本發(fā)明屬于中藥提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及畜禽養(yǎng)殖中姬松茸多糖抗寄生蟲(chóng)的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

姬松茸(agaricusblazeimurrill，abm)產(chǎn)自巴西，其味道鮮美，能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)能，具有抗病毒、抗細(xì)菌、抗寄生蟲(chóng)感染，抗腫瘤，是具有保健功能的食藥兩用真菌。

研究發(fā)現(xiàn)，姬松茸多糖的有效成分能夠顯著地增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，說(shuō)明這種多糖的有效成分能夠激發(fā)th1型免疫力，可以作為新型的免疫佐劑進(jìn)行研發(fā)。姬松茸多糖通過(guò)白介素-12(il-12)誘導(dǎo)干擾素-γ(ifn-γ)的分泌來(lái)激活殺傷細(xì)胞(nk細(xì)胞)，從而促進(jìn)先天性免疫反應(yīng)。姬松茸多糖可以有效刺激t細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放白介素-1β(il-1β)和白介素-6(il-6)，進(jìn)而提高機(jī)體針對(duì)異種抗原的特異性抗體產(chǎn)生。ni等研究發(fā)現(xiàn)，姬松茸多糖的提取物能夠提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性和kn細(xì)胞的殺傷能力，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)并調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

很多研究報(bào)道姬松茸多糖具有抗病毒活性，能夠抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒(pv)、西方馬型腦炎病毒(weev)、乙型肝炎(hbv)、丙型肝炎(hcb)、單純性皰疹病毒(hsv-1、hsv-2)的復(fù)制。體外試驗(yàn)表明，姬松茸多糖能夠誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、白介素-8(il-8)和一氧化氮(no)，并抑制由weev引起的vero細(xì)胞病變，從而體現(xiàn)出抗病毒感染效應(yīng)。姬松茸多糖也能夠增強(qiáng)機(jī)體特異性口蹄疫病毒(fmdv)dna疫苗的體液免疫反應(yīng)，并促進(jìn)t細(xì)胞的增殖。

姬松茸提取物對(duì)細(xì)菌、真菌也有抑菌作用。姬松茸多糖能夠刺激人的單核細(xì)胞捕獲白色念珠菌并產(chǎn)生促炎性反應(yīng)因子。等研究發(fā)現(xiàn)，姬松茸熱水浸提物能夠降低綠膿桿菌的菌膜形成能力，減少綠膿菌素的產(chǎn)生，降低菌體的運(yùn)動(dòng)能力，顯著地減少綠膿桿菌的毒力因子。

姬松茸多糖還具有抗寄生蟲(chóng)感染的作用。體內(nèi)和體外試驗(yàn)表明，姬松茸多糖的子實(shí)體能夠控制捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的發(fā)育和增殖。姬松茸多糖能夠?qū)汞懺x(chóng)的感染，增強(qiáng)宿主的抗氧化能力，減輕蟲(chóng)血癥的發(fā)生，增加宿主的存活率，減少體重的損失，對(duì)腦型瘧產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，減少腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、白介素-1β(il-1β)和白介素-6(il-6)的分泌，減輕對(duì)腦部的損傷。姬松茸多糖的提取物作為th1型疫苗佐劑，能夠增強(qiáng)抗內(nèi)臟型利氏曼原蟲(chóng)dna疫苗的免疫反應(yīng)。

鐮形艾美耳球蟲(chóng)(eimeriafalciformis)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(eimeriatenella)均隸屬于頂復(fù)門(mén)(apicomplexa)、孢子蟲(chóng)綱(sporozoasida)、球蟲(chóng)亞綱(coccidiasina)、真球蟲(chóng)目(eucoccidiorida)、艾美耳亞目(eimeriorina)、艾美耳科(eimeriidae)、艾美耳屬(eimeria)，它們分別感染小鼠和家禽的盲腸粘膜組織。其中，鐮形艾美耳球蟲(chóng)的潛隱期為7天，癥狀明顯期10-16天；柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的潛隱期為5.5天，癥狀明顯期8-14天。艾美耳球蟲(chóng)給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的損失，主要以藥物預(yù)防結(jié)合疫苗預(yù)防作為防治球蟲(chóng)的手段。目前，由于抗球蟲(chóng)化學(xué)藥物的使用極易導(dǎo)致耐藥型蟲(chóng)株的產(chǎn)生，且長(zhǎng)期使用造成藥物殘留的危害，而姬松茸多糖的使用安全性良好，作為候選的抗球蟲(chóng)藥物，具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究證明姬松茸多糖具有抗體內(nèi)寄生蟲(chóng)感染的作用，但是姬松茸多糖對(duì)于其它體內(nèi)寄生原蟲(chóng)的免疫調(diào)節(jié)作用還沒(méi)有詳細(xì)的研究，比如姬松茸多糖對(duì)感染鐮形艾美耳球蟲(chóng)的小鼠體重以及免疫器官的影響，姬松茸多糖對(duì)雛雞感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的卵囊排除量的影響等等都有待于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行不斷地探索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)姬松茸多糖應(yīng)用技術(shù)的不足，而提出一種畜禽養(yǎng)殖中使用姬松茸多糖抗艾美耳球蟲(chóng)的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題是采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種畜禽養(yǎng)殖中使用姬松茸多糖抗艾美耳球蟲(chóng)的方法，該方法是在家畜家禽的飼養(yǎng)過(guò)程中，每天以100mg/kg體重的計(jì)量將姬松茸多糖攝入到家畜家禽的體內(nèi)，以抵抗艾美耳球蟲(chóng)的感染。

而且，所述將姬松茸多糖攝入到家畜家禽體內(nèi)的具體方法包括：將姬松茸多糖攪拌在飼料中喂服、將姬松茸多糖溶于水中飲服或采用更為精確的人工灌服。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及其效果

1、本發(fā)明確定了鐮形艾美耳球蟲(chóng)和柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的最佳感染劑量分別為500個(gè)/只和5×10³個(gè)/只。

2、本發(fā)明找出了每天以100mg/kg的劑量灌服姬松茸多糖對(duì)小鼠所代表的家畜類(lèi)對(duì)抗艾美耳球蟲(chóng)感染的良好作用。

3、本發(fā)明確定了以100mg/kg的姬松茸多糖劑量拌料飼喂，對(duì)雛雞所代表的家禽類(lèi)對(duì)抗艾美耳球蟲(chóng)感染的良好作用。

4、本發(fā)明確定了以100mg/kg的姬松茸多糖劑量喂養(yǎng)，對(duì)畜禽養(yǎng)殖中動(dòng)物免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育有良好作用。

附圖說(shuō)明

圖1是感染不同劑量鐮形艾美耳球蟲(chóng)的小鼠每日存活率示意圖：4組試驗(yàn)動(dòng)物，1-10天，每組10只，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組比較。

圖2是各組小鼠體重的測(cè)定結(jié)果圖：4組試驗(yàn)動(dòng)物，0-17天，每組10只，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組比較。

圖3是各組小鼠糞便中ogp的測(cè)定結(jié)果圖：4組試驗(yàn)動(dòng)物，每組10只，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組比較。

圖4是各組小鼠器官指數(shù)的測(cè)定結(jié)果圖：4組試驗(yàn)動(dòng)物，每組10只，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組比較差異，其中，*，p<0.050。

圖5是感染不同劑量柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的小鼠每日存活率示意圖：4組試驗(yàn)動(dòng)物，1-10天，每組10只，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組比較。

圖6是各組雛雞糞便中ogp的測(cè)定結(jié)果圖：4組試驗(yàn)動(dòng)物，每組10只，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組比較。

圖7是各組雛雞免疫器官指數(shù)的測(cè)定結(jié)果圖：4組試驗(yàn)動(dòng)物，每組10只，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)各組比較差異，其中，*，p<0.050；**，p<0.010。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施做進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

第一步，為了找出姬松茸多糖的應(yīng)用方法，本發(fā)明首先要確定鐮形艾美耳球蟲(chóng)的最佳感染劑量，具體方法步驟是：

(1)40只30日齡的雌性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為4組，每組10只，第1組、第2組、第3組的小鼠分別按照500個(gè)/只、5000個(gè)/只、50000個(gè)/只鐮形艾美耳球蟲(chóng)的劑量經(jīng)口感染，第4組灌服等量的生理鹽水。

(2)感染后觀察10天，記錄每日各組小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤、食欲排泄、死亡等臨床癥狀。

