本發(fā)明涉及一種殼寡糖的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

殼寡糖(cos)又叫殼聚寡糖、低聚殼聚糖，是將殼聚糖降解得到的一種聚合度在2～20之間寡糖產(chǎn)品，是水溶性較好、功能作用大、生物活性高的低分子量產(chǎn)品。它具有殼聚糖所沒有的較高溶解度，全溶于水，容易被生物體吸收利用等諸多獨特的功能。

免疫是指機體免疫系統(tǒng)識別自身與異己物質(zhì)，并通過免疫應(yīng)答排除抗原性異物，以維持機體生理平衡的功能。免疫系統(tǒng)分為先天免疫和獲得性免疫。近年來有越來越多有關(guān)免疫增強劑的報道，其中糖類因其廣譜的藥理活性和較低的毒副作用而受到廣泛關(guān)注。目前的還沒有系統(tǒng)研究殼寡糖對不同狀態(tài)機體的免疫調(diào)節(jié)作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種殼寡糖的應(yīng)用。

本發(fā)明一種殼寡糖的應(yīng)用是指在提高正常機體巨噬細胞吞噬功能、在免疫低下的機體中促進脾淋巴細胞的增殖、提高脾淋巴細胞中nk細胞的活力和肝臟中抗氧化酶系的抗氧化活力以及提高輻射損傷機體的免疫力上的應(yīng)用。

本發(fā)明有益效果如下：

1、殼寡糖對正常機體沒有明顯的毒副作用且可以提高吞噬指數(shù)。正常動物模型中，巨噬細胞吞噬指數(shù)呈殼寡糖劑量依賴性變化，80mg/kg可以顯著提高小鼠的吞噬能力小鼠的巨噬細胞吞噬能力與對照組相比提高了1.21倍。證明殼寡糖對正常機體有增強免疫的作用。

2、殼寡糖可以劑量依賴地提高脾細胞增殖能力，nk活力和各種抗氧化酶系的活力，免疫低下模型中，與對照組相比，脾細胞中淋巴b細胞增殖能力提高了2.46倍，淋巴t細胞增殖能力提高了1.44倍，nk活力提高了3.34倍，總抗氧化能力提高了2.24倍，超氧化物歧化酶抗氧化能力提高了1.91倍，谷胱甘肽過氧化物酶抗氧化活力提高了3.56倍，過氧化氫酶抗氧化活力提高了3.78倍。

3、殼寡糖可以提高輻照機體的脾指數(shù)和免疫力，⁶⁰co照射誘導(dǎo)輻射損傷模型中殼寡糖可以提高輻照小鼠的免疫力，延長生存期。

附圖說明

圖1是實施例1中小鼠脾淋巴細胞增殖示意圖；其中a為lps,b為cona；

圖2是實施例1中小鼠脾淋巴細胞中nk活力變化示意圖；

圖3是實施例1中殼寡糖對免疫低下小鼠肝臟中總抗氧化能力活力影響示意圖；

圖4是實施例1中殼寡糖對免疫低下小鼠肝臟中超氧化物歧化酶活力影響示意圖；

圖5是實施例1中殼寡糖對免疫低下小鼠肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶活力影響示意圖；

圖6是實施例1中殼寡糖對免疫低下小鼠肝臟中過氧化氫酶活力影響示意圖；

圖7是實施例1中殼寡糖對輻照小鼠生存期的影響示意圖，其中c為對照組，d為cos組。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式一種殼寡糖的應(yīng)用是指在提高正常機體巨噬細胞吞噬功能、在免疫低下的機體中促進脾淋巴細胞的增殖、提高脾淋巴細胞中nk細胞的活力和肝臟中抗氧化酶系的抗氧化活力以及提高輻射損傷機體的免疫力上的應(yīng)用。

本實施方式的有益效果：

1、殼寡糖對正常機體沒有明顯的毒副作用且可以提高吞噬指數(shù)。正常動物模型中，巨噬細胞吞噬指數(shù)呈殼寡糖劑量依賴性變化，80mg/kg可以顯著提高小鼠的吞噬能力小鼠的巨噬細胞吞噬能力與對照組相比提高了1.21倍。證明殼寡糖對正常機體有增強免疫的作用。

2、殼寡糖可以劑量依賴地提高脾細胞增殖能力，nk活力和各種抗氧化酶系的活力，免疫低下模型中，與對照組相比，脾細胞中淋巴b細胞增殖能力提高了2.46倍，淋巴t細胞增殖能力提高了1.44倍，nk活力提高了3.34倍，總抗氧化能力提高了2.24倍，超氧化物歧化酶抗氧化能力提高了1.91倍，谷胱甘肽過氧化物酶抗氧化活力提高了3.56倍，過氧化氫酶抗氧化活力提高了3.78倍。

