本發(fā)明涉及慢性腎病的動物模型的建立，具體地，是伴有小球和小管間質(zhì)復(fù)合損傷的獼猴慢性腎病動物模型的建立。

背景技術(shù)：

各種病理因素導(dǎo)致的慢性腎病(ckd)是人類心血管疾病、早衰及終末期腎病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素之一。成年人慢性腎病發(fā)病率為8％-12％。西方國家，慢性腎病患病率在65歲以上老年人中達(dá)到25％；中國11.5％左右，城市(13％)高于農(nóng)村(10％)。在ckd患者中，僅8.7％被診斷，4.9％患者得到治療。ckd具有發(fā)病率高、伴發(fā)心血管病患病率高、病死率高；對ckd的知曉率低、防治率低、伴發(fā)心血管病知曉率低“三高三低”特點(diǎn)。隨我國人群飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，其他的繼發(fā)性慢性腎病正不斷增多，如糖尿病腎病、高血壓腎病等使慢性腎病的防治工作面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

目前針對慢性腎病的應(yīng)用基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)對象主要是嚙齒類動物，研究結(jié)果的應(yīng)用有很大局限性，非人靈長類動物作為目前動物界最高等種群，在解剖結(jié)構(gòu)、生理代謝及免疫系統(tǒng)等與人類有高度相似性，大概有98.5％的基因與人類具有同源性，是級別最高的非人慢性腎病模型使用物種，但利用非人靈長類動物建立模擬人類慢性腎病發(fā)生發(fā)展過程的慢性腎病模型不多，尤其兼顧腎小球和腎小管損傷模型很少，目前文獻(xiàn)僅報(bào)道猴免疫缺陷病毒shiv誘導(dǎo)，因shiv存在人源性感染的風(fēng)險(xiǎn)，安全性差，因此有必要探索新的、安全的方法建立此類模擬人類慢性腎病模型，為后期研究打下良好的模型基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種伴有小球和小管間質(zhì)復(fù)合損傷的慢性腎病動物模型的構(gòu)建方法。

本發(fā)明提供了阿霉素和/或順鉑在制備用于篩選治療慢性腎病的動物模型中的用途，其中阿霉素的施用劑量為1～2mg/kg/次，順鉑的施用劑量為2mg/kg/天；所述動物為靈長類動物。

其中，使用阿霉素和順鉑時，阿霉素和順鉑的給藥方式為：先給予阿霉素，每周1次，第1-4周劑量分別為4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停藥1周后，開始加用順鉑，每間隔一周1次給藥，連續(xù)4次，劑量為2mg/kg，加順鉑同時給予阿霉素，劑量為2mg/kg。

其中，使用阿霉素或順鉑時，阿霉素的給藥方式為：先給予阿霉素，每周1次，第1-4周劑量分別為4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停藥1周后，每間隔一周1次給藥，連續(xù)4次，劑量為2mg/kg；順鉑的給藥方式為：給藥2次，第1次給藥后60天再給一次，給藥劑量為5mg/kg。

其中，所述阿霉素為靜脈注射施藥；所述的順鉑為腹腔注射施藥。

其中，所述的動物模型是伴有小球和小管間質(zhì)復(fù)合損傷的獼猴動物慢性腎病動物模型。

本發(fā)明還提供了前述慢性腎病的動物模型的制備方法，它是將阿霉素和/或順鉑施用于靈長類動物，其中阿霉素的施用劑量為1～2mg/kg/次，順鉑的施用劑量為2mg/kg/天。

其中，使用阿霉素和順鉑時，阿霉素和順鉑的給藥方式為：先給予阿霉素，每周1次，第1-4周劑量分別為4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停藥1周后，開始加用順鉑，每間隔一周1次給藥，連續(xù)4次，劑量為2mg/kg，加順鉑同時給予阿霉素，劑量為2mg/kg。

其中，使用阿霉素或順鉑時，阿霉素的給藥方式為：先給予阿霉素，每周1次，第1-4周劑量分別為4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停藥1周后，每間隔一周1次給藥，連續(xù)4次，劑量為2mg/kg；順鉑的給藥方式為：給藥2次，第1次給藥后60天再給一次，給藥劑量為5mg/kg。

其中，所述阿霉素為靜脈注射施藥；所述的順鉑為腹腔注射施藥。

其中，所述靈長類動物為獼猴。

本發(fā)明還提供了一種篩選治療慢性腎病的藥物的方法，包括如下步驟：

a、按照前述的方法建立的慢性腎病模型；

b、將候選物施用于a步驟所述的慢性腎病模型；

c、用慢性腎病動物模型評價潛在的治療慢性腎病的藥物。

本發(fā)明方法可以有效建立伴有小球和小管間質(zhì)復(fù)合損傷的獼猴慢性腎病動物模型，而且制備方法安全，可以用于相關(guān)藥物的篩選，應(yīng)用前景優(yōu)良。

