本發(fā)明涉及抗骨關(guān)節(jié)炎藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含三肽化合物的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物。

背景技術(shù)：

骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)軟骨緩慢進(jìn)展的退行性病變，由關(guān)節(jié)軟骨退化損傷、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨反應(yīng)性增生綜合形成，其造成的疼痛和運(yùn)動(dòng)障礙是50歲以上人群喪失勞動(dòng)能力的主要原因，因而被世界衛(wèi)生組織稱為“致殘率最高的頭號(hào)疾病”。

骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率隨著年齡增加顯著升高。在荷蘭40歲人群中骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率為10-20％，60-70歲人群中發(fā)病率則高達(dá)55％，女性發(fā)病率(75％)高于男性。據(jù)美國國家健康訪談普查(nhis)估計(jì)，美國關(guān)節(jié)炎患者到2030年將增至6.7億1。我國人口老齡化嚴(yán)重，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率隨之攀升。據(jù)中國國家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)，2015年我國60周歲以上老齡人口為2.1億，占總?cè)丝诘?5.5％。中國疾病預(yù)防控制中心報(bào)道，截至2011年，我國60歲以上人群骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率達(dá)55％，全國約有1.2億人存在不同程度的骨關(guān)節(jié)問題，骨關(guān)節(jié)炎對我國國民健康危害極大。

然而，骨關(guān)節(jié)炎的根治仍是世界性難題，臨床上仍缺乏能有效治愈骨關(guān)節(jié)炎的藥物。目前，對于骨關(guān)節(jié)炎的治療主要是解除疼痛癥狀(如使用消炎鎮(zhèn)痛藥)、維持或改善關(guān)節(jié)功能(如使用氨基葡萄糖類藥物)，對晚期患者，在全身情況能耐受的條件下則進(jìn)行人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。硫酸氨基葡萄糖是軟骨基質(zhì)聚多糖和關(guān)節(jié)液聚氨基葡萄糖的必須構(gòu)成成分，可以刺激軟骨細(xì)胞合成聚氨基葡萄糖和蛋白聚糖、刺激滑膜細(xì)胞合成透明質(zhì)酸，起到保護(hù)和改善關(guān)節(jié)損傷作用，因而被用于預(yù)防和治療各種類型的骨關(guān)節(jié)炎。但硫酸氨基葡萄糖有胃腸道癥狀和過敏反應(yīng)等副作用，使用受限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有的骨關(guān)節(jié)炎藥物生物活性低且具有毒副作用而限制臨床應(yīng)用的問題，提供一種有效成分為三肽衍生物的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。

一種含三肽化合物的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物，包括三肽化合物或包括三肽化合物與藥學(xué)上可接受的載體，所述三肽化合物的結(jié)構(gòu)式為：

優(yōu)選的，所述三肽化合物的結(jié)構(gòu)式中，r基團(tuán)為：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物中含有以上公開的三肽化合物，這些三肽化合物能顯著減少骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中no和pge2釋放量、降低軟骨細(xì)胞中cox-2、inos、mmp-1、mmp-13表達(dá)量，能在抗炎的同時(shí)避免軟骨基質(zhì)蛋白和ⅱ型膠原的降解，因此，含有所公開的三肽衍生物的抗骨關(guān)節(jié)炎藥物對骨關(guān)節(jié)炎具有治療效果。

附圖說明

圖1為三肽化合物kdpt抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞no釋放的活性數(shù)據(jù)；

圖2為三肽化合物kdpt抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞pge2釋放的活性數(shù)據(jù)；

圖3為三肽化合物kdpt抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞cox-2表達(dá)量的活性數(shù)據(jù)；

圖4為三肽化合物kdpt抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞inos表達(dá)量的活性數(shù)據(jù)；

圖5為三肽化合物kdpt抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞mmp-1表達(dá)量的活性數(shù)據(jù)；

圖6為三肽化合物kdpt抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞mmp-13表達(dá)量的活性數(shù)據(jù)。

圖7為三肽化合物k2和k5抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞mmp-1表達(dá)量的活性數(shù)據(jù)；

圖8為三肽化合物k2和k5抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞mmp-13表達(dá)量的活性數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

為了更充分的理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步介紹和說明。

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)的記載方法，本發(fā)明所述的三肽化合物采用以下所示合成路線的方法合成：

