本專利申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?011800668493、申請(qǐng)日為2011年12月8日、發(fā)明名稱為“血紅蛋白組合物及其使用方法”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明涉及對(duì)患者施用的用于治療缺氧和相關(guān)狀況的氧運(yùn)輸劑。更具體而言，本發(fā)明涉及在缺氧情況下將氧輸送至細(xì)胞的雜合血紅蛋白分子，所述雜合血紅蛋白分子通過(guò)碳水化合物分子的連接而受到保護(hù)。
背景技術(shù)：
由心血管疾病引起的發(fā)病率和死亡率主要是由于冠狀和/或外周血管中運(yùn)輸血液的血管部分或完全阻塞而產(chǎn)生的結(jié)果。當(dāng)這種血管部分阻塞時(shí)，血流缺乏導(dǎo)致由該血管供血的肌肉組織局部缺血，結(jié)果抑制了肌肉收縮及其正常功能。血流的完全阻塞會(huì)引起肌肉組織壞死。肌肉組織壞死會(huì)引起瘢痕形成，導(dǎo)致心臟重構(gòu)和衰竭。
血管阻塞通常是通過(guò)在受影響的血管中機(jī)械地增強(qiáng)血流來(lái)進(jìn)行治療。這樣的機(jī)械增強(qiáng)通常是通過(guò)采用外科技術(shù)將天然或合成導(dǎo)管連接至該阻塞區(qū)域的近端和遠(yuǎn)端，從而提供旁路移植物，或是通過(guò)各種方法在阻塞點(diǎn)物理性地增大血管腔而使得血管再生成。這些血管再生術(shù)涉及諸如充氣球囊(balloons)、血管內(nèi)刀(endovascularknives)和血管內(nèi)鉆(endovasculardrills)等裝置。不利的是，外科方法伴隨著顯著的發(fā)病率甚至是死亡率，而許多情況下由于復(fù)發(fā)性狹窄使血管成形術(shù)類型的技術(shù)更復(fù)雜化。
在某些個(gè)體中，由于自然過(guò)程，使得血管阻塞得到部分補(bǔ)償，其中新血管形成(稱為“血管生成”)并且小血管增大(稱為“動(dòng)脈生成”)，從而替代受損血管的功能。這些新血管可有利于缺血組織中的血流恢復(fù)，從而在阻塞血管的周圍形成“天然旁路”。然而，某些個(gè)體不能生成足夠的側(cè)支血管來(lái)充分地補(bǔ)償由心血管疾病引起的血流減少。因此，期望能夠提供這樣的組合物，所述組合物能補(bǔ)償由于冠狀和外周動(dòng)脈中的阻塞所引起的血流減少，從而治療局部缺血。在由于這些機(jī)械性阻塞而引起缺血狀況的阻塞區(qū)域中，作為血液中的天然的氧運(yùn)輸組分，血紅蛋白的供應(yīng)可能短缺。需要對(duì)血紅蛋白進(jìn)行某種形式的化學(xué)修飾，以使其適合于用作改進(jìn)的氧運(yùn)輸劑，從而能夠補(bǔ)償缺血狀況下血流供應(yīng)的降低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本申請(qǐng)公開(kāi)了一種用于治療缺氧和相關(guān)狀況的方法和組合物。在所公開(kāi)的范圍內(nèi)，想到可將局部缺血、貧血和創(chuàng)傷稱為缺氧情況。不受限于任何特定的理論，據(jù)信，缺氧誘導(dǎo)了改變細(xì)胞新陳代謝和促進(jìn)新生血管生成的基因的轉(zhuǎn)錄激活。
根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的組合物為經(jīng)修飾的血紅蛋白氧運(yùn)輸劑。本申請(qǐng)公開(kāi)了一種在缺氧階段輸送氧的方法和組合物，其中所述組合物主要由被碳水化合物保護(hù)的血紅蛋白(carbohydrateshieldedhemoglobin，cshtm)構(gòu)成。根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的組合物基于氧化化學(xué)，該組合物被認(rèn)為在局部缺血和貧血中起關(guān)鍵作用并且具有以下通式結(jié)構(gòu)：
csh＝a[x]-b[y]-c[z]
a.交聯(lián)的穩(wěn)定的血紅蛋白
b.連接
c.天然果膠衍生物
