本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種治療腰椎間盤突出癥的中藥組合物及其藥劑的制備方法。
背景技術(shù)：
：腰椎間盤突出癥是臨床上常見病、多發(fā)病、而且病程較長(zhǎng)。其中約有10％～20％患者需手術(shù)治療，在美國統(tǒng)計(jì)每年有20萬人行腰椎間盤手術(shù)。國內(nèi)有人通過統(tǒng)計(jì)推斷國內(nèi)每年約有百萬例次椎間盤手術(shù)。1984年guinto對(duì)腰椎間盤突出癥病人的保守治療結(jié)果進(jìn)行隨訪，首次用ct觀察到突出椎間盤的重吸收現(xiàn)象。近年來，國外有關(guān)腰椎間盤突出后未經(jīng)手術(shù)治療而自然吸收的臨床報(bào)告日益增多，其結(jié)果證明了突出椎間盤吸收現(xiàn)象的存在，為臨床上保守治療椎間盤突出癥的有效性和合理性提供了理論依據(jù)。大量研究表明，腰椎間盤突出后重吸收與新生血管、肉芽組織、巨噬細(xì)胞、腫瘤壞死因子、多種炎性細(xì)胞激素均參與對(duì)椎間盤突出組織的吞噬消化，即吸收的過程是一個(gè)對(duì)突出物進(jìn)行免疫溶解的過程。中醫(yī)藥作為一種“自然療法”，在治療腰椎間盤突出癥促進(jìn)其重吸收方面有價(jià)格低廉、毒副作用少、療效顯著的優(yōu)勢(shì)。目前用中醫(yī)藥治療腰椎間盤突出癥在臨床較多見，然而尚未見用中醫(yī)藥治療腰椎間盤突出癥從而促進(jìn)其突出物重吸收的研究。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種治療腰椎間盤突出癥從而促進(jìn)其突出物重吸收的中藥組合物及其藥劑的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案：一種治療腰椎間盤突出癥的中藥組合物，所述中藥組合物包括：生黃芪30-60g、茯苓10-20g、豬苓10-20g、威靈仙15-20g、木瓜12-20g、陳皮6-12g、全當(dāng)歸15-20g、川芎20-30g、燙水蛭9-12g、地龍9-12g、生薏苡仁15-30g、防己15-30g、白芥子6-9g、炒白術(shù)10-20g、川牛膝10-20g。優(yōu)選地，所述中藥組合物包括：生黃芪40-50g、茯苓15-20g、豬苓15-20g、威靈仙15-18g、木瓜15-20g、陳皮10-12g、全當(dāng)歸15-20g、川芎20-30g、燙水蛭10-12g、地龍10-12g、生薏苡仁20-30g、防己20-30g、白芥子6-8g、炒白術(shù)15-20g、川牛膝15-20g。優(yōu)選地，所述中藥組合物包括：生黃芪45g、茯苓18g、豬苓16g、威靈仙16g、木瓜18g、陳皮11g、全當(dāng)歸17g、川芎25g、燙水蛭11g、地龍10g、生薏苡仁26g、防己24g、白芥子7g、炒白術(shù)16g、川牛膝18g。優(yōu)選地，所述中藥組合物制成的藥劑為中藥煎劑。優(yōu)選地，所述中藥組合物制成的藥劑為合劑。本發(fā)明還提供了另外一種技術(shù)方案：一種采用上述中藥組合物制成中藥藥劑的制備方法，包括：s1，按所述中藥組合物各原料的重量比例稱取一個(gè)療程量，將所述一個(gè)療程量的中藥組合物平均分為兩份，一份加水10～20倍量，另一份加水5～9倍量；s2，將加水的兩份中藥組合物分別煎煮至少一次，煎煮后過濾得到濾液，將兩份濾液合并，并將合并后的濾液濃縮，濃縮至濃度范圍相當(dāng)于1～10g/ml生藥的濃縮液；s3，將所述濃縮液加2～6倍量含醇量為60％的乙醇，冷藏靜置20～30h，濾過，至乙醇無醇味后將濾液回收；s4，煮沸所述回收濾液，加苯甲酸鈉2～6克、尼泊金乙脂0.2～0.4克，濾過放冷，加水至400～600ml，趁熱灌裝。優(yōu)選地，所述制備方法包括：s1′，按所述中藥組合物各原料的重量比例稱取一個(gè)療程量，將所述一個(gè)療程量的中藥組合物平均分為兩份，一份加水10倍量，另一份加水8倍量；s2′，將加水的兩份中藥組合物分別煎煮兩次，煎煮后過濾得到濾液，將兩份濾液合并，并將合并后的濾液濃縮，濃縮至濃度范圍相當(dāng)于5g/ml生藥的濃縮液；s3′，將所述濃縮液加3倍量含醇量為60％的乙醇，冷藏靜置24h，濾過，至乙醇無醇味后將濾液回收；s4′，煮沸所述回收濾液，加苯甲酸鈉3克、尼泊金乙脂0.25克，濾過放冷，加水至500ml，趁熱灌裝。優(yōu)選地，步驟s1中，所述一個(gè)療程量為7天。本發(fā)明中藥組合物以益氣利水、逐痰通絡(luò)，消髓化核為治則，由生黃芪、茯苓、豬苓、威靈仙、木瓜、陳皮、全當(dāng)歸、川芎、燙水蛭、地龍、生薏苡仁、防己、白芥子、炒白術(shù)、川牛膝為藥物組成。這一組藥物中：生黃芪補(bǔ)中益氣，使氣旺則血行，消瘀而不傷正，為君藥，當(dāng)重用；茯苓、豬苓利水滲濕力強(qiáng)，茯苓還可健脾寧心，防己祛風(fēng)除濕、利水消腫，當(dāng)歸活血化瘀通絡(luò)，而不傷血，白芥子長(zhǎng)于溫化寒痰，利氣散結(jié)，善驅(qū)皮里膜外之痰，共為臣藥；而川芎為血中之氣藥，助當(dāng)歸活血祛瘀，并有行氣止痛之效，陳皮、生薏苡仁、白術(shù)、木瓜助防己健脾除濕、利水消腫，威靈仙祛風(fēng)濕、軟堅(jiān)散結(jié)消骨鯁，消除突出之髓核，水蛭、地龍助白芥子化痰散結(jié)通絡(luò)，牛膝強(qiáng)腰膝、壯筋骨，均為佐藥。諸藥合用，使外邪得除，水濕得行，痰瘀得消，氣血運(yùn)行通暢，通則不痛，諸癥可愈?