本發(fā)明屬于中藥提取技術領域，具體涉及的是一種磷酸酯化姬松茸多糖的應用。

背景技術：

姬松茸(agaricusblazeimurrill，abm)又稱巴西蘑菇，是隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、傘菌科、傘菌屬的食藥兩用真菌。姬松茸不僅味道鮮美，而且由姬松茸提取的多糖具有調(diào)節(jié)免疫機能，增強免疫力，抗腫瘤，抗氧化，降血脂，防治糖尿病等方面的功效。

在畜牧獸醫(yī)相關研究中發(fā)現(xiàn)，在aa肉雞生長初期，日糧中添加姬松茸多糖可以提高雛雞的日增重和血清的抗氧化能力，從而提高機體的免疫能力，減少疾病的發(fā)生。經(jīng)科研人員研究表明，口服姬松茸多糖能夠增強雛雞的體液免疫反應，提高疫苗的保護率，并使免疫力維持時間更持久，同時，在疫苗免疫初期，適當劑量的姬松茸多糖能夠提高紅細胞c3b受體花環(huán)率，增強紅細胞的免疫功能。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，日常飲水中加入含有姬松茸多糖的中藥泡騰片既可以提高動物機體的免疫力，也能有效治療或者減輕大腸桿菌疾病癥狀，避免并發(fā)癥，還能有效改善飲用水質(zhì)。姬松茸多糖的有效成分能夠顯著地增強體液免疫和細胞免疫反應，說明這種多糖的有效成分能夠激發(fā)th1型免疫力，可以作為新型的免疫佐劑進行研發(fā)。姬松茸多糖通過白介素-12(il-12)誘導干擾素-γ(ifn-γ)的分泌來激活殺傷細胞(nk細胞)，從而促進先天性免疫反應。姬松茸多糖可以有效刺激t細胞和巨噬細胞釋放白介素-1β(il-1β)和白介素-6(il-6)，進而提高機體針對異種抗原的特異性抗體產(chǎn)生。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，姬松茸多糖的提取物能夠提高巨噬細胞的吞噬活性和kn細胞的殺傷能力，促進體液免疫反應并調(diào)節(jié)細胞免疫反應，進而調(diào)節(jié)先天性免疫應答和適應性免疫應答。姬松茸提取物對細菌、真菌也有抑菌作用。姬松茸熱水浸提物能夠降低綠膿桿菌的菌膜形成能力，減少綠膿菌素的產(chǎn)生，降低菌體的運動能力，顯著地減少綠膿桿菌的毒力因子。

很多研究報道姬松茸多糖具有抗病毒活性，能夠抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒(pv)、西方馬型腦炎病毒(weev)、乙型肝炎(hbv)、丙型肝炎(hcb)、單純性皰疹病毒(hsv-1、hsv-2)的復制。體外實驗表明，姬松茸多糖能夠誘導小鼠骨髓巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、白介素-8(il-8)和一氧化氮(no)，并抑制由weev引起的vero細胞病變，從而體現(xiàn)出抗病毒感染效應。姬松茸多糖也能夠增強機體特異性口蹄疫病毒(fmdv)dna疫苗的體液免疫反應，并促進t細胞的增殖。

研究表明，多糖經(jīng)過分子修飾后，伴隨其空間結構發(fā)生改變，其生物學活性也隨之改變，可以增強或賦予其更多的生物活性。磷酸酯化多糖作為多糖的重要衍生物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)葡聚糖經(jīng)磷酸酯化修飾之后，能夠促進小鼠脾細胞的有絲分裂，增強b淋巴細胞及樹突狀細胞表面的cd86和cd69表達，也能促進il-10的分泌。果聚糖經(jīng)磷酸酯化修飾之后，其抗皰疹病毒的活性明顯提高。將水不溶性多糖(1-3)-α-d-葡聚糖進行磷酸酯化修飾之后，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性顯著提高。因此，對于姬松茸多糖進行磷酸酯化修飾可能提高其生物學活性，具有更為廣闊的研究意義和應用價值。

