本發(fā)明涉及一種兩親性共聚物及其制備方法和應(yīng)用，具體說，是涉及一種氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物及其制備方法和在抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用，屬于藥物制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：癌癥作為21世紀(jì)威脅人類健康的重大疾病之一，具有治愈率低，復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，目前已經(jīng)成為最重要的威脅人類生命健康的疾病之一。據(jù)報道，2012年全球范圍內(nèi)癌癥共造成820萬人死亡，其中以肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌為主。過去十年，制藥行業(yè)中的腫瘤藥物供應(yīng)規(guī)模擴(kuò)大了超過60％，目前有超過500家公司正在從事該領(lǐng)域藥物的研發(fā)，2015年共有586種抗癌化合物已經(jīng)進(jìn)入臨床研發(fā)后期，十家規(guī)模最大的腫瘤藥物銷售商，有130種候選藥物正處在研發(fā)后期。目前，治療腫瘤的方法主要有放射療法、手術(shù)切除法、藥物化療和基因治療等。腫瘤的發(fā)生與生長是多種因素和途徑綜合作用的結(jié)果，上述單一的治療方法通常只解決一方面的問題，對腫瘤治療效果有限，經(jīng)常會伴隨腫瘤的多藥耐藥性產(chǎn)生，例如：手術(shù)切除法只能切除顯而易見的腫瘤細(xì)胞，對于那些微小以及隱匿的癌細(xì)胞是無法切除的，這給術(shù)后的復(fù)發(fā)埋下了隱患；而化療藥物的選擇性不強(qiáng)，在殺滅癌細(xì)胞的同時也會不可避免地?fù)p傷人體正常的細(xì)胞，從而出現(xiàn)藥物的不良反應(yīng)等。針對此種現(xiàn)象，腫瘤的聯(lián)合治療成為一個新興的研究領(lǐng)域，腫瘤的聯(lián)合治療可以通過聯(lián)合多種治療手段克服單一治療存在的問題，通過藥物與基因在腫瘤部位作用于不同靶點(diǎn)使得藥物之間發(fā)揮協(xié)同治療作用。現(xiàn)有的聯(lián)合治療主要有各種化療藥物協(xié)同治療、化學(xué)藥物和基因藥物的聯(lián)合治療。由于基因與化療藥物的作用機(jī)理不同，針對不同腫瘤發(fā)生途徑，在聯(lián)合治療中應(yīng)用最具前景。在化學(xué)藥物和基因藥物的聯(lián)合治療的實際應(yīng)用中還存在許多問題，主要包括：化療藥物常因水溶性差，導(dǎo)致其在體內(nèi)生物利用度低；治療基因表面是帶電負(fù)性的，由于靜電斥力很難進(jìn)入細(xì)胞，即使進(jìn)入細(xì)胞，單獨(dú)的治療基因也極易被體液中的核酸酶分解，無法起到治療作用，必須通過合適的載體將治療基因包裹著進(jìn)入細(xì)胞，且在恰當(dāng)?shù)臅r候?qū)⒅委熁蜥尫懦鰜?。因此，簡單、高效的能共同輸送藥物和基因的共輸送載體是聯(lián)合治療成功的關(guān)鍵。兩親性共聚物在水中完全溶解后可自發(fā)形成由親水性外殼和疏水性內(nèi)核組成的高分子聚合物膠束，并完成對疏水性藥物的增溶和包載，親水性外殼可以保護(hù)疏水性藥物避免與水相環(huán)境接觸，并且在體內(nèi)環(huán)境中可以防止被res系統(tǒng)識別，從而增強(qiáng)膠束的穩(wěn)定性。聚合物膠束具有粒徑小，載藥量高，可提高水難溶性藥物溶解度等特點(diǎn)，這些特點(diǎn)也使得聚合物膠束能夠作為理想的抗癌藥物遞送載體和腫瘤靶向載體?；蜉d體大體可以分為病毒性基因載體和非病毒性基因載體，陽離子聚合物是近年來發(fā)展的一種非病毒性基因載體，如聚精氨酸、聚乙烯亞胺、殼聚糖、聚酰胺-胺和聚賴氨酸等，陽離子聚合物外端含有大量可修飾的基團(tuán)，在經(jīng)過功能性分子的修飾后，能夠高效率地負(fù)載藥物和治療基因，將藥物和治療基因精準(zhǔn)地遞送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖，殺死腫瘤細(xì)胞的作用。盡管與病毒基因載體相比，陽離子聚合物具有可負(fù)載任意大小基因、易于制備和低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，但是轉(zhuǎn)染效率和材料毒性之間的矛盾一直制約著陽離子聚合物作為基因載體的應(yīng)用，同時具備較低的細(xì)胞毒性和較高的轉(zhuǎn)染效率的陽離子聚合物基因載體急需研發(fā)。含雙硫鍵的超支化聚酰胺胺外端含有大量活性基團(tuán)氨基，易于被修飾而使其具有多功能，如接上靶向分子而具有靶向功能或者連接上膠束而具有包載化療藥物的功能。加之其本身呈現(xiàn)正電性，可以負(fù)載治療基因，因此也可以作為基因載體來運(yùn)用。雙硫鍵的存在賦予材料氧化還原響應(yīng)性，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高濃度gsh存在下，可以發(fā)生雙硫鍵的斷裂，從而釋放其所包裹的藥物或者基因，同時降低材料的毒副作用。目前對超支化聚酰胺胺載體的修飾和改變中，通常是將超支化聚酰胺胺結(jié)合一個疏水性的載體基團(tuán)形成兩親性共聚物用于藥物和基因的共同載體，專利cn201410184171.4中公開了一種可降解超支化聚酰胺胺，該專利采用一鍋法邁克爾加成聚合反應(yīng)制備得到可降解超支化聚酰胺胺，在此基礎(chǔ)上偶聯(lián)聚乙二醇(peg)和葉酸(fa)，得到葉酸靶向、peg化的可降解超支化聚酰胺胺，得到的聚合物可用作治療腫瘤的藥物載體；李夢藝等人(氧化還原響應(yīng)性超支化聚酰胺胺衍生物在腫瘤治療中的應(yīng)用，《暨南大學(xué)》，2016)先用葉酸分子修飾超支化聚酰胺胺，然后通過酰胺化反應(yīng)在超支化聚酰胺胺上連接聚乙二醇-聚乳酸，合成了聚乙二醇-聚乳酸-超支化聚酰胺胺嵌段共聚物，從而構(gòu)建一種基因和藥物共遞送載體。但是上述共聚物對腫瘤的治療效果有限，還不能滿足使用需求。目前還沒有采用疏水性的抗癌藥物作為疏水嵌段修飾超支化聚酰胺胺形成一種本身具有抗腫瘤作用的高分子藥物載體的相關(guān)報道，更加沒有采用疏水性的抗癌藥物作為疏水嵌段修飾超支化聚酰胺胺形成一種本身具有抗腫瘤作用的高分子藥物載體，然后該藥物載體在水中形成膠束，進(jìn)而包載第二種抗腫瘤藥物，并通過靜電作用，還負(fù)載一種治療基因，成為用于治療腫瘤的藥物和基因的共遞送載體的相關(guān)報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物及其制備方法和在抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用，以實現(xiàn)基因與化學(xué)治療的聯(lián)合應(yīng)用，提高腫瘤的治療效果。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物，為具有式ⅰ結(jié)構(gòu)的化合物：其中x為帶羧基或與乙酸酐衍生化后帶羧基的抗腫瘤活性藥物。x優(yōu)先選擇藤黃酸(簡稱ga)、甲氨蝶呤(簡稱me)或阿霉素(簡稱dox)中的任意一種。一種制備所述氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物的方法，包括如下反應(yīng)：a)式ⅱ化合物(即胱胺)在堿性條件下與丙烯酰氯反應(yīng)得到式?；衔?化學(xué)名為n,n’-雙(丙烯酰)胱胺，簡稱cba)；b)式?