，F(xiàn)代藥理研究，君藥黃芪及其復(fù)方可增強(qiáng)突出髓核組織吸引活性的t、b淋巴細(xì)胞的作用，通過提高自身免疫效應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)腰椎間盤突出后的重吸收；防己中有效成分防己堿具有抗炎利尿消水腫作用，可減輕神經(jīng)根水腫，消除因髓核周圍水腫導(dǎo)致的影像學(xué)上突出物增大；當(dāng)歸多糖促進(jìn)紅細(xì)胞生成，刺激新生血管長(zhǎng)入；川芎有效成分川芎嗪，可擴(kuò)張血管，清除氧自由基；白術(shù)健脾燥濕，也具有免疫調(diào)節(jié)和利尿消腫作用；地龍、水蛭有促進(jìn)血小板聚集、抗凝、改善血液循環(huán)的作用。威靈仙具有鎮(zhèn)痛作用，并根據(jù)其散結(jié)消魚骨鯁功效推測(cè)其對(duì)突出的髓核也有一定溶解作用；而木瓜中提取的木瓜凝乳蛋白酶，早已被用來作為髓核溶解劑用于腰椎間盤突出癥的微創(chuàng)治療；白芥子有刺激性，可刺激加快局部血液循環(huán)，改善血供，促進(jìn)新生血管生成。另外，本發(fā)明中藥組合物經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、體外試驗(yàn)以及臨床觀察都證明其可以促進(jìn)突出的椎間盤重吸收，從而達(dá)到治療腰椎間盤突出癥的目的。附圖說明圖1是本發(fā)明中藥制劑制備方法的流程示意圖；圖2是本發(fā)明病例一初診時(shí)磁共振成像示意圖；圖3是本發(fā)明病例一隨訪4月后磁共振成像示意圖；圖4是本發(fā)明病例二初診時(shí)磁共振成像示意圖；圖5是本發(fā)明病例一隨訪8月后磁共振成像示意圖；圖6是本發(fā)明隨訪的95例患者的重吸收比例示意圖；圖7是本發(fā)明隨訪的78例患者的重吸收比例示意圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。實(shí)施例1本發(fā)明實(shí)施例1所揭示的一種治療腰椎間盤突出癥的中藥組合物，它的原料組分及各自的重量為：生黃芪30g、茯苓10g、豬苓10g、威靈仙15g、木瓜12g、陳皮6g、全當(dāng)歸15g、川芎20g、燙水蛭9g、地龍9g、生薏苡仁15g、防己15g、白芥子6g、炒白術(shù)10g、川牛膝10g。上述中藥組合物可制成中藥煎劑，也可制成合劑。如圖1所示，將上述實(shí)施例1的中藥組合物制成中藥藥劑的制備方法，包括：步驟s1，將上述實(shí)施例1中的原料稱取一個(gè)療程量，將該一個(gè)療程量的中藥組合物平均分為兩份，一份加水10倍量，另一份加水5倍量；步驟s2，將加水的兩份中藥組合物分別煎煮一次，煎煮后過濾得到濾液，將兩份濾液合并，并將合并后的濾液濃縮，濃縮至濃度范圍相當(dāng)于1g/ml生藥的濃縮液；步驟s3，將濃縮液加2倍量含醇量為60％的乙醇，冷藏靜置20h，濾過，至乙醇無醇味后將濾液回收；步驟s4，煮沸回收濾液，加苯甲酸鈉2克、尼泊金乙脂0.2克，濾過放冷，加水至400ml，趁熱灌裝。實(shí)施例2本發(fā)明實(shí)施例2所揭示的一種治療腰椎間盤突出癥的中藥組合物，它的原料組分及各自的重量為：生黃芪60g、茯苓20g、豬苓20g、威靈仙20g、木瓜20g、陳皮12g、全當(dāng)歸20g、川芎30g、燙水蛭12g、地龍12g、生薏苡仁30g、防己30g、白芥子9g、炒白術(shù)20g、川牛膝20g。上述中藥組合物可制成中藥煎劑，也可制成合劑。如圖1所示，將上述實(shí)施例2的中藥組合物制成合劑的制備方法，包括：步驟s1，將上述實(shí)施例2中的原料稱取一個(gè)療程量，將該一個(gè)療程量的中藥組合物平均分為兩份，一份加水20倍量，另一份加水9倍量；步驟s2，將加水的兩份中藥組合物分別煎煮兩次，煎煮后過濾得到濾液，將兩份濾液合并，并將合并后的濾液濃縮，濃縮至濃度范圍相當(dāng)于10g/ml生藥的濃縮液；步驟s3，將濃縮液加6倍量含醇量為60％的乙醇，冷藏靜置30h，濾過，至乙醇無醇味后將濾液回收；步驟s4，煮沸回收濾液，加苯甲酸鈉6克、尼泊金乙脂0.4克，濾過放冷，加水至600ml，趁熱灌裝。實(shí)施例3本發(fā)明實(shí)施例3所揭示的一種治療腰椎間盤突出癥的中藥組合物，它的原料組分及各自的重量為：生黃芪40g、茯苓15g、豬苓15g、威靈仙15g、木瓜15g、陳皮10g、全當(dāng)歸15g、川芎20g、燙水蛭10g、地龍10g、生薏苡仁20g、防己20g、白芥子6g、炒白術(shù)15g、川牛膝15g。上述中藥組合物可制成中藥煎劑，也可制成合劑。如圖1所示，將上述實(shí)施例3的中藥組合物制成合劑的制備方法，包括：步驟s1，將上述實(shí)施例3中的原料稱取一個(gè)療程量，將該一個(gè)療程量的中藥組合物平均分為兩份，一份加水10倍量，另一份加水5倍量；步驟s2，將加水的兩份中藥組合物分別煎煮一次，煎煮后過濾得到濾液，將兩份濾液合并，并將合并后的濾液濃縮，濃縮至濃度范圍相當(dāng)于1g/ml生藥的濃縮液；步驟s3，將濃縮液加2倍量含醇量為60％的乙醇，冷藏靜置20h，濾過，至乙醇無醇味后將濾液回收；步驟s4，煮沸回收濾液，加苯甲酸鈉2克、尼泊金乙脂0.2克，濾過放冷，加水至400ml，趁熱灌裝。實(shí)施例4本發(fā)明實(shí)施例4所揭示的一種治療腰椎間盤突出癥的中藥組合物，它的原料組分及各自的重量為：生黃芪50g、茯苓20g、豬苓20g、威靈仙18g、木瓜20g、陳皮12g、全當(dāng)歸20g、川芎30g、燙水蛭12g、地龍12g、生薏苡仁30g、防己30g、白芥子8g、炒白術(shù)20g、川牛膝20g。