近年來越來越多的研究證明abm具有免疫調(diào)節(jié)作用，但是磷酸酯化對于abm免疫調(diào)節(jié)作用的影響還沒有詳細的研究，比如磷酸酯化abm對小鼠體重以及免疫器官的影響，磷酸酯化abm攝入對于外源抗原激發(fā)宿主產(chǎn)生特異性免疫反應的水平等等都有待于本領域的技術人員進行不斷地探索。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對磷酸酯化姬松茸多糖應用技術的不足，而提出一種磷酸酯化姬松茸多糖的應用。

本發(fā)明解決其技術問題是采取以下技術方案實現(xiàn)的：

一種磷酸酯化姬松茸多糖的應用，該應用是將磷酸酯化姬松茸多糖用于家畜類飼養(yǎng)動物的輔助喂養(yǎng)，以提高家畜類飼養(yǎng)動物在對抗細菌感染、提高免疫能力及增加體重方面的能力。

而且，在使用磷酸酯化姬松茸多糖進行家畜類飼養(yǎng)動物的輔助喂養(yǎng)時，磷酸酯化姬松茸多糖的用量為在每公斤喂養(yǎng)飼料中添加500mg-1000mg的磷酸酯化姬松茸多糖。

本發(fā)明的優(yōu)點及其效果

1、本發(fā)明確定了磷酸酯化姬松茸多糖沒有急性毒性，它的使用安全性良好。

2、本發(fā)明確定了磷酸酯化姬松茸多糖對家畜類飼養(yǎng)動物生長發(fā)育與對抗細菌感染的作用好于姬松茸多糖。

3、本發(fā)明確定了磷酸酯化姬松茸多糖對家畜類飼養(yǎng)動物免疫器官生長發(fā)育的作用好于姬松茸多糖。

4、本發(fā)明確定了磷酸酯化姬松茸多糖對家畜類飼養(yǎng)動物細菌感染所激發(fā)的體液免疫應答的作用好于姬松茸多糖。

附圖說明

圖1為各組體重的測定結果：3組實驗動物，1-29天，每組18只，30-36天，每組9只，同一時間點內(nèi)各組比較。

圖2是各組脾臟指數(shù)的測定結果：3組實驗動物，每組9只，同一時間點內(nèi)各組比較，其中，*，p<0.050。

圖3是各組血清中抗大腸桿菌igg效價的測定結果：3組實驗動物，每組9只，同一時間點內(nèi)各組比較差異，其中，*，p<0.050；**，p<0.010。

圖4是各組脾臟指數(shù)的測定結果：3組實驗動物，每組9只，同一時間點內(nèi)各組比較，其中，*，p<0.050，**，p<0.010。

圖5是各組血清中抗大腸桿菌igg效價的測定結果：3組實驗動物，每組9只，同一時間點內(nèi)各組比較差異，其中，*，p<0.050；**，p<0.010。

具體實施方式

以下對本發(fā)明實施例做進一步詳述：需要強調(diào)的是，本發(fā)明所述的實施例是說明性的，而不是限定性的，因此本發(fā)明并不限于具體實施方式中所述的實施例，凡是由本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的技術方案得出的其它實施方式，同樣屬于本發(fā)明保護的范圍。

一種磷酸酯化姬松茸多糖的應用方法，包括步驟如下：

第一步，為了找出磷酸酯化姬松茸多糖的應用方法，本發(fā)明首先要確定磷酸酯化姬松茸多糖的急性毒性，具體方法步驟是：

(1)20只雌性昆明小鼠適應性喂養(yǎng)3天，隨機分為2組，每組10只，實驗組按照人用劑量的500倍(最大給藥量為500mg/kg)進行灌胃，磷酸酯化姬松茸多糖以生理鹽水溶解，濃度為0.6g/ml，0.25ml/只，每隔6小時灌胃1次，共灌服4次；對照組灌服等量的生理鹽水。

(2)給藥后觀察7天，記錄每日各組小鼠的體重及精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤、食欲排泄、死亡等臨床癥狀。