根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的組合物為被碳水化合物保護(hù)的血紅蛋白(cshtm)，其中[x]單位的a與[y]單位的b連接，并且b與[z]單位的c連接。a為四聚體血紅蛋白，并且[x]為1乃至最多6個(gè)四聚體單位。c為果膠的天然衍生物，并且[z]為1乃至最多12個(gè)單位。b為在a和c之間起橋接作用的化學(xué)或物理實(shí)體、或是它們的組合，并且[y]為2乃至最多24個(gè)所定的連接。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的一個(gè)方面，所述血紅蛋白雜合分子含有碳水化合物，以穩(wěn)定作為氧的通用載體的血紅蛋白的交聯(lián)四聚體亞單元的催化活性。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的另一個(gè)方面，所述血紅蛋白雜合分子通過(guò)靜脈注射在血液中循環(huán)，從肺中攝取氧然后自身定位至特定的缺氧器官或受損器官或病變器官，在此，存在于膜表面上的生物標(biāo)記或受體誘導(dǎo)將氧釋放至所述器官。在本申請(qǐng)公開(kāi)的范圍內(nèi)，想到了可利用其他的給藥途徑。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的另一個(gè)方面，組分a和c通過(guò)化學(xué)橋連或/和物理橋連(通過(guò)離子或/和疏水或范德華力[或范德華相互作用]的多重相互作用)而橋接。由于共價(jià)鍵或/和靜電相互作用或/和范德華力所導(dǎo)致的血紅蛋白分子(或者該分子的若干部分)和天然果膠衍生物之間的橋接力，在雜合血紅蛋白分子的優(yōu)異的穩(wěn)定性和催化活性(氧運(yùn)輸)中起到根本性作用。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的另一個(gè)方面，所述血紅蛋白雜合分子進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞中釋放氧。一旦該細(xì)胞變得充滿了氧，它們的缺氧情況就會(huì)被逆轉(zhuǎn)。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的又一個(gè)方面，所述血紅蛋白雜合分子具有這樣的作用機(jī)制：其用于對(duì)缺氧進(jìn)行直接的治療性藥物干預(yù)。根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的雜合血紅蛋白分子具有類似于人類紅血細(xì)胞的氧親和性或高于人類紅血細(xì)胞的氧運(yùn)輸能力，并且不會(huì)引起與之前所開(kāi)發(fā)的經(jīng)修飾的血紅蛋白相關(guān)的任何不良反應(yīng)。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的另一個(gè)方面，所述血紅蛋白雜合分子與所有血型均相容，并且可以直接施用。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的另一個(gè)方面，所述血紅蛋白雜合分子是穩(wěn)定的組合物，其具有約為2年的保存期限。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的另一個(gè)方面，所述血紅蛋白雜合分子能在室溫下儲(chǔ)存而所述組合物的氧運(yùn)輸親和力基本上不會(huì)降低。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的又一個(gè)方面，所述經(jīng)修飾的血紅蛋白分子可適配于治療與缺氧相關(guān)的退行性疾病的治療效果。