上述中藥組合物可制成中藥煎劑，也可制成合劑。如圖1所示，將上述實(shí)施例4的中藥組合物制成合劑的制備方法，包括：步驟s1，將上述實(shí)施例4中的原料稱取一個(gè)療程量，將該一個(gè)療程量的中藥組合物平均分為兩份，一份加水20倍量，另一份加水9倍量；步驟s2，將加水的兩份中藥組合物分別煎煮兩次，煎煮后過濾得到濾液，將兩份濾液合并，并將合并后的濾液濃縮，濃縮至濃度范圍相當(dāng)于10g/ml生藥的濃縮液；步驟s3，將濃縮液加6倍量含醇量為60％的乙醇，冷藏靜置30h，濾過，至乙醇無醇味后將濾液回收；步驟s4，煮沸回收濾液，加苯甲酸鈉6克、尼泊金乙脂0.4克，濾過放冷，加水至600ml，趁熱灌裝。實(shí)施例5本發(fā)明實(shí)施例5所揭示的一種治療腰椎間盤突出癥的中藥組合物，它的原料組分及各自的重量為：生黃芪45g、茯苓18g、豬苓16g、威靈仙16g、木瓜18g、陳皮11g、全當(dāng)歸17g、川芎25g、燙水蛭11g、地龍10g、生薏苡仁26g、防己24g、白芥子7g、炒白術(shù)16g、川牛膝18g。上述中藥組合物可制成中藥煎劑，也可制成合劑。如圖1所示，將上述實(shí)施例5的中藥組合物制成合劑的制備方法，包括：步驟s1，將上述實(shí)施例5中的原料稱取一個(gè)療程量，將該一個(gè)療程量的中藥組合物平均分為兩份，一份加水10倍量，另一份加水8倍量；步驟s2，將加水的兩份中藥組合物分別煎煮兩次，煎煮后過濾得到濾液，將兩份濾液合并，并將合并后的濾液濃縮，濃縮至濃度范圍相當(dāng)于5g/ml生藥的濃縮液；步驟s3，將上述濃縮液加3倍量含醇量為60％的乙醇，冷藏靜置24h，濾過，至乙醇無醇味后將濾液回收；步驟s4，煮沸上述回收濾液，加苯甲酸鈉3克、尼泊金乙脂0.25克，濾過放冷，加水至500ml，趁熱灌裝。實(shí)施例6本發(fā)明實(shí)施例5所揭示的一種治療腰椎間盤突出癥的中藥組合物，它的原料組分及各自的重量為：生黃芪42g、茯苓16g、豬苓18g、威靈仙17g、木瓜16g、陳皮11g、全當(dāng)歸16g、川芎26g、燙水蛭11g、地龍11g、生薏苡仁28g、防己26g、白芥子7g、炒白術(shù)18g、川牛膝16g。上述中藥組合物可制成中藥煎劑，也可制成合劑。如圖1所示，將上述實(shí)施例6的中藥組合物制成合劑的制備方法，包括：步驟s1，將上述實(shí)施例6中的原料稱取一個(gè)療程量，將該一個(gè)療程量的中藥組合物平均分為兩份，一份加水15倍量，另一份加水6倍量；步驟s2，將加水的兩份中藥組合物分別煎煮兩次，煎煮后過濾得到濾液，將兩份濾液合并，并將合并后的濾液濃縮，濃縮至濃度范圍相當(dāng)于8g/ml生藥的濃縮液；步驟s3，將上述濃縮液加4倍量含醇量為60％的乙醇，冷藏靜置26h，濾過，至乙醇無醇味后將濾液回收；步驟s4，煮沸上述回收濾液，加苯甲酸鈉4克、尼泊金乙脂0.3克，濾過放冷，加水至450ml，趁熱灌裝。在上述實(shí)施例1～6的步驟s1中，一個(gè)療程量一般為7天，當(dāng)然也可實(shí)際情況確定一個(gè)療程的具體周期時(shí)長(zhǎng)。另外，本發(fā)明上述實(shí)施例所用：生黃芪產(chǎn)地為內(nèi)蒙古，為豆科多年生草本植物蒙古黃芪astragalusmembranaceus(fisch.)bge.var.mongholicus(bge.)hsiao的根。防己產(chǎn)地為浙江，為防己科多年生木質(zhì)藤本植物粉防己stephaniatetrandras.moore的根。當(dāng)歸產(chǎn)地為甘肅，為傘形科植物當(dāng)歸angelicasinensis(oliv.)diels的干燥根。川芎產(chǎn)地為四川，為傘形科多年生草本植物川芎ligusticumchuanxionghort.的根莖。木瓜產(chǎn)地為云南，為薔薇科落葉灌木貼梗海棠chaenomeleslagenaria(loisel.)koidz.和木瓜(榠楂)c.sinensis(thouin)koehne的成熟果實(shí)。地龍產(chǎn)地為廣東，為環(huán)節(jié)動(dòng)物門鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓pheretimaaspergilum(eperrier)、通俗環(huán)毛蚓pvulgarischen、威廉環(huán)毛蚓pguillelmi(michaelsen)或櫛肓毛蚓ppectiniferamichaelsen的干燥體。白術(shù)產(chǎn)地為浙江，為菊科植物白術(shù)atractylodesmacrocephalakoidz.的干燥根莖。威靈仙產(chǎn)地為江蘇，為雙子葉植物毛茛科ranunculaceae威靈仙clematischinensisosbeck、棉團(tuán)鐵線蓮(山蓼)c.hexapetalapall.的干燥根及根莖。白芥子產(chǎn)地為安徽，為十字花科植物白芥sinapisalba(l.)boiss.或芥b.juncea(l.)czern.etcoss.的成熟種子。水蛭產(chǎn)地為江蘇，為水蛭科動(dòng)物螞蝗whitmaniapigrawhitman、水蛭hirudonipponicawhitman或柳葉螞蝗whitmaniaacranulatawhitman的干燥全體。茯苓產(chǎn)地為大別山金寨，是擬層孔菌科真菌茯苓wolfiporiacocos的干燥菌核。