本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及膠束的制備，具體涉及一種靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

藥物傳送系統(tǒng)可降低給藥劑量、提高療效，理想的給藥系統(tǒng)是能夠保護(hù)藥物、避免其在體內(nèi)的快速降解和清除，使藥物準(zhǔn)確到達(dá)靶部位并釋放。膠束是疏水結(jié)構(gòu)和親水基組成的具有核殼結(jié)構(gòu)的納米膠體粒子，這種特殊的結(jié)構(gòu)使膠束很適合做疏水性藥物的載體。疏水性藥物服用后生物利用度差，能夠快速被消除，造成了其療效低毒性大。膠束具有親水性的殼結(jié)構(gòu)使藥物的溶解性大大提高；膠束具有大小可調(diào)的尺寸，使藥物能夠靶向到病變組織，特別是腫瘤和有炎癥的部位。此外，可以在膠束表面進(jìn)行修飾，使其準(zhǔn)確到達(dá)特定部位，提高細(xì)胞的攝取率，使藥物達(dá)到高效低毒的效果。

聚唾液酸是一種能延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間但是研究的比較少的材料，和peg不同，聚唾液酸具有較高的水溶性、生物相容性好、免疫原性、生物可降解性、低毒等優(yōu)點(diǎn)。聚唾液酸是唾液酸以α-8和/或α-9連接的均聚物，聚唾液酸在細(xì)菌表面形成厚厚的圖層，可以保護(hù)細(xì)菌不被宿主免疫系統(tǒng)的吞噬，非常適合用作構(gòu)建藥物載體。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性、免疫紊亂性疾病，發(fā)病率約占人群的1%，需要長(zhǎng)期有效的藥物治療以控制病情。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎通常伴有慢性關(guān)節(jié)腫脹和發(fā)炎、關(guān)節(jié)軟骨受損和骨侵蝕，嚴(yán)重的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎會(huì)使患者失去行動(dòng)能力，引起的并發(fā)癥可縮短患者壽命。臨床常用的治療方法是用緩解病情的抗風(fēng)濕藥物(dmards)、非甾體類消炎藥（nsaids）、糖皮質(zhì)激素類(gcs)、生物治療等。這些治療方法常伴隨著嚴(yán)重的副作用，包括感染、骨質(zhì)疏松、高血壓、肺纖維化、肝損傷、腎衰竭等，藥物的這些不良反應(yīng)是由于藥物對(duì)發(fā)炎關(guān)節(jié)較低的親和力，肝臟中的代謝和從腎臟的快速排泄引起的，因此，臨床急需一種更有效的治療方法。

地塞米松屬于糖皮質(zhì)激素類抗炎藥物，有較好的抗炎效果，但是由于地塞米松給藥后缺乏特異性、糖皮素受體分布于全身使地塞米松的使用伴有嚴(yán)重的副作用，包括骨質(zhì)疏松和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加等，當(dāng)長(zhǎng)期高劑量使用時(shí)，副作用加重。為了治療ra，研究者做了很多努力，crielaardetal，將糖皮質(zhì)激素封裝于具有核殼交聯(lián)結(jié)構(gòu)的聚合物膠束中，改善了藥物釋放動(dòng)力學(xué)，并增強(qiáng)了對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為解決現(xiàn)有抗炎藥物副作用大、治療效果差的技術(shù)難題，公開(kāi)了一種靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備方法及其應(yīng)用，并公開(kāi)了載入經(jīng)典抗炎藥物地塞米松，降低地塞米松的毒副作用，提高其抗炎效果的具體應(yīng)用的詳細(xì)操作。

為解決上述技術(shù)難題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備方法，包括以下步驟：

（1）聚唾液酸的修飾；

（2）聚唾液酸膽固醇甲酰氯的合成；

（3）靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備。

所述步驟（1）的操作為：將氫型離子交換樹(shù)脂與四丁基溴化銨混合溶于去離子水中，150rpm攪拌0.5h，過(guò)濾后用去離子水沖洗氫型離子交換樹(shù)脂，然后把氫型離子交換樹(shù)脂加入到聚唾液酸水溶液中，室溫下攪拌2h，1000rpm離心5min，取上清溶液冷凍干燥，4℃保存，完成聚唾液酸的修飾。

所述四丁基溴化銨：聚唾液酸的物質(zhì)的量比為（3-4）:1，聚唾液酸的分子量為5000-50000，聚唾液酸水溶液的質(zhì)量濃度為1%-3%。

所述步驟（2）的操作為：將經(jīng)步驟（1）修飾過(guò)的聚唾液酸和膽固醇甲酰氯分別溶于有機(jī)溶劑中，然后將膽固醇甲酰氯溶液滴加到修飾過(guò)的聚唾液酸溶液中，加入反應(yīng)48h，40℃減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，完成聚唾液酸膽固醇甲酰氯的制備。