；衔镌诖呋瘎┐嬖谙屡c1-(2-胺乙基)哌嗪(簡稱aepz)進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)得到式ⅳ化合物(即超支化聚酰胺胺paas)；c)式ⅳ化合物在催化劑和縮合劑存在下與抗腫瘤活性藥物x進(jìn)行酰胺化反應(yīng)得到式ⅰ化合物(簡稱為pax)；其具體反應(yīng)路線如下所示：a反應(yīng)中的堿優(yōu)選氫氧化鈉。a反應(yīng)中的式ⅱ化合物與丙烯酰氯的摩爾比優(yōu)選為1:2～1:3。b反應(yīng)中的催化劑優(yōu)選氯化鈣。b反應(yīng)中的反應(yīng)溫度優(yōu)選為45～55℃。b反應(yīng)中的式?；衔锱c1-(2-胺乙基)哌嗪的摩爾比優(yōu)選為2:3～2:4。c反應(yīng)中的催化劑優(yōu)選4-二甲基吡啶(簡稱dmap)，縮合劑優(yōu)選1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(簡稱edc)。c反應(yīng)中的式ⅳ化合物與抗腫瘤活性藥物x的摩爾比優(yōu)選為2:3～3:2。采用上述技術(shù)方案得到的氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物pax，其分子量為5000～10,0000，將其溶于去離子水后，在去離子水中臨界膠束濃度為0.001～0.05mg/ml。一種氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌或腸癌。一種所述氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物自組裝形成的膠束，包括所述的氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物。所述氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物自組裝形成的膠束，為空白膠束或包載有疏水性抗腫瘤活性藥物y的載藥膠束(該載藥膠束簡稱pax/y)。該自組裝形成的膠束其結(jié)構(gòu)中具有抗腫瘤作用的化合物x和雙硫鍵，同時其表面帶有正電荷，屬于陽離子膠束的一種。所述疏水性抗腫瘤活性藥物y選自阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜樹堿、伊立替康、拓?fù)涮婵怠㈤L春堿、長春地辛中的任意一種。所述載藥膠束中，pax與疏水性抗腫瘤活性藥物y的質(zhì)量比優(yōu)選為優(yōu)選9:1～99:1，以9:1～19:1為佳。所述氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物自組裝形成的膠束可以通過薄膜揮發(fā)法、透析法或乳化法三種方法制備而得，具體如下：采用薄膜揮發(fā)法制備氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物自組裝形成的膠束，包括如下操作：將氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物或氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物與疏水性抗腫瘤活性藥物y溶于極性溶劑中，真空揮發(fā)除去極性溶劑，得到空白或載藥薄膜，然后加入適量去離子水，室溫攪拌，膜過濾，凍干，即得空白膠束或載藥膠束。采用透析法制備氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物自組裝形成的膠束，包括如下操作：將氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物或氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物與疏水性抗腫瘤活性藥物y溶于極性溶劑中，轉(zhuǎn)移至透析袋(mwcutoff＝1000)中，置于去離子水中透析，除去極性溶劑，膜過濾，凍干，即得空白膠束或載藥膠束。采用乳化法制備氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物自組裝形成的膠束，包括如下操作：將氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物或氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物與疏水性抗腫瘤活性藥物y溶于極性溶劑中，加入適量去離子水，超聲乳化，抽真空除去極性溶劑，膜過濾，凍干，即得空白膠束或載藥膠束。采用上述技術(shù)方案得到的載藥膠束的粒徑大小為100-300nm，表面電位為40-70mv。一種氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物自組裝形成的膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌或腸癌。一種同時負(fù)載治療基因和化療藥物的膠束，將氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物自組裝形成的膠束的溶液與治療基因z的溶液按照一定的質(zhì)量比混合，室溫孵育，即得所述同時負(fù)載治療基因和化療藥物的膠束(簡稱pax/y/z)。由于自組裝形成的膠束中除了結(jié)構(gòu)中具有抗腫瘤作用的化合物x外，還可用于包載疏水性化療藥物y，并且由于其表面帶有正電荷，因此可靜電吸附一種治療基因z，從而形成所述同時負(fù)載治療基因和化療藥物的膠束pax/y/z，該pax/y/z膠束可同時運(yùn)載兩種抗腫瘤藥物和一種治療基因，屬于多載藥體系，同時結(jié)構(gòu)中雙硫鍵可在腫瘤細(xì)胞中高濃度gsh的作用下發(fā)生斷裂，并釋放出抗腫瘤作用的化療藥物x和y，以及治療基因z，具有氧化應(yīng)激功能。所述同時負(fù)載治療基因和化療藥物的膠束中，pax與治療基因z的質(zhì)量比優(yōu)選9:1～99:1，以9:1～19:1為佳。所述治療基因選自p53gene、bcl-2sirna、egfrsirna、vegfsirna中的任意一種。所述負(fù)載治療基因的膠束其粒徑為100-300nm，表面電位為-50至+60mv，以0-30mv為最佳值。一種同時負(fù)載治療基因和化療藥物的膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述腫瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌或腸癌。總之，由于本發(fā)明所述的氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物pax具有抗腫瘤作用，可以用于制備抗腫瘤藥物，因此，基于pax自組裝形成的膠束及同時負(fù)載治療基因和化療藥物的膠束均可用于制備抗腫瘤藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著性有益效果：本發(fā)明的氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物pax相較于傳統(tǒng)的超支化聚酰胺胺衍生物而言，直接由帶羧基或與乙酸酐衍生化后帶羧基的抗腫瘤活性藥物x作為疏水端與親水的超支化聚酰胺胺paas通過酰胺化反應(yīng)得到，其主鏈上含有抗腫瘤活性藥物，自身即具有抗腫瘤作用；同時pax是一種具有疏水性和親水性嵌段的星型嵌段聚合物，由于結(jié)構(gòu)中具有兩親性嵌段，臨界膠束濃度較低，可在水中自組裝形成膠束，膠束內(nèi)層疏水端可進(jìn)一步包裹另一種疏水性抗腫瘤藥物y，并且由于膠束外表面帶有正電，通過靜電作用，還可以進(jìn)一步負(fù)載一種治療基因z，從而得到一種同時負(fù)載治療基因和化療藥物的膠束，該同時負(fù)載治療基因和化療藥物的膠束作為一種全新的藥物和基因的共遞送載體，可用于制備抗腫瘤藥物，治療包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、腸癌等癌癥；由pax得到的膠束pax/y/z，穩(wěn)定性好，其結(jié)構(gòu)中的雙硫鍵具有氧化應(yīng)激功能，可在腫瘤細(xì)胞中高濃度gsh的作用下發(fā)生解離，并釋放出所載的藥物x、y和基因z，從而實現(xiàn)靶向性，提高藥物的生物利用度同時降低毒副作用；另外，本發(fā)明制備方法簡單，無需特殊設(shè)備和苛刻條件，易于實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，具有極強(qiáng)的實用價值。