豬苓產(chǎn)地為甘肅，為非褶菌目多孔菌科真菌豬苓polyporusumbellatus(pers.)fries的干燥菌核。陳皮產(chǎn)地為湖北，為蕓香科植物橘citrusreticulatablanco及其栽培變種的成熟果皮。生薏苡仁產(chǎn)地為福建，為仁禾本科植物薏苡的種仁。川牛膝產(chǎn)地為四川，為莧科植物川牛膝cyathulaofficinaliskuan的干燥根。下面通過試驗(yàn)例進(jìn)一步說明本發(fā)明所述中藥組合物的有益效果，這些試驗(yàn)使用本發(fā)明上述實(shí)施例制備的合劑進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)：一、基礎(chǔ)研究1、實(shí)驗(yàn)儀器：501a型超級(jí)數(shù)顯恒溫水浴鍋，bb5060co2培養(yǎng)箱，ddb全自動(dòng)電子蠕動(dòng)泵，dhg-907ah電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，dk-8d電熱恒溫水槽，fa2004n電子分析天平，fr-200a全自動(dòng)紫外可見分析裝置，ka-1000低速臺(tái)式離心機(jī)，kq2200超聲波清洗器，ld對(duì)照組x-40立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，mk3酶標(biāo)儀，mv--1垂直板電泳槽，pcr基因擴(kuò)增儀，sbe6300電泳儀，synergy2多功能酶標(biāo)儀，tl-18m臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，s-1脫色搖床，u410超低溫冰箱，xsp-17c倒置生物顯微鏡，可調(diào)式移液器，超純水儀，細(xì)胞培養(yǎng)板、皿，pcr基因擴(kuò)增儀，紫外分光光度儀。2、實(shí)驗(yàn)試劑：總rna提取試劑盒(dp419)、氯仿、異丙醇、75％乙醇預(yù)冷乙醇、去離子水(高溫滅活)、depc處理水、dntp、隨機(jī)引物、m-mlv(200u/μl)、rnasin(40u/μl)、taqdna聚合酶(5u/μl)；dnamarker(100bp)；引物設(shè)計(jì)采用primerpremier3軟件合成，參照物選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gapdh)。其中，il-2：(擴(kuò)增長(zhǎng)度350bp)上游引物：5′-gcgcacccacttcaagccct-3′；下游引物：5′-ccaccacagttgctggctca-3′。tnf-α：(擴(kuò)增長(zhǎng)度363bp)上游引物：5′-tgagcactgaaagcatgatc-3′；下游引物：5′ttatctctcagctccacgcc-3′。vegf：(擴(kuò)增長(zhǎng)度127bp)上游引物：5′-tggaccctggctttactgctg-3′；下游引物：5′-gcaatagctgcgctggtaga-3′。col2α1：(擴(kuò)增長(zhǎng)度112bp)上游引物：5′-tcctaagggtgccaatggtga-3′；下游引物：5′-aggaccaactttgccttgagac-3′。mmp3：(擴(kuò)增長(zhǎng)度369bp)上游引物：5′-ctcttccatccaacatggatagctg-3′；下游引物：5′-actccaactgtgaagatccgctga-3′。mmp13：(擴(kuò)增長(zhǎng)度142bp)上游引物：5′-ccctggagccctgatgttt-3′。beta-actin(gapdh)：(擴(kuò)增長(zhǎng)度150bp)上游引物：5′-ggagattactgccctggctccta-3′；下游引物：5′-gactcatcgtactcctgcttgctg-3′。3、實(shí)驗(yàn)材料：(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇三月齡spf級(jí)sd雄性大鼠126只，體重在300g左右，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：清潔級(jí)。(2)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：因腰椎間盤突出癥住院患者行常規(guī)手術(shù)治療摘除的椎間盤組織(包括髓核與纖維環(huán))30例，其中，破裂型突15例，非破裂型15例(標(biāo)本獲取征得患者及家屬、醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意)。4、實(shí)驗(yàn)用藥：采用上述實(shí)施例1～6任意一個(gè)制備獲得的中藥組合物合劑，優(yōu)選采用實(shí)施例5制備獲得的中藥組合物合劑。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)成人用藥劑量進(jìn)行換算，大鼠灌胃治療，濃度1g/ml，2.4ml/次，每日給藥一次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模后第二日開始給藥，分別于給藥后第10天、20天、30天后將大鼠處死并取出埋植的椎間盤組織檢測(cè)。