以人用劑量的500倍給藥4次(最大給藥量為500mg/kg)后，發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠僅給藥當天活動量和采食量均減少。在給藥后7天內(nèi)各組小鼠的精神、活動、皮毛、食欲、排泄等臨床癥狀均無異常，也無其他中毒反應。

在給藥后7天內(nèi)實驗組與對照組小鼠的體重均有增長，差異不顯著(見表1)。

表1各組小鼠的體重(n＝10)g

(3)7天后剖檢，觀察各組小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟的病變情況，計算器官指數(shù)(各臟器重量與體重之比)。

給藥7天后剖檢小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟，實驗組與對照組相比，小鼠各臟器的形狀、大小與色澤均正常，未見病變情況。實驗組與對照組相比，小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟的器官指數(shù)差異不顯著(見表2)。

表2各組小鼠的器官指數(shù)％

(4)病理組織切片的制備

①固定：采集各組小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟，用4％甲醛溶液連續(xù)固定7天。

②清洗：用手術刀和鑷子從各個組織中切下一塊表面平整的組織塊，邊長約為1cm，高約為0.5cm。將組織塊置于包埋盒中，然后用紗布包裹住包埋盒；用鑷子將紗布懸掛于燒杯中，將其放在流動自來水下清洗24h，盡量將固定液清洗干凈。

③脫水：將包埋盒按順序分別在梯度乙醇溶液中依次浸泡1h，乙醇濃度依次為70％-80％-90％-95％-95％-100％-100％。

④透明：將包埋盒分別放入二甲苯1和二甲苯2中各透明10min，獲得的組織塊呈透明狀。

⑤浸蠟：將包埋盒分別放入石蠟1和石蠟2中各浸蠟2h，石蠟溫度控制在55-70℃之間。

⑥包埋：打開包埋蠟的開關，使蠟液裝入模具的三分之二處，用鑷子在浸蠟盒中打開包埋盒并取出其中的組織塊，把組織塊平整的貼放在模具底部中心部位，蓋上包埋盒，加入少許蠟液，使冷卻后的包埋盒與石蠟不易脫離。將處理好的模具放置在冷卻臺上，充分冷卻后，取下石蠟塊。

⑦切片

把石蠟塊放在萊卡轉輪式切片機的固定架上，鎖住轉輪臂，調(diào)整標尺確定切片的厚度，開鎖，輕輕轉動轉輪，直到切出組織完好平整的切片為止，每個組織塊切5片組織。

⑧展片：將切好的組織切片用鑷子平鋪在溫水槽中，使其充分在水中展開。

⑨撈片：捏住載玻片的一端，將另一端伸入水槽中，使切片上的一端石蠟貼在距離載玻片手捏一端較近的位置，緩慢拉出載玻片，組織切片隨即平鋪在載玻片上，含有組織的部分位于載玻片的中心處。

⑩烤片：把組織切片放在烤片機上，使組織中的石蠟融化，烤片5h，使組織固定在載玻片上，再將組織切片放在晾片架上放進烤箱中70℃烤片24h。

(5)組織切片的染色與觀察

①在染缸中依次分別加入如下試劑，并按相應時間，將組織切片置于染缸中分別與相應試劑反應如下時間：二甲苯1(15min)、二甲苯2(15min)、100％乙醇1(3min)、無水乙醇2(3min)、95％乙醇(1min)、90％乙醇(1min)、80％乙醇(1min)、70％乙醇(1min)、蘇木素染液(15min)、自來水1(15min)、1％鹽酸乙醇溶液(1s)、自來水2(15min)、0.5％伊紅染液(2min)、70％乙醇(1min)、80％乙醇(1min)、90％乙醇(1min)、95％乙醇(1min)、100％乙醇1乙醇(1min)、100％乙醇2乙醇(1min)、二甲苯1(10min)、二甲苯2(10min)。