上述三肽化合物的合成路線中，所述的pybopreagent、lihmds、tea、tfa的結(jié)構(gòu)式分別如下所示。

本發(fā)明所述三肽化合物作為抗骨關(guān)節(jié)炎藥物應(yīng)用的藥效相關(guān)實(shí)驗(yàn)如下試驗(yàn)1-5。

試驗(yàn)1-5中所述的三肽化合物(kdpt)的結(jié)構(gòu)如下：

試驗(yàn)1：細(xì)胞培養(yǎng)

骨科手術(shù)室取膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的絕經(jīng)后女性患者(年齡：65歲以上)的軟骨，迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)室，在超凈工作臺(tái)用眼科剪切取軟骨組織，越細(xì)越好，至6mm³大小的碎塊，放入培養(yǎng)皿，加dpbs溶液清洗兩次，每次5min，除去上清液后加入0.25％胰酶(m/v，g/ml)消化30min，然后吸棄上清液，并加入0.02％ii型膠原酶(m/v，g/ml)于37℃和5％co2(v/v)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)消化過夜，消化后將細(xì)胞懸液用100μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，加入含10％fbs(v/v)的高糖dmem培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心5min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用含10％fbs(v/v)的高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天在倒置熒光顯微鏡下觀察生長情況，每2天換液1次，待軟骨細(xì)胞鋪滿瓶底后，用0.25％胰酶(m/v，g/ml)進(jìn)行消化和傳代，傳代后繼續(xù)用含10％fbs(v/v)的高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)2：il-1β刺激軟骨細(xì)胞體外膝骨關(guān)節(jié)炎模型及藥物干預(yù)

將培養(yǎng)的第二代的人軟骨細(xì)胞按每孔3×10⁵個(gè)細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到80％(v/v)左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，用dpbs洗兩次后，分為以以下四組進(jìn)行試驗(yàn)：空白對照組只添加細(xì)胞培養(yǎng)液(高糖dmem培養(yǎng)基+10％大鼠空白血清v/v)；模型對照組添加細(xì)胞培養(yǎng)液(高糖dmem培養(yǎng)基+10％大鼠空白血清v/v)，并且加入10ng·ml^-1il-1β；含藥血清高劑量組：以10μm的三肽化合物預(yù)處理細(xì)胞2h，添加細(xì)胞培養(yǎng)液(dmem培養(yǎng)基+10％大鼠空白血清v/v)，并且加入10ng·ml^-1il-1β。含藥血清低劑量組：以2μm的三肽化合物預(yù)處理細(xì)胞2h，添加細(xì)胞培養(yǎng)液(dmem培養(yǎng)基+10％大鼠空白血清v/v)，并且加入10ng·ml^-1il-1β。以上各組細(xì)胞分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集各組細(xì)胞以及上清液。

試驗(yàn)3：三肽化合物抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞no的測試

軟骨細(xì)胞內(nèi)no含量是反應(yīng)其免疫炎癥反應(yīng)的指標(biāo)之一，使用碧云天的no檢測試劑盒按照說明書以griess方法測試由上述實(shí)驗(yàn)二中四組試驗(yàn)收集到的細(xì)胞上清液中no含量，具體為：

將griess試劑i和ii取出恢復(fù)室溫。以培養(yǎng)液(dmem培養(yǎng)基+10％大鼠空白血清v/v)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞培養(yǎng)上清液按50μl/孔加入至96孔板中，按50μl/孔加入griess試劑i，再加入50μl/孔griess試劑ii，于540nm測定吸光度。根據(jù)no試劑盒和多功能酶標(biāo)儀檢測540nm處吸光度，減去空白對照組的本底吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組no的絕對含量，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差。

測試結(jié)果如圖1所示，為三肽化合物抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞no釋放的活性數(shù)據(jù)，經(jīng)il-1β刺激，軟骨細(xì)胞內(nèi)的no含量增加，而化合物kdpt能劑量依賴性的降低軟骨細(xì)胞中no釋放量，說明化合物kdpt能抑制軟骨細(xì)胞中炎癥進(jìn)程。

試驗(yàn)4三肽化合物抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞前列腺素e2(pge2)的測試

采用elisa試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書檢測上清液中pge2含量。

測試結(jié)果如圖2所示，為三肽化合物抑制骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨細(xì)胞pge2釋放的活性數(shù)據(jù)，pge2是細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)的另一指標(biāo)，il-1β刺激下細(xì)胞內(nèi)pge2含量顯著上升，而化合物kdpt能劑量依賴性降低軟骨細(xì)胞中pge2釋放量，說明化合物kdpt能抑制軟骨細(xì)胞中炎癥進(jìn)程。