術(shù)中取出標(biāo)本后浸于含體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，置入冰盒迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，3h內(nèi)剪碎進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，建立腰椎間盤突出后重吸收細(xì)胞模型。sd大鼠8只，簡(jiǎn)單隨機(jī)分為兩組，每組4只，分別制備空白血清和中藥組合物合劑含藥血清，按體表面積折算動(dòng)物的等效劑量，配成溶液，給藥組按2ml/kg每天灌胃，對(duì)照組以生理鹽水2ml/kg每天灌胃。末次灌胃的1h后頸總動(dòng)脈采血，抽取血清，56℃水浴滅活，抽濾除菌，分裝，20℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)例1.大鼠椎間盤突出重吸收過程中il-2、tnf-α、vegf、col2αl、mmp3、mmp13mrna表達(dá)實(shí)驗(yàn)分組及造模1.椎間盤的獲?。捍笫蠼?jīng)鹽酸氯胺酮(0.10g/kg)腹腔注射麻醉成功后，剃去背部體毛。橡皮筋扎住尾部，常規(guī)消毒，無菌條件下每只大鼠切取第3、4尾椎椎間盤兩個(gè)(包含上下軟骨終板)。其中模型組i(椎間盤不刺破組)的椎間盤不刺破保持其完整性，模型組ii(椎間盤刺破組)、tnf-α抑制劑組、硫唑嘌呤組、中藥組合物合劑的椎間盤用10ml注射器針頭刺破所取椎間盤正中纖維環(huán)暴露髓核；用電子天平(萬分之一單位)稱其重量并記錄，將椎間盤放入有孔的200μlep管中。假手術(shù)組將空的ep管植入背部肌肉中。椎間盤的埋植：碘伏常規(guī)消毒背部，后正中線切開皮膚、肌肉、將裝有椎間盤的ep管；植入肌肉層，隨后逐層縫合，傷口處涂以紅霉素眼膏。造模成功后將大鼠放入籠中常規(guī)飼養(yǎng)。2.大鼠椎間盤細(xì)胞總rna的抽提采用上述總rna提取試劑盒(dp419)進(jìn)行：(1)取出保存于液氮中的大鼠尾椎間盤組織，冰上剪碎；(2)將剪碎的組織樣品移入勻漿管，立即加入1ml裂解液rz；(3)用勻漿器快速勻漿1min左右，把勻漿液轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無rnase的離心管中，室溫靜置5分鐘；(4)加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min；(5)4℃15000rpm離心10min；(6)去上清液0.5ml加入0.5ml異丙醇混勻，室溫放置10min(7)加入吸附柱cr3中，4℃15000rpm離心30s，棄掉管中的廢液；(8)向吸附柱cr3中加入500μl去蛋白液rd，4℃15000rpm離心30s，棄廢液；(9)向吸附柱cr3中加入700μl漂洗液rw，室溫靜置2min，4℃15000rpm離心30s，棄廢液；(10)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，4℃15000rpm離心30s，棄廢液；(11)將吸附柱放入2ml收集管中，4℃15000rpm離心2min，去除殘余液體；(12)將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中，加入25μldepc處理水溶解，便是抽出的rna，-70℃保存。3.rna的鑒定采用上述紫外分光光度儀進(jìn)行鑒定：取樣本5μl加入石英比色杯內(nèi)，加入雙蒸水0.8ml，充分混勻，與雙蒸水對(duì)照。在紫外分光光度計(jì)上讀取260、280nm波長(zhǎng)連個(gè)od值，記錄。計(jì)算：od260為1時(shí)，為40μgrna，所以計(jì)算如下：樣本rna含量(μg/μl)＝od260×160×40/1000當(dāng)od260/op280＜1.8時(shí)，提示有蛋白或酚的污染，需要進(jìn)一步純化rna。當(dāng)od260/op280＞1.8時(shí)，表明純度合格。逆轉(zhuǎn)錄rna→cdna(1)標(biāo)記試管，依次加入：(2)25℃10min，42℃1h，75℃10min逆轉(zhuǎn)錄為cdna轉(zhuǎn)錄為cdna。4.實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)反應(yīng)體系采用toyoborealtimepcrmastermix(sybrgreen)(qpk-201)，總反應(yīng)體積為25μl。(1)實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系熱循環(huán)參數(shù)：vegf，actin基因的退火溫度為62℃，mmp13為64℃，col10α1為56℃，其余均為60℃。樣品經(jīng)95℃變性5分鐘，先進(jìn)行3個(gè)循環(huán)，接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，在每個(gè)循環(huán)的檢測(cè)熒光強(qiáng)度。所有擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，進(jìn)行80個(gè)循環(huán)的熔解曲線檢測(cè)以確定pcr產(chǎn)物的特異性。