3、殼寡糖可以提高輻照機體的脾指數(shù)和免疫力，⁶⁰co照射誘導(dǎo)輻射損傷模型中殼寡糖可以提高輻照小鼠的免疫力，延長生存期。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：殼寡糖的制備方法為：將殼聚糖溶于質(zhì)量濃度為3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入殼聚糖20倍重的濃度為30％的過氧化氫，升溫攪拌至70℃恒溫，反應(yīng)8h，再經(jīng)質(zhì)量濃度為95％的乙醇沉淀過濾，濾渣經(jīng)過干燥，得到聚合度為2-30的殼寡糖，其中殼寡糖中聚合度為2-10的含量不低于80％，不包含水分含量的殼寡糖純度>98％，殼聚糖與質(zhì)量濃度3.5％的冰乙酸溶液的質(zhì)量體積比為1g：20ml。他與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：所述的抗氧化酶系為超氧化物歧化酶。其他與具體實施方式一或二不同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：所述的抗氧化酶系為谷胱甘肽過氧化物酶。其他與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：所述的抗氧化酶系為過氧化氫酶。其他與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：提高巨噬細胞吞噬功能時殼寡糖的服用量為0.52g/天。其他與具體實施方式一至五之一相同。

本實施方式的服用量是按照人體體重70kg計。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是：在免疫低下的機體中促進脾淋巴細胞的增殖、提高脾淋巴細胞中nk細胞的活力和肝臟中抗氧化酶系的抗氧化活力時殼寡糖的服用量為0.26～0.52g/天。其他與具體實施方式一至六之一相同。

本實施方式的服用量是按照人體體重70kg計。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：提高輻射損傷機體的免疫力時殼寡糖的服用量為0.26g/天。其他與具體實施方式一至七之一相同。

本實施方式的服用量是按照人體體重70kg計。

為驗證本發(fā)明的有益效果進行了以下實驗：

實施例一：一種殼寡糖的應(yīng)用是指殼寡糖在提高正常機體巨噬細胞吞噬功能、在免疫低下的機體中促進脾淋巴細胞的增殖、提高脾淋巴細胞中nk細胞的活力和肝臟中抗氧化酶系的抗氧化活力以及提高輻射損傷機體的免疫力上的應(yīng)用。

本實施例殼寡糖的制備方法為：將殼聚糖溶于質(zhì)量濃度為3.5％的冰乙酸溶液中，然后加入殼聚糖20倍重的濃度為30％的過氧化氫，升溫攪拌至70℃恒溫，反應(yīng)8h，再經(jīng)質(zhì)量濃度為95％的乙醇沉淀過濾，濾渣經(jīng)過干燥，得到聚合度為2-30的殼寡糖，其中殼寡糖中聚合度為2-10的含量不低于80％，不包含水分含量的殼寡糖純度>98％，殼聚糖與質(zhì)量濃度為3.5％的冰乙酸溶液的質(zhì)量體積比為1g：20ml。

1、驗證試驗的方法

1.1殼寡糖對正常小鼠的影響

1.1.1急毒試驗

spf級昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機分為2組，每組10只。一組一次性灌胃殼寡糖2000mg/kg，一組一次性尾靜脈注射殼寡糖2000mg/kg，進行急毒試驗。觀察小鼠的30天死亡率。

1.1.2免疫增強試驗

spf級昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機分為4組，每組7只。一組設(shè)為對照組，每天給予0.2ml生理鹽水，其余三組為殼寡糖的低(20mg/kg)中(40mg/kg)高(80mg/kg)劑量組，連續(xù)腹腔給藥10天，之后進行碳廓清實驗。尾靜脈注入10ul/g的印度墨汁，2min和10min時通過眼球取血20ul于2ml0.1％的na2co3中，以0.1％的na2co3為空白對照，600nm處測定吸光度值。處死小鼠，取肝臟，胸腺和脾臟，稱重，計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。并按照下式計算吞噬指數(shù)。