第1組和第4組的小鼠在試驗(yàn)中無(wú)死亡情況，兩組小鼠的精神、活動(dòng)、皮毛、食欲、排泄等臨床癥狀均無(wú)異常；如圖1所示，第2組的小鼠在感染后第7天開(kāi)始出現(xiàn)死亡情況，到試驗(yàn)第10天，共死亡4只小鼠；第3組的小鼠在感染后第5天開(kāi)始出現(xiàn)死亡情況，到試驗(yàn)第10天小鼠全部死亡，說(shuō)明小鼠感染劑量為500個(gè)/只的鐮形艾美耳球蟲(chóng)不會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，而鐮形艾美耳球蟲(chóng)的致死劑量為50000個(gè)/只。因此，試驗(yàn)組小鼠以500個(gè)/只的劑量感染鐮形艾美耳球蟲(chóng)。

第二步，確定姬松茸多糖對(duì)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育與對(duì)抗鐮形艾美耳球蟲(chóng)感染的作用，具體的確定過(guò)程如下：

(1)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后，隨機(jī)分為4組，每組10只。第1組灌服姬松茸多糖溶液100mg/kg，第2組灌服姬松茸多糖溶液40mg/kg，連續(xù)7天，同時(shí)第3、4組灌服等量的生理鹽水，記錄各組小鼠的體重變化。如圖2所示，從試驗(yàn)第1天起，各組小鼠的體重呈緩慢上升趨勢(shì)，第1組小鼠體重平均值高于第2、3、4組，說(shuō)明100mg/kg姬松茸多糖對(duì)小鼠的增重效果優(yōu)于40mg/kg姬松茸多糖和不喝姬松茸多糖的小鼠。

(2)在試驗(yàn)第8天，第1、2、3組分別灌服鐮形艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊500個(gè)/只，0.2ml/只，第4組灌服等量的生理鹽水，每日觀察各組小鼠對(duì)鐮形艾美耳球蟲(chóng)感染后的臨床癥狀，記錄各組小鼠的體重變化。如圖2所示，鐮形艾美耳球蟲(chóng)感染后，即試驗(yàn)第8-14天，各組小鼠的體重均有緩慢上升，在試驗(yàn)第15天，第1、2、3組體重均有顯著下降，其中第1組體重下降程度低于第2組和第3組，說(shuō)明100mg/kg姬松茸多糖組對(duì)于小鼠抗鐮形艾美耳球蟲(chóng)感染的效果優(yōu)于40mg/kg姬松茸多糖組和不喝姬松茸多糖組。

(3)在試驗(yàn)第14天清除各組小鼠的墊料，收集第15-17天的糞便，各組糞便分別攪拌均勻，再分別稱(chēng)取2g糞便至塑料小燒杯中，加入60ml飽和鹽水，攪拌均勻，充入改良麥克馬氏板記數(shù)室，靜止3min后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便中卵囊數(shù)(opg＝計(jì)數(shù)所得讀數(shù)×200)。如圖3所示，各組opg中，第1組為300，第2組為6×10⁴，第3組為6×10⁵，第4組為0，說(shuō)明100mg/kg姬松茸多糖組對(duì)于小鼠抗鐮形艾美耳球蟲(chóng)感染的效果優(yōu)于40mg/kg姬松茸多糖組和不喝姬松茸多糖組。

(4)在試驗(yàn)第17天后剖檢，觀察各組小鼠的器官病變，計(jì)算肝臟、腎臟和脾臟的器官指數(shù)(各臟器重量與體重之比)。在試驗(yàn)第17天后剖檢，各組小鼠實(shí)質(zhì)器官的形狀、大小與色澤均正常，未見(jiàn)病變情況。如圖4所示，各組小鼠的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)差異不顯著，脾臟指數(shù)第1組與第3組相比，差異顯著，說(shuō)明100mg/kg姬松茸多糖能夠促進(jìn)小鼠脾臟的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)小鼠抗鐮形艾美耳球蟲(chóng)感染的抵抗力。

第三步，為了找出姬松茸多糖的應(yīng)用方法，需要確定柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的最佳感染劑量，具體方法步驟是：

(1)40只4日齡的aa肉雞適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為4組，每組10只，第1組、第2組、第3組的雛雞分別按照5×10³個(gè)/只、5×10⁴個(gè)/只、5×10⁵個(gè)/只柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的劑量經(jīng)口感染，第4組灌服等量的生理鹽水。

(2)感染后觀察10天，記錄每日各組雛雞的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、皮毛光澤、食欲排泄、死亡等臨床癥狀。