在本發(fā)明的另一方面，認(rèn)為實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移極度依賴于腫瘤血管生成。腫瘤募集附加血管的主要刺激是細(xì)胞缺氧。缺氧會(huì)誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄激活，其改變細(xì)胞新陳代謝并促進(jìn)新生血管生成。大多數(shù)末期癌癥患者體內(nèi)的腫瘤處于缺氧狀態(tài)并且緩慢地分裂，并且對(duì)大多數(shù)抗癌藥物沒(méi)有反應(yīng)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的組合物，以抑制新生血管生成并使癌細(xì)胞恢復(fù)正常的分裂(這將使抗癌藥物更有效地起作用)。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的又一個(gè)方面，所述血紅蛋白雜合分子自身定位至癌細(xì)胞膜表面上的特異性受體，從而進(jìn)入細(xì)胞并在癌細(xì)胞中釋放氧。一旦癌細(xì)胞變得充滿了氧并且它們的缺氧情況被逆轉(zhuǎn)，抗癌藥物就會(huì)具有更高的效率。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
本申請(qǐng)所描述的實(shí)施方案在附圖的圖中示出，所述附圖旨在示例而不限制本發(fā)明，其中相同的標(biāo)記是指相同或?qū)?yīng)的部分，并且其中：
圖1示出了包括α和β亞單元的位置的血紅蛋白的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施方式
用于本發(fā)明的組合物中的血紅蛋白優(yōu)選為人血紅蛋白，其來(lái)自紅血細(xì)胞。然而，其它類型的形成氧運(yùn)輸劑的基礎(chǔ)的血紅蛋白(如動(dòng)物血紅蛋白，特別是牛血紅蛋白和豬血紅蛋白等，以及來(lái)自于細(xì)胞培養(yǎng)的血紅蛋白)在本發(fā)明中也是適用的。根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的雜合血紅蛋白分子具有以下通式結(jié)構(gòu)：
csh＝a[x]-b[y]-c[z]
a.交聯(lián)的穩(wěn)定的血紅蛋白
b.連接
c.天然果膠衍生物
根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的組合物為被碳水化合物保護(hù)的血紅蛋白(cshtm)，其中[x]單位的a與[y]單位的b連接，并且b與[z]單位的c連接。a為四聚體血紅蛋白，并且[x]為1乃至最多6個(gè)四聚體單位。c為果膠的天然衍生物，并且[z]為1乃至最多12個(gè)單位。b為在a和c之間起橋接作用的化學(xué)或物理實(shí)體、或是它們的組合，并且[y]為2乃至最多24個(gè)所定的連接。
組分a：
a為交聯(lián)的穩(wěn)定的血紅蛋白結(jié)構(gòu)
血紅蛋白結(jié)構(gòu)
hünefeld在1840年發(fā)現(xiàn)了攜氧蛋白血紅蛋白。1851年，ottofunke發(fā)表了一系列文章，其中他描述了通過(guò)用諸如純水、醇或醚等溶劑連續(xù)稀釋紅血細(xì)胞、然后從所得蛋白質(zhì)溶液中緩慢蒸發(fā)溶劑，來(lái)生長(zhǎng)血紅蛋白晶體。
若干年之后，felixhoppe-seyler描述了血紅蛋白的可逆氧合。血紅蛋白在血液中的作用是由生理學(xué)家claudebernard闡明的。名詞“血紅蛋白”是亞鐵血紅素和球蛋白的混成詞，反映了血紅蛋白的每個(gè)亞單元為具有嵌入式亞鐵血紅素(或血紅素)基團(tuán)的球蛋白。每個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)包含一個(gè)鐵原子，其能夠通過(guò)離子誘導(dǎo)偶極力結(jié)合一個(gè)氧分子。哺乳動(dòng)物中最常見(jiàn)的血紅蛋白類型包含4個(gè)這樣的亞單元。
亞鐵血紅素基團(tuán)
在大多數(shù)人中，血紅蛋白分子為四個(gè)球蛋白亞單元的集合。每個(gè)亞單元由與非蛋白亞鐵血紅素基團(tuán)緊密結(jié)合的蛋白鏈構(gòu)成。在球蛋白折疊結(jié)構(gòu)中，每個(gè)蛋白鏈排布為一組連接在一起的α-螺旋結(jié)構(gòu)片段，由于此結(jié)構(gòu)與其他亞鐵血紅素/球蛋白(如肌紅蛋白)中使用的折疊基序(motif)相同，因此這樣命名。該折疊模式含有與亞鐵血紅素基團(tuán)牢固結(jié)合的囊袋(pocket)。