由于靈長類動物本身的特殊性，采用藥物的方式建立慢性腎病動物模型非常困難，本發(fā)明采用特定的藥物劑量和給藥次數(shù)，成功制備得到了獼猴慢性腎病動物模型，效果顯著。

根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

附圖說明

圖1建模第120天時腎小球he、masson和pasm染色。藍(lán)染膠原纖維主要表達(dá)于腎小囊壁層周邊，腎小球系膜區(qū)也呈不同程度藍(lán)染。除正常組外，余三組藍(lán)色較深，范圍較廣，阿霉素組和聯(lián)合組更加明顯。pasm染色見黑色銀染顆粒主要沉積于腎小球內(nèi)系膜區(qū)，顯示系膜輕-中度局灶節(jié)段性硬化不伴系膜基質(zhì)增生、系膜局部增厚。聯(lián)合組較阿霉素組和順鉑組更典型，局部足細(xì)胞腫脹、空泡樣變性。阿霉素組、順鉑組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞無明顯增生、血管腔無明顯受壓、未見到明顯炎性細(xì)胞浸潤，聯(lián)合組局部腎小球血管腔擴(kuò)張，×400。

圖2建模第120天時腎小管he、masson和pasm染色。阿霉素組腎小管部分管腔縮小、腎小管上皮細(xì)胞增高、管周膠原纖維化；順鉑組大部分腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞水腫變性及空泡樣變性明顯、管周膠原纖維化。聯(lián)合組腎小管管腔縮小，呈中-重度萎縮、腎小管上皮細(xì)胞增高、管周膠原纖維化。阿霉素組、順鉑組及聯(lián)合組管周無明顯銀染顆粒沉積，間質(zhì)內(nèi)無明顯炎性細(xì)胞浸潤，×400。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1本發(fā)明動物模型的制備

1材料和方法

1.1主要材料和試劑

雌性獼猴12只，購自四川宜賓橫豎生物科技有限公司。初始體重4.5±0.5kg，獼猴單籠喂養(yǎng)，專用飼料喂養(yǎng)，每日2次，每次飼料后加一個蘋果，清潔飲水。

pasm試劑盒來(貨號36-47，北京環(huán)宇金鷹科技)、masson試劑盒(貨號d026，南京建成)、阿霉素凍干粉(產(chǎn)品編碼：1599494734，山東普德藥業(yè))、順鉑(產(chǎn)品編號：a14200156601，齊魯制藥)，余為常規(guī)化學(xué)分析純試劑。

1.2建模和分組

雌性獼猴12只，體重(4.5±0.5kg)，分4組，每組3只。分別為正常組、阿霉素組、順鉑組和阿霉素+順鉑聯(lián)合組。聯(lián)合組給藥方式為阿霉素靜脈給藥，每周1次，第1-4周劑量分別為4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg，停藥1周，開始加用順鉑，每間隔一周1次給藥，連續(xù)4次，腹腔注射，劑量為2mg/kg，加順鉑同時給予阿霉素，劑量為2mg/kg；阿霉素組同聯(lián)合組阿霉素給藥方法；順鉑組腹腔注射5mg/kg，第60天時再重復(fù)一次。在給藥第0、30、60、90、120天檢測血清肌酐、尿素氮、腎小球?yàn)V過率、總蛋白、白蛋白、肝功血鈣、磷指標(biāo)。

1.3獼猴腎組織he、masson和pasm染色

給藥第120天，腎臟穿刺活檢，常規(guī)石蠟包埋切片，片厚5μm，進(jìn)行腎組織he、masson和pasm染色。

1.3.1he染色：常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后水洗2次，每次3分鐘。蘇木素染色5分鐘，1％鹽酸乙醇分化、1/400氨水反藍(lán)后水洗，伊紅2分鐘，水洗后梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后鏡下觀察腎皮質(zhì)腎小球皮質(zhì)部位腎小管病理變化。

1.3.2masson染色：石蠟切片脫蠟至水，依次自來水和蒸餾水洗。蘇木精染液染核5-10min。充分水洗,如過染可鹽酸酒精分化、蒸餾水洗。用masson麗春紅酸性復(fù)紅液5-10min。以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。1％磷鉬酸水溶液分化3-5min。不經(jīng)水洗,直接用苯胺藍(lán)或光綠液染5min。以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。95％酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.3.3pasm染色：切片脫蠟至水、蒸餾水洗，高碘酸溶液處理10-15分鐘，蒸餾水速洗2遍，浸入水浴至58-60度的六胺銀工作液內(nèi)20-30分鐘，鏡下控制銀染色的強(qiáng)度，蒸餾水速洗后進(jìn)入氯化金溶液處理1分鐘，5％海波處理1分鐘，水洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，分化返蘭、脫水、透明、封片，鏡下觀察腎皮質(zhì)腎小球。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