附圖說明圖1為實施例3中pag的核磁氫譜；圖2為實施例3中paas、ga、pag的紫外吸收譜圖；圖3為實施例3中pag的gpc圖；圖4為實施例3中pag的cmc圖；圖5a為實施例6中pag-mmp-9在不同質(zhì)量比下的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖5b為實施例6中pag/dtx-mmp-9在不同質(zhì)量比下的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖5c為實施例6中dtt存在下pag/dtx-mmp-9在不同質(zhì)量比下的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖6為實施例7中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗圖；圖7為實施例8中pag/dtx-mmp-9膠束的透射電鏡圖；圖8為實施例9中pag/dtx的藥物釋放曲線；圖9為實施例10中dtx、dtx-mmp-9、pag/dtx、pag/dtx-mmp-9對mcf-7細(xì)胞增殖的抑制曲線(以dtx濃度計算)；圖10為實施例10中mmp-9、pag-mmp-9、dtx-mmp-9、pag/dtx-mmp-9對mcf-7細(xì)胞增殖的抑制曲線(以mmp-9濃度計算)；圖11為實施例11中nr,pag-nr,mmp-9sirna,pag/nr-mmp-9在mcf-7細(xì)胞內(nèi)吞實驗流式結(jié)果圖；圖12為實施例12中pag/icg、icg、空白裸鼠小動物成像實驗結(jié)果；圖13為實施例13中pag/dtx-mmp-9、pag-mmp-9、抗mcf-7乳腺癌的藥效結(jié)果；具體的13a為mcf-7荷瘤裸鼠腫瘤生長情況；13b為荷瘤裸鼠體重變化；13c為荷瘤裸鼠腫瘤重量比較；13d為荷瘤裸鼠腫瘤圖片；與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01；圖14為實施例13中mcf-7荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、腎、腫瘤h&e組織切片圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。實施例1：化合物ⅲ(n,n’-雙(丙烯酰)胱胺)的制備：將2.5g胱胺鹽酸鹽(化合物ⅱ)、1.8gnaoh溶于15.5ml去離子水中，冰浴條件下，滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液(3.3ml丙烯酰氯溶解于3.3ml無水二氯甲烷)，滴加完畢撤去冰浴，室溫下反應(yīng)6小時，結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)液加入200ml二氯甲烷萃取，萃取三次，合并有機(jī)相，有機(jī)相經(jīng)減壓蒸餾和真空干燥得白色粉末狀物質(zhì)，即化合物ⅲ(n,n’-雙(丙烯酰)胱胺)。經(jīng)測試：1hnmr(600mhz,cdcl3):δ6.68(s,1h)，6.34(dd,j＝17.0,1.5hz,1h)，6.24(dd,j＝17.0,10.2hz,1h)，5.69(dd,j＝10.2,1.5hz,1h)，3.69(q,j＝6.4hz,2h)，2.90(t,j＝6.5hz,2h)。實施例2：化合物ⅳ(超支化聚酰胺胺paas)的制備：將0.642g化合物ⅲ和0.592g無水氯化鈣溶于15ml甲醇水溶液中(甲醇/水的體積比為3/1)中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，反應(yīng)液升溫至50℃，攪拌下滴加0.16ml1-(2-胺乙基)哌嗪(aepz)，滴加完畢后，于50℃保溫反應(yīng)36小時，然后再次滴加0.35ml1-(2-胺乙基)哌嗪(aepz)，繼續(xù)保溫反應(yīng)4小時，結(jié)束反應(yīng)，加入稀鹽酸將反應(yīng)體系ph調(diào)節(jié)至3-4，然后將反應(yīng)液加入透析袋(mwcutoff＝1000)中，透析24小時，離心去除沉淀，溶液冷凍干燥得淡黃色粘稠物，即化合物ⅳ(超支化聚酰胺胺paas)。經(jīng)測試：1hnmr(600mhz,d2o)δ3.60(m,4h,conhch2ch2s)，3.30(m,4h,nch2ch2co)，3.25(m,4h,nch2ch2co)，2.92(m,4h,conhch2ch2s)，2.5-2.9(m,12h,ch2fromaepz)。實施例3：氧化還原響應(yīng)性兩親性超支化聚酰胺胺-藤黃酸共聚物pag的制備：將0.5g藤黃酸(ga)和0.1g4-二甲基吡啶(dmap)溶于10ml無水二氯甲烷中，在冰浴條件下，加入0.3g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)，冰浴攪拌1小時，然后加入1.5g化合物ⅳ，室溫反應(yīng)24小時，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液加入至透析袋(mwcutoff＝3500)中，透析24小時，離心去除沉淀，溶液冷凍干燥得黃色粘稠物，即超支化聚酰胺胺-藤黃酸共聚物(簡稱pag)。圖1為pag的核磁譜圖(1h-nmr(dmso-d))，圖中δ5.0-9.0ppm屬于藤黃酸的特征峰(h)，同時cba和1-(2-胺乙基)哌嗪的特征峰(a-f)也在氫譜中標(biāo)出，證明制得的化合物為所需要的超支化聚酰胺胺-藤黃酸共聚物pag。圖2為ga、paas和pag的uv譜圖；從圖中可見，在200nm,paas有末端吸收，而藤黃酸吸收較小，其結(jié)合物pag保留了200nm處的末端吸收，同時，藤黃酸在285nm處有吸收峰，paas在此處吸收峰較小，pag此處的最大吸收峰紅移至279nm，提示所制備的pag具有paas與ga共同的紫外光譜特征；同時根據(jù)藤黃酸在279nm處的吸光度標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，測定pag在波長279nm處的吸光度，pag中藤黃酸的含量在16.1-23.2％范圍內(nèi)，證明制得的化合物為所需要的超支化聚酰胺胺-藤黃酸共聚物pag。對制得的超支化聚酰胺胺-藤黃酸共聚物pag進(jìn)行性能測試，具體如下：a)pag的氧化還原響應(yīng)性測試：采用凝膠滲透色譜儀測定pag的分子量以及其在相同作用時間的還原劑gsh環(huán)境下，pag的分子量大小變化，具體為：將實驗分為兩組進(jìn)行，a組：無gsh處理組；b組：100mmgsh水溶液；兩組同時加入pag，室溫下攪拌4h，攪拌結(jié)束后，將樣品凍干，重新溶解在dmf(二甲基甲酰胺)中，pag樣品濃度為2mg/ml，利用凝膠滲透色譜儀對兩組溶液進(jìn)行分析；實驗儀器：agilenthplc1260-示差檢測器，流動相：dmf，柱溫：35℃，流速：1.0ml/min，并且記錄保存凝膠滲透色譜圖；以相同色譜條件下采用一系列不同分子量的聚甲基丙烯酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜峰峰位作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品分子量及分子量分布情況。