亞鐵血紅素基團(tuán)由保持在雜環(huán)(稱為卟啉)中的鐵(fe)離子(帶電原子)構(gòu)成。鐵離子(氧的結(jié)合位點(diǎn))與環(huán)中心的四個(gè)氮配合，它們均處于同一平面。所述鐵也通過(guò)卟啉環(huán)下方的f8組氨酸殘基的咪唑環(huán)與球蛋白緊密結(jié)合。第六位能夠通過(guò)配位共價(jià)鍵與氧可逆地結(jié)合，形成6個(gè)配體的八面體基團(tuán)。氧以“末端彎曲”(end-onbent)的幾何形狀結(jié)合，其中一個(gè)氧原子結(jié)合fe，并且另一個(gè)氧原子以一定角度突出。當(dāng)未結(jié)合氧時(shí)，結(jié)合得非常弱的水分子填充該位點(diǎn)，形成扭曲的八面體。
該鐵離子可以為fe2+或fe3+狀態(tài)，但是高鐵血紅蛋白(正鐵血紅蛋白)(fe3+)不能結(jié)合氧。在結(jié)合時(shí)，氧暫時(shí)將(fe2+)氧化為(fe3+)，因此鐵必須以+2氧化態(tài)存在以結(jié)合氧。正鐵血紅蛋白還原酶通過(guò)還原鐵中心來(lái)激活處于非活性(fe3+)狀態(tài)的血紅蛋白。
在成年人中，最常見(jiàn)的血紅蛋白類型為被稱為血紅蛋白a的四聚體(其含有4個(gè)亞單元蛋白)，其由非共價(jià)結(jié)合的兩個(gè)α亞單元和兩個(gè)β亞單元構(gòu)成，各個(gè)亞單元分別由141和146個(gè)氨基酸殘基形成。記為α2β2。這些亞單元結(jié)構(gòu)類似并且大小基本相同。每個(gè)亞單元的分子量約為17,000道爾頓，四聚體的總分子量約68,000道爾頓(64,458g/mol)。1g/dl＝0.6206mmol/l。在血紅蛋白分子中，研究最為深入的是血紅蛋白a。
四個(gè)多肽鏈通過(guò)鹽橋、氫鍵和疏水相互作用彼此結(jié)合。α和β鏈之間有兩種接觸方式：α1β1和α1β2。
在呼吸的過(guò)程中，當(dāng)氧與紅血細(xì)胞中的蛋白血紅蛋白的亞鐵血紅素組分結(jié)合時(shí)，形成氧合血紅蛋白。該過(guò)程發(fā)生在靠近肺的肺泡的肺毛細(xì)血管中。然后氧穿過(guò)血流流至細(xì)胞，在此，其被用于有氧糖酵解中，以及用于通過(guò)氧化磷酸化過(guò)程生成atp的作用中。然而，其對(duì)阻礙血液ph的下降沒(méi)有幫助。換氣或呼吸可通過(guò)除去二氧化碳而使該狀況逆轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致ph上升。
脫氧血紅蛋白是血紅蛋白不含結(jié)合氧的形式。氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的吸收光譜不同。在660nm波長(zhǎng)下，氧合血紅蛋白的吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于脫氧血紅蛋白，而在940nm波長(zhǎng)下，氧合血紅蛋白的吸收略高于脫氧血紅蛋白。這就解釋了血紅蛋白的紅色和脫氧血紅蛋白的藍(lán)色的原因。此差別用于通過(guò)被稱為脈動(dòng)血氧計(jì)的設(shè)備來(lái)測(cè)量患者血液中的氧含量。
以化學(xué)方法結(jié)合的蛋白質(zhì)陣列具有多種多樣的重要的應(yīng)用，包括紅細(xì)胞替代物的制備、生物共軛藥物輸送和蛋白質(zhì)療法(參見(jiàn)文獻(xiàn)：dongxinhu和ronaldkluger，efficientgenerationofdendriticarraysofcross-linkedhemoglobin:symmetryandredundancy)。
為了制備具有規(guī)定結(jié)構(gòu)的材料，需要有效和易于獲得的試劑。盡管能夠以高產(chǎn)率實(shí)現(xiàn)多亞單元蛋白的化學(xué)交聯(lián)，但是要使蛋白質(zhì)以樹(shù)狀集合的方式彼此連接并且同時(shí)交聯(lián)卻鮮有成功。目前已經(jīng)通過(guò)設(shè)計(jì)和實(shí)施容易制備的試劑以及補(bǔ)償競(jìng)爭(zhēng)性水解的附加反應(yīng)位點(diǎn)而克服了這一問(wèn)題。設(shè)計(jì)并由活性均苯三甲酰核通過(guò)三個(gè)階段高產(chǎn)率地合成了n,n',n"-三[雙(甲基磷酸鈉)間苯二甲酰]-1,3,5-苯三甲酰胺(n,n',n"-tris[bis(sodiummethylphosphate)isophthalyl]-1,3,5-benzene-tricarboxamide)(1)，即，一種六(甲基磷酸鹽)間苯二甲酰均苯三甲酰三胺(hexakis(methylphosphate)isophthalyltrimesoyltris-amide)。
所述物質(zhì)具有3對(duì)共面交聯(lián)活性位點(diǎn)，其對(duì)稱排列。三組位點(diǎn)的存在極大地提高了下述可能性：至少兩組在血紅蛋白四聚體內(nèi)部產(chǎn)生交聯(lián)(與水解作用競(jìng)爭(zhēng))，從而同時(shí)連接兩個(gè)交聯(lián)的四聚體。1與脫氧血紅蛋白在ph8.5下反應(yīng)，得到含有彼此連接為組成性αβ二聚體(constituentαβdimer)的兩個(gè)交聯(lián)血紅蛋白四聚體的材料。通過(guò)sds-page、ms、酶消化和hplc對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征。分離得到的具有2.5個(gè)四聚體組分的樹(shù)狀血紅蛋白具有與天然血紅蛋白相同的氧親和性(p50＝5.0托)并且保持了協(xié)同性(n50＝2.0)。圓二色光譜分析表明該集合體保留了球蛋白鏈的適當(dāng)折疊，但亞鐵血紅素處于變化的環(huán)境中。
sh是由處于鹽溶液中的化學(xué)穩(wěn)定的、交聯(lián)的牛(奶牛)血紅蛋白構(gòu)成的。在本申請(qǐng)公開(kāi)的范圍內(nèi)，可以考慮使用其他來(lái)源的血紅蛋白，包括人血紅蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)血紅蛋白和其他動(dòng)物來(lái)源的血紅蛋白。血紅蛋白自身對(duì)腎有毒性，這是由于其含有被內(nèi)毒素污染的基質(zhì)脂質(zhì)。然而，如果基質(zhì)脂質(zhì)被除去，那么血紅蛋白對(duì)氧的親和性過(guò)高，這意味著卸載到組織中的氧較少。為了保證血紅蛋白不具有毒性，但是仍然能用于治療，必須使其穩(wěn)定。可通過(guò)血紅蛋白的交聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。這是通過(guò)使兩個(gè)α亞單元和兩個(gè)β亞單元交聯(lián)來(lái)完成的。于是使得該αβ二聚體穩(wěn)定，這進(jìn)而使得血紅蛋白分子更穩(wěn)定，并且也降低了其對(duì)氧的親和力，使其更容易向組織輸送氧。血紅蛋白的結(jié)構(gòu)在圖1中示出，包括α和β亞單元的位置。
安全措施
由于根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)所使用的穩(wěn)定的血紅蛋白來(lái)自于奶牛，因此對(duì)這種雜合血紅蛋白分子進(jìn)行了詳盡的檢查以確保其不含病原體、傳染原(bse)并且是化學(xué)純的，包括：僅使用密切監(jiān)控的畜群，其原產(chǎn)地、食物供應(yīng)和健康均受到密切監(jiān)督；任用外部專家密切控制雜合血紅蛋白分子的嚴(yán)格的制備工藝，以確定除去潛在病原體的能力；并且嚴(yán)格遵守全球工業(yè)和監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)。
雜合血紅蛋白分子相對(duì)于rbc中的血紅蛋白分子的優(yōu)點(diǎn)
相比于常規(guī)來(lái)源的紅血細(xì)胞(rbc)中的血紅蛋白分子，根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的雜合血紅蛋白分子作為氧運(yùn)輸劑的優(yōu)點(diǎn)在下表1中示出：
表1
根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的雜合血紅蛋白分子的尺寸較小(乃至小于常規(guī)紅血細(xì)胞約1,000倍)并且具有比人紅血細(xì)胞(含有血紅蛋白)低的粘度。這意味著其可以在更低的血壓下攜帶比紅血細(xì)胞更多的氧。同樣，由于其尺寸更小，因此其可以攜氧通過(guò)部分阻塞的或受限的血管，而rbc的血紅蛋白分子則無(wú)法通過(guò)。
由于阻塞的動(dòng)脈所引起的不充分的組織氧合可導(dǎo)致心臟病發(fā)作、心絞痛、或短暫性腦缺血發(fā)作(這是中風(fēng)的前兆)。通常，這些狀況已經(jīng)通過(guò)輸血來(lái)治療，但是rbc的血紅蛋白分子通常過(guò)大而無(wú)法穿過(guò)阻塞處，這就是根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的雜合血紅蛋白分子能夠潛在地具有治療益處的原因。
局部、區(qū)域性或系統(tǒng)rbc流減少的脊椎動(dòng)物可能具有在其他方面正常的氧運(yùn)輸系統(tǒng)，或者可能具有額外的、可對(duì)身體的一部分或整個(gè)身體的氧運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移有不利影響的異常情況。
另外，在此方法中，在施用血紅蛋白之前，該脊椎動(dòng)物具有血量正常的血容量。血量正常的血容量被定義為：在該脊椎動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)中不會(huì)導(dǎo)致低血容量性休克的血液體積，低血容量性休克可由嘔吐、腹瀉、燒傷或脫水而繼發(fā)的大出血或大量失去體液所導(dǎo)致。通常，血量正常的血容量包括該脊椎動(dòng)物的正常血容量的至少約90％。在某些情況下，血量正常的容量可包含低至正常血容量的約80％，而不會(huì)引起低血容量性休克。
此外，構(gòu)成血量正常的血容量的血液含有至少大約為正常濃度的rbc。例如，人的血量正常的血容量的血液通常具有至少為約30％的主血管血細(xì)胞比容。
在此方法中，在施用血紅蛋白之前，脊椎動(dòng)物的循環(huán)系統(tǒng)也具有正?；蚋哂谡５捏w循環(huán)血管阻力。正常的體循環(huán)血管阻力是指不會(huì)導(dǎo)致脊椎動(dòng)物發(fā)生諸如感染性休克等分布性休克的血管阻力。
紅血細(xì)胞流減少包括局部、區(qū)域性和/或系統(tǒng)rbc流的任何減少(低于正常rbc流水平)，包括“無(wú)rbc流”的情況。局部rbc流由流經(jīng)毛細(xì)血管床內(nèi)的一條或多條毛細(xì)血管中的rbc流構(gòu)成，其中所述毛細(xì)血管能正常提供rbc流為局部組織區(qū)域充氧。區(qū)域性rbc流提供rbc流為更大的組織區(qū)域(如肢體或器官)充氧。系統(tǒng)rbc流流經(jīng)身體的主要循環(huán)系統(tǒng)，從而供應(yīng)rbc為整個(gè)身體充氧。
在本申請(qǐng)公開(kāi)的方法的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，向患有或?qū)⒒佳h(huán)系統(tǒng)部分性梗阻(如狹窄或血管堵塞)的脊椎動(dòng)物施用雜合血紅蛋白分子(hhm)，其量使得通過(guò)該部分性梗阻的rbc流減少或者阻止rbc流通過(guò)該部分性梗阻，但是至少一些血漿可以流過(guò)。施用hhm提高了在該局部或區(qū)域化的部分性梗阻的遠(yuǎn)端的組織中的組織氧合，并且/或者提高了整個(gè)身體的組織氧合，從而治療了系統(tǒng)的部分性梗阻。
rbc明顯大于根據(jù)本申請(qǐng)公開(kāi)的雜合血紅蛋白分子，通常直徑為7至10微米，因此流經(jīng)部分性梗阻時(shí)比hhm需要明顯更大的血管開(kāi)口。
部分性梗阻可發(fā)生在所有組織部位和所有血管中，如動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管。另外，循環(huán)系統(tǒng)中的瓣膜(如主動(dòng)脈瓣、二尖瓣和三尖瓣)也可發(fā)生部分阻塞。另外，心腔或心臟的一部分(例如心室流出道和通向肺動(dòng)脈的心室開(kāi)口)可發(fā)生部分阻塞。
