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員在實(shí)施本發(fā)明方案，尤其是在不背離本發(fā)明核心思想下，是可以替換其他核酸佐劑的。

16、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)所述核酸佐劑為poly(i:c)時(shí)，所述多肽和poly(i:c)以電荷比＝2混合。

17、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)病毒的抗原表位肽選擇為兩種或兩種的組合時(shí)，不同病毒的抗原表位肽以等摩爾比進(jìn)行混合。

18、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗為能夠覆蓋多種流感病毒亞型的流感疫苗，選擇以下中的一種：

19、(1)包括h1n1病毒的ha蛋白的表位多肽h1b、h3n2病毒的ha蛋白的表位多肽h3a、與核酸佐劑poly(i:c)，所述多肽h1b、多肽h3a、核酸佐劑poly(i:c)自組裝形成為復(fù)合多肽納米晶體，其中，多肽h1b、多肽h3a等摩爾比混合，復(fù)合多肽的總量和poly(i:c)以電荷比＝2混合；

20、(2)包括h1n1病毒的ha蛋白的表位多肽h1b、h3n2病毒的ha蛋白的表位多肽h3c、與核酸佐劑poly(i:c)，所述多肽h1b、多肽h3c、核酸佐劑poly(i:c)自組裝形成為復(fù)合多肽納米晶體，其中，多肽h1b、多肽h3c等摩爾比混合，復(fù)合多肽的總量和poly(i:c)以電荷比＝2混合；

21、(3)包括h1n1病毒的ha蛋白的表位多肽h1c、ibv病毒的ha蛋白的表位多肽bc、與核酸佐劑poly(i:c)，所述多肽h1c、多肽bc、核酸佐劑poly(i:c)自組裝形成為復(fù)合多肽納米晶體，其中，多肽h1c、多肽bc等摩爾比混合，復(fù)合多肽的總量和poly(i:c)以電荷比＝2混合；

22、(4)包括h1n1病毒的ha蛋白的表位多肽h1a、ibv病毒的ha蛋白的表位多肽ba、病毒的ha蛋白ibv的表位多肽bc與核酸佐劑poly(i:c)，所述多肽h1a、多肽ba、多肽bc、核酸佐劑poly(i:c)自組裝形成為復(fù)合多肽納米晶體，其中，多肽h1a、多肽ba、多肽bc等摩爾比混合，復(fù)合多肽的總量和poly(i:c)以電荷比＝2混合。

23、本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗的制備方法，包括以下步驟：

24、將多肽凍干粉末溶解在溶劑中制備多肽儲(chǔ)備溶液；

25、將核酸佐劑溶解在緩沖液中，制備核酸佐劑溶液；

26、將多肽儲(chǔ)備溶液和核酸佐劑溶液混合，渦旋，即得到基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗，其中多肽的總量和佐劑以電荷比＝2混合，形成ampitope-poly(i:c)復(fù)合物，將多肽儲(chǔ)備溶液和核酸佐劑溶液混合，渦旋，即得到基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗，其中多肽的總量和核酸佐劑以電荷比＝2混合。當(dāng)采用單一多肽時(shí)，單一多肽與核酸佐劑形成具有周期性微結(jié)構(gòu)的單多肽納米晶體，當(dāng)采用兩種或兩種以上復(fù)合多肽時(shí)，復(fù)合多肽與核酸佐劑形成具有周期性微結(jié)構(gòu)的復(fù)合多肽納米晶體；當(dāng)單一多肽或復(fù)合多肽與核酸佐劑不能形成有周期性微結(jié)構(gòu)的納米晶體時(shí)，將這種類型的復(fù)合物稱之為納米復(fù)合物。

27、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述溶劑選自二甲基亞砜(dmso)。

28、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述緩沖液為ph?7.4的10mm?4-羥乙基哌嗪乙磺酸(hepes)緩沖液，該緩沖液中含140mm?nacl。

29、本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗的應(yīng)用，所述基于自組裝原理的多表位肽復(fù)合疫苗在制備藥物中的應(yīng)用。

30、本發(fā)明探索了一種可實(shí)現(xiàn)多種表位肽共遞送的新型疫苗劑型。該方法的核心是病毒表位肽與核酸佐劑(poly(i:c))的自組裝，后者作為天然佐劑以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。本技術(shù)關(guān)注一類特殊的表位肽，即與宿主抗菌肽(amps)具有相同理化特征的多肽，這些多肽帶正電，且具備兩親性，可以與核酸佐劑通過靜電吸引組裝成有周期性微結(jié)構(gòu)的納米晶體。由于有周期性微結(jié)構(gòu)的納米晶體可顯著誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的核酸受體的招募和激活，多種表位肽可被整合至同一納米晶體中，因此該方案同時(shí)提高了多肽的疫苗的免疫原性和廣譜性。

31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

32、1、本技術(shù)提出了一種新的表位肽篩選方法，篩選出來的表位肽具有與抗菌肽類似的理化性質(zhì)，因此具備將例如poly(i:c)等核酸佐劑整合成促炎性(促進(jìn)炎癥因子釋放)納米晶體的能力，一方面實(shí)現(xiàn)了抗原和作為核酸佐劑的poly(i:c)的共遞送，另一方面可增強(qiáng)核酸佐劑poly(i:c)的免疫激活功能。

33、2、本技術(shù)創(chuàng)新性地利用類amp的表位肽控制poly(i:c)在晶體中的距離，使其與tlr3核酸受體的大小類似，可以誘發(fā)tlr3大規(guī)模聚集和有序排列，從而增強(qiáng)了細(xì)胞對poly(i:c)佐劑的響應(yīng)。而本技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同的類amp的表位肽可將poly(i:c)組裝成間距不同的納米晶體，這樣能夠微調(diào)免疫激活的水平以滿足特定的臨床需求。

34、3、本技術(shù)創(chuàng)新性利用類amp的表位肽的“晶體結(jié)構(gòu)相容性”原則，使多個(gè)類amp的表位肽可被組裝至同一個(gè)晶體內(nèi)，該共組裝原理使得那些本身和poly(i:c)結(jié)合效果弱的t細(xì)胞表位肽也能被整合進(jìn)晶體，因此擴(kuò)寬了表位肽遞送的廣譜性。例如，在用h1a、ba和bc三者的復(fù)合多肽與poly(i:c)制成的復(fù)合多肽納米晶體中，只有bc能將poly(i:c)組織成柱狀晶格，其poly(i:c)平均間距為3.67納米，而其余兩種表位肽無法誘導(dǎo)poly(i:c)形成周期性微結(jié)構(gòu)。因此，三元的類amp的表位肽體系的晶體結(jié)構(gòu)與使用bc制成的晶體結(jié)構(gòu)非常相似(平均poly(i:c)間距為3.76納米)，且有序區(qū)域的面積更大。相反，在研究h1b、h3b和bc分別與poly(i:c)制成的納米晶體或納米復(fù)合物中，雖然這三種多肽都能將poly(i:c)組織成柱狀晶體，但晶體結(jié)構(gòu)卻不同。h1b-poly(i:c)納米晶體中poly(i:c)的平均間距為4.4納米。h3b-poly(i:c)納米晶體中poly(i:c)的平均間距為3.9納米。bc-poly(i:c)納米晶體的則為3.67納米。此時(shí)，參與形成復(fù)合多肽納米晶體的多個(gè)表位肽本身與poly(i:c)形成的晶體結(jié)構(gòu)各不相同，則無法協(xié)同誘周期性微結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，在整合poly(i:c)時(shí)，參與的類amp的表位肽之間的晶體結(jié)構(gòu)相容性決定了復(fù)合多肽納米晶體的形成。

35、本發(fā)明為設(shè)計(jì)通用疫苗(例如通用流感疫苗)提供了一種前景廣闊的方法。該方法將病毒ha蛋白的抗原表位肽與外源性核酸佐劑(poly(i:c))共封裝為納米晶體，形成一種新型的疫苗。該疫苗能夠提高病毒抗原的穩(wěn)定性及抗原傳遞效率，改善傳統(tǒng)工藝中因抗原漂移導(dǎo)致的免疫效果降低，能夠同時(shí)激活強(qiáng)烈的天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)(細(xì)胞免疫)，具有更好的廣譜性。該疫苗制備工藝簡單，應(yīng)用可行性強(qiáng)。

36、雖然本發(fā)明以流感疫苗的制備為例進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但是本技術(shù)的方案具有更廣泛的應(yīng)用潛力，包括針對其他傳染病和癌癥的疫苗，為疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)提供了廣度和深度。