具體實驗結(jié)果如圖3所示。圖3為pag的gpc圖；上面的譜圖為a組，a組在沒有g(shù)sh作用下，pag分子量為單峰，分子量分布系數(shù)為1.65，分子量mw為1.542*104；下面的譜圖的b組，b組在10mmgsh作用4h后，出峰時間右移至4.2min，分子量mn為1879，分子量明顯的減小，表明100mmgsh作用4h后pag發(fā)生降解，大分子鏈斷裂成小分子片段；從結(jié)果可以看出，當(dāng)100mmgsh作用4h后pag就會發(fā)生降解，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)gsh的濃度遠(yuǎn)大于10mmgsh，故在腫瘤細(xì)胞內(nèi)pag會發(fā)生降解，從而說明本實施例的pag具有氧化還原響應(yīng)性。b)pag的臨界膠束濃度測定：采用經(jīng)典的芘熒光探針法對共聚物pag臨界膠束濃度值(cmc)進(jìn)行測定，測定方法如下：1)配制芘濃度為5×10-5mol/l的丙酮溶液，分別將此母液100μl轉(zhuǎn)移至一系列的10ml棕色容量瓶中；2)取適量pag，用水配置至濃度為3mg/ml水溶液，吸取不同體積pag溶液加入到上述含芘的棕色容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，得到熒光探針芘終濃度為5×10-7mol/l，最終配成pag濃度分別為1×10-4、5×10-4、1×10-3、5×10-3、1×10-2、2×10-2、3×10-2、4×10-2、6×10-2、8×10-2、0.1、0.2、0.4、0.6mg/ml的一系列濃度的混合溶液；3)將這些混合溶液置于180w功率下水浴超聲40min，40℃水浴過夜使其充分平衡；4)使用熒光分光光度計測量其熒光光譜，熒光掃描的激發(fā)波長為334nm，發(fā)射及激發(fā)狹縫寬度分別是2.5和5.0nm，將掃描速度設(shè)為240nm/min，記錄芘在不同濃度pag溶液中的熒光光譜圖，以pag的濃度為橫坐標(biāo)，i1(373nm)/i3(384nm)為縱坐標(biāo)，繪制不同濃度下芘的i1/i3強(qiáng)度比的變化曲線。芘熒光探針法就是利用該特點(diǎn)，將低溶解度的芘溶解在兩親性聚合物pag溶液中，通過芘溶解度的變化來測定聚合物的cmc值。當(dāng)兩親性共聚物的濃度超過cmc并形成膠束時，由于其內(nèi)部疏水基的增溶作用，芘的溶解度急劇增加，導(dǎo)致芘在水溶液中i1/i3降低，據(jù)此，可以準(zhǔn)確的測定聚合物的cmc值。具體測定結(jié)果如圖4所示。圖4為pag的cmc圖，從圖中可見在c(pag)為0.03mg/ml時i334/i337熒光強(qiáng)度的比值曲線有1個明顯的拐點(diǎn)，可以確定pag對應(yīng)的臨界膠束濃度為0.03mg/ml，臨界膠束濃度較低，便于在水中自組裝形成膠束進(jìn)一步包載抗腫瘤藥物或治療基因。實施例4：pag/dtx載藥膠束的制備：將pag共聚物溶于甲醇，將多烯紫杉醇(dtx)用甲醇溶解成1mg/ml，按照不同比例(pag與多烯紫杉醇的質(zhì)量比為1:1、2:1、4:1、9:1、19:1、49:1、99:1)將兩者渦旋混勻后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在40℃，100rpm的條件下，以-0.09mpa的真空度緩慢旋干甲醇，形成載藥薄膜，然后將載藥薄膜置于真空干燥器內(nèi)，抽真空干燥3小時，除去殘留的甲醇，室溫條件下以2ml去離子水磁力攪拌水化4h，然后2000r離心5min除去沒有包封的dtx，用0.45μm醋酸纖維素酯膜過濾，濾液凍干，即得pag/dtx載藥膠束凍干粉，每組平行實驗3份。分別測定各組pag/dtx載藥膠束中多烯紫杉醇(dtx)的載藥量、包封率、粒徑、zeta電位，具體如下：a)載藥量和包封率的測定：稱取適量凍干pag/dtx載藥膠束于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解并定容得到待測樣品。利用hplc測定樣品中多烯紫杉醇的濃度及質(zhì)量，根據(jù)以下公式計算載藥量及包封率：載藥量(lc％)＝膠束內(nèi)的多烯紫杉醇質(zhì)量/膠束的質(zhì)量*100％；包封率(ee％)＝膠束內(nèi)的多烯紫杉醇的質(zhì)量/藥物投入量*100％；具體測試結(jié)果如表1所示。b)粒徑及粒徑分布、zeta電位測定：取適量凍干pag/dtx載藥膠束，用去離子水配成濃度為0.5mg/ml的樣品，利用馬爾文納米粒度、zeta電位和絕對分子量分析儀測定載藥膠束的粒徑及其分布，檢測角度為90°，測試溫度為25℃；具體測試結(jié)果如表1所示。表1不同比例pag/dtx載藥膠束的性能測試數(shù)據(jù)pag/dtx載藥率包封率size電位1:117.4％±2.3％7.2％±1.1％215.1±34.6nm44.8±8.9mv2:117.7％±2.4％26.7％±4.3％257.5±18.7nm44.3±0.7mv4:112.4％±1.3％39.2％±2.9％204.4±27.4nm50.8±3.6mv9:18.5％±1.0％92.2％±5.7％145.7±10.4nm60.2±6.2mv19:16.4％±0.6％87.9％±3.3％115.9±13.7nm63.4±2.6mv49:13.4％±0.3％88.6％±3.3％117.7±15.2nm58.5±3.6mv99:10.5％±0.1％94.3％±1.9％109.0±7.2nm55.1±2.2mv由表1可見：pag水溶液膠束在包載不同劑量的dtx時，包封率隨著載藥率的增加而迅速降低，兼顧載藥率與包封率實驗結(jié)果，將選擇pag:dtx質(zhì)量比為9:1為最佳投料比，使得dtx的包封率高達(dá)92.2％，在此比例下，本申請的pag水溶液膠束可以很好的負(fù)載疏水性抗腫瘤活性藥物dtx，顯著增加疏水性抗腫瘤藥物的溶解度，生物利用度好；載藥膠束的表面電位隨dtx載藥量的變化，影響不大，在44.8-63.4mv的范圍內(nèi)，呈電正性，使得其所帶的表面正電荷有利于基因的運(yùn)載，為其進(jìn)一步包載治療基因提供了理論依據(jù)；制備的載藥膠束粒徑為納米級別。實施例5：包載治療基因的pag/dtx/mmp-9膠束的制備：取pag/dtx(質(zhì)量比為9:1)膠束凍干粉(含2mgpag計)，配置成1mg/mlpag/dtx的水溶液，經(jīng)孔徑為0.45μm的微孔過濾頭處理后，把pag/dtx與mmp-9(全稱mmp-9-sirna，是sirna的一種)溶液分別按照一定質(zhì)量比(1:1、2:1、4:1、9:1、19:1、49:1、99:1)進(jìn)行靜置混合，室溫孵育30分鐘，即可得到pag/dtx-mmp-9膠束，測定各pag/dtx/mmp-9膠束的粒徑及粒徑分布、zeta電位，測定結(jié)果如表2所示。