②封片：把組織切片正面朝上平放于操作臺上，用中性樹膠滴在組織切片上有組織的部分，蓋上載玻片，等待凝固。

③鏡檢：調(diào)節(jié)顯微鏡，把組織切片放在顯微鏡下觀察各個組織有無可見的病變，“-”表示無病變，“+”表示輕度損傷。

給藥7天后實驗組與對照組相比，小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟的病理組織學觀察未見異常，差異不顯著(見表3),結論是：磷酸酯化姬松茸多糖沒有急性毒性，它的使用安全性良好。

表3各組小鼠器官病理學檢查結果

第二步，確定磷酸酯化姬松茸多糖對小鼠生長發(fā)育與對抗細菌感染的作用，具體的確定過程如下：

(1)小鼠適應性喂養(yǎng)2天后，隨機分為3組，每組18只。第2組灌服姬松茸多糖溶液100mg/kg，第3組灌服磷酸酯化姬松茸多糖溶液100mg/kg，連續(xù)14天，同時第1組灌服等量的生理鹽水，記錄各組小鼠的體重變化。如圖1所示，從試驗第1天起，各組小鼠的體重呈上升趨勢，第3組小鼠體重平均值高于第2組，第2組小鼠體重平均值高于第1組，說明磷酸酯化姬松茸多糖對小鼠的增重效果優(yōu)于姬松茸多糖。

(2)在第15天和第29天，各組分別灌服大腸桿菌1×10⁸cfu/ml和1×10⁹cfu/ml，0.2ml/只/次，觀察各組小鼠對大腸桿菌感染后的抵抗力和發(fā)病情況，記錄各組小鼠的體重變化，以第1組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、活動量減少、體重下降、腹瀉為臨床檢測指標。如圖1所示，大腸桿菌感染后，即試驗第16天和第30天，各組小鼠的體重均有所下降，之后明顯上升，其中第3組體重恢復效果好于第2組和第1組，說明磷酸酯化姬松茸多糖對于小鼠對抗大腸桿菌感染的效果優(yōu)于姬松茸多糖。

第三步，確定磷酸酯化姬松茸多糖對小鼠免疫器官生長發(fā)育的作用，具體的確定過程如下：

小鼠適應性喂養(yǎng)2天后，隨機分為3組，每組18只。第2組灌服姬松茸多糖溶液100mg/kg，第3組灌服磷酸酯化姬松茸多糖溶液100mg/kg，連續(xù)14天，同時第1組灌服等量的生理鹽水，在第15天和第29天，各組分別灌服大腸桿菌1×10⁸cfu/ml和1×10⁹cfu/ml，0.2ml/只/次。在第29天和第36天各組分別取9只小鼠剖檢，觀察各組小鼠的器官病變情況，采集脾臟稱重并計算器官指數(shù)。如圖2所示，在首次感染后第14天，即試驗第29天，第1組與第2組相比脾臟指數(shù)差異顯著(p<0.05)，第1組與第3組相比差異顯著(p<0.05)，說明磷酸酯化姬松茸多糖和姬松茸多糖均能夠促進脾臟的生長發(fā)育；在二次感染后第7天，即試驗第36天，脾臟指數(shù)第1組與第3組相比差異顯著(p<0.05)，第2組與第3組相比差異顯著(p<0.05)，說明磷酸酯化姬松茸多糖對促進和維持脾臟生長發(fā)育的效果好于姬松茸多糖。

第四步，確定磷酸酯化姬松茸多糖對小鼠細菌感染所激發(fā)的體液免疫應答的作用，具體的確定過程如下：

小鼠適應性喂養(yǎng)2天后，隨機分為3組，每組18只。第2組灌服姬松茸多糖溶液100mg/kg，第3組灌服磷酸酯化姬松茸多糖溶液100mg/kg，連續(xù)14天，同時第1組灌服等量的生理鹽水，在第15天和第29天，各組分別灌服大腸桿菌1×10⁸cfu/ml和1×10⁹cfu/ml，0.2ml/只/次。在第29天和第36天各組分別取9只小鼠眼球采血。各組采集的血液均分離血清并于-20℃保存，用于檢測血清中抗大腸桿菌igg效價。