其中a是體重，b是肝重，c是脾重，od1是t1＝2min時的吸光度值，od2是t2＝10min時的吸光度值。

1.2殼寡糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的影響

spf級昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機分為5組，每組7只，分別為正常組(normal)，模型組(model)，殼寡糖的低劑量組cos20(20mg/kg)、中劑量組cos40(40mg/kg)、高劑量組cos80(80mg/kg)。除了正常組之外，其余組尾靜脈注入環(huán)磷酰胺200mg/kg制作免疫低下模型。6h后殼寡糖組給藥，連續(xù)腹腔注射給藥10天，模型組與正常組給生理鹽水。末次給藥24h后，處死小鼠，取肝臟，按照試劑盒測量肝臟中t-sod,t-aoc,cat,gsh-px活力的變化。無菌取脾臟，將脾臟放置在200目尼龍網(wǎng)上，加入少量pbs然后用組織研磨器研壓脾臟，使其成為單個細胞，收集培養(yǎng)皿中的液體于離心管中，1800rpm離心10min，棄上清，加入1.5ml紅細胞裂解液，室溫裂解3min后離心，預(yù)冷的pbs洗滌3次后，用無血清的rpmi1640培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整脾淋巴細胞濃度為2×10⁶/ml，每孔100ul接種于96孔板，分別加入cona(5ug/ml)和lps(2.5ug/ml)刺激細胞，培養(yǎng)48h后以空白培養(yǎng)基作對照，用cck-8法檢測脾淋巴細胞的增殖活性。

以脾細胞中的nk細胞為效應(yīng)細胞，k562細胞為靶細胞。按照效靶比50：1的比例接種細胞于96孔板，培養(yǎng)24h后，以無血清的培養(yǎng)基作空白，單獨的脾細胞和單獨的靶細胞作對照，用cck-8法檢測細胞活力。

其中，t為靶細胞對照的吸光度值，s為檢測樣品的吸光度值，e為效應(yīng)器對照的吸光度值.

1.3殼寡糖對輻照損傷小鼠的影響

spf級昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機分為2組，模型對照組和殼寡糖給藥(40mg/kg)組，每組12只。所有小鼠進行⁶⁰co全身照射，照射劑量為8.0gy(88.39cgy/min,8min46s)。照射前7天和照射后7天每天腹腔注射給藥，模型對照組給生理鹽水。觀察小鼠的30天生存期。實驗結(jié)束后，解剖取胸腺和脾，計算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。

2、試驗結(jié)果

2.1殼寡糖對正常小鼠的影響

2.1.1急毒試驗

急毒試驗結(jié)果表明，單次灌胃或尾靜脈注射殼寡糖2000mg/kg30天內(nèi)沒有動物死亡，且小鼠行為無明顯異常。證明殼寡糖安全無毒。

2.1.2免疫增強試驗

與對照組相比，殼寡糖給藥組的體重和免疫器官指數(shù)無明顯變化，顯示殼寡糖對正常小鼠沒有明顯的毒副作用。吞噬指數(shù)呈劑量依賴性變化，且80mg/kg可以顯著提高小鼠的吞噬能力(表1)，由表1可知，小鼠的吞噬能力與對照組相比提高了1.21倍。證明殼寡糖對正常小鼠有增強免疫的作用。

表1殼寡糖對正常小鼠的影響

注：與對照組相比，*p<0.05。si＝脾質(zhì)量(mg)/體重(g).ti＝胸腺質(zhì)量(mg)/體重(g).

2.2殼寡糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠的影響

與正常組相比，模型組的脾增殖活力，nk活力和各種酶的活力都顯著下降，說明環(huán)磷酰胺對小鼠的免疫系統(tǒng)進行了有效的打擊，免疫低下模型造模成功。從圖1，圖2、圖3、圖4、圖5和圖6可以看出，殼寡糖可以劑量依賴地提高脾細胞增殖能力，nk活力、總抗氧化活力和各種抗氧化酶系的活力，與對照組相比，脾細胞中淋巴b細胞增殖能力提高了2.46倍，淋巴t細胞增殖能力提高了1.44倍，nk活力提高了3.34倍，總抗氧化能力提高了2.24倍，超氧化物歧化酶抗氧化能力提高了1.91倍，谷胱甘肽過氧化物酶抗氧化活力提高了3.56倍，過氧化氫酶抗氧化活力提高了3.78倍。證明殼寡糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠具有很好的提高免疫的作用。

2.3殼寡糖對輻照損傷小鼠的影響

輻照后對照組小鼠從第7天開始有動物開始死亡，殼寡糖給藥組從第13天開始有動物死亡。在觀察終點，即照射后30天，對照組動物存活率為25％，殼寡糖給藥組動物存活率為50％(圖7)，而且殼寡糖可以顯著提高輻照小鼠的脾指數(shù)(表2)。證明殼寡糖可以提高輻照小鼠的免疫力，延長生存期。

表2殼寡糖對輻照小鼠免疫器官指數(shù)的影響

注：*p<0.05,與對照組相比

綜上所述，殼寡糖安全無毒且對不同類型的小鼠均具有很好的提高免疫力的作用，可以提高正常機體巨噬細胞吞噬功能、在免疫低下的機體中促進脾淋巴細胞的增殖、提高脾淋巴細胞中nk細胞的活力和肝臟中抗氧化酶系的抗氧化活力以及提高輻射損傷機體的免疫力。