表2pag/dtx/mmp-9膠束的性能測試數(shù)據(jù)投料比(質(zhì)量比)是否有dtx析出size電位1:1沉淀221.4±8.4nm-46.3±3.2mv2:1沉淀233.7±1.2nm-29.8±0.1mv4:1渾濁411.0±38.0nm-13.4±0.6mv9:1乳光238.6±23.7nm5.6±2.1mv19:1澄清170.4±1.2nm22.7±1.1mv49:1澄清162.4±2.6nm44.2±0.8mv99:1澄清171.6±6.354.9±1.3mv由表2可見：由于超支化聚酰胺胺含有大量的氨基，故pag電位呈現(xiàn)正電性，而mmp-9是帶負(fù)電，由于細(xì)胞膜表面帶負(fù)電，載體與基因所形成的復(fù)合物想要進(jìn)入細(xì)胞，呈正電更有利于藥物的吸收；zeta電位分析結(jié)果表明pag/dtx與mmp-9能形成帶正電性的膠束，這為其作為基因載體運(yùn)載基因進(jìn)入細(xì)胞提供可能性，pag/dtx-mmp-9膠束的zeta電位隨著mmp-9加入比例的增加，電位逐漸減小，并且由正電荷轉(zhuǎn)為負(fù)電荷，當(dāng)pag-mmp-9質(zhì)量比為4時，pag/dtx-mmp-9膠束的表面電位由正電轉(zhuǎn)為負(fù)電；膠束的粒徑隨著mmp-9加入比例的增加逐漸增大，直至出現(xiàn)沉淀，根據(jù)文獻(xiàn)報道，粒徑在50-200nm之間的粒子容易進(jìn)入細(xì)胞，兼顧考慮所形成pag/dtx-mmp-9膠束的電位和粒徑，當(dāng)pag：mmp-9的質(zhì)量比范圍在9:1-19:1之間時，所形成電位在22.7至44.2mv之間，納米粒大小在170nm，符合臨床治療要求，因此，pag-mmp-9的質(zhì)量比范圍為9:1-19:1制備得到的膠束符合臨床治療要求。實施例6：凝膠電泳實驗采用凝膠電泳實驗來評價pag對mmp-9的結(jié)合能力，具體如下：電泳凝膠板由1％的瓊脂糖(含0.2μg/ml的溴化乙錠)制得，分別取10μl的聚合物/基因復(fù)合物注入凝膠板上的凹槽內(nèi)，用1×tae做電泳緩沖液，140伏電壓下電泳15分鐘；然后通過biodoc-ittmsystem凝膠成像系統(tǒng)將電泳結(jié)果成像；分別考察pag/dtx(9:1)和mmp-9不同質(zhì)量比(0/4/9/14/19)時，形成pag-mmp-9膠束的穩(wěn)定性，且考察pag/dtx(9:1)-mmp-9膠束的穩(wěn)定性；同時另一組樣品加入還原劑dtt(二硫蘇糖醇)，使之終濃度為3mm，考察dtt對pag/dtx(9:1)-mmp-9膠束的穩(wěn)定性的影響；具體結(jié)果如圖5a-c所示。圖5a為pag-mmp-9在不同質(zhì)量比下的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖5b為pag/dtx-mmp-9在不同質(zhì)量比下的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖5c為dtt存在下pag/dtx-mmp-9在不同質(zhì)量比下的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；從圖5a可知，當(dāng)pag和mmp-9質(zhì)量比為0、4時，mmp-9可從電場中遷出，表明pag不能與mmp-9形成穩(wěn)定的復(fù)合物；直到兩者質(zhì)量比為9及以上時，顯示mmp-9不能從電場中遷移出，表明pag和mmp-9已形成穩(wěn)定的復(fù)合物；而相同條件下，pag和mmp-9質(zhì)量比為9時，pag/dtx-mmp-9仍能觀察到mmp-9能從電場中遷移出(見圖5b)，從而可以推測dtx的載入后，在一定程度會影響pag對mmp-9的復(fù)合作用，直到兩者質(zhì)量比為14及以上時，顯示mmp-9不能從電場中遷移出；因此，選擇以pag/mmp-9＝14:1為本實驗進(jìn)一步研究的處方；同時在3mmdtt作用下(見圖5c)，pag結(jié)構(gòu)中的雙硫鍵發(fā)生解離，使得形成膠束結(jié)構(gòu)破壞，并進(jìn)一步破壞pag/dtx(9:1)-mmp-9的穩(wěn)定性，使得pag/dtx(9:1)和mmp-9質(zhì)量比>14時，mmp-9sirna均能從電場中遷移出，之前形成的穩(wěn)定膠束在強(qiáng)還原劑環(huán)境中發(fā)生解離。該實驗結(jié)果提示本申請的pag在腫瘤細(xì)胞中還原性條件下，可以發(fā)生定位解離，釋放出抗腫瘤藥物與基因藥物，發(fā)揮其抗腫瘤作用。實施例7：細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗本實驗使用的mmp-9sirna是進(jìn)入細(xì)胞可表達(dá)綠色熒光蛋白的基因，從大腸桿菌中提取。取對數(shù)期生長的mcf-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度以每孔105個接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞飽和度為70％；接著換(1x)無血清細(xì)胞培養(yǎng)基孵育2小時，同時將一定體積的含pag-mmp-9和pag/dtx-mmp-9的無血清或有血清培養(yǎng)液鋪加到培養(yǎng)皿中，確保每孔中mmp-9sirna的含量為1μg。以pei-25k/mmp-9作為陽性對照組，裸mmp-9作為陰性對照組，然后將24孔板置于培養(yǎng)箱中，在37℃、5％co2的環(huán)境下培養(yǎng)4小時后，將培養(yǎng)液換掉，加入含血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時。在熒光顯微鏡下定性研究綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，然后吸出培養(yǎng)液，加入一定量的胰酶消化細(xì)胞并加入一定的培養(yǎng)基終止胰酶作用，細(xì)胞樣品經(jīng)離心后重新懸浮于pbs中，采用流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染個數(shù)，即樣品的基因轉(zhuǎn)染效率。為了定量分析pag的轉(zhuǎn)染效率，本項目進(jìn)行了在無血清條件下和有血清條件下實驗，pag和pag/dtx分別與mmp-9形成的膠束的轉(zhuǎn)染試驗，試驗中依據(jù)凝膠電泳試驗結(jié)果，設(shè)定pag/dtx的質(zhì)量比為9：1，pag與mmp-9質(zhì)量比為4、9和14，對照組為pei-25k與mmp-9質(zhì)量比為1.3:1時所形成的膠束，在此時pei-25k能達(dá)到最好的轉(zhuǎn)染效率；具體結(jié)果如圖6所示。圖6為細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗圖，其中6a、6b分別為無血清和有血清條件下mcf-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果圖；6c、6d分別為在有無血清條件下細(xì)胞轉(zhuǎn)染的熒光照片；從圖6可見，在無血清的實驗條件下，與pei相比，pag和pag/dtx均表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)染效率，pag與mmp-9質(zhì)量比為9時，轉(zhuǎn)染效率為44.9％±3.9％，高于pei的轉(zhuǎn)染效率39.1％±1.0％；且當(dāng)pag與mmp-9質(zhì)量比為14時，可達(dá)到pag最好的轉(zhuǎn)染效率，約48.5％±3.8％；隨著dtx的載入，對于pag材料承載mmp-9的轉(zhuǎn)染效率有一定影響；當(dāng)pag與mmp-9質(zhì)量比為4時，dtx的載入使得pag對mmp-9的轉(zhuǎn)染效率下降了56％；隨著pag比例的增加，其影響逐漸縮小，分別降為18.1％和7.6％；與此同時，我們發(fā)現(xiàn)血清的存在對pei、pag對mmp-9的轉(zhuǎn)染效率均有不同程度的影響，與無血清的轉(zhuǎn)染效率相比，pei在有血清下的轉(zhuǎn)染效率下降了32.0％；而當(dāng)pag與mmp-9質(zhì)量比為14時，血清對pag的轉(zhuǎn)染效率影響較小，轉(zhuǎn)染效率依然高達(dá)49.6％±2.8％，而在dtx存在的情況下，pag有血清下的轉(zhuǎn)染效率下降了24.8％，仍高達(dá)33.7％±4.2％。