所述有機(jī)溶劑為二甲基亞砜、二氯甲烷或乙腈中的一種或幾種，催化劑為三乙胺；修飾過(guò)的聚唾液酸：膽固醇甲酰氯的物質(zhì)的量比為1：（0.6-3）。

所述步驟（3）的操作為：將步驟（2）制備的聚唾液酸膽固醇甲酰氯加入dspe-peg-fa溶液中，再加入去離子水、旋蒸、透析冷凍干燥，完成靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備。

所述聚唾液酸膽固醇甲酰氯：dspe-peg-fa的物質(zhì)的量比為1：（0.01-0.1）。

所述靶向性聚唾液酸混合納米膠束的平均粒徑為50nm-300nm，電位為-10mv--40mv。

一種靶向性聚唾液酸混合納米膠束的應(yīng)用，所述混合納米膠束作為靶向性藥物載體的應(yīng)用。

作為靶向性藥物載體的應(yīng)用的步驟為：將聚唾液酸混合納米膠束和目標(biāo)藥物都溶于有機(jī)溶劑中，攪拌，旋蒸除去有機(jī)溶劑，形成一層膜，停止旋蒸，加入去離子水，渦旋，超聲，過(guò)微孔濾膜，完成靶向性藥物載體的制備；所述聚唾液酸混合納米膠束：目標(biāo)藥物的質(zhì)量比為20：（1-10）。

本發(fā)明的有益效果在于：

1.本發(fā)明提供的處方和制備方法合成兩親性嵌段共聚物，在水中自組裝形成膠體溶液，制備的載藥膠束的載藥量可達(dá)10%，粒徑為110nm左右，多分散系數(shù)pdi為0.2左右。

2.本發(fā)明制備簡(jiǎn)單，效果好，載體材料無(wú)毒，使藥物保持穩(wěn)定性，使藥物在生物體內(nèi)的緩釋，提高藥效，降低毒性和具有靶向性，以解決藥物治療炎癥時(shí)治療效果差、毒副作用大的問(wèn)題，該發(fā)明具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

說(shuō)明書附圖

圖1為靶向性混合納米膠束的粒徑圖。

圖2為靶向性混合納米膠束的電位圖。

圖3為靶向性混合納米膠束的透射電鏡圖。

圖4為靶向性混合納米膠束的臨界膠束濃度圖。

圖5為靶向性混合納米載藥膠束的體外釋藥圖。

圖6為靶向性混合納米膠束載體的細(xì)胞毒性圖。

圖7為以tnf-α為標(biāo)志物的靶向性混合納米載藥膠束的體外抗炎活性圖。

圖8為以il-6為標(biāo)志物的靶向性混合納米載藥膠束的體外抗炎活性圖。

具體實(shí)施方式

下面實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1

聚唾液酸的修飾：600mg氫型離子交換樹(shù)脂和750mg四丁基溴化銨（2.26mmol）混合于25ml的去離子水中，150rpm攪拌0.5h，過(guò)濾，并用去離子水沖洗離子樹(shù)脂，以去除沒(méi)有結(jié)合的四丁基溴化銨，水洗過(guò)的陽(yáng)離子樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到10ml2%（w/w）的聚唾液酸水溶液中（200mg，0.65mmol聚唾液酸單體），室溫下攪拌2h，1000rpm5min離心，取上清，溶液冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備方法通過(guò)如下方法制備而成：離子交換過(guò)的聚唾液酸16mg、膽固醇甲酰氯28mg分別溶于dmso和二氯甲烷中，將膽固醇甲酰氯滴加到聚唾液酸溶液中，在催化劑三乙胺的條件下二者發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，40℃減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，備用。將0.5mgdspe-peg-fa溶于適量的二氯甲烷，加入到旋蒸后的溶液中，劇烈攪拌下再加入去離子水，旋蒸、透析、冷凍干燥即可。

靶向性聚唾液酸混合納米載藥膠束的制備方法通過(guò)如下方法制備而成：將10mg的膠束載體和1mg的地塞米松都溶于乙腈中，緩慢攪拌，旋蒸除去有機(jī)溶劑，待形成一層膜時(shí)，停止旋蒸，加入去離子水，渦旋，超聲，過(guò)微孔濾膜。