試驗(yàn)5三肽化合物下調(diào)cox-2、inos、mmp-1、mmp-13基因表達(dá)量的活性測定

使用rnaisoplus提取軟骨細(xì)胞的總rna，通過oligodt18將1μg總rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，通過定量pcr技術(shù)，使用toyobo公司thunderbirdsybrqpcrmix試劑按照說明書對引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。每組樣品3個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性。使用β-actin為內(nèi)參，檢測目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)變化來定量。采用2^-δδct方法分析數(shù)據(jù)(即實(shí)驗(yàn)組目的基因相對于對照組的表達(dá)量的變化倍數(shù))。

所用引物為：

gapdh(sense:5’-cccatcaccatcttccaggag-3’；antisense:5’-cttctccatggtggtgaagacg-3’)、

cox-2(sense:5’-gagagatgtatcctcccacagtca-3’；antisense:5’-gaccaggcaccagaccaaag-3’)、

inos(sense:5’-tttccaagacacacttcacca-3’；antisense:5’-atctcctttgttaccgcttcc-3’)、

mmp-1(sense:5’-atttctccgcttttcaactt-3’；antisense:5’-atgcacagctttcctccact-3’)、

mmp-13(sense:5’-tgctgcattctccttcagga-3’；antisense:5’-atgcatccaggggtcctggc-3’)。

檢測目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)變化來定量。采用2^-δδct方法分析數(shù)據(jù)(即實(shí)驗(yàn)組目的基因相對于對照組的表達(dá)量的變化倍數(shù))。

測試結(jié)果如圖3-4所示，10μm濃度下的三肽化合物能顯著降低軟骨細(xì)胞內(nèi)cox-2和inos的mrna表達(dá)量(三肽化合物處理過的細(xì)胞cox-2和inos的mrna表達(dá)量分別為模型對照組的0.32倍和0.42倍)。

如圖3所示，相對于模型組，化合物kdpt濃度依賴性降低cox-2的mrna表達(dá)量，cox-2是細(xì)胞內(nèi)前列腺素合成所必須的酶，降低cox-2的mrna表達(dá)量能減少細(xì)胞內(nèi)pge2產(chǎn)量，減輕炎癥反應(yīng)。

如圖4所示，inos是細(xì)胞內(nèi)no合成的催化酶，相對于模型組，化合物kdpt濃度依賴性降低cox-2的mrna表達(dá)量，進(jìn)一步可減少細(xì)胞內(nèi)no產(chǎn)量，減輕炎癥反應(yīng)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)能降解各類膠原蛋白，mmp-1參與了細(xì)胞外間隙膠原纖維的代謝及許多非基質(zhì)底物和細(xì)胞表面分子的分裂，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用。如圖5所示，相對于模型組，化合物kdpt濃度依賴性降低mmp-1的mrna表達(dá)量，從而減少mmp-1對軟骨基質(zhì)蛋白的破壞。

mmp-13是已知的惟一存在于結(jié)締組織中可以裂解ⅱ型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白酶，其優(yōu)先降解ⅱ型膠原，促進(jìn)膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的裂解膨脹，對ⅱ型膠原的降解和破壞是不可逆性的，ⅱ型膠原的降解和破壞導(dǎo)致軟骨支架結(jié)構(gòu)的崩塌，軟骨細(xì)胞賴以發(fā)揮功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)遭到破壞，激發(fā)進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)和軟骨組織破壞，造成炎癥與破壞的惡性循環(huán)。如圖6所示，相對于il-1β刺激的模型組，化合物kdpt計(jì)量依賴性的降低細(xì)胞內(nèi)mmp-13的mrna含量，阻止mmp-13對ii型膠原的破壞。

此外，還以上述試驗(yàn)1-5所示的方法分別測試了三肽化合物k2和k5作為抗骨關(guān)節(jié)炎藥物的藥效。

三肽化合物k2和k5的結(jié)構(gòu)通式與本發(fā)明所述的三肽化合物的結(jié)構(gòu)通式相同，為：其中，k2的結(jié)構(gòu)式中，r為：k5的結(jié)構(gòu)式中，r為：

測試結(jié)果如圖7和圖8所示，k2和k5不能降低mmp-1的mrna含量，k2甚至增加了mmp-13的mrna含量，k5也不能降低mmp-13的mrna含量。

以上所述僅以實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，以便于讀者更容易理解，但不代表本發(fā)明的實(shí)施方式僅限于此，任何依本發(fā)明所做的技術(shù)延伸或再創(chuàng)造，均受本發(fā)明的保護(hù)。