循環(huán)系統(tǒng)的部分性梗阻可能是暫時(shí)的、永久的或是反復(fù)性的。循環(huán)系統(tǒng)部分性梗阻可由于各種原因而引起，如血管壁缺陷、疾病、損傷、血液組分凝結(jié)、贅生物、占位損傷、感染、異物、擠壓、藥物、機(jī)械裝置、血管收縮和血管痙攣。
本文所述的循環(huán)系統(tǒng)狹窄是指在循環(huán)系統(tǒng)中的任何管道或腔變窄的情況。通常，狹窄可由以下原因引起：疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化；血管壁異常，如動(dòng)脈移植物的縫合線，連接移植物或支架的結(jié)點(diǎn)，血管、移植物或支架的扭結(jié)或畸形，受傷或侵入性操作(如導(dǎo)管插入，血管成形術(shù)，血管支架植入，假體、外源組織和/或自體組織的血管移植)的愈合組織或瘢痕組織；血管假體，如人造瓣膜或血管；擠壓，如通過(guò)贅生物塊、血腫或機(jī)械方法(如夾鉗、止血帶或箍口裝置(cuffdevice))導(dǎo)致的擠壓；化學(xué)毒害或藥物副反應(yīng)；血管收縮；以及血管痙攣。
組分b：
b為a和c之間的‘橋’‘連接體’。
在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，組分a和c通過(guò)若干常規(guī)連接技術(shù)連接，所述技術(shù)包括但不限于thermoscientificpierce的sulfo-nhs(n-羥基磺基琥珀酰亞胺)及其不帶電類似物nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)，它們是用于在各種生物共軛和交聯(lián)方法中將羧基轉(zhuǎn)移至胺反應(yīng)性sulfo-nhs酯的化學(xué)修飾劑。
在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，組分a和c通過(guò)物理橋相連接，此外通過(guò)離子或/和疏水或范德華力[或范德華相互作用]的多重相互作用而連接。除了上述之外，分子間(或該分子的若干部分之間)的引力或斥力歸因于離子與離子或是離子與中性分子之間的共價(jià)鍵或靜電相互作用。術(shù)語(yǔ)包括：永久偶極子和相應(yīng)的誘導(dǎo)偶極子、瞬時(shí)誘導(dǎo)偶極子-誘導(dǎo)偶極子之間的力(倫敦色散力)。這些力在雜合血紅蛋白的生物催化活性和聚合物穩(wěn)定性中起到根本性的作用。
通過(guò)將sulfo-nhs與含羧基的分子以及脫水劑(如碳二亞胺edc(edac))混合，可容易地合成化學(xué)鍵。該方法是生成許多類型的蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑的基礎(chǔ)，所述蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑包括胺反應(yīng)性熒光染料、生物素親和標(biāo)簽和聚乙二醇化化合物(pegylationcompounds)。
nhs和sulfo-nhs化學(xué)修飾劑的結(jié)構(gòu)
在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，將不可割裂的(non-cleavable)、不可透過(guò)膜的水溶性交聯(lián)劑用作連接劑。所述連接劑如下：
雙(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸酯(bs3)為同型雙功能的(homobifunctional)、水溶性的、不可割裂且不可透過(guò)膜的交聯(lián)劑。其在8碳間隔臂的每個(gè)末端分別具有胺反應(yīng)性n-羥基磺基琥珀酰亞胺(nhs)酯。nhs酯與伯胺在ph7-9下反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵，同時(shí)釋放出n-羥基磺基琥珀酰亞胺離去基團(tuán)。蛋白質(zhì)(包括抗體)通常在賴氨酸(k)殘基的側(cè)鏈和每個(gè)多肽的n端上具有若干個(gè)伯胺，其可作為nhs酯交聯(lián)劑的作用點(diǎn)。
