本發(fā)明屬于核磁共振成像造影劑制備領(lǐng)域，具體涉及一種精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的制備方法、產(chǎn)品及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，核磁共振成像技術(shù)(mri)以其強大的成像能力已經(jīng)成為臨床醫(yī)學(xué)中非常重要的診斷工具。它能夠穿透人體的組織深部，實時動態(tài)的對疾病損傷和治療效果進(jìn)行檢測，同時整個檢測診斷過程是非侵襲性的，不會給患者帶來機(jī)體的損傷和痛苦。對于患者機(jī)體的異常情況和組織損傷，核磁共振成像技術(shù)能夠為醫(yī)生提供準(zhǔn)確和詳細(xì)的診斷依據(jù)。因此，核磁共振成像技術(shù)在臨床診斷中越來越得到患者接受和醫(yī)生的重視。

但是mri的敏感性和分辨率并不高，因此需在被檢測對象中加入一類能改變氫質(zhì)子弛豫時間的物質(zhì)來增加核磁共振成像的敏感性和分辨率，這種物質(zhì)被稱為核磁共振造影劑。

目前，臨床中用到的造影劑多為釓類造影劑，如釓噴葡胺注射液，但是釓作為造影劑對于機(jī)體具有潛在的毒性，能夠引起腎源性系統(tǒng)性纖維化病變，因此并不能在臨床中受到特別的歡迎。

近年來，各國的研究機(jī)構(gòu)嘗試將合成的氧化鐵納米粒作為t2造影劑，但是t2造影劑是一種陰性對比劑，在成像過程中看到的是黑暗的圖像，在臨床中很難和其他的一些能產(chǎn)生暗場的病變進(jìn)行區(qū)分，比如出血、血凝塊和鈣化等。因此，將氧化鐵納米粒作為t2造影劑應(yīng)用于臨床還受到很大的限制。

同時，通過在油相條件下合成得到超小氧化鐵納米粒，以及基于錳和釓的納米粒用于t1造影劑的研究，并有望轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的造影劑。但是，油相條件下得到的納米粒必須經(jīng)過相應(yīng)的方法將其轉(zhuǎn)移到水相才能用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如聚合物包裹，配體交換等。但是這種方法得到的造影劑合成過程復(fù)雜、不能批量生產(chǎn)、不同的納米粒表面需要選用不同的配體，因而，油相條件下得到的無機(jī)納米粒用于臨床推廣還有很長的路要走。

基于以上考慮，設(shè)計合成安全、有效的核磁共振t1造影劑，并用于臨床研究依然是患者、醫(yī)生以及材料學(xué)家共同的期待。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的制備方法、產(chǎn)品及應(yīng)用，所制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒在核磁共振成像過程中能夠產(chǎn)生很好的t1成像效果。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案為：

一種精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的制備方法，包括如下步驟：

1)將精氨酸溶解于水中，加入環(huán)己烷混合后加熱，然后再加入正硅酸乙酯進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后除去環(huán)己烷，得到精氨酸穩(wěn)定的二氧化硅納米粒；

2)將二氧化硅納米粒、高錳酸鉀、乙醇和水混合后進(jìn)行水熱反應(yīng)，分離得到精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒。

上述的技術(shù)方案中，采用精氨酸及正硅酸乙酯制備精氨酸穩(wěn)定的二氧化硅納米粒，由于精氨酸是一種堿性氨基酸且具有較高的等電點，能夠在二氧化硅合成的過程中提供堿性環(huán)境同時能夠結(jié)合在二氧化硅表面，進(jìn)而能夠合成水中穩(wěn)定存在、粒徑較小且均一的二氧化硅納米粒；繼續(xù)將二氧化硅納米粒、高錳酸鉀、乙醇和水混合反應(yīng)，得到中空泡狀的形貌，主要是由于在高溫高壓條件下，二氧化硅納米粒的表面可以形成一些原硅酸活性位點，同時高錳酸鉀可以將乙醇氧化，生成二氧化碳，然后以二氧化碳?xì)馀轂槟０澹咤i酸鉀中的錳離子可以和原硅酸生成精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒。

上述方法制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒，由于具有特殊的形貌，有效得增加了核磁共振成像的敏感性和分辨率，此外還具有較好的水溶性、生物相容性及生物安全性。

優(yōu)選的，所述步驟1)中加熱至50～60℃。

優(yōu)選的，所述步驟1)中反應(yīng)時間為20～30h。

優(yōu)選的，所述步驟1)中精氨酸、環(huán)己烷與正硅酸乙酯的投料比為30～60mg:2～5ml:3ml。

優(yōu)選的，所述步驟2)中二氧化硅納米粒和高錳酸鉀的質(zhì)量比為1:1～3。

優(yōu)選的，所述步驟2)中水熱反應(yīng)的溫度為180～200℃，反應(yīng)時間為20～30h。

本發(fā)明還提供一種如上述的制備方法制備得到的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒。該精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒具有很好的增強t1成像的作用，為核磁共振成像技術(shù)用于臨床疾病的精確診斷提供詳細(xì)可靠的依據(jù)，最終實現(xiàn)對疾病的精準(zhǔn)、個體化治療。

優(yōu)選的，所述精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的粒徑為5～10nm。進(jìn)一步優(yōu)選為5～6nm。

本發(fā)明還提供一種如上述的制備方法制備得到的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒在制備t1造影劑中的應(yīng)用。

同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

(1)本發(fā)明通過水熱反應(yīng)制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒具有較好的水溶性、生物相容性。

(2)本發(fā)明制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒具有很好的增強t1成像效果的功能，同時與釓基相應(yīng)的t1成像造影劑相比具有更好的生物安全性。

(3)本發(fā)明中的反應(yīng)步驟操作簡單，條件可控，合成過程中不涉及毒性較大的有機(jī)溶劑，具有良好的臨床轉(zhuǎn)化可能性。

(4)本發(fā)明制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米?？梢源罅亢铣?，有利于將來的臨床轉(zhuǎn)化。

附圖說明

圖1為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的二氧化硅納米粒的透射電子顯微鏡(tem)圖；

圖2為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的透射電子顯微鏡(tem)圖；

圖3為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的水合粒徑分布圖；

圖4位實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的zeta電位分布圖；

圖5為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的xrd圖；

圖6為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的磁滯曲線圖；

圖7為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的xps圖；

圖8為單純的精氨酸和實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的紫外吸收圖譜；

圖9為單純的精氨酸的熱重分析(tga)曲線；

圖10為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的熱重分析(tga)曲線；

圖11為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的t1加權(quán)成像圖以及納米粒的弛豫效率曲線；

圖12為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒在不同ph條件分散24小時的tem圖；

圖13為實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒在不同ph條件分散24小時的磁共振成像信號強度圖；

圖14為mada-mb231細(xì)胞對實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的攝取情況曲線圖；

圖15為在裸鼠腫瘤模型中腫瘤部位的磁共振成像效果冠狀面掃描圖片，白色框內(nèi)為腫瘤部位；

圖16為在裸鼠腫瘤模型中腫瘤部位的磁共振成像效果橫斷面掃面圖片，白色框內(nèi)為腫瘤模型；

圖17為材料在裸鼠肝臟部位的分布與代謝磁共振成像圖片；

圖18為材料在裸鼠腎臟部位的分布與代謝磁共振成像圖片；

圖19裸鼠在給藥24小時后，錳離子在其體內(nèi)的分布情況。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實施例1

(1)稱取精氨酸50mg，加入到裝有40ml去離子水的圓底燒瓶中，在磁力攪拌器500～600r/min條件下攪拌溶解，然后加入3ml環(huán)己烷，加熱至50℃，然后再加入正硅酸乙酯(teos)3ml，反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后用分液漏斗靜置分離，除去上層環(huán)己烷，得到精氨酸穩(wěn)定的二氧化硅納米粒。

對所制備的精氨酸穩(wěn)定的二氧化硅納米粒進(jìn)行tem表征，結(jié)果如圖1所示，二氧化硅納米粒的粒徑約為20nm。

(2)稱取高錳酸鉀固體25mg，去離子水4ml，乙醇1.5ml，二氧化硅納米粒0.5ml(20mg/ml)，將其混合后放入到高壓反應(yīng)釜中，190℃反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。然后用去離子水洗滌、離心3次，最后將所得到的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒分散于10ml水中。

對所制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒進(jìn)行tem表征，結(jié)果如圖2所示，精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的粒徑為5～6nm。

精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的水合粒徑分布圖如圖3所示，說明在水相中納米粒的水粒半徑為185.5nm；精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的zeta電位分布圖如圖4所示，表面電荷為-20.8mv。

對精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒進(jìn)行xrd表征，如圖5所示，證明所合成的納米材料確實為硅酸錳納米粒；精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒的磁滯曲線圖如圖6所示，說明合成的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒是順磁性的；對精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒進(jìn)行xps表征，如圖7所示，說明合成的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒中含有硅，錳，碳和氧等元素；對單純的精氨酸和精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒進(jìn)行uv表征,如圖8所示，兩者在202nm有最大紫外吸收，證明精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒表面有精氨酸修飾；對單純的精氨酸和精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒進(jìn)行熱重(tga)表征，如圖9、10所示，單純精氨酸失重在160℃～250℃左右，精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒在此溫度范圍內(nèi)也有相應(yīng)的失重，證明精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒表面有精氨酸修飾。

實施例2

(1)稱取精氨酸50mg，加入到裝有40ml去離子水的圓底燒瓶中，在磁力攪拌器500～600r/min條件下攪拌溶解，然后加入4ml環(huán)己烷，加熱至60℃，然后再加入正硅酸乙酯(teos)3ml，反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后用分液漏斗靜置分離，除去上層環(huán)己烷，得到精氨酸穩(wěn)定的二氧化硅納米粒。

(2)稱取高錳酸鉀固體25mg，去離子水4ml，乙醇1.5ml，二氧化硅納米粒0.5ml(20mg/ml)，將其混合后放入到高壓反應(yīng)釜中，200℃反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。然后用去離子水洗滌、離心3次，最后將所得到的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒分散于10ml水中。

實施例3

(1)稱取精氨酸50mg，加入到裝有40ml去離子水的圓底燒瓶中，在磁力攪拌器500～600r/min條件下攪拌溶解，然后加入3ml環(huán)己烷，加熱至60℃，然后再加入正硅酸乙酯(teos)3ml，反應(yīng)30小時，反應(yīng)結(jié)束后用分液漏斗靜置分離，除去上層環(huán)己烷，得到精氨酸穩(wěn)定的二氧化硅納米粒。

(2)稱取高錳酸鉀固體25mg，去離子水4ml，乙醇1.5ml，二氧化硅納米粒0.5ml(20mg/ml)，將其混合后放入到高壓反應(yīng)釜中，180℃反應(yīng)30小時，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。然后用去離子水洗滌、離心3次，最后將所得到的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒分散于10ml水中。

性能試驗

1、體外精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒t1加權(quán)成像和弛豫效率的評價

(1)將實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒溶液濃度按等比稀釋，設(shè)置不同的濃度梯度，分別為0，0.4375，0.875，1.75，3.5(mm)。

每個濃度量取200μl液體分別加入到ep管中，然后將ep管放于臨床3.0t核磁共振儀的線圈中。調(diào)整用于t1成像的序列為tr＝240.00ms，te＝15ms，fa＝90.00。如圖11所示，測得的r1值為0.3082mm^-1s^-1。

(2)將實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒在不同ph條件的pbs緩沖液中，研究材料在腫瘤弱酸性微環(huán)境條件下的降解情況，證明這種精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒具有一定得ph響應(yīng)性。

分別將等量的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒分散于ph＝7.4，7.0，6.5，6.0，5.5，5.0的pbs緩沖液中，24h后通過透射電子顯微鏡觀察材料的ph響應(yīng)情況，以及在不同ph條件下的磁共振成像效果評價。

圖12為精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒在不同ph條件分散24小時的tem圖，可知隨著ph的降低，這種泡狀納米粒的結(jié)構(gòu)會發(fā)生降解；圖13為精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒在不同ph條件分散24小時的磁共振成像信號強度圖，說明隨著ph的降低，材料的結(jié)構(gòu)發(fā)生降解，錳離子從結(jié)構(gòu)中釋放出來，從而使得其成像能力得到加強。

(3)將mada-mb231細(xì)胞種于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時，使細(xì)胞貼壁生長，待細(xì)胞密度到達(dá)70-80％，將實施例1制備的不同濃度的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒，分別為0，5，10，25，50，100μg/ml加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，24h后，消化，離心，洗滌細(xì)胞，然后通過磁共振成像判斷細(xì)胞對納米粒的攝取情況。結(jié)果如圖14所示，說明泡狀的硅酸錳納米粒通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且隨著材料濃度的增加，細(xì)胞的攝取量也在增加。

2、精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒作為t1造影劑的體內(nèi)成像效果評價

裸鼠乳腺癌模型的構(gòu)建：將培養(yǎng)的mda-mb231乳腺癌細(xì)胞通過皮下注射到裸鼠(nu/nu)體內(nèi)，每個小鼠種植的乳腺癌細(xì)胞個數(shù)為1×10⁷個，將裸鼠飼養(yǎng)2周后，尾靜脈注射實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒溶液，評價其體內(nèi)成像能力。

每只小鼠加藥量為200μl(2.6mg/ml)，分別在0min，15min，30min，2h，5h，24h，48h，對裸鼠進(jìn)行掃描觀察其成像效果。

圖15，16，17和18為精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒用于乳腺癌裸鼠模型的腫瘤部位核磁共振成像效果的評價以及納米粒在裸鼠體內(nèi)的代謝情況。

圖15為裸鼠的冠狀面掃描圖片，白色框內(nèi)為腫瘤模型；圖16為裸鼠腫瘤部位的橫斷面掃面圖片，白色框內(nèi)為腫瘤模型；圖17為材料在肝臟部位的分布與代謝情況；圖18為材料在腎臟部位的分布與代謝情況。從圖15和16可以看出，尾靜脈給藥兩個小時后腫瘤部位的成像開始增強，并且可以持續(xù)到48小時。

3、給藥后24小時評價材料在小鼠體內(nèi)的分布代謝情況

通過尾靜脈注射200μl(2.6mg/ml)實施例1制備的精氨酸穩(wěn)定的中空泡狀硅酸錳納米粒溶液到腫瘤模型的裸鼠體內(nèi)，24小時后，將裸鼠解剖，取出主要的器官和腫瘤組織，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜分析裸鼠體內(nèi)各個主要器官錳離子的分布情況。圖19為給藥24小時后，錳離子在裸鼠體內(nèi)的分布情況。

以上所述實施例僅是對本發(fā)明較佳的技術(shù)方案，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并非是對本發(fā)明作其他形式的限制，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改，補充和等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。