血清腎功數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)差異采用單因素方差分析(banferroniposthoctest)，組間差異采用配對t檢驗(yàn)。p<0.05，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1獼猴一般情況及體重變化

實(shí)驗(yàn)過程中，各組獼猴表現(xiàn)有明顯不同，聯(lián)合組獼猴較阿霉素組和順鉑組精神差、反應(yīng)慢、不愛活動、食欲差、身體消瘦明顯、毛色暗淡無光澤。各組獼猴體重變化，聯(lián)合組體重隨給藥時間逐漸下降，阿霉素組和順鉑組體重隨時間稍增加(表1)。

表1獼猴體重變化(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)

2.2獼猴腎功變化

血清生化檢測結(jié)果顯示給藥第30天時，各組肌酐、尿素氮較給藥前增高，順鉑組增加更顯著。第60天時，阿霉素組和順鉑組肌酐、尿素氮下降，聯(lián)合組仍上升，到90天時各組均升高，120天時下降，但聯(lián)合組肌酐和尿素氮水平較阿霉素組和順鉑組高。腎小球?yàn)V過率各組從給藥第30天時開始就明顯下降，到第120天時，阿霉素組和順鉑組較給藥前下降近25％，聯(lián)合組較給藥前下降近40％。血清白蛋白給藥后三個模型組均呈下降趨勢，到給藥第120天時阿霉素組和順鉑組恢復(fù)近正常水平，聯(lián)合組呈進(jìn)行性下降。肝功能ast、alt指標(biāo)隨給藥時間呈進(jìn)行性增加。在給藥后第120天，順鉑組ast接近給藥前水平，阿霉素組和聯(lián)合組仍較給藥前明顯增加，三個模型組alt均較給藥前明顯增加，聯(lián)合組更甚。血清鈣、磷結(jié)果顯示第30天時，三個模型組血鈣和血磷均稍上升；60天時，阿霉素組和順鉑組血鈣輕度降低、血磷升高，120天時血鈣近給藥前水平，血磷仍較給藥前高。聯(lián)合組血鈣和血磷隨時間增高，到120天聯(lián)合組血鈣和血磷水平均較給藥前增高(表2)。

表2建模不同時間各組獼猴腎功變化(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，n＝3)

注：^a,dp<0.05，與同時間點(diǎn)另三組比較；^b,c,ep<0.05，與同組給藥前比較。

2.3獼猴腎組織病理變化

建模第120天時腎小球病理變化顯示藍(lán)染膠原纖維主要表達(dá)于腎小囊壁層周邊，腎小球系膜區(qū)也呈不同程度藍(lán)染。除正常組外，余三組藍(lán)色較深，范圍較廣，阿霉素組和聯(lián)合組更加明顯。pasm染色見黑色銀染顆粒主要沉積于腎小球內(nèi)系膜區(qū)，顯示系膜輕-中度局灶節(jié)段性硬化不伴系膜基質(zhì)增生、系膜局部增厚。聯(lián)合組較阿霉素組和順鉑組更典型，局部足細(xì)胞腫脹、空泡樣變性明顯。阿霉素組、順鉑組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞無明顯增生、血管腔無明顯受壓、未見到明顯炎性細(xì)胞浸潤，聯(lián)合組局部腎小球血管腔擴(kuò)張(圖1)。

建模第120天時阿霉素組腎小管部分管腔縮小、腎小管上皮細(xì)胞增高、管周膠原纖維化；順鉑組大部分腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞水腫變性及空泡樣變性明顯、管周膠原纖維化。聯(lián)合組腎小管管腔縮小，呈中-重度萎縮、腎小管上皮細(xì)胞增高、管周膠原纖維化。阿霉素組、順鉑組及聯(lián)合組管周無明顯銀染顆粒沉積，間質(zhì)內(nèi)無明顯炎性細(xì)胞浸潤(圖2)。

綜合上述檢測指標(biāo)可以看出，本發(fā)明單獨(dú)給予阿霉素組、順鉑，或者聯(lián)合給予阿霉素組和順鉑，可以使得腎小球?yàn)V過率下降，并有尿白蛋白等腎損傷標(biāo)志物出現(xiàn)，腎小管出現(xiàn)了病變，和人類慢性腎病的病理和腎功變化過程相似，說明成功制備得到了慢性腎病模型，同時兼顧了腎小球和腎小管的損傷。其中，特別是阿霉素和順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)慢性腎病模型的各個指標(biāo)變化較大。

該實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明建立了獼猴的慢性腎病模型，可用于篩選治療慢性腎病的藥物及治療方法。