由于bs3交聯(lián)劑含有親水性磺?；糠?，因此，該交聯(lián)劑在水和許多常用的緩沖液中是可溶的(最高達(dá)約10mm)，從而避免了使用可能會(huì)擾亂蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的有機(jī)溶劑。此外，bs3的非水溶性類似物dss也可用于需要較低親水性交聯(lián)劑的應(yīng)用(例如，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)交聯(lián))。dss和bs3對(duì)伯胺具有基本上相同的交聯(lián)活性。
組分c：天然果膠衍生物
天然果膠的特征結(jié)構(gòu)為：形成果膠骨架的、由α-(l-4)-連接的d-半乳糖醛酸的直鏈，即均聚半乳糖醛酸(homogalacturonan)。果膠是在所有植物組織的細(xì)胞壁中作為膠結(jié)料的多糖。檸檬和橙子的外皮的白色部分含有約30％的果膠。天然果膠為聚半乳糖醛酸的甲基化酯，其由采取1α→4連接方式連接的300至1000個(gè)半乳糖醛酸單元的鏈組成。酯化度(de)影響果膠的膠凝性能。在此所示的結(jié)構(gòu)中每?jī)蓚€(gè)羧基(-cooh)就有3個(gè)甲基酯形式(-cooch3)，因此其具有60％的酯化度，通常稱為de-60果膠。
果膠為具有不同數(shù)量的甲基酯基團(tuán)的α-半乳糖醛酸的聚合物。
在該骨架中，存在這樣的區(qū)域，其中半乳糖醛酸被(1-2)-連接的l-鼠李糖替代。不同的中性糖側(cè)鏈從鼠李糖殘基分支出來(lái)。這種類型的果膠稱為鼠李糖半乳糖醛酸聚糖i。主鏈中至多每25個(gè)半乳糖醛酸中有一個(gè)被鼠李糖替代。某些結(jié)構(gòu)段由交替的半乳糖醛酸和鼠李糖構(gòu)成-“發(fā)狀區(qū)”(hairyregions)，其他則具有較低密度的鼠李糖-“平滑區(qū)”。所述中性糖主要為d-半乳糖、l-阿拉伯糖和d-木糖，這些中性糖的類型和比例隨著果膠來(lái)源而有所不同。
第三種結(jié)構(gòu)類型的果膠為鼠李糖半乳糖醛酸聚糖ii，其是較為少見(jiàn)而復(fù)雜的、高度支化的多糖。
分離的天然果膠的分子量通常最高達(dá)400,000g/mol，其隨著來(lái)源和提取條件而有所不同。
在自然界中，半乳糖醛酸中約80％的羧基是被甲醇酯化的。在果膠提取的過(guò)程中該比例或多或少會(huì)有所降低。酯化半乳糖醛酸與未酯化半乳糖醛酸的比例決定了果膠在食品應(yīng)用中的行為。這是果膠被分為高酯與低酯果膠或簡(jiǎn)稱hm與lm果膠(在全部半乳糖醛酸中，分別有大于或小于一半被酯化)的原因。
未酯化半乳糖醛酸單元可以為游離酸(羧基)，或是與鈉、鉀或鈣成的鹽。部分酯化的果膠的鹽稱為果膠酸酯鹽(pectinates)，如果酯化度低于5％，則所述鹽稱為果膠酸鹽(pectates)，其不溶性酸形式稱為果膠酸。
酰胺化的果膠為果膠的改性形式。在此，一些半乳糖醛酸被氨轉(zhuǎn)化為羧酸酰胺。這些果膠在使用時(shí)更能耐受鈣濃度的變化。
高酯果膠比低酯果膠的凝固溫度高。然而，與鈣的膠凝反應(yīng)隨著酯化度降低而增強(qiáng)。類似地，較低的ph值或較高溶解性的固體(通常為糖)會(huì)提高膠凝速度。
盡管在此已經(jīng)參照天然果膠衍生物的特定實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，然而在前述公開(kāi)內(nèi)容中旨在包括一定范圍的調(diào)整、各種改變和替換，并且應(yīng)當(dāng)理解，在某些情況中，采用本發(fā)明的某些特征但不用相應(yīng)地采取其他特征，而不會(huì)脫離所述的本發(fā)明的范圍。由于天然果膠的來(lái)源眾多，所以在不脫離本發(fā)明基本范圍和精神的情況下，可對(duì)本發(fā)明的教導(dǎo)進(jìn)行多種修改以適應(yīng)特定的工藝或材料。本發(fā)明應(yīng)當(dāng)不受限于所公開(kāi)的作為實(shí)施本發(fā)明的最佳方式而設(shè)計(jì)的特定實(shí)施方案，相反，本發(fā)明應(yīng)包括落入權(quán)利要求書范圍內(nèi)的所有實(shí)施方案和等同方案。