elisa檢測血清中抗大腸桿菌igg效價：用包被緩沖液將大腸桿菌全抗原稀釋至1μg/ml，加到elisa反應板中，100μl/孔，4℃過夜；移去包被液，凹孔用洗滌緩沖液洗3次，洗滌時將反應板放在96孔板振蕩器上，600r/min洗滌5min；將封閉液加到elisa反應板中，300μl/孔，放于濕盒中，37℃孵育2h；移去封閉液，凹孔用洗滌緩沖液洗3次，洗滌時將反應板放在96孔板振蕩器上，600r/min洗滌5min；待測血清用抗體稀釋液以1:100比例進行稀釋，加入elisa反應板中，100μl/孔，放于濕盒中，37℃孵育1h，同時設立陰性對照；移去待檢血清，凹孔用洗滌緩沖液洗4次，洗滌時將反應板放在96孔板振蕩器上，600r/min洗滌5min；hrp-goatanti-mouseigg用抗體稀釋液以1:10000比例進行稀釋，加入elisa反應板中，100μl/孔，放于濕盒中，37℃孵育1h；；移去抗體，凹孔用洗滌緩沖液洗4次，洗滌時將反應板放在96孔板振蕩器上，600r/min洗滌5min；在elisa反應板中加入顯色液，100μl/孔，避光反應15min；在elisa反應板中加入終止液，50μl/孔；將elisa反應板放入酶標儀中，讀取450nm和630nm波長處的吸光度值，試驗孔的od值為對照孔的2倍時，認為是陽性。

如圖3所示，在首次感染后第14天，即試驗第29天，抗大腸桿菌igg效價第1組與第3組相比差異顯著(p<0.05)，第2組與第3組相比差異顯著(p<0.05)，說明磷酸酯化姬松茸多糖能夠提高首次感染小鼠血清中抗大腸桿菌igg效價，增強機體的體液免疫反應；在二次感染后第7天，即試驗第36天，抗大腸桿菌igg效價第1組與第2組相比差異顯著(p<0.05)，第1組與第3組相比差異極顯著(p<0.01)，第2組與第3組相比差異顯著(p<0.05)，說明磷酸酯化姬松茸多糖和姬松茸多糖均能夠提高二次感染小鼠血清中抗大腸桿菌igg效價，且磷酸酯化姬松茸多糖對增強機體的體液免疫反應的效果好于姬松茸多糖。

第五步，推廣確定磷酸酯化姬松茸多糖對家畜類飼養(yǎng)動物在對抗細菌感染、免疫器官生長發(fā)育、細菌感染所激發(fā)的體液免疫應答及增加體重方面的作用，

在某家兔飼養(yǎng)場，選擇一年齡內(nèi)家兔作為實驗對象，將家兔分為3組，每組9只，將家兔飼料制成3種，分別為普通飼料、添加有姬松茸多糖飼料，添加量為500mg/kg-1000mg/kg、添加有磷酸酯化姬松茸多糖飼料，添加量為500mg/kg-1000mg/kg，以3種飼料分別對3組家兔進行喂養(yǎng)。然后在喂養(yǎng)的第15天和第29天分別進行各組灌服大腸桿菌1×10⁸cfu/ml和1×10⁹cfu/ml，2ml/只/次，觀察各組家兔對大腸桿菌感染后的抵抗力和發(fā)病情況。如圖4、5所示，對于3組家兔進行免疫器官生長發(fā)育和細菌感染所激發(fā)的體液免疫應答對比實驗，結果同樣表明磷酸酯化姬松茸多糖對于家兔對免疫器官生長發(fā)育的效果優(yōu)于姬松茸多糖、于家兔對體液免疫應答的效果優(yōu)于姬松茸多糖，說明服用了添加有磷酸酯化姬松茸多糖飼料的家兔，家兔對抗大腸桿菌感染的效果優(yōu)于普通飼料及添加有姬松茸多糖飼料的家兔。