實(shí)施例2

聚唾液酸的修飾：800mg氫型離子交換樹(shù)脂和996mg四丁基溴化銨（3mmol）混合于25ml的去離子水中，150rpm攪拌0.5h，過(guò)濾，并用去離子水沖洗離子樹(shù)脂，以去除沒(méi)有結(jié)合的四丁基溴化銨，水洗過(guò)的陽(yáng)離子樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到10ml2%（w/w）的聚唾液酸水溶液中（308mg，1mmol聚唾液酸單體），室溫下攪拌2h，1000rpm5min離心，取上清，溶液冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備方法通過(guò)如下方法制備而成：離子交換過(guò)的聚唾液酸16mg、膽固醇甲酰氯57mg分別溶于dmso和二氯甲烷中，將膽固醇甲酰氯滴加到聚唾液酸溶液中，在催化劑三乙胺的條件下二者發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，40℃減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，備用。將3.6mgdspe-peg-fa溶于適量的二氯甲烷，加入到旋蒸后的溶液中，劇烈攪拌下再加入去離子水，旋蒸、透析、冷凍干燥即可。

靶向性聚唾液酸混合納米載藥膠束的制備方法通過(guò)如下方法制備而成：將10mg的膠束載體和2mg的地塞米松都溶于乙腈中，緩慢攪拌，旋蒸除去有機(jī)溶劑，待形成一層膜時(shí)，停止旋蒸，加入去離子水，渦旋，超聲，過(guò)微孔濾膜。

實(shí)施例4

聚唾液酸的修飾：1000mg氫型離子交換樹(shù)脂和1327mg四丁基溴化銨（4mmol）混合于25ml的去離子水中，150rpm攪拌0.5h，過(guò)濾，并用去離子水沖洗離子樹(shù)脂，以去除沒(méi)有結(jié)合的四丁基溴化銨，水洗過(guò)的陽(yáng)離子樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到10ml2%（w/w）的聚唾液酸水溶液中（308mg，1mmol聚唾液酸單體），室溫下攪拌2h，1000rpm5min離心，取上清，溶液冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備方法通過(guò)如下方法制備而成：離子交換過(guò)的聚唾液酸16mg、膽固醇甲酰氯45mg分別溶于dmso和二氯甲烷中，將膽固醇甲酰氯滴加到聚唾液酸溶液中，在催化劑三乙胺的條件下二者發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，40℃減壓蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，備用。將2mgdspe-peg-fa溶于適量的二氯甲烷，加入到旋蒸后的溶液中，劇烈攪拌下再加入去離子水，旋蒸、透析、冷凍干燥。

靶向性聚唾液酸混合納米載藥膠束的制備方法通過(guò)如下方法制備而成：將10mg的膠束載體和3mg的地塞米松都溶于乙腈中，緩慢攪拌，旋蒸除去有機(jī)溶劑，待形成一層膜時(shí)，停止旋蒸，加入去離子水，渦旋，超聲，過(guò)微孔濾膜。

實(shí)施例5

聚唾液酸的修飾：600mg氫型離子交換樹(shù)脂和750mg四丁基溴化銨（2.26mmol）混合于25ml的去離子水中，150rpm攪拌0.5h，過(guò)濾，并用去離子水沖洗離子樹(shù)脂，以去除沒(méi)有結(jié)合的四丁基溴化銨，水洗過(guò)的陽(yáng)離子樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到10ml2%（w/w）的聚唾液酸水溶液中（200mg，0.65mmol聚唾液酸單體），室溫下攪拌2h，1000rpm5min離心，取上清，溶液冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

靶向性聚唾液酸混合納米膠束的制備方法通過(guò)如下方法制備而成：離子交換過(guò)的聚唾液酸16mg、膽固醇甲酰氯32mg分別溶于dmso和二氯甲烷中，將膽固醇甲酰氯滴加到聚唾液酸溶液中，在催化劑三乙胺的條件下二者發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，40℃減壓蒸發(fā)除去除去有機(jī)溶劑，備用。1.5mgdspe-peg-fa溶于適量的二氯甲烷，加入到旋蒸后的溶液中，劇烈攪拌下再加入去離子水，旋蒸、透析、冷凍干燥即可。

靶向性聚唾液酸混合納米載藥膠束的制備方法通過(guò)如下方法制備而成：將10mg的膠束載體和4mg的地塞米松都溶于乙腈中，緩慢攪拌，旋蒸除去有機(jī)溶劑，待形成一層膜時(shí)，停止旋蒸，加入去離子水，渦旋，超聲，過(guò)微孔濾膜。

效果實(shí)施例1：本發(fā)明靶向性聚唾液酸混合納米膠束的粒徑考察

本發(fā)明實(shí)施例5得到的混合納米膠束用粒徑儀測(cè)其粒徑，結(jié)果如圖1、圖2所示。由粒徑圖顯示可看出，根據(jù)本發(fā)明制備得到的混合膠束的粒徑在100nm左右，粒徑分布成正態(tài)分布，電位為-26mv。膠束的形態(tài)如圖3，為規(guī)則的球形，粒徑約為100nm。載藥膠束的載藥量可達(dá)10%，粒徑約為110nm，多分散系數(shù)pdi為0.23。