實(shí)時(shí)熒光定量pcr結(jié)果分析：目的基因的相對(duì)表達(dá)量可以采用δδct法(指不同組別間ct值的差值)分析，以正常組作為對(duì)照樣本。δδct＝觀察樣本δct-對(duì)照樣本δct＝(觀察樣本的目的基因ct-觀察樣本內(nèi)參ct)-(對(duì)照樣本的目的基因ct-對(duì)照樣本內(nèi)參ct)。樣本的相對(duì)表達(dá)量＝2-δδct。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：各組中il-2、tnf-α、vegf、col2α1、mmp3、mmp13mrna的相對(duì)表達(dá)量如下：10天各組中il-2、tnf-α、vegf、col2α1、mmp3、mmp13mrna的相對(duì)表達(dá)量，如下表一：表一注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治?，中藥組合物合劑組與模型i比較p＜0.05；模型組ii與模型i組比較p＜0.05。20天各組中il-2、tnf-α、vegf、col2α1、mmp3、mmp13mrna的相對(duì)表達(dá)量，見下表二：表二注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治?，中藥組合物合劑與模型i比較p＜0.05；模型組ii與模型i組比較p＜0.05；中藥組合物合劑與益賽普組比較p＜0.05；中藥組合物合劑與硫唑嘌呤組比較p＜0.05；模型組ii與益賽普組比較p＜0.05。30天各組中il-2、tnf-α、vegf、col2α1、mmp3、mmp13mrna的相對(duì)表達(dá)量，見下表三：表三注：?jiǎn)我蛩胤讲罘治?，中藥組合物合劑與模型i比較p＜0.05；模型組ii與模型i組比較p＜0.05；中藥組合物合劑與益賽普組比較p＜0.05；中藥組合物合劑與硫唑嘌呤組比較p＜0.05；模型組ii與益賽普組比較p＜0.05；模型組ii與硫唑嘌呤組比較p＜0.05。本研究發(fā)現(xiàn)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的各組椎間盤髓核中均檢測(cè)到il-2、tnf-α、vegf、col2α1、mmp3、mmp13mrna表達(dá)，隨著時(shí)間的推移，表達(dá)量逐漸增多。其中，中藥組合物合劑組待測(cè)基因mrna表達(dá)量最多。中藥組合物合劑可明顯增加待測(cè)基因mrna表達(dá)，從而促進(jìn)突出椎間盤的重吸收。試驗(yàn)例2.中藥組合物合劑對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞mmp-3、mmp-7、mmp-13影響實(shí)驗(yàn)分組及造模1.原代培養(yǎng)在無菌超凈工作臺(tái)中，將取下的組織用pbs液沖洗3次至椎間盤組織塊中的血污全部洗凈，分清纖維環(huán)與髓核，組織塊剪碎至約為0.5mm×0.5mm×0.5mm，置于直徑為10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿底，保持碎塊間距約為1mm，加入體積分?jǐn)?shù)為20％fbs的dmem培養(yǎng)基1.5ml，置于體積分?jǐn)?shù)為5％co2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h，3h后再加入體積分?jǐn)?shù)為20％fbs的dmem培養(yǎng)基1.5ml，盡量避免組織塊漂浮，再加入含青霉素100u/ml，鏈霉素100mg/l。前三次換液每三天更換一次，待細(xì)胞長(zhǎng)出后每?jī)商鞊Q液一次。2.傳代培養(yǎng)原代細(xì)胞約90％鋪滿瓶底時(shí)，吸去培養(yǎng)液，pbs液輕輕沖洗3遍，加入2ml左右0.25％胰蛋白酶和0.01％edta混合液，輕搖培養(yǎng)皿，使消化液覆蓋住所有的細(xì)胞表面，2～4min后于鏡下見胞質(zhì)回縮、細(xì)胞變圓、多數(shù)細(xì)胞懸浮后，加入少許10％fbs培養(yǎng)液終止消化；毛細(xì)吸管輕輕吹打皿壁細(xì)胞使之脫落，轉(zhuǎn)移到15cm的離心管中，放入離心機(jī)，1000r/min，離心5min，去除上清液；再加入體積分?jǐn)?shù)為20％fbs的dmem培養(yǎng)基，將細(xì)胞混懸液均勻分別滴入3個(gè)六孔板細(xì)胞培養(yǎng)皿中的玻片上，每個(gè)玻片上盛有約1ml的細(xì)胞混懸液，輕輕置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中按原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，4小時(shí)后置于倒置顯微鏡觀察可見大部分細(xì)胞已貼壁，再次加入培養(yǎng)基約1.5ml，每?jī)商鞊Q液一次。3.人巨噬細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)蘇：(1)實(shí)驗(yàn)前在超凈工作臺(tái)進(jìn)行酒精擦洗準(zhǔn)備，并且把水浴鍋溫度調(diào)至37℃。(2)從液氮中用加厚手套拿出凍存的目標(biāo)細(xì)胞株，在37℃溫度下的水浴鍋中不斷振搖，使之盡快融化。(3)將融化的凍存管用75％酒精擦洗消毒后迅速移至超凈工作臺(tái)，無菌條件下用移液槍吸取細(xì)胞懸液，移入已滅菌的離心管中，加入5ml的相應(yīng)培養(yǎng)液，輕輕吹勻。