本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，涉及一種絲膠蛋白，具體為一種絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

絲膠蛋白是由家蠶分泌的一種天然動物蛋白，含有18種氨基酸，不僅具有可降解、抗菌、抗癌、抗氧化、抗凝血、親水、保濕、無免疫原性以及促進(jìn)細(xì)胞粘附和增殖等生物活性，而且富有氨基、羥基、羧基等利于修飾或改造的活性基團(tuán)，如今絲膠蛋白已成為一種備受關(guān)注的新型組織工程材料。

近年來，人們基于絲膠開發(fā)了不同類型的組織工程材料，如水凝膠，絲膠蛋白膜，絲膠海綿樣材料，絲膠納米纖維和納米粒等。然而到目前為止，基于絲膠蛋白材料的研發(fā)，所用的絲膠蛋白均是經(jīng)過分離純化和后續(xù)一系列的理化處理加工而成，在這些過程中，均難以避免地造成絲膠蛋白天然結(jié)構(gòu)的破壞(分子量和天然構(gòu)象)和天然生物活性的改變。同時(shí)目前有關(guān)絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的制備工藝也較為復(fù)雜，成本較高且機(jī)械性能不佳。因此，如何開發(fā)具有天然結(jié)構(gòu)和活性的絲膠蛋白新型材料無疑具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明通過調(diào)控家蠶的吐絲平臺，改變家蠶吐絲習(xí)性，從而選育適用于生產(chǎn)天然絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的家蠶品種同時(shí)直接生產(chǎn)可用于創(chuàng)傷修復(fù)的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料；此外，本發(fā)明提供了由上述方法制得的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料，以及該敷料在生物醫(yī)用材料等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：一種絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的制備方法，包含以下步驟：

(1)構(gòu)建家蠶吐絲平臺，選用平整的臺基，首先在臺基上覆蓋吸水紙或吸水布，再覆蓋一層2～30目的尼龍網(wǎng)或棉紗網(wǎng)；

(2)將絲素缺失突變型家蠶飼養(yǎng)至5齡熟蠶期，待家蠶體內(nèi)排泄干凈后，將其轉(zhuǎn)移至步驟(1)構(gòu)建的平臺上，每批次家蠶的投放密度為250頭/平方米以下；

(3)家蠶完成吐絲并化蛹后，選取健康的家蠶蛹用于化蛾、制種傳代；

(4)將步驟(3)留種的家蠶按步驟(2)的方式飼養(yǎng)，并重復(fù)步驟(3)；

(5)重復(fù)傳代10～15代后，按照步驟(2)的方式飼養(yǎng)，待家蠶吐絲完成，將網(wǎng)與下層紙或布分開，再從網(wǎng)上分離絲膠蛋白，即可獲得絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料。絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的厚度可以通過控制單位面積吐絲家蠶的數(shù)量和上蠶的次數(shù)來實(shí)現(xiàn)。

優(yōu)選的，所述絲素缺失突變型家蠶的品種為185nd-s,140nd-s,139nd-s,nd。以上品種均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存。

由所述方法制備獲得的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料。

優(yōu)選的，所述絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料為絲膠蛋白支架。

所述絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料在生物醫(yī)用材料中的應(yīng)用。

所述絲膠蛋白支架在細(xì)胞載體中的應(yīng)用。

有益效果：(1)本發(fā)明首次采用絲素缺失突變型家蠶品種結(jié)合家蠶育種技術(shù)通過改變家蠶的吐絲生理習(xí)性獲得可用于創(chuàng)傷修復(fù)的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料，該創(chuàng)傷敷料具有絲膠蛋白的天然結(jié)構(gòu)和活性，保持了絲膠蛋白的“原生態(tài)”特性；同時(shí)本方案獲得的絲膠蛋白生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，具有可推廣性；(2)通過本發(fā)明所述方法制得的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料具有多孔結(jié)構(gòu)，透氣性好；具有很好的機(jī)械強(qiáng)度，便于手術(shù)縫合；具有高生物相容性；能有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合，可用于皮膚組織創(chuàng)傷修復(fù)；(3)本發(fā)明所述絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料具有良好的生物相容性和細(xì)胞粘附性，可長期支持細(xì)胞的存活、增殖與遷移；(4)該敷料也是一種三維多孔的絲膠蛋白生物支架，可用于細(xì)胞外基質(zhì)支持細(xì)胞生長和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)交換，可應(yīng)用于多種組織損傷的修復(fù)和疾病的治療。