效果實(shí)施例2：本發(fā)明靶向性聚唾液酸混合納米膠束的臨界膠束濃度

臨界膠束濃度是評(píng)價(jià)兩親性聚合物形成膠束能力的重要參數(shù)，臨界膠束濃度越小表示載體越容易形成膠束，形成的膠束越穩(wěn)定。實(shí)例5中臨界膠束濃度（cmc）的測(cè)定采用芘熒光探針?lè)?，避光稱取15mg的芘，用丙酮定容到5ml，從中取50μl，用丙酮定容到5ml容量瓶，避光保存。稱取10mg的膠束載體，溶于10ml的水，逐級(jí)稀釋得到11個(gè)小樣，分別加入8μl芘的儲(chǔ)備液，超聲30min，65℃振蕩4h，黑暗中冷卻，隔夜用熒光分光光度計(jì)測(cè)熒光強(qiáng)度。用337nm和334nm兩個(gè)發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度的比值作圖，即i1/i3，由曲線的第一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)求出臨界膠束濃度。結(jié)果如圖4所示，得到的臨界膠束濃度為32.1±5.2ug/ml，濃度較低，說(shuō)明混合膠束的穩(wěn)定性很好。

效果實(shí)施例3：本發(fā)明靶向性聚唾液酸混合載藥膠束的體外釋放實(shí)驗(yàn)

將實(shí)例5中載藥混合納米膠束溶于5ml去離子水中，轉(zhuǎn)移到透析袋中，置于45ml、37℃、ph7.4去離子水中，10min,20min,40min,1,2,4,6,12,24,48h和72h取1ml透析液，補(bǔ)1ml的透析液，用uplc測(cè)釋放量，繪制釋放曲線。其累積釋放量如圖5所示。體外釋放結(jié)果顯示，本發(fā)明所制備的載藥混合膠束在120h內(nèi)的累積釋藥量為80%左右，達(dá)到了較好的緩釋效果，避免了藥物突釋造成的不適反應(yīng)。

效果實(shí)施例4：本發(fā)明靶向性聚唾液酸混合納米膠束載體的細(xì)胞毒性考察

巨噬細(xì)胞在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中具有關(guān)鍵的作用，它可以表達(dá)許多的炎癥介質(zhì)和炎癥因子，參與炎癥的反應(yīng)，采用巨噬細(xì)胞來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明普通膠束、靶向混合膠束的細(xì)胞毒作用的強(qiáng)弱。

將巨噬細(xì)胞接種于96孔板中，每孔約為15000個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h后（細(xì)胞的密度約為65%），取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去舊的培養(yǎng)基。將實(shí)例5中含有不同濃度的膠束新鮮培養(yǎng)基過(guò)0.22um的微孔濾膜，濃度的范圍為0.3125mg/ml~20mg/ml，然后加入到不同的細(xì)胞孔中并設(shè)置對(duì)照組和空白組，細(xì)胞板周圍用pbs封板。培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，避光條件下，每孔加入含10%cck-8且不含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸光度od值，計(jì)算ic50。不同濃度的混合膠束對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性考察結(jié)果如圖6所示，隨著聚唾液酸膠束載體材料濃度的增大對(duì)細(xì)胞的毒性也隨之增大，普通膠束和靶向混合膠束的ic50分別為4.98±0.73mg/ml、5.85±0.58mg/ml，表明載體材料在所用的濃度范圍內(nèi)是無(wú)毒的。

效果實(shí)施例5：本發(fā)明靶向性聚唾液酸混合載藥膠束對(duì)炎癥細(xì)胞的抗炎活性

將有炎癥的巨噬細(xì)胞按照每孔1.5萬(wàn)的密度接種于96孔板中，37℃，5%co2中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度約為65%時(shí)，棄去舊的培養(yǎng)基，加入空白組、濃度為1mg/ml的地塞米松原料藥組、濃度為0.1mg/ml的地塞米松原料藥組，普通膠束載地塞米松組，混合膠束載地塞米松組，對(duì)照組（lps組）加入相同量的培養(yǎng)基，空白組不經(jīng)lps刺激，加入相同量的培養(yǎng)基，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)副孔，1h后，加入含有l(wèi)ps的培養(yǎng)基，使得lps的最終濃度為1ug/ml，孵育24h后，收集上清，elisa檢測(cè)tnf-α和il-6水平。結(jié)果如圖7、圖8所示，當(dāng)藥物載入膠束中依然能夠保持藥物的抗炎活性，且混合靶向膠束載藥能夠提高地塞米松抗炎的效果。