(4)細(xì)胞懸液1000rpm離心8min，棄去上清液。(5)細(xì)胞用相應(yīng)培養(yǎng)液稀釋成105cells/ml的細(xì)胞懸液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。(6)將細(xì)胞瓶放于co2培養(yǎng)箱中，5％co2條件下37℃培養(yǎng)。第二天換新的培養(yǎng)液，然后按照常規(guī)方式培養(yǎng)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)：將人巨噬細(xì)胞株復(fù)蘇后接種于10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入8ml體積分?jǐn)?shù)為10％fbs的1640培養(yǎng)基，置于體積分?jǐn)?shù)為5％co2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。巨噬細(xì)胞為半貼壁細(xì)胞，換液時(shí)輕輕吸取上層變黃的2/3培養(yǎng)液，再加入等量的新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞數(shù)量長(zhǎng)至10x106時(shí)，毛細(xì)吸管輕輕吹起皿壁細(xì)胞，使之懸浮，轉(zhuǎn)移到15cm的離心管中，放入離心機(jī)，600r/min，離心5min，去除上清液；加入體積分?jǐn)?shù)為10％fbs的1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞混懸液均勻分別滴入3個(gè)10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，再加入適量培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中按原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞的凍存：(1)細(xì)胞凍存前24-48h將細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，保證細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。(2)配制凍存液：rpmi1640∶血清∶dmso＝7∶2∶1(體積比)的混合液。(3)毛細(xì)吸管輕輕吹起皿壁細(xì)胞，使之懸浮，轉(zhuǎn)移到15cm的離心管中，放入離心機(jī)，600r/min，離心5min，去除上清液。(4)用配置好的細(xì)胞凍存液溶解沉淀并混勻，然后轉(zhuǎn)移至凍存管中。(5)為降低細(xì)胞凍存過程中細(xì)胞染菌，凍存管要用封口膜封口，同時(shí)用記號(hào)筆做好標(biāo)記，凍存。4℃存放15min，-20℃存放40min，細(xì)胞懸液結(jié)凍后，-80℃存放一天，最后凍存在液氮中。實(shí)驗(yàn)分組：(1)空白對(duì)照組：?jiǎn)为?dú)椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)(1)ns對(duì)照組：?jiǎn)为?dú)椎間盤細(xì)胞培養(yǎng)(3)低劑量組：細(xì)胞加入5％中藥組合物合劑含藥血清(4)中劑量組：細(xì)胞加入5％中藥組合物合劑含藥血清(5)高劑量組：細(xì)胞加入5％中藥組合物合劑含藥血清(6)觀察時(shí)間分為12h，24h，48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：各組椎間盤細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的mmp-3蛋白表達(dá)group12h24h48h空白對(duì)照0.488±0.091*△▲★□0.467±0.055*△▲★□0.575±0.043*△▲★□ns對(duì)照0.457±0.025*△▲★口0.602±0.046△▲★□0.713±0.062△▲★口低劑量組0.607±0.041△▲★口1.275±0.025▲口0.904±0.018△▲★□中劑量組0.898±0.053△▲★□2.367±0.0312.175±0.057▲□高劑量組0.987±0.060△▲★口3.612±0.0463.723±0.052△★表四注：*p＜0.05，vs24h低劑量組；△p＜0.05，vs24h中劑量組；▲p＜0.05，vs24h高劑量組；★p＜0.05，vs48h中劑量組；□p＜0.05，vs48h高劑量組。各組椎間盤細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的mmp-7蛋白表達(dá)group12h24h48h空白對(duì)照0.288±0.001*△▲★□0.267±0.081*△▲★□0.275±0.036*△▲★□ns對(duì)照0.287±0.048*△▲★□0.312±0.006*△▲★口0.303±0.009*△▲★□低劑量組0.527±0.021*△▲★口0.875±0.014▲口0.904±0.018▲★□中劑量組0.808±0.083▲★口1.367±0.073口1.715±0.071高劑量組1.987±0.0372.112±0.0062.623±0.029△表五注：*p＜0.05，vs12h高劑量組；△p＜0.05，vs24h中劑量組；▲p＜0.05，vs24h高劑量組；★p＜0.05，vs48h中劑量組；□p＜0.05，vs48h高劑量組。