綜上所述，pag對mmp-9的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于pei，說明本實施例中的pag對mmp-9基因具有較好的轉(zhuǎn)染效率。實施例8：驗證性實驗按照pag/dtx-mmp-9質(zhì)量比為9:1:0.64進(jìn)行三批膠束樣品的平行制備，并分別測定各組膠束中多烯紫杉醇的載藥量、包封率、粒徑及粒徑分布、zeta電位，具體測試結(jié)果如表3所示；同時將平行制備的pag/dtx-mmp-9膠束分別用去離子水配置成相同濃度的pag/dtx-mmp-9膠束溶液，并滴到表面附有支撐膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余的水，用1％磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，待樣品37℃晾干后，在加速電壓為80k下利用透射電子顯微鏡觀察膠束的形態(tài)，具體測試結(jié)果如圖7所示。表3驗證性實驗測試數(shù)據(jù)批次載藥率包封率粒徑(nm)pdi電位(mv)018.5％92.3％170.00.17222.7028.7％93.6％171.30.18123.5038.7％93.5％175.10.17521.6由表3可見：平行三批次的試驗結(jié)果基本穩(wěn)定，pag/dtx-mmp-9膠束的粒徑大小穩(wěn)定在170nm左右，電位穩(wěn)定在20mv。圖7為本實施例中ag/dtx-mmp-9膠束的透射電鏡圖，從圖中可見載藥膠束的形態(tài)為球形或類球形，形貌結(jié)構(gòu)好。實施例9：體外藥物釋放實驗稱取凍干的pag/dtx膠束約10mg，配置成含有2.5mg/mlpag的水溶液，分別取0.8ml膠束溶液用含有3mmdtt的pbs將膠束溶液稀釋2倍，將混合液裝入截留分子量為6kd-8kd的透析袋中，然后將透析袋分別置于50ml含還原劑dtt濃度為3mm、(模擬細(xì)胞外基質(zhì)、血液及腫瘤部位還原性物質(zhì)的濃度)的pbs(ph7.4)中；上述溶液于37℃下恒溫震蕩，轉(zhuǎn)速為100rpm，分別于0，0.5、1、2、4、6、8、12、24h時間點(diǎn)取0.1ml透析袋內(nèi)液，采用高效液相色譜儀測定釋放液中不同時間點(diǎn)的多烯紫杉醇dtx的濃度，采用紫外分光光度法測定藤黃酸ga的含量，繪制多烯紫杉醇和藤黃酸的釋放曲線；每個時間點(diǎn)每個樣品設(shè)置三個平行樣，具體測試結(jié)果如圖8所示。圖8為本實施例中pag/dtx的藥物釋放曲線；從圖中可以看出，在沒有還原劑dtt的作用下，pag/dtx膠束粒子緩慢釋放出dtx和ga，在釋放24小時后，dtx的總累積釋放百分率低于60％，ga的總累計釋放百分率不超過20％，這表明pag載藥膠束在正常血液循環(huán)中有較好的藥物包裹能力，不會出現(xiàn)較大的藥物泄露；而在還原劑條件下，由于雙硫鍵敏感的還原響應(yīng)性，載藥粒子在24小時內(nèi)dtx和ga的累積釋放率大大增加，在3mmdtt釋放介質(zhì)中，pag/dtx膠束粒子中dtx和ga的釋放率分別為80.0％±2.0％，80.0％±6.0％。以上實驗結(jié)果表明，pag共聚物自組裝形成的pag前藥膠束能在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高還原性環(huán)境下，釋放出ga發(fā)揮抗腫瘤作用，同時也能作為藥物載體，負(fù)載dtx類難溶性藥物至腫瘤及其他病患部位。實施例10：體外毒性實驗采用celltiter-gloluminescentcellvaiabilityassay法評價dtx、mmp-9、dtx-mmp-9、pag/dtx、pag-mmp-9或pag/dtx-mmp-9對mcf-7乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。具體實驗過程如下：使用的培養(yǎng)基為含有10％fbs和1％雙抗(青鏈霉素混合液)的rpmi1640培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃及5％co2，細(xì)胞每2天換液一次，每4天傳代一次；取對數(shù)期生長的mcf-7細(xì)胞，加入10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，然后每孔加入100μl細(xì)胞懸液于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至8000個/孔(邊緣孔用無菌pbs填充，以防止水分的散失)；在37℃、5％co2條件下孵育12小時，使細(xì)胞貼壁呈單層生長；吸去培養(yǎng)液后，加入新鮮的含有不同濃度的dtx、mmp-9、dtx-mmp-9、pag/dtx、pag-mmp-9或pag/dtx-mmp-9的1％dmso培養(yǎng)液在37℃培養(yǎng)48h，每個樣品設(shè)置6個復(fù)孔，設(shè)置3個只有含有1％dmso培養(yǎng)基的復(fù)孔作為空白，3個加含有1％dmso培養(yǎng)基不含藥物培養(yǎng)的mcf-7作為對照組；孵育結(jié)束后，棄去舊的培養(yǎng)基，每孔加入含有100μlcelltiter-glo試劑，室溫再繼續(xù)培養(yǎng)10min，200r震搖10min，轉(zhuǎn)移至四面不透光的96孔板，使用多功能酶標(biāo)儀檢測化學(xué)發(fā)光值(實驗重復(fù)操作三次)，計算細(xì)胞活性，具體實驗結(jié)果如圖9、圖10以及表4、表5所示。圖9為dtx,dtx-mmp-9,pag/dtx,pag/dtx-mmp-9對mcf-7細(xì)胞增殖的抑制曲線(以dtx濃度計算)；從圖9中可見，通過制備pag/dtx和pag/dtx-dna膠束，能夠增強(qiáng)dtx對mcf-7的抑制作用。圖10為mmp-9,pag-mmp-9,dtx-mmp-9,pag/dtx-mmp-9對mcf-7細(xì)胞增殖的抑制曲線(以mmp-9濃度計算)；從圖10可見，mmp-9對mcf-7細(xì)胞的增殖基本無抑制作用，而通過制備pag-mmp-9,和pag/dtx-mmp-9膠束，能增強(qiáng)mmp-9對mcf-7的抑制作用。實驗結(jié)果表明，dtx、pag/dtx、pag-mmp-9、pag/dtx-mmp-9對mcf-7細(xì)胞的增殖均有一定程度的抑制作用，如圖12、13所示。其中圖12顯示，通過制備pag/dtx和pag/dtx-dna膠束，能夠增強(qiáng)dtx對mcf-7的抑制作用。表4dtx,dtx-mmp-9,pag/dtx,pag/dtx-mmp-9對mcf-7細(xì)胞增殖的抑制數(shù)據(jù)(以dtx濃度計算)μmdtxdtx-mmp-9pag-dtxpag-dtx-mmp-9ic502.394±0.6471.916±0.2211.480±0.250*1.047±0.145**▲▲注：**與dtx組的比較，p<0.01；*與dtx組的比較，p<0.05；▲▲與pag-dtx組的比較，p<0.01；*與dtx組的比較，p<0.05。由表4可見：dtx-mmp-9相較于dtx，對mcf-7的抑制作用物顯著性增強(qiáng)，而pag/dtx和pag/dtx-mmp-9相較于dtx，其ic50分別減少了38.2％和56.3％，對mcf-7的抑制作用物顯著性增強(qiáng)。表5mmp-9,pag-mmp-9,dtx-mmp-9,pag/dtx-mmp-9對mcf-7細(xì)胞增殖的抑制數(shù)據(jù)(以mmp-9濃度計算)ug/mlmmp-9pag-mmp-9dtx-mmp-9pag/dtx-mmp-9ic50∞15.007±0.6463.169±0.538**2.274±0.315**注：**與pag-dna組的比較，p<0.01。