本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種零余子水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

圍絕經(jīng)期即婦女從絕經(jīng)前出現(xiàn)與絕經(jīng)相關(guān)的內(nèi)分泌、生物學(xué)和臨床特征起，至絕經(jīng)后一年內(nèi)的時(shí)間。女性進(jìn)入絕經(jīng)期后，隨著卵巢功能的衰退和體內(nèi)雌激素水平的下降，引起生理機(jī)能及代謝方面的很大變化，出現(xiàn)潮熱、情緒變化、心血管系統(tǒng)疾病、骨質(zhì)疏松、免疫功能衰退等。早期的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，亞洲女性乳腺癌的發(fā)病率低與其攝入富含植物雌激素的膳食有關(guān)，由此引發(fā)了人們對(duì)植物雌激素藥理活性的濃厚興趣。

零余子，為山藥(薯蕷科薯蕷)的葉腋間常生有腎形或卵圓形的珠芽，又稱山藥籽，俗稱"山藥豆、山藥蛋"，有食補(bǔ)作用。具有補(bǔ)肺益氣，健脾補(bǔ)虛，固腎益精，益心安神，強(qiáng)志增智，滋潤血脈，寧嗽定喘，輕身延年。民間常作為膳食原料，深受大家的喜愛，但目前對(duì)其的藥理活性研究甚少，對(duì)零余子水提物雌激素的研究還未見公開報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種零余子水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，可有效解決零余子水提物的制備及其治療雌激素缺乏癥的用藥問題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種零余子水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的零余子水提物是，將零余子清水洗凈，晾干，稱取晾干后的零余子，每次加晾干后的零余子20倍重量水提取3次，第一次先加20倍重量的水浸泡30min，煎煮1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加藥物20倍重量的水，煎煮1h，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加藥物20倍重量的水，煎煮1h，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，提取液減壓濃縮干燥得零余子水提物。

本發(fā)明零余子水提物具有雌激素樣活性，作為唯一活性成分有效用于制備雌激素類藥物，開拓了零余子的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種零余子水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的零余子水提物是，將零余子清水洗凈，晾干，稱取晾干后的零余子200g，每次加4000ml水提取3次，第一次先加4000ml水浸泡30min，煎煮1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加4000ml水，煎煮1h，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加4000ml水，煎煮1h，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，提取液減壓濃縮干燥得零余子水提物，提取率為2.0％。

實(shí)施例2

本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種零余子水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的零余子水提物是，將零余子清水洗凈，晾干，稱取晾干后的零余子100g，每次加2000ml水提取3次，第一次先加2000ml水浸泡30min，煎煮1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加2000ml水，煎煮1h，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加2000ml水，煎煮1h，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，提取液減壓濃縮干燥得零余子水提物，提取率為1.9％。

實(shí)施例3

本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種零余子水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，所述的零余子水提物是，將零余子清水洗凈，晾干，稱取晾干后的零余子300g，每次加6000ml水提取3次，第一次先加6000ml水浸泡30min，煎煮1h，過濾，得第一次濾液；藥渣再加6000ml水，煎煮1h，過濾，得第二次濾液；第二次藥渣再加6000ml水，煎煮1h，過濾，得第三次濾液，合并三次濾液，提取液減壓濃縮干燥得零余子水提物，提取率為2.2％。

本發(fā)明提取物作為唯一活性成分經(jīng)實(shí)驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用，具有雌激素樣活性和有效用于制備雌激素藥物，有關(guān)試驗(yàn)資料如下：

首先通過小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)對(duì)零余子水提物進(jìn)行雌激素樣活性的篩選，接著采用mcf-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)對(duì)零余子水提物進(jìn)行體外雌激素樣活性的篩選，并且分析零余子水提物對(duì)未成熟雌性小鼠的體重增長率、血清e(cuò)2(雌二醇)、lh(促黃體生成素)、fsh(卵泡刺激素)的影響，初步探討其作用特點(diǎn)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)藥物

本發(fā)明零余子水提物。

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

清潔級(jí)昆明種小鼠，雌性，出生21天(剛斷乳)，體重9～12g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：scxk(京)2016-0011)。人乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.3主要試劑

dmem高糖培養(yǎng)基(gibcoinvitrogen)；去雌激素胎牛血清(廣州四季青)；無酚紅dmem高糖培養(yǎng)基、葡聚糖-活性炭去激素胎牛血清(hyclone)；17β-雌二醇(17β-estrogen，e2)、氨芐青霉素、tris堿(sigma)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥)；edta、mtt及dmso(amresco)；e2、fsh、lhelisa試劑盒(r&d)。

1.4儀器

倒置顯微鏡(nikoneclipsets100)；二氧化碳培養(yǎng)箱(stik)；sorvallst16rcentrifuge高速低溫冷凍離心機(jī)(thermofisherscientific公司)；酶標(biāo)儀(bio-rad680)；超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán))；90-3磁力攪拌器(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；rd-7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；微量加樣器(nichipetexplus)；ab204-n電子讀數(shù)分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品)；10cm培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、凍存管(corning)；普通手術(shù)器械。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)

將小鼠按體重均衡和隨機(jī)的原則分組，持續(xù)給藥7天。正常組每日蒸餾水0.02ml/g灌胃；陽性對(duì)照組隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃；零余子水提物按藥典規(guī)定人用藥量的20倍量×提取率，配成混懸液，每日按0.02ml/g灌胃。最后一次給藥24h后，摘眼球取血，脫頸椎處死小鼠，立即摘取子宮稱重，計(jì)算子宮系數(shù)(子宮濕重×(體重)^-1×100％)。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果與正常組相比，計(jì)算p值，考察有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2mcf-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

mcf-7細(xì)胞經(jīng)含5％去雌激素胎牛血清的無酚紅dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，pbs洗兩次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入無酚紅dmem培養(yǎng)基吹打均勻，以2×10⁴個(gè)/ml的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為200μl。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，換為含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在490nm下測定各孔吸光度值(a)，計(jì)算平均a值和細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。

細(xì)胞活力＝各組od值/正常組od值

2.3elisa法檢測血清e(cuò)2、lh、fsh

小鼠摘眼球取血，血液室溫靜置1h后，3000轉(zhuǎn)低溫離心10min，取上清。按照elisa試劑盒說明書仔細(xì)操作。

2.4統(tǒng)計(jì)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，用spss20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(one-wayanova)進(jìn)行組間差異的比較，以p<0.05為差異有顯著性意義，以p<0.01為差異有極顯著性意義。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1零余子水提物對(duì)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響

與正常組相比，零余子水提物能顯著誘導(dǎo)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的增加(p<0.05)。提示零余子水提物在體內(nèi)具有雌激素樣作用。見表1。

表1零余子水提物對(duì)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響(n＝10)

注:與正常組比較，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

3.2零余子水提物對(duì)mcf-7細(xì)胞促增殖作用

零余子水提物在10^-2mg/ml時(shí)與正常組比，對(duì)mcf-7細(xì)胞有顯著的促增殖作用(p<0.05)。提示零余子水提物在體外具有雌激素樣作用。見表2。

表2零余子水提物對(duì)mcf-7細(xì)胞增殖的影響(n＝6)

注:與正常組比較，*表示p<0.05，**表示p<0.01。

3.3零余子水提物對(duì)血清e(cuò)2、lh、fsh的影響

與正常組相比，零余子水提物能顯著增加小鼠血清e(cuò)2、lh的水平，但基本不影響血清fsh的水平(p<0.05)。提示零余子水提物在體具有雌激素樣作用，可能與其增加體內(nèi)e2以及l(fā)h的水平有關(guān)。見表3。

表3零余子水提物對(duì)血清e(cuò)2、lh、fsh的影響(n＝10)

注:與正常組比較，*表示p<0.05，**表示p<0.01；

四結(jié)論

子宮中含有大量的雌激素受體(ers)，雌激素類物質(zhì)通過與該受體結(jié)合，可誘導(dǎo)子宮靶蛋白(ips)含量增加，表現(xiàn)為子宮組織增生等，因此可以通過測定外源雌激素對(duì)性未成熟小鼠子宮促增長作用來評(píng)價(jià)藥物的雌激素樣活性。本實(shí)驗(yàn)采用性未成熟雌性小鼠子宮濕重與體重之比(子宮系數(shù))作為評(píng)價(jià)雌激素樣活性的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，零余子可顯著增加性未成熟小鼠子宮系數(shù)，提示零余子水提物在體內(nèi)具有雌激素樣作用。

mcf-7細(xì)胞是雌激素受體陽性的人乳腺癌細(xì)胞株，能特異地受雌激素或雌激素樣活性物質(zhì)調(diào)節(jié)而增殖，是最常用的檢測雌激素樣活性的細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，零余子水提物在濃度為0.01mg/ml時(shí)對(duì)mcf-7細(xì)胞有顯著的促增殖作用。提示零余子水提物在體內(nèi)、體外均有一定的雌激素樣作用。

雌二醇是體內(nèi)主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進(jìn)和調(diào)節(jié)女性性器官及副性征的正常發(fā)育。促黃體生成素由垂體產(chǎn)生的一種激素在在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。卵泡刺激素是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種激素，主要作用為促進(jìn)卵泡成熟，促進(jìn)整個(gè)卵巢長大。研究發(fā)現(xiàn)，零余子水提物可以顯著性增加未成熟雌性小鼠的血清e(cuò)2以及l(fā)h的水平，但對(duì)fsh的影響不大。推測零余子水提物增加小鼠子宮系數(shù)發(fā)揮雌激素樣活性可能與其增加體內(nèi)e2以及l(fā)h的水平有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)證明，零余子水提物作為唯一活性成分有效用于制備雌激素藥物，實(shí)現(xiàn)零余子水提物作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，開拓了制備雌激素類藥物的新途徑，提高了零余子的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。