附圖說明

圖1是家蠶吐絲平臺結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料結(jié)構(gòu)圖；

其中a為宏觀結(jié)構(gòu)圖，b為微觀結(jié)構(gòu)圖；

圖3是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料孔隙率統(tǒng)計(jì)圖；

圖4是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料水平衡圖；

圖5是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料在不同ph環(huán)境中的降解曲線圖；

圖6是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的傅里葉紅外光譜圖；

圖7是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的機(jī)械性能測試圖；

圖8是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的熱穩(wěn)定性圖；

圖9是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的x衍射圖；

圖10是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料對凝血時(shí)間的影響圖；

圖11是小鼠皮膚成纖維細(xì)胞nih3t3細(xì)胞活力檢測圖；

圖12是人皮膚角質(zhì)細(xì)胞hacat細(xì)胞活力檢測圖；

圖13是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料中細(xì)胞遷移圖；

圖14是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料3d細(xì)胞培養(yǎng)圖；

圖15是絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1制備家蠶絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料

(一)選擇家蠶品種

選用絲素缺失型突變品種家蠶品種(由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存并向外商業(yè)化提供)，該類家蠶品種所吐的絲蛋白中只含有絲膠蛋白而不含絲素蛋白。

(二)制備家蠶吐絲平臺

選用6塊厚度為1cm、長和寬均為50cm的紙板，制作一個(gè)表面積為1.5m²的立方體紙箱。將紙箱放于一個(gè)平整的臺面上，在其向上的一面覆蓋3層厚度為0.4mm的經(jīng)高溫滅菌的新聞紙。然后再在紙上覆蓋一層棉紗網(wǎng)(10目)，并將棉紗網(wǎng)的四邊繃緊。

(三)選育家蠶品種

選取家蠶絲素缺失突變型品種(185nds或140nds)，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下(1-2齡28℃，3-5齡25℃)，選用新鮮桑葉飼喂，采用一天三回育。待家蠶5齡成熟時(shí)，將蠶放置在一個(gè)鋪有報(bào)紙的蠶匾中，等家蠶糞便排泄干凈后，再將家蠶轉(zhuǎn)移到步驟二制作的家蠶吐絲平臺上。讓家蠶在平臺上吐絲，人員在旁邊觀察，如發(fā)現(xiàn)有家蠶在平臺上掉下，即將掉下來的蠶再放回平臺。家蠶吐完絲后即在平臺上化蛹。待化蛹結(jié)束，挑選化蛹較為正常的個(gè)體化蛾后交配留種，其余淘汰。按此種方法選育15代，即可獲得適應(yīng)于在平臺上吐絲的絲素缺失型家蠶新品種。

(四)制備絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料

選取由步驟(三)選育后的家蠶品種進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)方法同步驟(三)所述。待家蠶5齡成熟后，將家蠶轉(zhuǎn)移到鋪有報(bào)紙的蠶匾中，當(dāng)它們體內(nèi)糞便排泄干凈后，再將蠶放在步驟(二)制作的吐絲平臺上，每平方米放置100頭蠶。24小時(shí)后，此時(shí)，家蠶已吐絲完畢，將該批家蠶轉(zhuǎn)移走。然后再重新放置100頭即將吐絲的家蠶，同樣24小時(shí)后，待家蠶吐絲完畢，然后轉(zhuǎn)移，再重新放100頭即將吐絲的家蠶。24小時(shí)后，將家蠶移去。將附有絲膠蛋白的網(wǎng)輕輕取下，然后將網(wǎng)慢慢揭除，則即可獲得一定厚度的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料。

如圖1所示，家蠶吐絲平臺由三部分構(gòu)成，下層臺基為一個(gè)平整的平臺。中間一層為吸水紙或布，最上層為尼龍網(wǎng)或棉紗網(wǎng)。

對上述方法制備獲得的家蠶絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料進(jìn)行性能測試，結(jié)果如下：

如圖2所示，其中a為家蠶絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的宏觀圖，由普通數(shù)碼相機(jī)拍攝；b為家蠶絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的微觀結(jié)構(gòu)圖，為電子掃描電鏡照片。從b圖可見，絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料為纖維狀的絲膠蛋白交織構(gòu)成的多孔結(jié)構(gòu)，具有良好的透氣性。

絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的孔隙率的測定采用超純水作為替代溶液。將干重質(zhì)量為w1的樣品浸沒在超純水中，1小時(shí)后取出，去除樣品表面多余的水后稱得樣品的重量為w2，則樣品的孔隙率即為(w2-w1)/w2×100％。結(jié)果如圖3所示。

將干燥的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料(質(zhì)量為wd)置于超純水中，24h后去除表面多余的水，取出其質(zhì)量為ws。則創(chuàng)傷敷料的水平衡為：結(jié)果如圖4所示。

對于測試絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料在不同ph環(huán)境中的降解，將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料浸泡于不同ph值(ph3.0、ph7.4、ph11.0)的pbs溶液中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每日更換一次pbs溶液，在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)，取出、干燥、稱重。結(jié)果如圖5所示：絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料降解具有ph響應(yīng)性，其中在ph11.0的堿性條件下降解速率最快，8周的降解率為69％，而在中性(ph7.4)和酸性(ph3.0)環(huán)境中的降解率分別僅為38％和23％。另外，在堿性(ph11.0)條件下，絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料在前4周內(nèi)降解速度較快，第4周降解率已達(dá)67％，此后降解速度變緩。

利用傅里葉變換紅外光譜儀(nexus,thermalnicolet,usa)測定絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料在4000–400cm^-1的特征峰。后采用軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6。β折疊所占比例高達(dá)44.16％，比所報(bào)道的絲膠蛋白材料的β折疊含量均高。表明，本發(fā)明獲得的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料穩(wěn)定性更高。另一方面也在一定程度上反映了我們獲得的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料保持絲膠蛋白的天然結(jié)構(gòu)與性質(zhì)。

絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的拉伸強(qiáng)度由萬能材料測試機(jī)(instron5848microtester,usa)測得，結(jié)果如圖7所示，其拉伸強(qiáng)度高達(dá)2.5mpa。表明該創(chuàng)傷敷料具有良好的拉伸強(qiáng)度，能夠滿足手術(shù)縫合的需要且不易破損。

采用同步熱分析儀(netzschsta449f3,germany)檢測絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料熱重變化和在相變時(shí)熔點(diǎn)的變化。程序升溫范圍為40～800℃，每分鐘升溫10℃。如圖8所示：絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的分解溫度為313.4℃和423.6℃。

絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的x衍射分析，將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料剪成圓形片狀，采用轉(zhuǎn)靶x射線衍射儀(型號：d/max-rb,日本rigaku公司)測試。結(jié)果如圖9所示，絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的2θ角為20.56°和28.6°，顯著高于前期報(bào)道的經(jīng)過分離純化的非降解絲膠蛋白的2θ角(19.08°和22.86°)，見文獻(xiàn)scientificreports,4:7064,doi:10.1038/srep07064)。結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料由于保持了絲膠蛋白的天然構(gòu)象，具有較高的結(jié)晶度。

絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料對凝血時(shí)間的影響測定方法如下：首先將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料剪成小片狀，然后在室溫下，浸入到血液里，同時(shí)未加絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的小鼠新鮮血液作為對照。從樣品放入血液時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄血液的凝血時(shí)間。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖10，含有絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的血液和對照組在凝血時(shí)間上沒有顯著性差異。結(jié)果表明絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料對血液的凝血時(shí)間沒有影響。前期人們研究發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白具有抗凝血的現(xiàn)象，和我們的結(jié)果不同，他們所采用的均是降解性的絲膠蛋白。而我們制備的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料蛋白結(jié)構(gòu)是天然的，其活性也是未被破壞的，這也可能是我們獲得的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料和前期人們在絲膠蛋白抗凝血的結(jié)果有所不同的原因。

實(shí)施例2家蠶絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料用作細(xì)胞載體

(一)小鼠成皮膚成纖維細(xì)胞(nih3t3)和人皮膚角質(zhì)細(xì)胞(hacat)絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料細(xì)胞活力檢測

(1)首先將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料剪片狀，然后用滅菌pbs洗3次，再用75％乙醇浸泡1小時(shí)，最后用已滅菌pbs洗1次，置于室溫備用。

(2)將從細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞經(jīng)懸浮，吹散，種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后將步驟(1)中預(yù)處理的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料轉(zhuǎn)入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)板中，每孔放置一片絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料。未放置絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的細(xì)胞培養(yǎng)孔作為對照。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為dmem高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，co2濃度為5％，濕度為100％)中培養(yǎng)。

如圖11和圖12所示，采用cck8方法檢測細(xì)胞在種植后2天和3天后細(xì)胞的活力。結(jié)果顯示：小鼠皮膚成纖維細(xì)胞(nih3t3)絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料組與人皮膚角質(zhì)細(xì)胞(hacat)絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料組和對照組相比，在細(xì)胞活力方面沒有顯著性差異，結(jié)果表明，絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料具有良好的細(xì)胞相容性。

(二)絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的細(xì)胞遷移檢測

所用細(xì)胞系為小鼠皮膚成纖維細(xì)胞(nih3t3)。

(1)首先將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料剪圓形片狀，然后用滅菌pbs洗3次，再用75％乙醇浸泡1小時(shí)，最后用已滅菌pbs洗1次，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

(2)將從細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞經(jīng)懸浮，吹散，種植于步驟(1)含有絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的細(xì)胞培養(yǎng)板中，初始種植細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。待細(xì)胞貼壁后，將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料轉(zhuǎn)移到新的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。再統(tǒng)計(jì)原培養(yǎng)板中各孔剩余的細(xì)胞數(shù)量，則得知絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料上初始種植細(xì)胞數(shù)量。

此后，每隔一天將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)板中一次，同時(shí)統(tǒng)計(jì)原培養(yǎng)板中相對應(yīng)的孔中剩余的細(xì)胞數(shù)并作好記錄。最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為dmem高糖培養(yǎng)基，細(xì)胞放于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，co2濃度為5％，濕度為100％)中培養(yǎng)。

結(jié)果如圖13所示，在統(tǒng)計(jì)的24天內(nèi)細(xì)胞從絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料中遷移出的細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)增長的現(xiàn)象。表明絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料具有良好的細(xì)胞相容性，能夠長期支持細(xì)胞的存活、增殖與遷移。

(三)絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的3d細(xì)胞培養(yǎng)

所用細(xì)胞系為gfp穩(wěn)轉(zhuǎn)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系shsy5y。

首先將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料剪成圓形片狀，然后用滅菌pbs洗3次，再用75％乙醇浸泡1小時(shí)，最后用已滅菌pbs洗1次，置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。接下來將從細(xì)胞培養(yǎng)瓶收集的細(xì)胞經(jīng)懸浮、吹散，再種植于含有絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的細(xì)胞培養(yǎng)板中。2天后將含有絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料的樣品取出用激光共聚焦進(jìn)行觀察和拍照。如圖14所示，絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料中的細(xì)胞生長狀態(tài)良好。結(jié)果表明絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料具有良好的細(xì)胞相容性，可以作為細(xì)胞的載體。

實(shí)施例3家蠶絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料用于小鼠皮膚損傷修復(fù)

(1)首先將絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料剪成直徑為1cm的圓形片狀，然后用滅菌pbs洗3次，再用75％乙醇浸泡1小時(shí)，最后用已滅菌pbs洗1次，干燥后置于室溫備用。

(2)制備小鼠燙傷模型，選用的動物為6周齡的昆明鼠。首選將小鼠麻醉和脫毛處理；然后采用溫度為100℃金屬棒(直徑為1cm的圓柱體)緊貼小鼠后背部燙5秒鐘。然后將燙傷后的皮膚剪去，將步驟(1)預(yù)處理的絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料在創(chuàng)傷面上，未用創(chuàng)傷敷料處理的小鼠作為對照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示，2天后絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料組較對照組的小鼠創(chuàng)面面積縮小顯著，表明絲膠蛋白創(chuàng)傷敷料可以有效促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)，可用于皮膚組織損傷修復(fù)。