由表5可見：由于mmp-9質(zhì)粒由于無法進(jìn)入腫瘤細(xì)胞而發(fā)揮作用，因此單純的mmp-9對mcf-7腫瘤細(xì)胞的增殖幾乎無抑制作用，而制備pag-mmp-9膠束可發(fā)揮mmp-9對mcf-7乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，同時通過制備pag/dtx-mmp-9，可進(jìn)一步將pag-mmp-9的ic50降低了84.8％，且pag同時載dtx和mmp-9體系，抑制作用最強(qiáng)，可見pag是運(yùn)載mmp-9質(zhì)粒對于mmp-9質(zhì)粒的細(xì)胞毒性發(fā)揮的關(guān)鍵因素。綜上可見，pag可以顯著增強(qiáng)dtx和mmp-9對mcf-7乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，pag同時載dtx和mmp-9體系，抑制作用最強(qiáng)，從而說明pag有望開發(fā)為用于治療腫瘤的藥物和基因的共遞送載體。實施例11：細(xì)胞內(nèi)吞實驗11.1激光共聚焦顯微鏡實驗為了探索pag/dtx-mmp-9膠束在mcf-7細(xì)胞中的內(nèi)吞情況，我們選擇與dtx脂溶性相似的細(xì)胞膜熒光探針尼羅紅(nilered，nr)代替dtx作為模型藥物，并選擇熒光fam-sirna代替治療基因mmp-9，制備pag/nr-fam-sirna膠束粒子，探索pag膠束粒子在mcf-7細(xì)胞中的分布，同時用4’,6’-二瞇基-2-苯基吲哚(dapi)對細(xì)胞核染色(dapi在405nm激發(fā)波長下發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)光)，通過激光共聚焦在nr通道、dapi以及fam-sirna通道下觀察pag/nr-sirna膠束在細(xì)胞中的內(nèi)吞以及降解情況，從而探索pag/dtx-mmp-9進(jìn)入細(xì)胞作用的過程。實驗過程：培養(yǎng)的mcf-7細(xì)胞復(fù)蘇后傳代一次，培養(yǎng)條件為rpmi1640培養(yǎng)基添加10％的胎牛血清、青霉素(100μ/ml)與鏈霉素(100μ/ml)；將培養(yǎng)好的mcf-7細(xì)胞鋪于激光共聚焦培養(yǎng)皿，每孔2×104個/孔；培養(yǎng)24h后將準(zhǔn)備好的pag/nr、nr、pag/nr-fam-sirna、fam-sirna等溶液100μl分別加入培養(yǎng)皿中孵育1、4小時；細(xì)胞用預(yù)冷的pbs清洗兩次(終止內(nèi)吞作用)；加入預(yù)冷的200μl、4％多聚甲醛，室溫下固定30min，pbs清洗三次；細(xì)胞核染色：將4’,6’-二瞇基-2-苯基吲哚(dapi)稀釋為1μg/ml，每孔加入100μl，室溫下染色3min，pbs洗三次；加入500μlpbs，共聚焦激光顯微鏡下觀察，其中nr的激發(fā)波長為488nm，dapi的激發(fā)波長為405nm，fam-sirna的激發(fā)波長為552nm。實驗結(jié)果如下：mcf-7細(xì)胞孵育1h后，便可在pag/nr-fam-sirna作用的mcf-7細(xì)胞基質(zhì)中觀察到nr發(fā)出的紅色熒光，且該熒光強(qiáng)度明顯高于nr組，pag/nr組與pag/nr-fam-sirna熒光強(qiáng)度相當(dāng)，并于細(xì)胞核的藍(lán)色熒光有著較強(qiáng)的共定位，說明pag膠束可以明顯提高mcf-7細(xì)胞對純nr的內(nèi)吞效果，而且作用時間較快，也側(cè)面說明pag膠束可以提高mcf-7細(xì)胞對所載藥物的吸收；同時實驗結(jié)果顯示單獨(dú)的fam-sirna作用于mcf-7細(xì)胞，無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，但經(jīng)pag運(yùn)載的fam-sirna能迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可觀察到綠色熒光，而且這種作用不受pag對dtx的運(yùn)載干擾，說明pag具有較好的基因遞藥功能；作用4小時后的實驗結(jié)果與1小時基本一致。因此，pag/nr-fam-sirna細(xì)胞內(nèi)吞速度快于nr和fam-sirna本身，從而證明了本發(fā)明制備的pag共聚物具有較好的同時對藥物和基因遞藥功能，有望開發(fā)為用于治療腫瘤的藥物和基因的共遞送載體。11.2流式細(xì)胞術(shù)按照11.1描述的方法將培養(yǎng)的mcf-7細(xì)胞按2×105個/孔種于12孔板；細(xì)胞于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中孵育24小時后，分別加入游離nr、pag/nr、pag/nr-mmp-9膠束孵育1和4小時；吸去上清液，用pbs洗三遍，0.25％胰酶消化，收集細(xì)胞，離心，去掉上清液，加入pbs制成細(xì)胞混懸液；以氬離子激光器作為光源，利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行分析，測定nr在細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度，以x-mean值表示；具體結(jié)果如圖11所示。圖11為nr,pag-nr,mmp-9sirna,pag/nr-mmp-9在mcf-7細(xì)胞內(nèi)吞實驗流式結(jié)果圖；具體的圖11a為孵育1小時，nr,pag-nr,mmp-9sirna,pag/nr-mmp-9的熒光強(qiáng)度曲線；圖11b為孵育4小時，nr,pag-nr,mmp-9sirna,pag/nr-mmp-9的熒光強(qiáng)度曲線；圖11c為孵育1小時和4小時時nr,pag-nr,mmp-9sirna,pag/nr-mmp-9攝取量；從圖11a可見，孵育1小時候，pag/nr和pag/nr-mmp-9的熒光強(qiáng)度分別是游離nr熒光強(qiáng)度的3.68和3.67倍；從圖11c可見，mcf-7細(xì)胞對pag/nr和pag/nr-mmp-9的攝取量明顯高于游離nr，綜合圖11可見，4小時后的實驗結(jié)果與1小時基本一致；實驗結(jié)果與利用激光共聚焦顯微鏡考察的結(jié)果相吻合；進(jìn)一步說明pag共聚物具有較好的同時對藥物和基因遞藥功能，有望開發(fā)為用于治療腫瘤的藥物和基因的共遞送載體。實施例12：體內(nèi)活體熒光成像實驗及體內(nèi)組織分布實驗spf級balb/c裸鼠3只，右前肢腋下接種收集好的生長狀態(tài)良好的人乳腺癌mcf-7細(xì)胞，預(yù)先將熒光材料icg代替dtx制備載藥膠束pag/icg，待腫瘤體積長到約300mm3，將200微升樣品溶液(生理鹽水、icg、pag/icg)經(jīng)尾靜脈分別注射到小鼠體內(nèi)；注射前和注射后0.5、2h、4h、8h和24h時間點(diǎn)麻醉狀態(tài)下置于活體熒光成像儀中拍照成像；其中icg激發(fā)波長為780nm，發(fā)射濾光為800nm。曝光時間為30s；實驗后的裸鼠斷頸處死，取出心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織，pbs清洗后，濾紙吸干表面液體，活體熒光成像儀下進(jìn)行拍照；具體實驗結(jié)果如圖12所示。圖12為pag/icg、icg、空白裸鼠小動物成像實驗結(jié)果；圖12a是注射前和注射后0.5、2h、4h、8h和24h時間點(diǎn)麻醉狀態(tài)下活體熒光成像；圖12b是試驗后裸鼠心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織處的熒光成像；圖12c是空白、icg、pag/icg組腫瘤組織處的熒光成像。