第1組和第4組的雛雞在試驗(yàn)中無(wú)死亡情況，兩組雛雞的精神、活動(dòng)、羽毛、食欲、排泄等臨床癥狀均無(wú)異常；如圖5所示，第2組的雛雞在感染后第9天開(kāi)始出現(xiàn)死亡情況，到試驗(yàn)第10天，共死亡2只雛雞；第3組的雛雞在感染后第6天開(kāi)始出現(xiàn)死亡情況，到試驗(yàn)第10天雛雞全部死亡，說(shuō)明雛雞感染劑量為5×10³個(gè)/只的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)不會(huì)導(dǎo)致雛雞死亡，而柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的致死劑量為5×10⁵個(gè)/只。因此，試驗(yàn)組雛雞以5×10³個(gè)/只的劑量感染柔嫩艾美耳球蟲(chóng)。

第四步，確定姬松茸多糖對(duì)雛雞生長(zhǎng)發(fā)育與對(duì)抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染的作用，具體的確定過(guò)程如下：

(1)40只4日齡的aa肉雞適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為4組，每組10只。第1組將姬松茸多糖拌料，劑量為100mg/kg體重，第2組將姬松茸多糖拌料，劑量為40mg/kg體重，連續(xù)飼喂7天，同時(shí)第3、4組正常飼喂。在試驗(yàn)第8天，第1、2、3組分別灌服柔嫩艾美耳球蟲(chóng)孢子化卵囊5×10³個(gè)/只，0.2ml/只，第4組灌服等量的生理鹽水，每日觀察各組雛雞對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染后的臨床癥狀。在試驗(yàn)第13天清除各組雛雞的糞便，收集第14-17天的糞便，各組糞便分別攪拌均勻，再分別稱(chēng)取2g糞便至塑料小燒杯中，加入60ml飽和鹽水，攪拌均勻，充入改良麥克馬氏板記數(shù)室，靜止3min后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便中卵囊數(shù)(opg＝計(jì)數(shù)所得讀數(shù)×200)。如圖6所示，各組opg中，第1組為800，第2組為4.8×10⁴，第3組為2.56×10⁵，第4組為0，說(shuō)明100mg/kg姬松茸多糖拌料飼喂對(duì)于雛雞抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染的效果優(yōu)于40mg/kg姬松茸多糖和不用姬松茸多糖。

(4)在試驗(yàn)第17天后剖檢，觀察各組雛雞的器官病變，計(jì)算胸腺、脾臟和法氏囊的器官指數(shù)(各臟器重量與體重之比)。在試驗(yàn)第17天后剖檢，各組雛雞實(shí)質(zhì)器官的形狀、大小與色澤均正常，未見(jiàn)病變情況。如圖7所示，在胸腺指數(shù)中，3組與4組相比差異極顯著(p<0.01)，說(shuō)明柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染影響胸腺的發(fā)育，進(jìn)而降低機(jī)體的免疫力；1組與2組相比差異顯著(p<0.05)，1組與3組相比差異顯著(p<0.05)，2組與4組相比差異極顯著(p<0.01)，2組與3組相比差異不顯著(p>0.05)，1組與4組相比差異不顯著(p>0.05)，說(shuō)明100mg/kg姬松茸多糖比40mg/kg姬松茸多糖拌料飼喂能夠促進(jìn)胸腺的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而有效抵抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的感染。

如圖7所示，在脾臟指數(shù)中，3組與4組相比差異顯著(p<0.05)，說(shuō)明柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染影響脾臟的發(fā)育，進(jìn)而降低機(jī)體的免疫力；1組與3組相比差異顯著(p<0.05)，2組與3組相比差異極顯著(p<0.01)，2組與4組相比差異不顯著(p>0.05)，1組與4組相比差異不顯著(p>0.05)，1組與2組相比差異不顯著(p>0.05)，說(shuō)明姬松茸多糖能夠促進(jìn)脾臟的發(fā)育，進(jìn)而有效抵抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的感染，且100mg/kg與40mg/kg的姬松茸多糖拌料飼喂對(duì)于脾臟的發(fā)育差異不顯著。

如圖7所示，在法氏囊指數(shù)中，3組與4組相比差異極顯著(p<0.01)，說(shuō)明柔嫩艾美耳球蟲(chóng)感染影響法氏囊的發(fā)育，進(jìn)而降低機(jī)體的免疫力；1組與3組相比差異顯著(p<0.05)，2組與3組相比差異顯著(p<0.05)，2組與4組相比差異顯著(p<0.05)，1組與4組相比差異不顯著(p>0.05)，說(shuō)明100mg/kg姬松茸多糖比40mg/kg姬松茸多糖拌料飼喂能夠更為顯著地促進(jìn)法氏囊的發(fā)育，進(jìn)而有效抵抗柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的感染。