各組椎間盤細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的mmp-13蛋白表達(dá)group12h24h48h空白對(duì)照0.388±0.010*δ0.363±0.018*△0.357±0.006*δns對(duì)照0.417±0.055*δ0.312±0.016*δ0.348±0.019*δ低劑量組0.527±0.061*△0.675±0.0740.704±0.064中劑量組0.788±0.0360.967±0.0590.975±0.011高劑量組0.987±0.0801.612±0.0561.823±0.024表六注：*p＜0.05，vs24h高劑量組；δp＜0.05，vs48h高劑量組。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的中藥組合物合劑能促進(jìn)巨噬細(xì)胞作用于椎間盤細(xì)胞，使椎間盤基質(zhì)蛋白酶家族mmps高表達(dá)，加速椎間盤基質(zhì)降解，從而促進(jìn)重吸收，進(jìn)一步從分子細(xì)胞學(xué)角度驗(yàn)證了此方的功效，為研究該方促進(jìn)重吸收的機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。二、典型病例舉例經(jīng)大量臨床隨訪觀察研究證實(shí)此方在改善患者癥狀方面的有效性，并有利于椎間盤突出后發(fā)生重吸收。病例一：患者男性，初診48歲，于無明顯誘因下出現(xiàn)腰痛牽及右下肢20余天，直腿抬高試驗(yàn)右側(cè)30°(+)，joa評(píng)分4分，患者拒絕手術(shù)，故予以益氣活血方中藥綜合治療，隨訪4月前后mri對(duì)比發(fā)現(xiàn)突出物基本消失，且患者臨床癥狀完全緩解，joa評(píng)分升高至29分，隨訪至今患者病情未復(fù)發(fā)，生活質(zhì)量明顯提高。如圖2a和圖2b所示，初診時(shí)mri(磁共振成像，英文全稱magneticresonanceimaging)可見椎間盤巨大突出；如圖3a和圖3b所示，隨訪4月后，mri顯示突出物基本消失。病例二：何某某，女，42歲，個(gè)體售貨員，因腰椎間盤突出癥入住我院骨傷科，入院時(shí)joa評(píng)分6分，入院mri如圖4a和圖4b所示，突出率100％，住院期間予益氣活血中藥組方同時(shí)配合地塞米松甘露醇脫水治療，癥狀好轉(zhuǎn)后出院休養(yǎng)，臥床8周后癥狀逐漸好轉(zhuǎn)消失，8月后至我院復(fù)查，joa評(píng)分28分，其復(fù)查mri如圖5a和圖5b所示，突出率為10％，治療前后突出物吸收率90％。影像學(xué)前后時(shí)間間隔為8個(gè)月。如圖4a和圖4b所示，初診時(shí)mri可見椎間盤巨大突出伴有上掛；如圖5a和圖5b所示，8月后，mri顯示突出物完全消失。三、病例隨訪結(jié)果報(bào)道本團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期以來對(duì)于益氣活血中藥組方治療腰椎間盤突出癥的臨床療效進(jìn)行了大量隨訪觀察。本團(tuán)隊(duì)最初隨訪了30例腰椎間盤突出患者，保守治療后發(fā)現(xiàn)有21例(70％)發(fā)生縮小，其中5例出現(xiàn)明顯縮小。隨后又隨訪了95例腰椎間盤突出患者，分別以中藥益氣活血方和西藥治療，平均隨訪6個(gè)月，中藥組joa評(píng)分8改善率和mri突出物吸收率明顯優(yōu)于西藥組。其中10例出現(xiàn)了重吸收率＞50％。由于破裂型突出更易于發(fā)生重吸收，因此為了研究中藥組方促進(jìn)破裂型突出后重吸收的療效，又隨訪78例破裂型腰椎間盤突出患者，通過中藥組方干預(yù)，隨訪發(fā)現(xiàn)椎間盤突出后出現(xiàn)重吸收的比例達(dá)81％。另外對(duì)于青少年腰椎間盤突出患者，中藥組方對(duì)于改善臨床癥狀，尤其是促進(jìn)突出物縮小方面也有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)?？梢姳局兴幗M方在改善腰椎間盤突出患者臨床癥狀、特別是促進(jìn)破裂型突出發(fā)生重吸收方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和良好療效。其中，隨訪的95例腰椎間盤突出患者中，如圖6所示，益氣活血中藥組方治療發(fā)生重吸收比例達(dá)29％。隨訪78例破裂型腰椎間盤突出患者，如圖7所示，益氣活血中藥組方治療后椎間盤發(fā)生重吸收比例達(dá)81％。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容及技術(shù)特征已揭示如上，然而熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員仍可能基于本發(fā)明的教示及揭示而作種種不背離本發(fā)明精神的替換及修飾，因此，本發(fā)明保護(hù)范圍應(yīng)不限于實(shí)施例所揭示的內(nèi)容，而應(yīng)包括各種不背離本發(fā)明的替換及修飾，并為本專利申請(qǐng)權(quán)利要求所涵蓋。當(dāng)前第1頁12