本實驗所選用的icg熒光材料屬于兩親性材料，幾乎不受生物組織本底影響，不傷害實驗動物本身，能夠穿透深層組織產(chǎn)生信號進(jìn)行成像，從圖中可見，空白組裸鼠中幾乎觀測不到熒光干擾，icg、pag/icg經(jīng)尾靜脈進(jìn)入裸鼠后，快速分布，且pag/icg給藥組0.5小時后即可觀察到icg熒光達(dá)到組織部位，同時24小時后取裸鼠心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織發(fā)現(xiàn)icg主要集中于肝和腫瘤組織，且其中pag/icg組腫瘤組織的熒光明顯強(qiáng)于icg組。由此可見，本發(fā)明的pag具有較好的抗腫瘤作用。實施例13：pag載體藥物對mcf-7荷瘤裸鼠的治療作用實驗24只裸鼠，雌性，體重18-20g左右，飼養(yǎng)于spf環(huán)境中，裸鼠食料、飲用水、墊料均定期經(jīng)高壓滅菌消毒，鼠籠、墊料一周更換一次；采用人源的mcf-7胰腺癌細(xì)胞建立裸鼠皮下移植瘤模型，將2*106的細(xì)胞懸浮于20ml新鮮的的pbs中，將細(xì)胞懸液注射至裸鼠右前肢腋下，10天后觀察荷瘤裸鼠的種瘤體積達(dá)到60mm3，開始隨機(jī)分為4組：①生理鹽水模型組；②pag-mmp-9(14:1)治療組；③pag/dtx-mmp-9(9:1:0.64)治療組；④(多西他賽)注射液治療組，每組6只；經(jīng)尾靜脈分別將pag/mmp-9、pag/dtx/mmp-9或注射到裸鼠體內(nèi)，生理鹽水模型組則直接尾靜脈注射200μl生理鹽水處理，給藥劑量dtx為3mg/kg/次與mmp-9均為1.9mg/kg/次；將開始治療的時間定義為第10天，隔天給藥，至第40天；隔天觀察各組裸鼠腫瘤大小、體重、進(jìn)食情況和大小便情況，其中腫瘤大小用游標(biāo)卡尺測量，分別記錄每個腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，以公式v(mm3)＝0.5*a2*b計算腫瘤大小；實驗至40天終止，通過頸椎脫臼處死動物，取材。13.1病理檢查切取裸鼠心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織，在4％中性多聚甲醛溶液(福爾馬林)固定2天后，進(jìn)行病理檢查。60℃下浸蠟5h進(jìn)行包埋處理，用石蠟切片機(jī)將組織蠟塊切成4μm厚度的薄片，展片后在60℃溫箱中放置2h；依次用濃度梯度乙醇浸泡脫水(70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇)，每級乙醇浸泡30分鐘，之后用95％乙醇兩次，每次20分鐘，用蘇木素染色8分鐘，用自來水沖洗約8分鐘，用1％鹽酸酒精浸泡分化5s后，再用自來水沖洗8分鐘，溫?zé)崴{(lán)化后再使用自來水充分沖洗，最后進(jìn)行伊紅染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。13.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±sd)進(jìn)行表示，通過spss12.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用單因素方差分析；p<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。13.3實驗結(jié)果圖13為pag/dtx-mmp-9、pag-mmp-9、抗mcf-7乳腺癌的藥效結(jié)果；其中13a為mcf-7荷瘤裸鼠腫瘤生長情況；13b為荷瘤裸鼠體重變化；13c為荷瘤裸鼠腫瘤重量比較；13d為荷瘤裸鼠腫瘤圖片；與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01；從圖中可見，mcf-7荷瘤裸鼠經(jīng)過1個月治療后，pag/dtx-mmp-9組的抑瘤效果最為顯著，其次為pag-mmp-9和組，抑瘤率分別為45.57％、37.8％和24.85％；瘤重數(shù)據(jù)結(jié)果表明，與生理鹽水模型組比較，pag/dtx-mmp-9和pag-mmp-9均有顯著性抑制作用；而且在治療過程，未見裸鼠體重發(fā)生顯著性變化；可見pag/dtx-mmp-9、pag-mmp-9對mcf-7乳腺癌具有較好的抑瘤作用，pag在整個治療過程中，起到較好運(yùn)載藥物和基因的作用。對各組荷瘤裸鼠中腫瘤組織和臟器組織進(jìn)行石蠟切片，蘇木精-伊紅(h&e)染色后組織病理學(xué)觀察，結(jié)果如圖14所示。圖14為mcf-7荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺、腎、腫瘤h&e組織切片圖；從圖中可見，生理鹽水模型組腫瘤細(xì)胞密集，細(xì)胞核完整、包漿面積較小，腫瘤細(xì)胞沒有發(fā)生凋亡和死亡；dtx組細(xì)胞中包漿面積增大，細(xì)胞核的密度相對于生理鹽水組明顯的減少，說明部分腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡與壞死作用，而pag/dtx-mmp-9、pag-mmp-9組腫瘤組織細(xì)胞中包漿面積顯著增大，細(xì)胞核顯著減少，說明腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，腫瘤組織發(fā)生壞死；通過顯微鏡觀察荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺、腎組織的h&e染色切片可得，各給藥組與生理鹽水模型對照組相比，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的病理特征如內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、壞死、炎癥反應(yīng)以及再生性的改變等。總之，pag/dtx-mmp-9、pag-mmp-9對mcf-7乳腺癌具有較好的治療作用，而且pag材料在治療過程中可較好的運(yùn)載藥物和基因，顯著性增強(qiáng)dtx對乳腺癌的治療作用。綜上所述：本發(fā)明直接由帶羧基或與乙酸酐衍生化后帶羧基的抗腫瘤活性藥物x作為疏水端與親水的超支化聚酰胺胺paas通過酰胺化反應(yīng)得到氧化還原響應(yīng)性兩親性共聚物pax，pax的主鏈上含有抗腫瘤活性藥物，自身即具有抗腫瘤作用；pax可在水中自組裝形成膠束，形成的膠束內(nèi)層疏水端可進(jìn)一步包裹另一種疏水性抗腫瘤藥物y，并且由于膠束外層帶有正電，通過靜電作用，還可以進(jìn)一步負(fù)載一種治療基因z，得到負(fù)載治療基因的膠束；總之pax及由pax自組裝形成的膠束和負(fù)載治療基因的膠束，都具有抗腫瘤作用，尤其是負(fù)載治療基因的膠束可用作藥物和基因的共遞送載體，用于制備抗腫瘤藥物，治療包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、腸癌等癌癥；由pax得到的膠束pax/y/z，穩(wěn)定性好，其結(jié)構(gòu)中的雙硫鍵具有氧化應(yīng)激功能，可在腫瘤細(xì)胞中高濃度gsh的作用下發(fā)生解離，并釋放出所載的藥物x、y和基因z，從而實現(xiàn)靶向性，提高藥物的生物利用度同時降低毒副作用；另外，本發(fā)明制備方法簡單，無需特殊設(shè)備和苛刻條件，易于實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，具有極強(qiáng)的實用價值，相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，取得了顯著性進(jìn)步和出乎意料的效果。最后需要在此指出的是：以上僅是本發(fā)明的部分優(yōu)選實施例，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁12